專(zhuān)利名稱：在高pH下蛋白質(zhì)的回收的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從培養(yǎng)液中回收糖苷酶或者肽酶的方法，所述酶在該培養(yǎng)液中是從不溶狀態(tài)到溶解狀態(tài)。
背景技術(shù)：
由于顯著量的目標(biāo)蛋白不是處于溶解狀態(tài)，可能會(huì)阻礙從培養(yǎng)液中回收該蛋白。
該問(wèn)題可能發(fā)生在如下情況中，比如當(dāng)目標(biāo)蛋白結(jié)合在沉積物的成分上，同樣地或者由于顯著量的目標(biāo)蛋白在從培養(yǎng)液中回收前已經(jīng)沉淀或結(jié)晶。
目標(biāo)蛋白與沉積物的結(jié)合是指該蛋白結(jié)合在培養(yǎng)基中的固形物上，比如細(xì)胞類(lèi)的固形物或培養(yǎng)基中的其他固體成分。
在蛋白質(zhì)的有效回收上，這是一個(gè)重要問(wèn)題。
已經(jīng)有幾種方法可以解決或者減小該問(wèn)題。
在許多情況下，低或不穩(wěn)定的回收率被接受，其他情況下通過(guò)添加如下物質(zhì)可消除這個(gè)問(wèn)題，比如離子型或非離子型表面活性劑，鹽類(lèi)，消/去泡劑，醇類(lèi)，目標(biāo)酶的底物或其類(lèi)似物。
在許多情況下這些技術(shù)是低效的，其他情況下，采取了復(fù)雜的步驟(如液-液分離系統(tǒng))，這需要添加大量的(可能不只一種的)試劑。
在脂肪酶類(lèi)的回收上可以找到這樣的一些例子，脂肪酶很容易附著在發(fā)酵液中的固形物和/或在回收中可能用到的助濾劑上。
WO 97/23604描述了一種從發(fā)酵液中回收脂肪酶的方法。
所述方法的必要步驟包括非離子表面活性劑和醇的使用，這樣得到的終產(chǎn)物含有微生物蛋白(優(yōu)選脂肪酶)，所述非離子表面活性劑和所述醇。參見(jiàn)WO 97/23604的權(quán)利要求1。
EP 0574050A1描述了一種方法，用于從發(fā)酵液中回收疏水性產(chǎn)物，優(yōu)選脂解酶(參見(jiàn)第3欄，47-50行)。該方法的必要步驟包括非離子表面活性劑和鹽的一同使用。參見(jiàn)例如權(quán)利要求1。
生物技術(shù)雜志(Journal of biotechnology)，26(1992)111-142是一篇綜述性文章，文章記述了關(guān)于脂肪酶不同純化策略的現(xiàn)有技術(shù)。在129頁(yè)提到脂肪酶的純化通常受其溶解性問(wèn)題的阻礙。該文章總結(jié)了現(xiàn)有技術(shù)對(duì)此問(wèn)題的解決方案，其中包含著非常復(fù)雜的純化策略，比如液-液提取，雙水相提取，特異性膜加工和免疫純化。
對(duì)于在回收發(fā)酵液前蛋白質(zhì)出現(xiàn)沉淀或結(jié)晶，至今沒(méi)有真正有效的方法。通常嘗試使用大量的助溶劑(如尿素)。其他例子中采取了固-固分離技術(shù)，其中該沉淀或結(jié)晶的目標(biāo)蛋白與發(fā)酵液中其他固體分離—這些分離經(jīng)常是不可能的并且總是復(fù)雜的。
發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的方法，用于從培養(yǎng)液中回收糖苷酶或者肽酶，其中顯著量的目標(biāo)糖苷酶或肽酶在培養(yǎng)液中不是處于溶解狀態(tài)。
發(fā)明人的解決方案是培養(yǎng)液中所含顯著量的目標(biāo)糖苷酶或肽酶因pH在7.5而沒(méi)有處于溶解狀態(tài)時(shí)，通過(guò)使用極端pH條件，即pH9.5～13，目標(biāo)蛋白可以得到有效的回收。
因此，本發(fā)明涉及從培養(yǎng)溶液回收目標(biāo)糖苷酶或肽酶的方法，該培養(yǎng)溶液含有可產(chǎn)生目標(biāo)糖苷酶或肽酶的細(xì)胞，并且在pH7.5下，其中少于80％的目標(biāo)糖苷酶或肽酶在該培養(yǎng)溶液中處于溶解狀態(tài)，該方法包括a)通過(guò)調(diào)節(jié)該培養(yǎng)液的pH到9.5～13，使目標(biāo)糖苷酶或肽酶溶解；并且b)將細(xì)胞與溶解了的產(chǎn)物相分離，得到含有目標(biāo)糖苷酶或肽酶的溶液。
所述“培養(yǎng)液”在此指包含目標(biāo)蛋白和產(chǎn)生該目標(biāo)蛋白的細(xì)胞的溶液。該培養(yǎng)液可能含有其他任何成分，尤其是通常被用于細(xì)胞發(fā)酵的成分。按照本發(fā)明，培養(yǎng)液將優(yōu)先指發(fā)酵培養(yǎng)液。
所述“培養(yǎng)液在pH7.5下，其中少于80％的目標(biāo)糖苷酶或肽酶處于溶解狀態(tài)”指本文要解決的主要問(wèn)題，即當(dāng)顯著量的目標(biāo)蛋白為不溶狀態(tài)時(shí)回收該目標(biāo)蛋白。
“培養(yǎng)液”是否符合此標(biāo)準(zhǔn)可由如下事實(shí)確定，培養(yǎng)液的上清液中目標(biāo)蛋白濃度低于該培養(yǎng)溶液中目標(biāo)蛋白總濃度的80％。上清液是水相培養(yǎng)液，可通過(guò)例如，在足以去除細(xì)胞的條件下離心而得到。
所述濃度指每一升中蛋白的量(干重)(如g/L)，或者是每一升中的蛋白活性。
所述“在pH7.5下”在此指上清液從pH7.5的培養(yǎng)溶液中分離(優(yōu)選離心)得到。
上清液和培養(yǎng)液中的目標(biāo)蛋白濃度可以隨后在此pH7.5或另一pH下測(cè)定。
這取決于目標(biāo)蛋白和培養(yǎng)液的特性，可以由技術(shù)人員的常識(shí)決定(可參見(jiàn)下面對(duì)此的進(jìn)一步討論)。
可以選擇另一種表示為“培養(yǎng)液”符合本文標(biāo)準(zhǔn)的前提是Prot.Conc.sup./Prot.Conc.Cul-sol×100＜80，pH7.5；其中Prot.Conc.sup.是培養(yǎng)液的上清液中目標(biāo)蛋白濃度。
Prot.Conc.Cul-sol是該培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白總濃度。
優(yōu)選地，上清液中該目標(biāo)蛋白的濃度在該培養(yǎng)液蛋白濃度中所占比率低于70％；更優(yōu)選地低于55％，甚至40％；最優(yōu)選地低于25％。
測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度的實(shí)際方法遵循在本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，并依目標(biāo)蛋白的特性而做調(diào)整。
當(dāng)測(cè)定該培養(yǎng)液中酶的濃度時(shí)，所用方法當(dāng)然應(yīng)該在檢測(cè)培養(yǎng)液中的目標(biāo)蛋白濃度前使目標(biāo)蛋白的不溶部分溶解。
有許多這樣的為本領(lǐng)域所熟知的方法，例如疏水蛋白或沉淀蛋白的提取方法，該方法包括進(jìn)行高倍稀釋添加去污劑，尿素等。
依據(jù)上面列出的標(biāo)準(zhǔn)挑選特定的方法是技術(shù)人員的常識(shí)。
應(yīng)在此提起注意的是，公開(kāi)在WO 97/20921中的培養(yǎng)液沒(méi)有一種符合這些標(biāo)準(zhǔn)，這是由于該公開(kāi)文本中沒(méi)有回收不溶狀態(tài)下蛋白的方法。
因此，公開(kāi)在WO 97/20921中的所有特定培養(yǎng)液的上清液中，目標(biāo)蛋白濃度都高于該培養(yǎng)液中蛋白總濃度的80％。
正如在此描述的，本方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是調(diào)節(jié)pH到9.5～13可直接引起目標(biāo)蛋白的溶解。
因此，通過(guò)簡(jiǎn)單的離心分離可以沉積固形物(例如細(xì)胞)，回收上清液，這樣就可以將固形物與目標(biāo)蛋白分離。在此描述的方法不用添加化合物，如離子型/非離子型表面活性劑，鹽類(lèi)，消/去泡劑，特定的醇類(lèi)，而這些都是在WO97/23604和EP 0574050A1中所提方法的必要步驟。
而且，正如本發(fā)明實(shí)施例1中說(shuō)明的，此方法可以獲得很高的目標(biāo)蛋白終產(chǎn)率。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下所述。
發(fā)明詳述在含有可以產(chǎn)生糖苷酶或肽酶的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，其中多于20％的目標(biāo)蛋白，在pH7.5下，在該培養(yǎng)液中不是處于溶解狀態(tài)(不溶狀態(tài))。
正如在上面背景部分描述的，培養(yǎng)液中的目標(biāo)蛋白不是處于溶解狀態(tài)是由于，比如目標(biāo)蛋白與沉積物中的成分相結(jié)合，和/或是由于在從培養(yǎng)液中收集前顯著量的目標(biāo)蛋白已經(jīng)沉淀或結(jié)晶。
目標(biāo)蛋白與沉積物的結(jié)合是指蛋白結(jié)合在培養(yǎng)液中的固形物上，如細(xì)胞類(lèi)的固形物，或溶液中的其他固體物質(zhì)。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中涉及，一種方法，其中有多于20％的在pH7.5下在該培養(yǎng)液中處于不溶狀態(tài)的目標(biāo)蛋白是與培養(yǎng)液中固形物相結(jié)合的目標(biāo)蛋白，結(jié)合的固形物可以是細(xì)胞類(lèi)的固形物或者培養(yǎng)液中其他固體物質(zhì)；或一種方法，其中多于20％的在pH7.5培養(yǎng)液中處于不溶狀態(tài)的目標(biāo)蛋白是在該培養(yǎng)液中沉淀或結(jié)晶的目標(biāo)蛋白。
培養(yǎng)液通常由分批發(fā)酵中得到。
具體的發(fā)酵如何進(jìn)行對(duì)本發(fā)明的回收方法而言相對(duì)不重要。
因此，發(fā)酵時(shí)間，pH或其他具體發(fā)酵條件可以按照為本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。優(yōu)選地，應(yīng)調(diào)整發(fā)酵條件以獲得最大的目標(biāo)蛋白產(chǎn)率。
此外，該培養(yǎng)液可以是一種培養(yǎng)液的離心分離(離心)的級(jí)分。
所述“培養(yǎng)液的離心分離級(jí)分”指培養(yǎng)液被離心分離下來(lái)的部分，比如細(xì)胞，不溶物質(zhì)，不溶的發(fā)酵產(chǎn)物。不溶的發(fā)酵產(chǎn)物可能包括沒(méi)溶解的目標(biāo)蛋白。
因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中涉及到本發(fā)明的一種方法，其中的培養(yǎng)液是培養(yǎng)液的離心分離下來(lái)的部分。
在依照本文所述方法回收目標(biāo)蛋白前，所述培養(yǎng)液的離心分離級(jí)分可以懸浮或稀釋在水性溶液，如水中。可以依據(jù)技術(shù)人員常識(shí)進(jìn)行上述懸浮或稀釋。
此外，為技術(shù)人員所熟知的任何利于不溶蛋白溶解的其他試劑或組分都可以加入到培養(yǎng)液中。這些組分可以是那些能阻止目標(biāo)蛋白的沉淀或結(jié)晶的成分。
這樣的成分的例子有，鹽類(lèi)，鈣，多元醇，去污劑，除泡劑，消泡劑，或目標(biāo)蛋白的底物類(lèi)似物/抑制劑?？蓞⒖糤O 97/23604，EP 0574050A1或生物技術(shù)雜志，26(1992)，其中有這些適合成分的描述。
此外，這里所指的培養(yǎng)液優(yōu)選含有化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的溶液。參見(jiàn)WO 98/37179中對(duì)這樣的基本由化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)液的進(jìn)一步描述。
pH的調(diào)整可以使用技術(shù)人員所熟知的任何合適策略進(jìn)行培養(yǎng)液pH的調(diào)整。
如可以使用任何合適的堿進(jìn)行pH調(diào)整。優(yōu)選的堿有氫氧化鈉，氫氧化鉀和氫氧化銨，尤其是氫氧化鈉。
優(yōu)選地，依照本發(fā)明的步驟a)，培養(yǎng)液pH被調(diào)整到9.75～13；更優(yōu)選地到pH10～13；進(jìn)一步優(yōu)選地到pH10.25～13；最優(yōu)選地pH到10.5～13。
如上所述，培養(yǎng)液可以是從分批發(fā)酵中獲得的。
因此，pH可以在發(fā)酵過(guò)程中已經(jīng)作出調(diào)整，從而使這批發(fā)酵液具有本發(fā)明步驟a)設(shè)定的pH值。何時(shí)以及如何進(jìn)行pH的調(diào)整在此描述的方法中并不重要。重要的是培養(yǎng)液的pH在所述范圍內(nèi)。
回收期間如本發(fā)明所述進(jìn)行了調(diào)整的pH應(yīng)優(yōu)選維持一段時(shí)間，這取決于目標(biāo)蛋白的特性，特別是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
這也就是說(shuō)，如果目標(biāo)蛋白在高pH下相對(duì)不穩(wěn)定，應(yīng)依照此處的描述優(yōu)先調(diào)整pH使蛋白溶解；再依照本發(fā)明的第一部分b)項(xiàng)較快地回收已溶解的蛋白；接著馬上調(diào)節(jié)pH到一個(gè)蛋白質(zhì)可以較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的值，或者可以選擇首先調(diào)整到高pH值，接著在分離前在蛋白溶解后馬上調(diào)整pH到較低值。
相反地，如果目標(biāo)蛋白在高pH相對(duì)較為穩(wěn)定，依照本發(fā)明第一部分條款a)的描述調(diào)整了的pH可以維持相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間。
如何根據(jù)要回收的目標(biāo)蛋白的特性優(yōu)化維持此調(diào)整后pH的時(shí)間長(zhǎng)短是技術(shù)人員的常識(shí)。
此外，在此要解決的主要問(wèn)題，即要對(duì)顯著量處于不溶狀態(tài)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行回收時(shí)，如果目標(biāo)蛋白的表達(dá)產(chǎn)量相對(duì)較高尤為突出。
所以，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中優(yōu)選培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白的表達(dá)量至少達(dá)到2g蛋白(干重)/kg培養(yǎng)基；優(yōu)選至少3g蛋白(干重)/kg培養(yǎng)基；更優(yōu)選至少5g蛋白(干重)/kg培養(yǎng)基；最優(yōu)選至少10g蛋白(干重)/kg培養(yǎng)基。
能夠生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞能夠生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞原則上可以是任何細(xì)胞，比如微生物細(xì)胞，植物細(xì)胞或者動(dòng)物細(xì)胞。
這里優(yōu)先指微生物細(xì)胞，特別是細(xì)菌或真菌細(xì)胞。本發(fā)明特別適合于細(xì)菌細(xì)胞。
細(xì)菌細(xì)胞優(yōu)先指芽孢桿菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞優(yōu)先指絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬或鐮刀菌屬的絲狀真菌細(xì)胞。
絮凝劑的使用優(yōu)選地，在本發(fā)明的步驟a)中的培養(yǎng)液可以進(jìn)一步用一種或多種絮凝劑處理。
在實(shí)際的pH調(diào)整之前，期間或之后，可以在培養(yǎng)液和/或發(fā)酵液/發(fā)酵培養(yǎng)基中加入絮凝劑。
絮凝劑為本領(lǐng)域所熟知，均特別用于提供一種蛋白質(zhì)溶液(例如在此所指的含有能產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)液)，此溶液特別適于離心，過(guò)濾，或膜濃縮/過(guò)濾，使所述蛋白的流通量和蛋白質(zhì)純度都得以提高。
優(yōu)選地，絮凝劑是可溶性的鐵和/或鋁化合物。
這些作為絮凝劑的可溶性的鐵和/或鋁化合物的使用由WO 96/38469得知。
然而，在WO 96/38469公開(kāi)內(nèi)容的第7頁(yè)，第13-14行，寫(xiě)著“保持發(fā)酵液pH4～9之間是重要的”。
因此，WO 96/38469的公開(kāi)內(nèi)容描述了一種培養(yǎng)液，其必要條件是pH在4～9之間，這樣的pH范圍超出了本發(fā)明中回收方法的pH范圍。
優(yōu)選地，以每升培養(yǎng)液0.02mol～1.2mol鋁/鐵化合物處理培養(yǎng)液，更優(yōu)選地，用每升培養(yǎng)液0.04mol～1.0mol鋁/鐵化合物處理培養(yǎng)液。
依照本發(fā)明任何可溶性鐵或鋁的化合物或它們的任何混合物均可使用，例如Al2(SO4)3，NaAlO2，K2Al2O4，Al(NO3)3，AlCl3，醋酸鋁，甲酸鋁，F(xiàn)e2(SO4)3，甲酸鐵，醋酸鐵，甲酸亞鐵，和醋酸亞鐵。
優(yōu)選的化合物是氯化氫氧化鋁(aluminiumhydroxychloride)聚合物(例如從Boliden得到的EKOFLOCK)，水合氯化鋁聚合物(來(lái)自Calgon公司)，或NaAlO2。
穩(wěn)定劑依照本發(fā)明在某些情況下優(yōu)選加入穩(wěn)定劑(這樣目標(biāo)蛋白能提高對(duì)高pH值的耐受性)或加入蛋白酶抑制劑(這樣目標(biāo)蛋白不會(huì)降解)。可以使用的蛋白酶抑制劑可以是硼酸或boronic acid，特別是在WO 96/41859中描述的4-甲酰基-苯基-boronic acid。
將細(xì)胞與溶解的產(chǎn)物分離并得到含目標(biāo)蛋白的溶液依照本發(fā)明步驟b)的分離可參照任一已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。
這樣的方法可能是一種或多種固/液分離技術(shù)，例如離心，過(guò)濾，或微濾。
目標(biāo)蛋白本發(fā)明的方法可用于回收任何目標(biāo)蛋白。
優(yōu)選地，目標(biāo)蛋白是一種酶，特別是糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)；(EC-編號(hào)依照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)命名委員會(huì)推薦的酶命名法(1992))。特別優(yōu)選的酶選自淀粉酶(特別是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))，纖維素酶(EC3.2.1.4)，乳糖酶(EC3.2.1.108)，木葡聚糖酶，甘露聚糖酶(mannanase)(EC3.2.1.25)和蛋白酶；特別選自淀粉酶，甘露聚糖酶和蛋白酶。此組優(yōu)選酶在回收中經(jīng)常由于沉淀和/或結(jié)晶而出現(xiàn)問(wèn)題。
尤其優(yōu)選目標(biāo)蛋白質(zhì)(優(yōu)選目標(biāo)酶)通過(guò)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)工程變體。
這是由于在回收這些變體時(shí)能多次出現(xiàn)意想不到問(wèn)題，比如沉淀或結(jié)晶。
這些蛋白質(zhì)工程變體可以是，例如蛋白酶或淀粉酶的變體，特別是提高了疏水性和/或降低了在培養(yǎng)液中的溶解性的變體。
優(yōu)選地，目標(biāo)蛋白應(yīng)該是在5攝氏度，pH9.5下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白；更優(yōu)選地，應(yīng)在5攝氏度，pH10.0下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白；最優(yōu)選地，應(yīng)在5攝氏度，pH11下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白。
實(shí)施例1對(duì)WO96/23873所述α-淀粉酶變體進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
發(fā)酵后，在顯微鏡(400×)下可以看到培養(yǎng)液中有酶結(jié)晶。
培養(yǎng)液中α-淀粉酶活性經(jīng)測(cè)定為100％。
培養(yǎng)液在pH7.5下離心。
離心后，上清液中α-淀粉酶活性為20.4％。
溶解的/(溶解的＋不溶的)的關(guān)系式因此是(參見(jiàn)第4頁(yè))(Prot.Conc.sup./Prot.Conc.Cul-sol)*100＜80)＝20.4％/100％*100＝20.4，(遠(yuǎn)低于80的限度)。
絮凝如下的化學(xué)劑添加到(在攪拌狀況下)兩個(gè)各100g的培養(yǎng)樣品中200％水；1％CaCl2·2H2O；0.2％NaAlO2；0.3％Superfloc C 521和0.3％Superfloc A130。在添加這些化學(xué)物質(zhì)時(shí)，一個(gè)樣品保持pH7.5，第二個(gè)保持在pH10.5-pH在7.5/10.5保持10分鐘；溫度為室溫(接近20℃)。
接著兩個(gè)樣品進(jìn)行離心，測(cè)定上清部分中α-淀粉酶的活性產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)1(pH7.5)產(chǎn)率＝45％實(shí)驗(yàn)2(pH10.5)產(chǎn)率＝80％上述實(shí)驗(yàn)清楚地表明對(duì)樣品的堿性處理可以顯著提高產(chǎn)物產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種從培養(yǎng)液中回收糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)的方法，該培養(yǎng)液中含有能產(chǎn)生糖苷酶或肽酶的細(xì)胞，并且其中不到80％的糖苷酶或肽酶在pH7.5的該培養(yǎng)液中處于溶解狀態(tài)，所述方法包括a)通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)液的pH到9.5～13，使目標(biāo)糖苷酶或肽酶溶解；b)將細(xì)胞與溶解態(tài)的所述糖苷酶或肽酶分離，得到含有所述糖苷酶或肽酶的溶液。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中在pH7.5的該培養(yǎng)液中不處于溶解狀態(tài)的所述糖苷酶或肽酶結(jié)合在該培養(yǎng)液中的固形物如細(xì)胞類(lèi)固形物或者溶液中的其它固體成分上。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中在pH7.5的該培養(yǎng)液中不處于溶解狀態(tài)的目標(biāo)糖苷酶或者肽酶在該培養(yǎng)液中沉淀和/或結(jié)晶。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)液的pH被調(diào)節(jié)到9.75～13；更優(yōu)選地，pH被調(diào)節(jié)到10～13；更進(jìn)一步優(yōu)選的，pH被調(diào)節(jié)到10.25～13；最優(yōu)選地，pH被調(diào)節(jié)到10.5～13。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求1的步驟a)中的所述培養(yǎng)液在pH調(diào)整之前，期間，或之后進(jìn)一步用一種或多種絮凝劑處理。
6.權(quán)利要求5中的方法，其中絮凝劑是可溶性的鐵和/或鋁化合物，特別是氯化氫氧化鋁的聚合物，水合氯化鋁聚合物，或NaAlO2。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖苷酶或肽酶是蛋白質(zhì)工程變體。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖苷酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。
9.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的方法，其中所述肽酶是蛋白酶。
10.權(quán)利要求1中的方法，其中步驟b)中培養(yǎng)液的pH在分離前被調(diào)節(jié)到更低。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從培養(yǎng)液中回收糖苷酶或者肽酶的方法,所述酶在該培養(yǎng)液中是從不溶狀態(tài)到溶解狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12N9/50GK1337999SQ00803065
公開(kāi)日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2000年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月25日
發(fā)明者梅斯·A·勞斯特森, 柯倫·M·辛普森, 邁克爾·J·奧雷利 申請(qǐng)人:諾維信公司