專利名稱：基于重組豬腺病毒的病毒載體和病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過插入異源核苷酸序列重組的血清型3和血清型5豬腺病毒，這些腺病毒能在體內(nèi)自主復(fù)制，并能表達(dá)這些異源序列。本發(fā)明還涉及獲得的豬疫苗，用它們免疫豬的方法，缺失的復(fù)制型腺病毒載體，及獲得這些腺病毒、疫苗和載體的方法。
本說明書中引用的文件以及在這些文件中引用的文件在此引用作為參考。
腺病毒是含有線性雙鏈DNA分子的病毒，在每一末端均含有翻轉(zhuǎn)的末端重復(fù)序列。腺病毒是腺病毒科家族的一部分，其引起可侵襲大量物種如猿、牛、綿羊、豬、馬、鼠、犬和鳥種屬的疾病。根據(jù)物種和腺病毒類型，腺病毒感染的特征可能是腦炎、肺炎、腎臟損傷、腹瀉和肝炎的病征。
腺病毒基因組可因物種而不同[(T.Adrian等人，病毒學(xué)學(xué)報(bào)(Arch.Virol.)1986，91，277-290)，(J.Hamelin等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)1988，26，31-33)，(R.Assaf等人，加拿大比較醫(yī)學(xué)雜志(Can.J.Comp.Med.)1983，47，460-463)，(T.Kurokawa等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)1978，28，212-218)，(S.-L.Hu等人，病毒學(xué)雜志，1984，51，880-883)，(L.Zsak等人，Intervirology 1984，22，110-114)]。不同于人腺病毒，動(dòng)物腺病毒具有非常有限的宿主譜，它們通常只感染屬于其起源物種的動(dòng)物。
在1964年第一次分離了豬腺病毒(或PAV)(D.Haig等人，比較病理學(xué)雜志(J.Comp.Pathol.)1964，74，81-84)。自從那天起，已經(jīng)鑒定并描述了5種豬腺病毒血清型(Hirahara等人，獸醫(yī)學(xué)雜志(J.Vet.Sci.)1990，52，407-409)。血清型1和血清型2腺病毒與腹瀉有關(guān)；血清型4腺病毒與肺炎和腦炎癥狀有關(guān)。已根據(jù)不存在與血清型1至血清型4 PAV特異抗血清的交叉中和，將一些豬腺病毒歸類為第5種血清型。已分析了PAV-5基因組，并已建立了限制酶切圖譜(Tuboly等人，病毒研究(Virus Res.)1995，37，49-54)。這一分析表明了在PAV-5與其他血清型的PAV的限制酶切圖譜之間不存在相似性PAV-1和PAV-2(Reddy等人，病毒學(xué)學(xué)報(bào)1995，140，195-200)，PAV-3(Reddy等人，Intervirology 1993，36，161-168)和PAV-4(Kleiboeker等人，病毒學(xué)學(xué)報(bào)1993，133，357-368)。在血清型3與5之間，存在對豬而言天然不致病的菌株。
PAV具有約32-34kbp大小的基因組。PAV-1的基因組約33.5kbp大小。PAV-2基因組約33.3kbp大小。PAV-3病毒的完整序列最近已經(jīng)確定，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中申請為AF083132(P.S.Reddy等人，病毒學(xué)(Virol.)1998，251，414-426)；其大小為34094堿基對(bp)。PAV-4的基因組約32kbp大小，PAV-5基因組約33.2kbp大小。PAV-5的完整基因組，特別是E3區(qū)，尚未測序或公布。
為腺病毒設(shè)想的主要用途在人類基因治療領(lǐng)域，并計(jì)劃了大量構(gòu)建體和系統(tǒng)。也提出腺病毒作為保護(hù)人類和動(dòng)物免于感染多種致病病毒的免疫組合物的重組載體。
迄今為止已發(fā)展了用于構(gòu)建重組腺病毒載體的兩種策略(M.Eloit和M.Adam，普通病毒學(xué)雜志1995，76，1583-1589)。
第一種策略包括向腺病毒復(fù)制所必需的區(qū)域中插入表達(dá)盒，因此需要發(fā)展反式互補(bǔ)系統(tǒng)，同時(shí)也能確保病毒的復(fù)制。對于豬腺病毒，已提出E1區(qū)作為插入位點(diǎn)(P.S.Reddy等人，病毒研究1998，58，97-106)。這樣構(gòu)建的重組載體被稱為“非復(fù)制型的”，因?yàn)樗鼈儾荒茉谒┯玫乃拗髦袕?fù)制。
作為第一種策略的變化，能使用一種在目標(biāo)動(dòng)物中不能復(fù)制的病毒。特別是已經(jīng)將PRV gD表達(dá)盒插入血清型5人腺病毒的E1A位點(diǎn)中，該病毒在豬中不能復(fù)制(M.Monteil等人，普通病毒學(xué)雜志1997，78，3303-3310；A.Ambriovic等人，病毒學(xué)1997，238，327-335)。
第二種策略包括向?qū)ο俨《緩?fù)制不是必需的病毒基因組區(qū)域中插入表達(dá)盒。確定腺病毒中非必需區(qū)域的困難及堅(jiān)硬衣殼的存在使第二種策略難以實(shí)施。
特別地，腺病毒重要特征之一是，它們具有堅(jiān)硬的衣殼，這嚴(yán)格限制了可包裹于其中的DNA分子的大小。通常認(rèn)為能包裹相當(dāng)于基因組大小105％-114％的DNA分子，根據(jù)基因組大小，其對應(yīng)于約1.7-3.9kbp的插入片段。如果過大，在重組基因組中可能會(huì)發(fā)生不希望的缺失和/或重排。
在一種特定種的腺病毒與另一種的腺病毒之間，或在不同血清型的豬腺病毒之間，E3區(qū)在大小與遺傳組構(gòu)方面都不保守(S.Kleiboeker，病毒研究1994，31，17-25)。
PAV-3病毒的E3區(qū)大小為1179堿基對。它是一種編碼至少3個(gè)開放閱讀框(ORF)的復(fù)雜區(qū)域。這些ORF彼此重疊，第一個(gè)ORF也與編碼一種必需蛋白質(zhì)——pVIII蛋白的基因部分重疊(P.S.Reddy等人，病毒研究1995，36，97-106)。
在E3區(qū)中存在這些重疊ORF代表了為使重組腺病毒在豬中仍可復(fù)制而確定插入位點(diǎn)和/或缺失限制中的一個(gè)主要困難。
E3區(qū)的第二個(gè)ORF所編碼的氨基酸序列顯示，PAV-3腺病毒與HAV-2腺病毒(它是血清型2人腺病毒)，或與當(dāng)前所知的其他任何腺病毒蛋白之間均無同源性(P.S.Reddy等人，病毒研究1995,36,97-106)。根據(jù)PAV-3 E3區(qū)的第一種ORF的核苷酸序列預(yù)測的氨基酸序列與血清型2犬腺病毒(CAV-2)只有33.3％同一性。不僅是多種腺病毒4的E3區(qū)編碼的蛋白質(zhì)不同源，另外，E3區(qū)的ORF編碼的蛋白質(zhì)在PAV-3與PAV-4腺病毒之間也不顯示同源性(S.B.Kleiboeker，病毒研究1994，31，17-25)。
E3區(qū)在PAV-1中大小為1162bp(有5個(gè)ORF)；在PAV-2中為1222bp(有5個(gè)ORF)(P.S.Reddy等人，病毒研究1996，43，99-109)，而在PAV-4中為1879bp(有6個(gè)ORF)。只有PAV-4病毒E3區(qū)的第四個(gè)ORF(對應(yīng)于13.2kDa蛋白質(zhì))才與E3區(qū)的另一種已知ORF——編碼5型人腺病毒(稱作人腺病毒5或HAV-5)的14.7kDa蛋白質(zhì)——顯示同源性。PAV-4的E3區(qū)與其他豬腺病毒特別是PAV-3和PAV-5的E3區(qū)不顯示序列同源性。
除了限定保持體內(nèi)復(fù)制性質(zhì)的限制的困難外，E3區(qū)的缺失也不是沒有危險(xiǎn)。E3區(qū)的缺失實(shí)際上可能對重組腺病毒的致病性具有影響。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HAV-5病毒E3區(qū)的缺失提高了該病毒在棉鼠感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械姆尾恐虏⌒?Ginsberg等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1989，86，3823-3827)。
這表明，腺病毒E3區(qū)中缺失的后果必須逐情考慮，而不只是將一種特定腺病毒的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移給另一個(gè)。PAV-3的E3區(qū)的遺傳組構(gòu)是獨(dú)特的，PAV-5的E3區(qū)同樣如此。
由于存在復(fù)雜剪接帶和聚腺苷酸化帶的事實(shí)，E3區(qū)中插入位點(diǎn)的精確定位更加復(fù)雜，這些帶是腺病毒所特有的(Imperiale等人，微生物免疫學(xué)現(xiàn)代主題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)1995，199，139-171)。位于E3區(qū)中的剪接帶對于位于E3區(qū)外的序列所編碼的多種必需信使RNA的成熟是重要的。E3區(qū)本身位于顯示高轉(zhuǎn)錄活性的病毒基因組的一部分(P.S.harp，1984，《腺病毒》，H.S.Ginsberg編，Plenun出版社，紐約和倫敦，173-204)；異源核苷酸序列向E3區(qū)的插入可能對重組病毒的生物活性有負(fù)面影響。另外，E3區(qū)也位于主要晚期啟動(dòng)子(MLP)下游，它是已經(jīng)證明了插入片段轉(zhuǎn)錄與MLP啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄之間具有干擾的區(qū)域(Xu等人，普通病毒學(xué)雜志1995，76，1971-1980)。
因此不能將用來源于其他物種(人、牛、綿羊等)的腺病毒獲得的結(jié)果用于豬腺病毒。迄今為止尚未由豬腺病毒生產(chǎn)復(fù)制型重組載體。
申請公司的目的在于，能向PAV-3和PAV-5病毒基因組中插入異源基因，而不明顯改變其在體內(nèi)復(fù)制的能力。
本發(fā)明的另一目的在于提供能被刪除但復(fù)制能力不容懷疑的插入?yún)^(qū)，以提高向病毒中插入的能力。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的在于提供保留體內(nèi)復(fù)制能力的重組PAV-3和PAV-5病毒，使其能用作活重組疫苗，包括粘膜施用和/或在母體來源的抗體存在下施用的疫苗。
申請公司已成功地修飾了PAV-3和PAV-5的E3區(qū)，而同時(shí)保留體內(nèi)復(fù)制能力。也能夠證明插入該區(qū)域的基因的體內(nèi)表達(dá)。因此，使PAV-3和PAV-5能用作復(fù)制型表達(dá)載體。
因此本發(fā)明的一個(gè)主題是血清型3或5豬腺病毒，其至少含有一種插入PAV-3或PAV-5基因組的異源核苷酸序列，插入條件是能使獲得的重組病毒在豬中體內(nèi)復(fù)制，并表達(dá)該插入序列。這些修飾病毒在接種方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢，特別是，它們甚至在母體抗體存在下仍是有效的，因而能有效地粘膜使用。
優(yōu)選地，將異源序列插入基因組的非必需帶特別是E3帶中，該插入帶含有缺失。表述“帶的缺失”是指插入帶的全部或部分、優(yōu)選地全部缺失。換句話說，插入異源序列代替插入帶的全部或部分，優(yōu)選地代替該帶的全部。
對于PAV-3，向E3中插入的優(yōu)選帶是含有P.S.Reddy等人，病毒研究1995，36-97-106所公布序列的核苷酸706-1624的全部或部分的帶，其對應(yīng)于GenBank AN#U10433中公布的序列的位點(diǎn)27794-28712。換句話說，該插入帶及其可能的缺失可含有序列706-1624的全部或只是部分，和/域能在E3中延伸到限度706和/或限度1624之外，并能任選地含有完整的E3。優(yōu)選地，該帶含有E3、核苷酸706-1624、核苷酸1002-1624，或序列706-1002的全部或部分。特別是，至少含有序列1002-1624。
對于PAV-5，E3由SEQ ID No.5中的核苷酸序列2382-4042所限定。插入帶及其可能的缺失包括E3，并含有SEQ ID No.5的核苷酸2064-4083的全部或部分，例如核苷酸2389-3861的全部或部分(


圖13)。換句話說，該插入帶及其可能的缺失可能只含有序列2389-3861的部分，和/域能在E3中延伸到限度2389和/或限度3861之外，并能任選地含有完整E3。當(dāng)進(jìn)行缺失可達(dá)包含的核苷酸4083時(shí)，優(yōu)選地插入剪接受體位點(diǎn)代替核苷酸4083。優(yōu)選地，該插入帶主要由核苷酸2389-3861組成。
不用說，本發(fā)明也涵蓋向PAV-3和PAV-5其他菌株的核苷酸序列所限定的相應(yīng)區(qū)帶中的插入，其序列不同于根據(jù)本發(fā)明的參照菌株的序列。
本發(fā)明的一個(gè)主題是PAV-3或PAV-5病毒，其就大小而言具有較高的插入能力，而同時(shí)仍能在豬中體內(nèi)復(fù)制。保持在宿主中的復(fù)制性質(zhì)對于獲得最佳保護(hù)效果是需要的，特別是粘膜使用和/或在母體來源抗體存在下使用免疫組合物。
利用如E3區(qū)全部或部分的缺失實(shí)現(xiàn)插入能力的提高，可缺失的E3部分位于編碼pVIII蛋白的基因和編碼尾絲的基因之間。特別是，本發(fā)明描述了可在PAV-3病毒E3區(qū)中進(jìn)行的622bp和919bp的缺失，而同時(shí)保留重組病毒的復(fù)制性質(zhì)(見實(shí)施例6-10)。本發(fā)明還描述了PAV-5病毒E3區(qū)中1472bp的缺失，產(chǎn)生重組病毒的相同表型特征(見實(shí)施例14-17)。
根據(jù)本發(fā)明獲得的重組PAV-3或PAV-5腺病毒，對于PAV-3病毒可有利地用于插入最大約3.0kbp，對于PAV-5約3.5kbp，并在豬中表達(dá)。
因此本發(fā)明的一個(gè)主題也是尤其在E3區(qū)中缺失、而同時(shí)仍能復(fù)制的PAV-3和PAV-5載體，特別是在上述區(qū)帶中缺失，即缺失所述區(qū)帶的全部或部分，優(yōu)選地該區(qū)帶的全部。
可以插入的異源核苷酸序列是編碼免疫原或免疫原的免疫活性片段如表位的序列，特別是編碼豬病原體免疫原的基因或基因片段(例如表位)。
在本發(fā)明上下文中，當(dāng)然能向同一病毒中插入一種以上的異源序列。特別是，可向其中插入來源于同一病毒或不同病毒的異源序列。
根據(jù)一種特殊方法，能插入組合了來源于相同病原體或不同病原體的幾種片段或表位的人工序列，其被稱為“多表位序列”。在后一情況中，多表位序列位于一個(gè)啟動(dòng)子控制下。
也能插入編碼免疫調(diào)節(jié)劑的序列，特別是細(xì)胞因子，優(yōu)選地豬細(xì)胞因子，如豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(poGM-CSF)、豬白細(xì)胞介素4(poIL-4)、豬IL-12或豬IL-18。
通過插入特別是來源于小核糖核酸病毒如豬水泡病毒(SVDV；B.-F.Chen等人，病毒學(xué)雜志1993，67，2142-2148)、腦心肌炎病毒(EMCV；R.J.Kaufman等人，核酸研究，1991，19，4485-4490)或口蹄疫病毒(FMDV；N.Luz和E.Beck，病毒學(xué)雜志，1991，65，6486-6494)或其他來源的被稱為“IRES”(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))的序列，也能表達(dá)插入插入座位中的幾種異源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照所引用的3篇文章的內(nèi)容。兩種基因的表達(dá)盒因而具有下列最小結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子(任選的)-基因1-IRES-基因2-聚腺苷酸化信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的重組活疫苗因此可含有插入插入座位中的一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒連續(xù)包含啟動(dòng)子，由IRES成對分隔的兩種或多種基因，和聚腺苷酸化信號(hào)。
豬病原體是病毒、細(xì)菌和寄生蟲，特別是選自奧爾斯基病病毒(PRV或偽狂犬病病毒)、豬流感病毒(SIV)、豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRS病毒)、parvovirosis病毒(PPV病毒)、豬霍亂病毒(HCV)、豬環(huán)病毒(circovirus)，特別是2型豬環(huán)病毒(豬環(huán)病毒2型、PCV2或小豬系統(tǒng)性消耗性綜合征病毒)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)和豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)。
至于奧爾斯基效價(jià)，能以其天然或分泌形式使用gB基因(RobbinsA.K.等人，病毒學(xué)雜志1987，61，2691-2701 GenBank AN#M17321)、gC基因(Ishikawa K.人，獸醫(yī)微生物學(xué)(Vet.Microbiol.)1996，49，267-272 GenBank AN#D49435)和/或gD基因(Riviere M.等人，病毒學(xué)雜志1992，66，3424-3434，和Hong W.Z.等人，GenBank AN#AF086702)。
至于豬流感效價(jià)，優(yōu)選地使用HA基因(WO-A-98/03658，實(shí)施例10和12)(天然或分泌形式)、NA基因(Nerome K.等人，普通病毒學(xué)雜志1995，76，613-624 GenBank AN#D21194)(天然或分泌形式)和/或NP基因(WO-A-98/03658，實(shí)施例11和13)。
至于PRRS效價(jià)，優(yōu)選地使用來源于歐洲菌株(Meulenberg J.等人，病毒學(xué)，1993，192，62-72)和美洲菌株(Mardassi H.等人，病毒學(xué)學(xué)報(bào)1995，140，1405-1418)的ORF4基因、ORF3基因(天然或分泌形式)、ORF5基因(天然或分泌形式)、ORF6基因和/或ORF7基因。
至于豬霍亂效價(jià)，優(yōu)選地使用E0基因、E1基因(天然或分泌形式)和或E2基因(天然或分泌形式)(Meyers G.等人，病毒學(xué)，1989，171，18-27)。
至于parvovirosis效價(jià)，優(yōu)選地使用VP2衣殼基因(VasudevacharyaJ.等人，病毒學(xué)，1990，178，611-616)。
至于PCV2效價(jià)，優(yōu)選地使用IRF1和/或ORF2基因，但優(yōu)選地ORF1和ORF2(Meehan B.等人，普通病毒學(xué)雜志1998，79，2171-2179)。
在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)特別是啟動(dòng)子控制下插入異源序列，優(yōu)選地在重組期間引入。然而，不排除在用作載體的腺病毒所固有的信號(hào)控制下表達(dá)這些異源序列。
在有用的啟動(dòng)子之中，優(yōu)選使用強(qiáng)真核啟動(dòng)子，如勞氏肉瘤病毒LTR，優(yōu)選地巨細(xì)胞病毒直接早期(CMV-IE)啟動(dòng)子，特別是鼠源的(MCMV-IE)或人源的(HCMV-IE)，或其他來源如來源于豬、猴、大鼠或豚鼠的啟動(dòng)子。
一種特別有利的方式是，CMV-IE啟動(dòng)子能與增強(qiáng)子一起使用(US-A-5,168,062、US-A-4,968,615、US-A-4,963,481)?？梢杂欣厥褂眠@些啟動(dòng)子的片段，它們保留啟動(dòng)子活性，優(yōu)選地含有增強(qiáng)子，例如根據(jù)WO-A-98/00166的截短的CMV-IE啟動(dòng)子。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照WO-A-98/00166，特別是其中的實(shí)施例12。
本發(fā)明的主題也可以是免疫原性或免疫制劑和豬疫苗，其含有根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒，獸醫(yī)觀點(diǎn)可接受的載體或賦形劑，和任選的佐劑。根據(jù)定義，免疫原性或免疫制劑在向動(dòng)物施用后至少誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答(細(xì)胞和/或體液的)。一種疫苗誘導(dǎo)一種保護(hù)性應(yīng)答。
佐劑優(yōu)選地選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和馬來酸酐與(鏈)烯基衍生物的共聚物。
優(yōu)選的化合物是尤其與糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。這些化合物被稱作術(shù)語“carbomer”(Pharmeuropa第8卷，2號(hào)，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可查閱US-A-2 909 462，其中描述了與至少含有3個(gè)、優(yōu)選地不超過8個(gè)羥基的多羥基化合物交聯(lián)的丙烯酸聚合物，至少三個(gè)羥基的氫原子被替換為含有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂基。優(yōu)選的基團(tuán)是含有2-4個(gè)碳原子的基團(tuán)，如乙烯基、烯丙基和其他烯不飽和基團(tuán)。不飽和基本身可含有其他取代基，如甲基。商品名為Carbopol(BF Goodrich，Ohio，美國)的產(chǎn)品特別合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中可提到Carbopol974P、934P和971P。
在馬來酸酐與烯基衍生物的共聚物中，優(yōu)選EMAs(Monsanto)，它是馬來酸酐與乙烯的共聚物，可以是線性的或交聯(lián)的，例如與二乙烯醚交聯(lián)?？蓞⒖糐.Fields等人，自然，186，778-780，1960年6月4日。
根據(jù)結(jié)構(gòu)，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMAs優(yōu)選地由下列通式的基本單位形成 其中-R1和R2，可以相同或不同，代表H或CH3-X＝0或1，優(yōu)選地x＝1-Y＝1或2，且x+y＝2。
對于EMAs，x＝0而y＝2。對于carbomer，x＝y(tǒng)＝1。
這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生一種酸性溶液，將被中和為優(yōu)選地生理pH，獲得可摻入實(shí)際疫苗的佐劑溶液。聚合物的羧基部分地是COO-形式。
優(yōu)選地，在蒸餾水中，優(yōu)選地在氯化鈉存在下制備根據(jù)本發(fā)明的佐劑溶液，特別是carbomer溶液，所獲得的溶液為酸性pH。通過加入到所需量(獲得希望的終濃度)或大比例的含NaCl水、優(yōu)選地生理鹽水(6g/l NaCl)中稀釋該貯存液，在一個(gè)或多個(gè)階段中同時(shí)或隨后優(yōu)選地用NaOH中和(pH 7.3-7.4)。使用生理pH的該溶液吸收疫苗，而不需進(jìn)一步修飾，其特別以凍干形式貯存。
終免疫組合物中的聚合物濃度為0.01％-2％W/V，更特別地0.06％-1％W/V，優(yōu)選地0.1％-0.6％W/V。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性制劑和疫苗能包含幾種根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒，包含來源于相同和/或不同病原體的不同異源核苷酸序列。
本發(fā)明的一個(gè)主題是針對一種或多種豬病原體而免疫和接種豬的方法，包括施用有效劑量的上述免疫原性制劑和疫苗。例如，劑量可為104-107CCID50。
本發(fā)明特別涉及這些免疫原性制劑和疫苗的粘膜施用，例如經(jīng)口、經(jīng)鼻或經(jīng)眼施用，和/或?qū)︼@示母體抗體的幼小動(dòng)物的施用。也能使用常規(guī)用于接種豬的其他途徑(特別是肌肉內(nèi)、皮內(nèi)等)。
本發(fā)明的一個(gè)主題是獲得重組PAV-3和PAV-5載體和摻有它們的免疫原性制劑和疫苗的方法。
本發(fā)明的一個(gè)主題是用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的免疫原性制劑和疫苗而的這些載體的用途，特別是用于粘膜施用，和/或?qū)︼@示母體抗體的幼小動(dòng)物施用，和/或通過常規(guī)途徑施用。
本發(fā)明的一個(gè)主題是PAV-5DNA的片段，其包含E3，并且在此處使用的特定菌株中具有稱作SEQ ID NO.5的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及該序列的任何片段，特別是保留PAV-5特異性的任何片段。因此本發(fā)明的一個(gè)主題是序列2064-4083及其片段，特別是PAV-5的E3序列，它在此處使用的特定菌株中由核苷酸2382-4042所限定，及其片段，特別是SEQID NO.5的序列2389-3861的全部或部分。不言而喻，本發(fā)明自動(dòng)涵蓋等同性序列，即不改變所述序列或該序列編碼的多肽的PAV-5菌株功能性或特異性的序列。不用說，將包括由于密碼簡并性而不同的序列。
本發(fā)明也涉及PAV-5特異的序列，它們在能與上述序列在高嚴(yán)格條件下雜交方面相當(dāng)，和/或與本發(fā)明的菌株有強(qiáng)同源性，特別是大于或等于85％、尤其90％、更特別地95％的同源性。
現(xiàn)在通過非限制性實(shí)施例，參照附圖，利用實(shí)施方案，更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中附圖列表
圖1pKS-Right ITR3、pPolyII-Right ITR3和pITRsPAV3質(zhì)粒的圖示。
圖2pE3PAV3、pE3dl622CMV-EGFP和pE3dl622CMV-gD質(zhì)粒的圖示。
圖3pE3PAV3和pE3dl919質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖4pCMV-EGFP、pCMV-gD和pgD質(zhì)粒的圖示。
圖5pCMV-EGFP、pgD、pE3dl919CMV-EGFP和pE3dl919CMV-gD質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖6pE3dl622EGFP和pE3dl919EGFP質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖7pE3dl622gD和pE3dl919CMV-gD質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖8pCR-Right ITR5、pCR-Left ITR5、pPolyII-Right ITR5和pITR-PAV5質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖9pE3PAV5質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖10pE3dln472CMV-EGFP和pE3dl1472CMV-gD質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖11pE3dl1472EGFP和pE3dl1472gD質(zhì)粒的限制酶切圖譜。
圖12PAV-5的物理圖譜，用BamHI消化。
圖135614堿基對的序列(PAV-5病毒的E3區(qū)和相鄰序列)。
序列表SEQ ID NO 1寡核苷酸ITRPAV3SEQ ID NO 2寡核苷酸T3SEQ ID NO 3寡核苷酸T7SEQ ID NO 4寡核苷酸ITRPAV5SEQ ID NO 5PAV-5病毒E3區(qū)的序列實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞與病毒細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑由Gibco BRL供應(yīng)。培養(yǎng)基(含Glutamax-1的Dulbecco’s MEM，Cat#61965-026)中添加1mM丙酮酸鈉(Cat#11360-039)、慶大霉素(50μg/ml，Cat#15710-031)和10％胎牛血清(Cat#10270-106批號(hào)40Q5774K)。
用PK-15細(xì)胞(ATCC號(hào)CCL33)和ST細(xì)胞(ATCC號(hào)CRL1756)培養(yǎng)病毒。
野生型3型豬腺病毒(＝PAV-3)，對豬不致病，從Eva Nagy博士(Guelph大學(xué)，病理學(xué)系，50 Stone Road Guelph，Ontario，加拿大，NIG 2W1)的實(shí)驗(yàn)室獲得(Reddy P.等人，病毒研究1996，43，99-109)。
野生型5型豬腺病毒(＝PAV-5)，對豬不致病，從Tadashi Hirahara博士(Kyoto Biken Laboratories Inc.，獸醫(yī)微生物學(xué)部，24-16Makishima-cho，Uji-shi，Kyoto，611日本)的實(shí)驗(yàn)室獲得(Hirahara T.等人，獸醫(yī)學(xué)雜志1990，52，407-409)。
培養(yǎng)與傳代條件一周兩次，將細(xì)胞胰蛋白酶化(用Earle’s平衡鹽溶液(Gibco-BRL Cat#14155-030)稀釋50倍的2.5％胰蛋白酶溶液(Sigma Cat#044-5075))，并重懸浮于培養(yǎng)基(1∶6稀釋)中。細(xì)胞在重新培養(yǎng)前在5％CO2存在下37℃培養(yǎng)。實(shí)施例2酶、細(xì)菌、質(zhì)粒和分子生物學(xué)技術(shù)限制酶、用于鏈擴(kuò)增反應(yīng)的Taq聚合酶和不同DNA修飾所需的其他酶分別由New England Biolabs Inc.，Roche Diagnostics和Gibco-BRL供應(yīng)。
所有這些酶都按照使用說明使用。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)如《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南》，第二版，(Sambrook等人，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，1989)所述進(jìn)行。
BJ5183感受態(tài)細(xì)胞(Hanahan D.，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)1983，166，557-580)如下制備按照氯化鈣技術(shù)(Sambrook等人，1989)制備指數(shù)期的這些細(xì)菌的60ml培養(yǎng)物。用終體積2ml的50mM CaCl2收獲。300μl這種細(xì)菌懸液與100μl體積的100mM Tris-HCl pH7.4中所含的不同同源重組配偶體DNA混合，并在融化中的冰上接觸30分鐘，然后在+45℃下熱休克處理細(xì)菌2分鐘，在融化中的冰上保持10分鐘，最后涂于選擇培養(yǎng)基上。實(shí)施例3PAV-3和PAV-5病毒DNA的提取病毒在實(shí)施例1的條件下在10cm2Falcon搖瓶中培養(yǎng)并擴(kuò)增。當(dāng)CPE完成后，收獲細(xì)胞，通過3個(gè)循環(huán)的冷凍/融解裂解，然后通過低速離心使病毒懸液澄清。PAV-3和PAV-5病毒以氯化銫梯度(1.34g/ml)純化，收獲并純化病毒帶，然后在用蛋白酶K處理及酚/氯仿抽提后獲得病毒DNA(Sambrook等人，1989)。這些DNA然后用于不同克隆或聚合酶鏈擴(kuò)增(PCA)步驟。實(shí)施例4“pITRs PAV3”質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例3制備的PAV-3病毒的基因組DNA用EcoRI消化，在瓊脂糖凝膠電泳后分離245bp EcoRI D片段。然后將該片段與EcoRI預(yù)消化并去磷酸化的pBlueScript KS質(zhì)粒(pBS-KS)(Stratagene Inc.LaJolla，CA)(GenBank # X52327)連接，產(chǎn)生被稱為“pKS-EcoDPAV3”的質(zhì)粒。
用pKS-EcoDPAV3質(zhì)?；|(zhì)和下列寡核苷酸進(jìn)行PCA反應(yīng)ITRPAV3(SEQ ID NO1)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3’和T3(SEQ ID NO2)(20-mer)5’ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’擴(kuò)增產(chǎn)物(367bp)用T4 DNA聚合酶處理以使末端成為平端，然后用ClaI酶消化，并與ClaI和EcoRV預(yù)消化的pBS-KS質(zhì)粒連接，產(chǎn)生被稱為“pKS-Right ITR3”的質(zhì)粒(
圖1)。
然后用BamHI和KpnI酶消化，使EcoRI D片段不含pKS-RightITR3質(zhì)粒，353-bp BamHI-KpnI限制酶切片段與BamHI和KpnI預(yù)消化的pPolyII質(zhì)粒(Lathe R.等人，基因，1987，57，193-201)(GenBank#G209113)連接，產(chǎn)生被稱為“pPolyII-Right ITR3”的質(zhì)粒(
圖1)。
根據(jù)實(shí)施例3制備的PAV-3的基因組DNA用KpnI消化，以在瓊脂糖凝膠電泳后分離939-bp KpnI F末端片段。該片段與KpnI預(yù)消化并去磷酸化的pBS-KS質(zhì)粒連接，產(chǎn)生被稱為“pKS-KpnFPAV3”的質(zhì)粒。
然后用pKS-KpnFPAV3質(zhì)?；|(zhì)和下列寡核苷酸進(jìn)行PCA反應(yīng)ITRPAV3(SEQ ID NO1)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3’和T7(SEQ ID NO3)5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’擴(kuò)增產(chǎn)物(1086 bp)用T4 DNA聚合酶處理，以使末端成為平端，然后用XhoI酶消化，并與用BglII預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理然后用XhoI消化的pPolyII-Right ITR3質(zhì)粒連接，產(chǎn)生被稱為“pITRsPAV3”的質(zhì)粒(
圖1)。實(shí)施例5pPAV3質(zhì)粒的構(gòu)建pITRsPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例4)通過用ClaI消化線性化，然后與根據(jù)實(shí)施例2制備的PAV-3病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。該共轉(zhuǎn)化使得能通過大腸桿菌中的同源重組(Chartier C.等人，病毒學(xué)雜志1996，70，4805-4810)產(chǎn)生含有PAV-3完整克隆基因組的質(zhì)粒。該質(zhì)粒被命名為“pPAV3”。實(shí)施例6PAV-3穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建6.1.在E3區(qū)中缺失622個(gè)堿基對(小缺失)的質(zhì)粒的構(gòu)建pNEB193質(zhì)粒(New England BioLabs Cat#305-1)用PacI消化，用T4 DNA聚合酶處理，然后自身連接，產(chǎn)生“pNEBPac-”質(zhì)粒。
pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)用KpnI和BamHI消化，分離含有E3區(qū)的4344-bp KpnI-BamHI片段(Reddy等人，病毒學(xué)，1998，251，414-426)。該片段與KpnI和BamHI預(yù)消化的pNEBPac-質(zhì)粒連接，產(chǎn)生“pE3PAV3”質(zhì)粒(圖2)。核對KpnI-BamHI片段的序列，發(fā)現(xiàn)它與Reddy P.等人(病毒研究，1995，36，97-106和病毒學(xué)，1998，251，414-426)所公布的序列(GenBank AN#U10433和AN#AF083132)相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可查閱這些參考文獻(xiàn)。
修飾pEGFP-F質(zhì)粒(Chalfie M.等人，科學(xué)，1994，263，802-805；Clontech Cat # 6074-1)以完全除去多接頭。通過用BamHI消化，隨后用T4 DNA聚合酶處理，獲得這種缺失。這樣修飾的載體的自身再連接產(chǎn)生pCMV-EGFP質(zhì)粒。然后用AsnI和MluI酶消化pCMV-EGFP質(zhì)粒，用T4 DNA聚合酶處理，分離1.6-kbp AsnI(平端)-MluI(平端)片段(＝CMV-EGFP表達(dá)盒)。該片段與用BsrGI和SnaBI預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理的pE3PAV3質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl622CMV-EGFP質(zhì)粒(圖2)。在PAV-3病毒E3區(qū)的BsrGI和SnaBI位點(diǎn)之間產(chǎn)生的缺失大小為622堿基對。該缺失從P.Reddy等人(病毒研究，1995，36，97-106)所公布的序列(GenBank AN # U10433)的核苷酸1002延伸到1624。
pCMV-gD質(zhì)粒(Ambriovic A.等人，病毒學(xué)，1997，238，327-335)用SnaBI和ClaI消化，分離1.8-kbp SnaBI-ClaI片段(含有CMV啟動(dòng)子的3’部分和PRV gD基因)。然后用T4 DNA聚合酶處理該片段，使末端成為平端，然后與SnaBI和HpaI預(yù)消化的pE3dl622CMV-EGFP質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl622CMV-gD質(zhì)粒(圖2)。6.2.在E3區(qū)中缺失919個(gè)堿基對(大缺失)的質(zhì)粒的構(gòu)建pE3PAV3質(zhì)粒(見上述部分6.1)用SgrAI和SacI消化，以分離644-bp SgrAI-SacI片段。該片段用T4 DNA聚合酶處理，使末端成為平端，然后與用EcoRI預(yù)消化、用T4 DNA聚合酶處理、然后用SacI消化的pNEBPac-質(zhì)粒(以上6.1.)連接，產(chǎn)生pSgrAI-SacI質(zhì)粒。
pE3PAV3質(zhì)粒用SnaBI和HindIII消化，以分離2.4-kbp SnaBI-HindIII片段。該片段與PmeI和HindIII預(yù)消化的pSgrAI-SacI質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl919質(zhì)粒(圖3)。在PAV-3病毒E3區(qū)的SacI與SnaBI位點(diǎn)之間產(chǎn)生的缺失大小為919堿基對。該缺失從P.Reddy等人(病毒研究，1995，36，97-106)所公布的序列(GenBank AN#U10433)的核苷酸706延伸到1624。
pCMV-gD質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)用SnaBI和ClaI消化，以分離1.8-kbp SnaBI-ClaI片段。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用SnaBI和HpaI預(yù)消化、然后去磷酸化的pCMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)連接，產(chǎn)生pgD質(zhì)粒(圖4)。
pCMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)用AsnI和MluI消化，以分離1.8-kbp AsnI-MluI片段(CMV-EGFP盒)。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用AscI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理使末端成為平端、然后去磷酸化的pE3dl919質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl919CMV-EGFP質(zhì)粒(圖5)。
pgD質(zhì)粒(同上)用AsnI和MluI消化，以分離2.3-kbp AsnI-MluI片段。該片段用T4 DNA聚合酶處理使末端成為平端，然后與用AscI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理使末端成為平端、然后去磷酸化的pE3dl919質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl919CMV-gD質(zhì)粒(圖5)。實(shí)施例7重組基因組pPAV3dl622CMV--EGFP和pPAV3dl622CMV-gD的構(gòu)建pE3dl622CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)用KpnI和BamHI消化，以分離5.5-kbp KpnI-BamHI片段。該片段與通過用SnabI酶消化而線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl622CMV-EGFP質(zhì)粒。
pE3CMVgD質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)用EcoRI和PmeI消化，以分離6.0-kbp EcoRI-PmeI片段。該片段與通過用SnaBI酶消化而線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl622CMVgD質(zhì)粒。實(shí)施例8重組基因組pPAV3dl919CMV-EGFP和pPAV3dl919CMV-gD的構(gòu)建pE3dl919CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.2)用HindIII線性化，然后與通過用SnaBI酶消化而線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl919CMV-EGFP質(zhì)粒。
pE3dl919CMV-gD質(zhì)粒(實(shí)施例6.2)用HindIII線性化，然后與通過用SnaBI酶消化而線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl919CMV-gD質(zhì)粒。實(shí)施例9重組基因組pPAV3dl622EGFP、pPAV3dl622gD、pPAV3dl919EGFP和pPAV3dl919gD的構(gòu)建(不含CMV啟動(dòng)子序列的編碼序列的插入)9.1.pE3dl622EGFP和pE3dl919EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建pCMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.1.)用NheI和MluI消化，以分離1.0-kbp NheI-MluI片段。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用BsrGI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理、最后用SnaBI消化的pE3PAV3質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)連接，產(chǎn)生pE3dl622EGFP質(zhì)粒(圖6)。
pCMV-EGFP質(zhì)粒用NheI和MluI消化，以分離1.0-kbp NheI-MluI片段。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用AscI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理、然后去磷酸化的pE3dl919質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl919EGFP質(zhì)粒(圖6)。9.2.pE3dl622gD和pE3dl919gD質(zhì)粒的構(gòu)建pgD質(zhì)粒(實(shí)施例6.2)用XhoI和ClaI消化，以分離1.5-kbpXhoI-ClaI片段。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用BsrGI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理、然后用SnaBI消化的pE3PAV3質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)連接，產(chǎn)生pE3dl622gD質(zhì)粒(圖7)。
pgD質(zhì)粒(實(shí)施例6.2)用XhoI和ClaI消化，以分離1.5-kbpXhoI-ClaI片段。該片段用DNA聚合酶Klenow片段處理，使末端成為平端，然后與用AscI預(yù)消化、用DNA聚合酶Klenow片段處理、最后去磷酸化的pE3dl919質(zhì)粒(實(shí)施例6.2)連接，產(chǎn)生pE3dl919gD質(zhì)粒(圖7)。9.3.pPAV3dl622EGFP、pPAV3dl622gD、pPAV3dl919EGFP和pPAV3dl919gD質(zhì)粒的構(gòu)建pE3dl622EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例9.1)用KpnI和BamHI消化，然后與通過用SnabI消化而預(yù)線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化使得能通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl622EGFP質(zhì)粒。
pE3dl622gD質(zhì)粒(實(shí)施例9.2)用EcoRI和PmeI消化，然后與通過用SnaBI消化而預(yù)線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl622gD質(zhì)粒。
pE3dl919EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例9.1)通過用HindIII消化線性化，然后與通過用SnaBI消化而預(yù)線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl919EGFP質(zhì)粒。
pE3dl919gD質(zhì)粒(實(shí)施例9.2)通過用HindIII消化線性化，然后與通過用SnaBI消化而預(yù)線性化的pPAV3質(zhì)粒(實(shí)施例5)一起共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV3dl919gD質(zhì)粒。實(shí)施例10利用克隆到大腸桿菌中的重組PAV3基因組轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組PAV3病毒根據(jù)細(xì)胞系，用在4-12μl LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat#18324-012)存在下稀釋的、PacI預(yù)消化的2μg重組PAV-3基因組DNA，在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染PK-15或ST細(xì)胞(見實(shí)施例1)，至60-80％的匯合密度。
在根據(jù)供應(yīng)商推薦的條件轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)天，直到出現(xiàn)病毒CPE。然后進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)傳代，以擴(kuò)增獲得的重組病毒。
用pPAV3dl622CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例7)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-1。
用pPAV3dl622CMV-gD質(zhì)粒(實(shí)施例7)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-2。
用pPAV3dl919CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例8)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-3。
用pPAV3dl919CMV-gD質(zhì)粒(實(shí)施例8)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-4。
用pPAV3dl622EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例9.3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-5。
用pPAV3dl622gD質(zhì)粒(實(shí)施例9.3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-6。
用pPAV3dl919EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例9.3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-7。
用pPAV3dl919gD質(zhì)粒(實(shí)施例9.3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV3-8。實(shí)施例11pITRs PAV5質(zhì)粒的構(gòu)建11.1.右端基因組片段的克隆根據(jù)實(shí)施例3制備的PAV-5病毒的基因組DNA用EcoRI消化，在瓊脂糖凝膠電泳后分離0.9-kbp EcoRI I右端片段。將該片段與用EcoRI預(yù)消化并去磷酸化的pBS-KS質(zhì)粒連接，產(chǎn)生“pKS-Right ITR5”質(zhì)粒。
然后用pKS-Right ITR5質(zhì)?；|(zhì)和下列寡核苷酸進(jìn)行PCA反應(yīng)ITRPAV5(SEQ ID NO4)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3’和T3(SEQ ID NO2)(20-mer)5’ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’產(chǎn)生1.0-kbp片段。該片段與pCRII質(zhì)粒(InVitrogen Original TA克隆試劑盒Cat # K2000-01)連接，產(chǎn)生“pCR-Right ITR5”質(zhì)粒(圖8)。11.2.左端基因組片段的克隆根據(jù)實(shí)施例3制備的PAV-5病毒的基因組DNA用HindIII消化，在瓊脂糖凝膠電泳后分離1.2-kbp HindIII左端片段。將該片段與用HindIII預(yù)消化并去磷酸化的pBS-KS質(zhì)粒連接，產(chǎn)生“pKS-Left ITR5”質(zhì)粒。
然后用pKS-Left ITR5質(zhì)?；|(zhì)和下列寡核苷酸進(jìn)行PCA反應(yīng)ITRPAV5(SEQ ID NO4)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3’和T7(SEQ ID NO3 20-mer)5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’產(chǎn)生1.3-kbp片段。該片段與pCRII質(zhì)粒連接，產(chǎn)生“pCR-Left ITR5”質(zhì)粒(圖8)。11.3.pPolyII-Right ITR5質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI和HindIII消化pCR-Right ITR5質(zhì)粒(實(shí)施例11.1)，以分離1.0-kbp BamHI-HindIII片段。然后將該片段與用BamHI和HindIII預(yù)消化的pPolyII質(zhì)粒(見實(shí)施例4)連接，產(chǎn)生“pPolyII-RightITR5”質(zhì)粒(圖8)。11.4.pITRsPAV5質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI和HindIII消化pCR-Left ITR5質(zhì)粒(實(shí)施例11.2)，以分離1.3-kbp BamHI-HindIII片段。然后將該片段與用BglII和HindIII預(yù)消化的pPolyII-Right ITR5質(zhì)粒連接，產(chǎn)生“pITRs PAV5”質(zhì)粒(圖8)。實(shí)施例12pPAV5質(zhì)粒的構(gòu)建通過用HindIII消化使pITRsPAV5質(zhì)粒線性化，然后將獲得的片段與根據(jù)實(shí)施例3制備的PAV-5病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。該共轉(zhuǎn)化通過同源重組產(chǎn)生含有PAV-5病毒全部基因組的質(zhì)粒。該質(zhì)粒被命名為“pPAV5”。實(shí)施例13PAV-5穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建13.1.E3 PAV-5穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建用SacI和MluI消化pPAV5質(zhì)粒(實(shí)施例12)，以分離含有E3區(qū)的4372-bp SacI-MluI片段。該片段與用SmaI和AscI預(yù)消化的pNEB193質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)連接，產(chǎn)生“pE3PAV5”質(zhì)粒(圖9)。
完整測序并分析克隆到pE3PAV5質(zhì)粒中的SacI-MluI片段。該序列及pPAV5質(zhì)粒上存在的相鄰序列的分析證實(shí)，克隆片段確實(shí)代表PAV-5病毒的E3區(qū)。該區(qū)的序列(5614堿基對)(SEQ ID NO5)在
圖13中列出。13.2.在E3區(qū)中缺失1472堿基對的供體CMV-EGFP和CMV-PRV gD質(zhì)粒的構(gòu)建pCMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)用AsnI和MluI酶消化，然后用T4 DNA聚合酶處理，以分離1.6-kbp AsnI(平端)-MluI(平端)片段。該片段與用PvuII和BglI預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理的pE3PAV5質(zhì)粒(實(shí)施例13.1)連接，產(chǎn)生pE3dl1472CMV-EGFP質(zhì)粒(
圖10)。在PvuII和BglI位點(diǎn)之間引入的缺失大小為1472bp。該缺失位于
圖13列出的序列(SEQ ID NO5)的核苷酸2389與3861之間。
用AsnI和MluI酶消化pgD質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)，以分離2.3-kbpAsnI-MluI片段。然后用T4 DNA聚合酶處理該片段使其成為平端，并與PvuII和BglI預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理的pE3PAV5質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl1472CMVgD質(zhì)粒(
圖10)。
用NheI和MluI消化pCMV-EGFP質(zhì)粒，以分離1.0-kbp NheI-MluI片段。用DNA聚合酶Klenow片段處理該片段使其成為平端，并與PvuII和BglI預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理的pE3PAV5質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl1472EGFP質(zhì)粒(
圖11)。
用XhoI和ClaI消化pCMVgD質(zhì)粒(實(shí)施例6.1)，以分離1.5-kbpXhoI-ClaI片段。用DNA聚合酶Klenow片段處理該片段使其成為平端，并與PvuII和BglI預(yù)消化并用T4 DNA聚合酶處理的pE3PAV5質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pE3dl1472gD質(zhì)粒(
圖12)。實(shí)施例14重組基因組pPAV5dl1472CMV-EGFP和pPAV5dl1472CMV-gD的構(gòu)建pE3dl1472CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例13.2)用PmeI線性化，然后與通過用BamHI酶部分消化而線性化的pPAV5質(zhì)粒(實(shí)施例12)共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌(BamHI A-BamHI D限制亞片段的連接位點(diǎn)，
圖12)。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV5dl1472CMV-EGFP質(zhì)粒。
pE3dl1472CMVgD質(zhì)粒(實(shí)施例13.2)用PmeI線性化，然后與通過用BamHI酶部分消化而線性化的pPAV5質(zhì)粒(實(shí)施例12)共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌(BamHI A-BamHI D限制亞片段的連接位點(diǎn)，
圖12)。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV5dl1472CMV-gD質(zhì)粒。實(shí)施例15重組基因組pPAV5dl1472EGFP和pPAV5dl1472gD的構(gòu)建(不含CMV啟動(dòng)子序列的編碼序列的插入)pE3dl1472EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例13.2)用PmeI線性化，然后與通過用BamHI酶部分消化而線性化的pPAV5質(zhì)粒(實(shí)施例12)共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌(BamHI A-BamHI D限制亞片段的連接位點(diǎn)，
圖12)。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV5dl1472EGFP質(zhì)粒。
pE3dl1472gD質(zhì)粒(實(shí)施例13.2)用PmeI線性化，然后與通過用BamHI酶部分消化而線性化的pPAV5質(zhì)粒(實(shí)施例12)共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌(BamHI A-BamHI D限制亞片段的連接位點(diǎn)，
圖12)。這種共轉(zhuǎn)化通過在大腸桿菌中同源重組產(chǎn)生pPAV5dl1472gD質(zhì)粒。實(shí)施例16利用克隆到大腸桿菌中的重組PAV5基因組轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生重組PAV5病毒根據(jù)細(xì)胞系，用在4-12μl LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat#18324-012)存在下稀釋的、PacI預(yù)消化的2μg重組PAV-5基因組DNA，在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染PK-15或ST細(xì)胞(見實(shí)施例1)，至60-80％的匯合密度。
在根據(jù)供應(yīng)商推薦的條件轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)天，直到出現(xiàn)病毒CPE。然后進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)傳代，以擴(kuò)增獲得的重組病毒。
用pPAV5dl1472CMV-EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例14)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV5-1。
用pPAV5dl1472CMV-gD質(zhì)粒(實(shí)施例14)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV5-2。
用pPAV5dl1472EGFP質(zhì)粒(實(shí)施例15)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV5-3。
用pPAV5dl1472gD質(zhì)粒(實(shí)施例15)進(jìn)行轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒vPAV5-4。實(shí)施例19根據(jù)本發(fā)明的疫苗的生產(chǎn)在PK-15細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)并擴(kuò)增根據(jù)本發(fā)明獲得的重組病毒。在觀察到完全的細(xì)胞病變效應(yīng)后收獲上清液。通過低速離心除去細(xì)胞碎片使之澄清，隨后離心濃縮病毒體并洗滌病毒沉淀，在培養(yǎng)基溶液中吸收沉淀。測定這些懸液的病毒滴度。然后任選地通過稀釋調(diào)節(jié)病毒滴度，以獲得10450％細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量(CCID50)至107CCID50/ml的終病毒滴度。
然后能在凍干底物存在下冷凍或優(yōu)選地凍干病毒懸液。實(shí)施例20豬的接種在用可注射制劑用水融解或吸收凍干劑量，并任選地加入一種佐劑后，用104-107CCID50劑量的每種重組病毒接種豬。疫苗含有一種或多種表達(dá)不同免疫原的重組PAV病毒。
通過以2ml體積用針注射(肌肉內(nèi)途徑)或粘膜(鼻內(nèi)或滴眼)(改變體積以適應(yīng)每種途徑)施用疫苗。
也可用無針注射器如PIGJET裝置(Societe Endoscoptic，Laon，法國)進(jìn)行皮內(nèi)注射。實(shí)施例21偽狂犬病的接種/檢測方案用一種接種/檢測方案評價(jià)由無佐劑重組vPAV3-2病毒(本發(fā)明的實(shí)施例10)懸液組成的疫苗的效能。
建立每組6只8-10周齡小豬，它們?yōu)樵谌焉镩_始時(shí)即已對偽狂犬病病毒(PRV)接種的母豬所生。所有這些小豬在接種第D0天均確定具有母體抗PRV抗體。組1和組2的小豬在D0天鼻內(nèi)接種1毫升(ml)滴度為107CCID50/ml的重組病毒vPAV3-2(PAV-3/PAV gD)懸液(每只鼻孔0.5ml)。組2以相同方式接種，但也在D21天接受第二次施用。組3在D0天肌肉內(nèi)接受1ml滴度為107CCID50/ml的PAV-3/gD病毒懸液。組4以與組3相同的方式接種，但在D21天接受第二次病毒懸液注射。組5不接種，用作檢測的陰性對照組。
所有組均在D35天通過施用2ml(每只鼻孔1ml)至少1073pfu/ml滴度的PRV NIA3菌株懸液檢測。
檢測后，根據(jù)體重變化標(biāo)準(zhǔn)(delta G7)(Stellmann C.等人，生物標(biāo)準(zhǔn)雜志(J.Biol.Standard)1989，17，1-11)(檢測后的D0-D7)和鼻粘膜的病毒分泌水平，并根據(jù)ELISA抗體效價(jià)和抗PRV血清中和滴度監(jiān)測這些豬。
應(yīng)當(dāng)清楚地理解，附加權(quán)利要求所限定的本發(fā)明不限于以上說明書中所述的具體實(shí)施方案，而包括不背離本發(fā)明的內(nèi)容和精神的變化。
權(quán)利要求
1.重組的、在體內(nèi)可復(fù)制的豬腺病毒，其特征在于它包含一種插入豬腺病毒基因組中的異源核苷酸序列，插入條件是使后者可在體內(nèi)復(fù)制并表達(dá)插入的異源核苷酸序列，并且腺病毒基因組來源于血清型3或5腺病毒(PAV-3或PAV-5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的豬腺病毒，其特征在于異源核苷酸序列被插入豬腺病毒E3區(qū)的非必需區(qū)帶中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的豬腺病毒，其特征在于異源核苷酸序列被插入豬腺病毒E3區(qū)的非必需區(qū)帶中，該區(qū)帶含有缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的豬腺病毒，其特征在于腺病毒基因組來源于PAV-3，并且異源核苷酸序列被插入含有該區(qū)域核苷酸706-1624的區(qū)帶的E3區(qū)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的豬腺病毒，其特征在于插入異源核苷酸序列代替E3區(qū)的核苷酸706-1624。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的豬腺病毒，其特征在于腺病毒基因組來源于PAV-5，并且異源核苷酸序列被插入含有SEQ ID NO.5核苷酸2064-4083的全部或部分、特別是2389-3861的區(qū)帶中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的豬腺病毒，其特征在于插入異源核苷酸序列代替SEQ ID NO.5的核苷酸2064-4083、特別是2389-3861。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的豬腺病毒，其特征在于異源核苷酸序列編碼豬病原體的一種免疫原或免疫活性片段或免疫原表位，和/或編碼一種免疫調(diào)節(jié)劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的腺病毒，其特征在于插入數(shù)種異源核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的腺病毒，其特征在于插入多肽序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的腺病毒，其特征在于插入IRES序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的腺病毒，其特征在于它含有一種來源于選自病毒、細(xì)菌和寄生蟲的豬病原體的異源核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的腺病毒，其特征在于它含有一種來源于豬病原體的異源核苷酸序列，所述病原體選自偽狂犬病病毒、豬流感病毒、豬生殖與呼吸綜合征病毒、parvovirosis病毒、豬霍亂病毒、2型豬環(huán)病毒、胸膜肺炎放線桿菌和豬肺炎支原體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的腺病毒，其特征在于異源核苷酸序列選自偽狂犬病病毒的gB基因、gC基因或gD基因，豬流感病毒的HA基因、NA基因或NP基因，豬生殖與呼吸綜合征病毒的ORF4基因或ORF7基因，豬霍亂病毒的E1基因或E2基因，parvovirosis病毒的VP2基因，2型豬環(huán)病毒的ORF1基因或ORF2基因，和這些基因的免疫活性片段和表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的豬腺病毒，其特征在于它含有一種編碼豬細(xì)胞因子的異源核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的腺病毒，其特征在于豬細(xì)胞因子選自GM-CSF、IL-4、IL-12和IL-18。
17.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的豬腺病毒和獸醫(yī)觀點(diǎn)可接受的載體或賦形劑的重組豬疫苗。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的重組豬疫苗，其特征在于它含有數(shù)種根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的豬腺病毒，這些腺病毒含有不同的異源核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的重組豬疫苗，其特征在于它含有佐劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的重組豬疫苗，其特征在于該佐劑選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和馬來酸酐與烯基衍生物的共聚物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的重組豬疫苗，其特征在于佐劑是一種carbomer。
22.血清型3或5豬腺病毒載體，它們在體內(nèi)均可復(fù)制，其基因組的非必需區(qū)缺失。
23.血清型3或5豬腺病毒載體，它們在體內(nèi)均可復(fù)制，E3區(qū)缺失。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的豬腺病毒載體，其特征在于它含有一種E3區(qū)核苷酸706-1624缺失的血清型3豬腺病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的豬腺病毒載體，其特征在于E3區(qū)的缺失主要包括核苷酸706-1624的缺失。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的豬腺病毒載體，其特征在于它含有一種血清型5豬腺病毒，它在含有SEQ ID NO.5核苷酸2064-4083的全部或部分、特別是2389-3861的區(qū)帶中含有缺失。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的豬腺病毒載體，其特征在于SEQ ID NO.5的核苷酸2064-4083、特別是2389-3861缺失。
28.含有PAV-5核苷酸序列的全部或部分的DNA片段，其包含E3，并且在一特定PAV-5菌株中含有被稱為SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
29.含有PAV-5核苷酸序列的DNA片段，其對應(yīng)于E3，并且在一特定菌株中由SEQ ID NO.5的核苷酸2382-4042所定義。
全文摘要
一種體內(nèi)復(fù)制型重組豬腺病毒,其特征在于它含有一種插入豬腺病毒中的異源核苷酸序列,插入條件使后者能在體內(nèi)復(fù)制并表達(dá)插入的異源核苷酸序列,并且腺病毒基因組來源于3或5血清型(PAV－3或PAV－5)腺病毒。插入在E3區(qū)的非必需區(qū)帶中發(fā)生,優(yōu)選地該區(qū)帶包含缺失。本發(fā)明也涉及含有一種這樣的豬腺病毒的重組豬疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在體內(nèi)可復(fù)制并且其基因組非必需區(qū)缺失的血清型3或5豬腺病毒載體。本發(fā)明也涉及一種含有所述SEQ ID NO.5核苷酸序列的全部或部分的DNA片段。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1343257SQ0080487
公開日2002年4月3日 申請日期2000年2月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月11日
發(fā)明者M·艾洛伊特, B·G·克隆克沃斯基 申請人:梅瑞爾公司, 邁松阿爾福國立獸醫(yī)學(xué)院