專利名稱：具有半乳糖氧化酶活性的多肽和編碼它們的核酸的制作方法
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分離多肽和編碼這些多肽的分離核酸序列。本發(fā)明還涉及包含這些核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及制備和使用這些多肽的方法。
2、有關(guān)技術(shù)的說明在分子氧的存在下，半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)催化D一半乳糖的氧化作用，生成D-半乳-己二醛糖和過氧化氫。
半乳糖氧化酶已經(jīng)從下列來源分離到圓形多孔菌(Amarai等，1966，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)987-92；Avigad等，1962，《生物化學(xué)雜志》(Journal of Biological Chemistry)2372736-2743；Kosman等，1974，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)文獻(xiàn)》(Archives of Biochemistry and Biophysics)165456-467)、樹狀指孢(Tressel和Kosman，1982，《酶學(xué)方法》89163-171；Kellener等，1988，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)文獻(xiàn)》262349-354)、稻惡苗赤霉(Asaka和Terada，1982，《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)》(Agricultural and Biological Chemistry)46333-340)、禾谷鐮孢(Dias和Kemmelmeir，1987，《微生物學(xué)評(píng)論》(Rev.Microbiol.)18276-278)。
編碼半乳糖氧化酶的基因已經(jīng)從下列來源分離到橙色標(biāo)樁菌(Stigmatella aurantiaca)(Silakowski等，1998，《細(xì)菌學(xué)雜志》(Journal of Bacteriology)1801241-1247)和樹狀指孢(McPherson等，1992，《生物化學(xué)雜志》2678146-8152).
本發(fā)明的目的是提供具有半乳糖氧化酶活性的改進(jìn)多肽和編碼這些多肽的核酸。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分離多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2之氨基酸21至679具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)被在中等嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；(c)具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽的變體，包含一個(gè)或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)具有半乳糖氧化酶活性的(a)、(b)或(d)的片段。
本發(fā)明還涉及編碼這些多肽的分離核酸序列和包含這些核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體與宿主細(xì)胞，以及制備和使用這些多肽的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說明


圖1顯示Fusarium venenatum半乳糖氧化酶的基因組DNA序列和演繹氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS1和2)。
圖2顯示pSheB1的限制圖。
圖2顯示pEJG43的限制圖。
發(fā)明的詳細(xì)說明具有半乳糖氧化酶活性的多肽術(shù)語(yǔ)“半乳糖氧化酶活性”在本文中被定義為D-半乳糖氧6-氧化還原酶活性，它在分子氧的存在下催化D-半乳糖的氧化作用，生成D-半乳-己二醛糖和過氧化氫。除了D-半乳糖以外，其他天然底物包括但不限于二羥丙酮、甘油、棉子糖、甲基-α-D-吡喃半乳糖和甲基-β-D-吡喃半乳糖。出于本發(fā)明的目的，半乳糖氧化酶活性按照Baron等，1994，《生物化學(xué)雜志》26925095-25105所述操作加以測(cè)定，其中半乳糖氧化酶活性是這樣測(cè)量的將通過半乳糖氧化酶的作用從D(+)-半乳糖與O2產(chǎn)生過氧化氫和2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)在辣根過氧化酶存在下的氧化聯(lián)結(jié)在一起。一單位半乳糖氧化酶活性被定義為在24℃pH7下，每分鐘產(chǎn)生1微摩爾過氧化氫。
在第一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有這樣一種氨基酸序列的分離多肽，所述氨基酸序列對(duì)SEQ ID NO2之氨基酸21至679(即成熟多肽)具有至少約65％的同一性程度，優(yōu)選為至少約70％，更優(yōu)選為至少約80％，進(jìn)而更優(yōu)選為至少約90％，最優(yōu)選為至少約95％，進(jìn)而最優(yōu)選為至少約97％，該多肽具有半乳糖氧化酶活性(以下稱為“同源多肽”)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源多肽具有這樣一種氨基酸序列，它與SEQ ID NO2之氨基酸21至679的區(qū)別是五個(gè)氨基酸，優(yōu)選為四個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為三個(gè)氨基酸，進(jìn)而更優(yōu)選為兩個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為一個(gè)氨基酸。出于本發(fā)明的目的，兩種氨基酸序列之間的同一性程度采用GeneAssistTM軟件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)加以測(cè)定，使用修改的Smith-Waterman算法，BLOSUM 62矩陣的閾值為70。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位基因變體、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段。在更優(yōu)選的實(shí)施方式種，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2之氨基酸21至679或其等位基因變體、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2之氨基酸21至679。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽由SEQ IDNO2的氨基酸序列或其等位基因變體、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段組成。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽由SEQ IDNO2的氨基酸序列組成。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2之氨基酸21至679或其等位基因變體、或其具有半乳糖氧化酶活性的片段組成。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2之氨基酸21至679組成。
SEQ ID NO2的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪去一個(gè)或更多氨基酸的多肽。優(yōu)選地，片段含有至少560個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選為至少600個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選為至少640個(gè)氨基酸殘基。
等位基因變體表示占據(jù)相同染色體基因位點(diǎn)的基因的任意兩種或更多交替形式。等位基因變異在自然情況下是通過突變引起的，可以導(dǎo)致種群內(nèi)的多形現(xiàn)象?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有變化)，或者可能編碼氨基酸序列發(fā)生改變的多肽。多肽的等位基因變體是被基因的等位基因變體所編碼的多肽。
在第二種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分離多肽，是被這樣的核酸序列編碼的，它們?cè)诜浅５蛧?yán)格條件下與核酸探針雜交，優(yōu)選為低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選為中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選為中-高嚴(yán)格條件，進(jìn)而更優(yōu)選為高嚴(yán)格條件，最優(yōu)選為非常高的嚴(yán)格條件，該核酸探針在相同條件下與下列雜交(i)SEQ ID NO1之核苷酸61至2037，(ii)包含在SEQ ID N01之核苷酸61至2037中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.)。SEQ ID NO1的子序列可以是至少100個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選為至少200個(gè)核苷酸。而且，子序列可以編碼具有半乳糖氧化酶活性的多肽片段。多肽還可以是具有半乳糖氧化酶活性的多肽的等位基因變體或片段。
按照本領(lǐng)域的熟知方法，SEQ ID NO1的核酸序列或其子序列以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段可以用于設(shè)計(jì)核酸探針，以鑒別和克隆來自不同屬或種的菌株的具有半乳糖氧化酶活性的DNA編碼多肽。確切地說，這樣的探針能夠用于在標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡操作之后，與有關(guān)屬或種的基因組或cDNA雜交，目的是鑒別和分離其中相應(yīng)的基因。這樣的探針與完整序列相比可以是非常短的，但是在長(zhǎng)度上應(yīng)當(dāng)是至少15個(gè)、優(yōu)選為至少25個(gè)、更優(yōu)選為至少35個(gè)核苷酸。還能夠使用更長(zhǎng)的探針。DNA和RNA探針都能使用。在檢測(cè)相應(yīng)的基因時(shí)，通常對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋這樣的探針。
在從這些其他生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中，可以篩選出與上述探針雜交的DNA和編碼具有半乳糖氧化酶活性的多肽的DNA。來自這些其他生物的基因組或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳法或其他分離工藝加以分離。來自文庫(kù)的DNA或所分離的DNA可以被轉(zhuǎn)移和固定在硝基纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒別與SEQ ID NO1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印跡中使用該載體材料。出于本發(fā)明的目的，雜交表示在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下，核酸序列雜交到經(jīng)過標(biāo)記的核酸探針上，后者相當(dāng)于SEQ ID NO1所示核酸序列、它的互補(bǔ)鏈或其子序列。利用X-射線膜檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針是編碼SEQ ID NO2的多肽或其子序列的核酸序列。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針是SEQID NO1。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針是包含在質(zhì)粒pEJG45中的核酸序列，該質(zhì)粒是包含在大腸埃希氏桿菌NRRLB-30076中的，其中該核酸序列編碼具有半乳糖氧化酶活性的多肽。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸探針是包含在質(zhì)粒pEJG45中的成熟多肽編碼區(qū)，該質(zhì)粒是包含在大腸埃希氏桿菌NRRL B-30076中的。
關(guān)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格條件被定義為在下列條件下的預(yù)雜交和雜交在標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡操作后，在42℃下，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切與變性的鮭魚精液DNA中，并且非常低和低嚴(yán)格性為25％甲酰胺，中等和中-高嚴(yán)格性為35％甲酰胺，高和非常高嚴(yán)格性為50％甲酰胺。
關(guān)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，載體材料最后用2×SSC、0.2％SDS洗滌三次，每次15分鐘，溫度優(yōu)選為至少45℃(非常低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選為至少50℃(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選為至少55℃(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選為至少60℃(中-高嚴(yán)格性)，進(jìn)而更優(yōu)選為至少65℃(高嚴(yán)格性)，最優(yōu)選為至少70℃(非常高的嚴(yán)格性)。
關(guān)于長(zhǎng)度為約15個(gè)核苷酸至約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件被定義為在下列條件下的預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌在標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡操作之后，在低于按照Bolton和McCarthy(1962，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proceedings of the National Academy ofSciences USA)481390)所計(jì)算的Tm5℃至10℃的溫度下，在0.9M NaCl、0.09 M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt氏溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA每ml中。
關(guān)于長(zhǎng)度為約15個(gè)核苷酸至約70個(gè)核苷酸的短探針，載體材料用6×SCC加0.1％SDS洗滌15分鐘一次，用6×SSC洗滌兩次，每次15分鐘，溫度為低于所計(jì)算的Tm5℃至10℃。
在第三種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽變體，包含一個(gè)或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入。
多肽變體的氨基酸序列與SEQ ID NO2之氨基酸序列或其成熟多肽的區(qū)別可以是一個(gè)或更多氨基酸殘基的插入或缺失和/或一個(gè)或更多氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代。優(yōu)選地，氨基酸的變化是次要性質(zhì)，也就是不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常為一個(gè)至約30個(gè)氨基酸；小的氨基或羧基末端延長(zhǎng)，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；小的連接肽，至多為約20-25個(gè)殘基；或小的延長(zhǎng)，有利于通過改變凈電荷或另一種功能而純化，例如多組氨酸通路、抗原表位或結(jié)合域。
保守性取代的實(shí)例發(fā)生在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)。一般不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，例如描述在H.Neurath和R.L.Hill，1979，《蛋白質(zhì)》(The Proteins)，Academic Press，New York中。最常見的置換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及相反的這些。
在第四種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化學(xué)同一性或部分免疫化學(xué)同一性的分離多肽。免疫化學(xué)性質(zhì)是按照熟知的Ouchterlony雙向免疫擴(kuò)散操作，通過免疫交叉反應(yīng)同一性試驗(yàn)加以測(cè)定的。具體來說，按照Harboe和Ingild，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，編輯，《定量免疫電泳指南》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章、或Johnstone和Thorpe，《免疫化學(xué)實(shí)踐》(Immunochemistry in Practice)，Blackwell ScientificPublications，1982(更具體為27-31頁(yè))所述，通過免疫兔子(或其他嚙齒動(dòng)物)制備含有多克隆抗體的抗血清，這些抗體是免疫反應(yīng)性的或者與具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位結(jié)合。具有免疫化學(xué)同一性的多肽是以完全相同的方式與抗血清反應(yīng)的多肽，例如使用特定的免疫化學(xué)工藝所得到的沉淀的全部融合、完全相同的沉淀形態(tài)和/或完全相同的電泳移動(dòng)性。免疫化學(xué)同一性的進(jìn)一步解釋參見Axelsen，Bock和Kroll，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，編輯，《定量免疫電泳指南》，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章。具有部分免疫化學(xué)同一性的多肽是以部分相同的方式與抗血清反應(yīng)的多肽，例如利用特定的免疫化學(xué)工藝所得到的沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形態(tài)和/或部分相同的電泳移動(dòng)性。部分免疫化學(xué)同一性的進(jìn)一步解釋參見Bock和Axelsen，In N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks，編輯，《定量免疫電泳指南》，Blackwell ScientificPublications，1973，第11章。
抗體也可以是單克隆抗體。單克隆抗體例如可以按照E.Harlow和D.Lane，編輯，1988，《抗體實(shí)驗(yàn)室指南》(Antibodies，ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.的方法加以制備和使用。
本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO2之成熟多肽的半乳糖氧化酶活性的至少20％，優(yōu)選為至少40％，更優(yōu)選為至少60％，進(jìn)而更優(yōu)選為至少80％，進(jìn)而更優(yōu)選為至少90％，最優(yōu)選為至少100％。
本發(fā)明的多肽可以從任意屬的微生物獲得。出于本發(fā)明的目的，本文所用的與給定來源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“從……獲得”應(yīng)當(dāng)表示被核酸序列編碼的多肽是由該來源產(chǎn)生的，或者是由這樣一種細(xì)胞產(chǎn)生的，其中已經(jīng)插入來自該來源的核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽是細(xì)胞外分泌的。
本發(fā)明的多肽可以是真菌多肽，更優(yōu)選為酵母多肽，例如假絲酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬或Yarrowia多肽；或者更優(yōu)選為絲狀真菌多肽，例如支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球菌屬、Filibasidium，鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、白霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix、鏈孢霉屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、熱子囊菌屬、草根霉屬、Tolypocladium或木霉屬多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽是卡爾斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維氏糖酵母、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母多肽。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、桿孢狀鐮孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙鏈孢霉、產(chǎn)紫青霉、Trichoderma harzianum、康寧氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉多肽。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽是桿孢狀鐮孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum多肽。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，F(xiàn)usarium venenatum細(xì)胞是Fusariumvenenatum A3/5，最初作為禾谷鐮孢ATCC 20334而保藏的，最近Yoder和Christianson，1998，《真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)》(FungalGenetics and Biology)2362-80和O’Donnell等，1998，《真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)》2357-67將其重新分類為Fusariumvenenatum；以及Fusarium venenatum的分類學(xué)等價(jià)物，與它們目前已知的種名無(wú)關(guān)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，F(xiàn)usariumvenenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum A3/5或 Fusariumvenenatum ATCC 20334的形態(tài)突變體，參見WO 97/26330。
關(guān)于上述種類不言而喻的是，本發(fā)明涵蓋完整與不完整的狀態(tài)，和其他分類學(xué)等同物，例如無(wú)性型，與它們已知的種名無(wú)關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于認(rèn)識(shí)到適當(dāng)?shù)韧锏耐恍浴＠?，鐮孢屬的分類學(xué)等同物是由D.L.Hawksworth，P.M.Kirk，B.C.Sutton和D.N.Pegler(編輯)，1995，《Ainsworth與Bisby氏真菌辭典》(Ainsworth&Bisby’s Dictionary of the Fungi)，第八版，CAB International，University Press，Cambridge，England，pp.173-174所定義的。
這些種類的菌株在大量培養(yǎng)物保藏中心是易為公眾獲得的，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Col1ection(ATCC))、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection、Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，這些多肽可以利用上述探針從其他來源鑒別和獲得，包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物。從自然棲息地分離微生物的工藝是本領(lǐng)域熟知的。然后通過類似的篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)，可以衍生核酸序列。一旦已用探針檢測(cè)到編碼多肽的核酸序列，即可以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的工藝分離或克隆序列(例如參見Sambrook等，1989，出處同上)。
正如本文所定義的，“分離”多肽是基本上不含其他非半乳糖氧化酶多肽的多肽，根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定，純度例如為至少約20％，優(yōu)選為至少約40％，更優(yōu)選為約60％，進(jìn)而更優(yōu)選為約80％，最優(yōu)選為約90％，進(jìn)而最優(yōu)選為約95％。
被本發(fā)明核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中在該多肽或其片段的N-端或C-端融合了另一種多肽。融合多肽是這樣制備的，將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)融合到本發(fā)明的核酸序列(或其部分)上。制備融合多肽的工藝是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列，以便它們?cè)诳蚣軆?nèi)，并且融合多肽的表達(dá)受相同啟動(dòng)子和終止子的控制。
核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸序列列在SEQ ID NO1中。在另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸序列是包含在質(zhì)粒pEJG45中的序列，該質(zhì)粒是包含在大腸埃希氏桿菌NRRL B-30076中的。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸序列是包含在質(zhì)粒pEJG45中的成熟多肽編碼區(qū)，該質(zhì)粒是包含在大腸埃希氏桿菌NRRL B-30076中的。本發(fā)明還涵蓋這樣的核酸序列，它們編碼具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于SEQ ID NO1。本發(fā)明還涉及SEQ ID NOl的子序列，它們編碼具有半乳糖氧化酶活性的SEQ IDNO2片段。
SEQ ID NO1的子序列是由SEQ ID NO1所涵蓋的核酸序列，但是已從5，和/或3，末端刪去一個(gè)或更多核苷酸。優(yōu)選地，子序列含有至少1680個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至少1800個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為至少1920個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還涉及突變的核酸序列，在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，其中該突變的核酸序列編碼由SEQ IDNO2之氨基酸21至679組成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的工藝是本領(lǐng)域已知的，包括從基因組DNA分離、從cDNA制備或其組合。從基因組DNA克隆本發(fā)明核酸序列例如可以這樣進(jìn)行，利用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選，以檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的所克隆的DNA片段。例如參見Innis等，1990，《PCR方法與應(yīng)用指導(dǎo)》(PCRA Guide to Methods and Application)， Academic Press，NewYork。還可以使用其他核酸擴(kuò)增操作，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。核酸序列可以從鐮孢屬或另一種菌株或有關(guān)生物克隆，因此例如可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或變種。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離核酸序列”指的是基本上不含其他核酸序列的核酸序列，根據(jù)瓊脂糖電泳測(cè)定，純度例如至少為約20％，優(yōu)選為至少約40％，更優(yōu)選為至少約60％，進(jìn)而更優(yōu)選為至少約80％，最優(yōu)選為至少約90％。例如，分離核酸序列可以通過用在遺傳工程中的標(biāo)準(zhǔn)克隆操作獲得，使核酸序列從其天然位置重新定位到不同的位點(diǎn)，在那里它將被復(fù)制?？寺〔僮骺梢陨婕鞍幋a多肽的核酸序列的所需核酸片段的切除和分離、片段向載體分子中的插入和重組載體向宿主細(xì)胞中的摻入，在那里核酸序列的多個(gè)副本或克隆將被復(fù)制。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的或其任意組合。
本發(fā)明還涉及這樣的核酸序列，它們與SEQ ID N01的成熟多肽編碼區(qū)(即核苷酸61至2037)具有至少約65％的同源程度，優(yōu)選為約70％，優(yōu)選為約80％，更優(yōu)選為約90％，進(jìn)而更優(yōu)選為約95％，最優(yōu)選為約97％的同源性，這些序列編碼活性多肽。出于本發(fā)明的目的，兩種核酸序列之間的同源程度是這樣測(cè)定的按照Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》80726-730)，使用帶有同一性表格和下列多重排列參數(shù)的LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)缺口罰為10，缺口長(zhǎng)度罰為10。成對(duì)排列參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰＝3，窗口＝20。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的修飾對(duì)基本上相似于該多肽的多肽合成來說可能是必要的。術(shù)語(yǔ)“基本上相似”于該多肽指的是多肽的非天然存在形式。這些多肽可以在有些設(shè)計(jì)方式上不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、pH最優(yōu)值等方面不同的變體。變體的序列可以這樣構(gòu)建，在如SEQ ID NO1之多肽編碼部分所示核酸序列的基礎(chǔ)上，例如其子序列，和/或通過引入核苷酸取代，這些取代不會(huì)產(chǎn)生被核酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但是相當(dāng)于意欲制備酶的宿主生物的密碼子用途，或者通過引入產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代。關(guān)于核苷酸取代的一般說明，例如參見Ford等，1991，《蛋白質(zhì)表達(dá)與純化》(ProteinExpression and Purification)295-107。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的是這些取代可以在對(duì)分子功能起決定性作用的區(qū)域之外進(jìn)行，仍然會(huì)產(chǎn)生活性多肽。被本發(fā)明分離核酸序列編碼的多肽的活性所必需的氨基酸殘基——因此優(yōu)選地不進(jìn)行取代——可以按照本領(lǐng)域已知的操作加以鑒別，例如定向誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見Cunningham和Wells，1989，《科學(xué)》(Science)2441081-1085)。在后者工藝中，在分子中每個(gè)帶正電的殘基上引入突變，試驗(yàn)所得突變分子的半乳糖氧化酶活性，以鑒別對(duì)分子活性起決定性作用的氨基酸殘基。通過核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等工藝所測(cè)定的三維結(jié)構(gòu)分析，還能夠測(cè)定底物-酶相互作用的位點(diǎn)(例如參見de Vos等，1992，《科學(xué)》255306-312；Smith等，1992，《分子生物學(xué)雜志》(Journalof Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLetters 30959-64)。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列，它們?cè)诜浅５偷膰?yán)格條件下與核酸探針雜交，優(yōu)選為低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選為中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選為中-高嚴(yán)格條件，進(jìn)而更優(yōu)選為高嚴(yán)格條件，最優(yōu)選為非常高的嚴(yán)格條件，該核酸探針在相同條件下與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈、或其等位基因變體與子序列雜交(Sambrook等，1989，出處同上)，如本文所定義。
本發(fā)明還涉及通過下列步驟制備的分離核酸序列(a)在非常低、低、中等、中-高、高或非常高的嚴(yán)格條件下，雜交DNA與(i)SEQID NO1之核苷酸61至2037、(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸61至2037中的cDNA序列、(iii)(i)或(ii)的子序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；和(b)分離核酸序列。子序列優(yōu)選為至少100個(gè)核苷酸的序列，例如編碼具有半乳糖氧化酶活性的多肽片段的序列。
制備突變的核酸序列的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備突變的核酸序列的方法，包括向SEQ IDNO1的成熟多肽編碼序列或其子序列引入至少一個(gè)突變，其中該突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2之氨基酸21至679或其片段組成的、具有半乳糖氧化酶活性的多肽。
利用本領(lǐng)域已知的任意方法，可以通過定向誘變來實(shí)現(xiàn)向核酸序列引入突變以置換一個(gè)核苷酸為另一個(gè)核苷酸。特別有用的是這樣的操作，利用超螺旋的雙鏈DNA載體，其中具有有關(guān)的插入片段和兩個(gè)含有所需突變的合成引物。分別與載體的對(duì)立鏈互補(bǔ)的低聚核苷酸引物在溫度循環(huán)期間借助Pfu DNA聚合酶而延長(zhǎng)。引物一經(jīng)摻入，即生成含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)之后，將產(chǎn)物用DpnI處理，后者對(duì)甲基化與半甲基化的DNA是特異性的，以消化母體DNA模板和選擇含有突變的合成DNA。還可以使用本領(lǐng)域已知的其他操作。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的核酸構(gòu)建體，它們?cè)诓僮魃峡蛇B接到一個(gè)或更多控制序列上，該控制序列指向在適合的宿主細(xì)胞中編碼序列在與控制序列相容的條件下的表達(dá)。表達(dá)將被理解為包括任何涉及多肽產(chǎn)生的步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在本文中被定義為這樣一種單鏈或雙鏈的核酸分子，它是從天然存在的基因中分離的，或者經(jīng)過修飾含有以自然界不會(huì)存在的方式聯(lián)合和并置的核酸區(qū)段。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明編碼序列的表達(dá)所需全部控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)彈夾是同義的。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在本文中被定義為這樣一種核酸序列，它直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般是由恰好位于mRNA 5’末端可讀框架上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)和恰好位于mRNA 3’末端可讀框架下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定的。編碼序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重組的核酸序列。
編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列可以以各種方式進(jìn)行處理，以供多肽的表達(dá)。核酸序列在其插入載體之前的處理可以是可取的或必要的，因表達(dá)載體而異。利用重組DNA法修飾核酸序列的工藝是本領(lǐng)域熟知的。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文中被定義為包括全部對(duì)本發(fā)明多肽的表達(dá)來說是必要或有利的組分。每種控制序列都可以是編碼多肽的核酸序列天生的或外來的。這樣的控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。控制序列最起碼包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄與翻澤終止信號(hào)?？刂菩蛄锌梢跃哂薪宇^，目的是引入特殊的限制位點(diǎn)，有利于控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)連接。術(shù)語(yǔ)“在操作上可連接”在本文中被定義為這樣一種構(gòu)型，其中相對(duì)DNA序列的編碼序列而言，控制序列被適當(dāng)放置在這樣一個(gè)位置，使控制序列指向多肽的表達(dá)。
控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，這是被宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列，用于核酸序列的表達(dá)。啟動(dòng)子序列含有轉(zhuǎn)錄的控制序列，介導(dǎo)多肽的表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以是任意在所選的宿主細(xì)胞內(nèi)顯示轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，包括突變、截短和雜種啟動(dòng)子，可以從編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得，這些多肽與宿主細(xì)胞是同源的或異源的。
適合于指向本發(fā)明核酸構(gòu)建體——尤其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中——轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子實(shí)例是從下列來源獲得的啟動(dòng)子大腸埃希氏桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖生成酶基因(sacB)、地衣型芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因(amyM)、液化淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣型芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA與xylB基因和原核生物β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》753727-3731)以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》8021-25)。其他啟動(dòng)子描述在“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”(Useful proteins fromrecombinant bacteria)，《科學(xué)美國(guó)人》(Scientific American)，1980，24274-94和Sambrook等，1989，出處同上。
適合于指向本發(fā)明核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子實(shí)例是從下列來源獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)的基因以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶與米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子雜種)和其突變、截短與雜種啟動(dòng)子。
在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子是從啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的。關(guān)于酵母宿主細(xì)胞，其他有用的啟動(dòng)子描述在Romanos等，1992，《酵母》(Yeast)8423-488中。
控制序列還可以是適合的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列在操作上可連接到編碼多肽的核酸序列3’末端。任何在所選的宿主細(xì)胞中起作用的終止子都可以用在本發(fā)明中。
關(guān)于絲狀真菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的。
關(guān)于酵母宿主細(xì)胞，優(yōu)選的終止子是從啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的。關(guān)于酵母宿主細(xì)胞，其他有用的終止子描述在Romanos等，1992，出處同上。
控制序列還可以是適合的前導(dǎo)序列，這是mRNA的非翻譯區(qū)，對(duì)宿主細(xì)胞翻譯來說是重要的。前導(dǎo)序列在操作上可連接到編碼多肽的核酸序列5’末端。任何在所選的宿主細(xì)胞中起作用的前導(dǎo)序列都可以用在本發(fā)明中。
關(guān)于絲狀真菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選的前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因獲得的。
適合于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列是從啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α-因子和啤酒糖酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的。
控制序列還可以是多腺苷酸化序列，該序列在操作上可連接到核酸序列的3’末端，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，被宿主細(xì)胞識(shí)別為向所轉(zhuǎn)錄的mRNA加入多腺苷殘基的信號(hào)。任何在所選的宿主細(xì)胞中起作用的多腺苷酸化序列都可以用在本發(fā)明中。
關(guān)于絲狀真菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選的多腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因獲得的。
關(guān)于酵母宿主細(xì)胞，有用的多腺苷酸化序列描述在Guo和Sherman，1995，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Molecular Cellular Biology)155983-5990中。
控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，它編碼與多肽氨基末端連接的氨基酸序列，使所編碼的多肽指向細(xì)胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列5’端可以固有地含有這樣一種信號(hào)肽編碼區(qū)，它在翻譯閱讀框架中與編碼所分泌的多肽的編碼區(qū)區(qū)段是天然連接的。或者，編碼序列5’端可以含有對(duì)編碼序列來說是外來的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列天然不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來的信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘?，外來的信號(hào)肽編碼區(qū)可以簡(jiǎn)單地替代天然的信號(hào)肽編碼區(qū)，目的是增強(qiáng)多肽的分泌。不過，任何使所表達(dá)的多肽指向所選的宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可以用在本發(fā)明中。
關(guān)于細(xì)菌宿主細(xì)胞，有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從下列來源獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837麥芽淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣型芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣型芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因。其他信號(hào)肽描述在Simonen和Palva，1993，《微生物學(xué)評(píng)論》57109-137中。
關(guān)于絲狀真菌宿主細(xì)胞，有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從下列來源獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，信號(hào)肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO2之氨基酸1至20的SEQ ID NO1之核苷酸1至60。
關(guān)于酵母宿主細(xì)胞，有用的信號(hào)肽是從啤酒糖酵母5-因子和啤酒糖酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得的。其他有用的信號(hào)肽編碼區(qū)描述在Romanos等，1992，出處同上。
控制序列還可以是前肽編碼區(qū)，它編碼定位在多肽氨基末端上的氨基酸序列。所得多肽已知是酶前體或前多肽(或者在有些情況下是酶原)。前多肽一般是無(wú)活性的，能夠通過前肽的催化性或自動(dòng)催化性裂解而從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母5-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila漆酶的基因(WO 95/33836)獲得。
當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端上時(shí)，前肽區(qū)定位在多肽氨基末端旁邊，信號(hào)肽區(qū)定位在前肽區(qū)氨基末端旁邊。
還有可能加入調(diào)節(jié)序列，允許多肽表達(dá)相對(duì)于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是導(dǎo)致基因表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而開或關(guān)的那些，包括調(diào)節(jié)化合物的存在。原核生物系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。其他調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核生物系統(tǒng)中，這些包括在甲氨蝶呤的存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和與重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將在操作上與調(diào)節(jié)序列連接。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止信號(hào)?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸與控制序列連接在一起，形成重組表達(dá)載體，它可以包括一個(gè)或更多適宜的限制位點(diǎn)，允許編碼多肽的核酸序列在這樣的位點(diǎn)上插入或取代?；蛘?，本發(fā)明的核酸序列可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中而進(jìn)行表達(dá)。在創(chuàng)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體中，以便編碼序列在操作上可與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列連接。
重組表達(dá)載體可以是任何能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作并且能夠引起核酸序列表達(dá)的載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常將取決于載體與所要引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或封閉循環(huán)的質(zhì)粒。
載體可以是自發(fā)復(fù)制的載體，即以非染色體性實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制與染色體復(fù)制無(wú)關(guān)，例如質(zhì)粒、非染色體性元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有任意確保自我復(fù)制的手段?；蛘?，載體可以在引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組內(nèi)，與已被整合的染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；蛘邇蓚€(gè)或更多載體或質(zhì)粒，它們一起含有所要引入到宿主細(xì)胞基因組中的全體DNA、或轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或更多可選擇的標(biāo)記物，易于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可選擇的標(biāo)記物是這樣一種基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒耐受性、對(duì)重金屬的耐受性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌可選擇的標(biāo)記物實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da1基因，或者賦予抗生素耐受性的標(biāo)記物，例如氨芐西林、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素耐受性。適合于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的可選擇標(biāo)記物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)及其等價(jià)物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS與pyrG基因和吸水鏈霉菌的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有允許載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或者允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自發(fā)復(fù)制的元件。
關(guān)于向宿主細(xì)胞基因組中的整合，載體可以依賴于編碼多肽的核酸序列或任何其他適合于載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合到基因組中的載體元件?；蛘?，載體可以含有其他指向通過同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中的核酸序列。其他核酸序列使載體能夠整合到宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加整合到精確位置的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地含有足夠數(shù)量的核酸，例如100至1500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選為400至1500個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選為800至1500個(gè)堿基對(duì)，它們與對(duì)應(yīng)的靶序列是高度同源的，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
關(guān)于自發(fā)復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述宿主細(xì)胞中自發(fā)復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)。細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)實(shí)例是允許在大腸埃希氏桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制起始點(diǎn)。用在酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起始點(diǎn)實(shí)例是復(fù)制的2微米起始點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合和ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起始點(diǎn)可以是具有這樣一種突變者，使其在宿主細(xì)胞中的功能是溫度敏感性的(例如參見Ehrlich，1978，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》751433)。
向宿主細(xì)胞中可以插入一個(gè)以上本發(fā)明核酸序列的副本，以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。核酸序列副本數(shù)量的增加可以這樣實(shí)現(xiàn)，向宿主細(xì)胞基因組中整合至少一種另外的序列副本，或者包括帶有核酸序列的、可擴(kuò)增的可選擇的標(biāo)記基因，其中通過在適當(dāng)選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，能夠選擇含有可選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增副本以及核酸序列的其他副本。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如參見Sambrook等，1989，出處同上)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，包含本發(fā)明的核酸序列，它們有利地用于多肽的重組制備。向宿主細(xì)胞中引入包含本發(fā)明核酸序列的載體，以便使載體保持染色體完整或者如前所述作為自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋母體細(xì)胞的任何因發(fā)生在復(fù)制期間的突變而不等同于母體細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞的微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞的微生物，例如真核生物。
有用的單細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌、液化淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如變青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸埃希氏桿菌和假單胞菌。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性芽孢桿菌。
向細(xì)菌宿主細(xì)胞引入載體例如可以這樣進(jìn)行，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如參見Chang和Cohen，1979，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Molecular General Genetics)168111-115)、利用活性細(xì)胞(例如參見Young和Spizizin，1961，《細(xì)菌學(xué)雜志》81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，《分子生物學(xué)雜志》56209-221)、電穿孔(例如參見Shigekawa和Dower，1988，《生物工藝》(Biotechniques)6742-751)或接合(例如參見Koehler和Thorne，1987，《細(xì)菌學(xué)雜志》1695771-5278)。
宿主細(xì)胞可以是真核生物、例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌的細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、壺菌綱和接合菌綱(如Hawksworth等定義，《Ainsworth與Bisby氏真菌辭典》，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌亞綱(如Hawksworth等所引用，1995，出處同上，171頁(yè))和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出處同上)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(酵母目)、產(chǎn)擔(dān)子孢子酵母和屬于不完全菌綱(芽生菌目)的酵母。由于將來酵母的分類可能發(fā)生改變，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)根據(jù)《酵母的生物學(xué)與活性》(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所述加以定義。
在進(jìn)而更優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬或Yarrowia細(xì)胞。
在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維氏糖酵母、Saccharomyces norbensis或卵形糖酵母細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維氏酵母細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌和卵菌亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等所定義，1995，出處同上)。絲狀真菌的特征在于菌絲壁由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜的多糖組成。植物性生長(zhǎng)是通過菌絲伸長(zhǎng)進(jìn)行的，碳的分解代謝必須是需氧的。相形之下，啤酒糖酵母等酵母的植物性生長(zhǎng)是通過單細(xì)胞葉狀體的芽生進(jìn)行的，碳的分解代謝可以是發(fā)酵的。
在進(jìn)而更優(yōu)選的實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是下列種類的細(xì)胞，但不限于支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、白霉屬、毀絲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、草根霉屬、Tolypocladium或木霉屬。
在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、(Nirenborg sop.nov.)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙鏈孢霉、產(chǎn)紫青霉、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康寧氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細(xì)胞。
真菌細(xì)胞可以按本身已知的方式轉(zhuǎn)化，其過程涉及原生質(zhì)體生成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁的再生。適合于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的操作描述在EP 238 023和Yelton等，1984，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》811470-1474中。適合于轉(zhuǎn)化鐮孢屬的方法描述在Malardier等，1989，《基因》(Gene)78147-156和WO 96/00787中。酵母可以用下述方法轉(zhuǎn)化Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編輯，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)(Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology)，《酶學(xué)方法》，194卷，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，《細(xì)菌學(xué)雜志》153163；和Hinnen等，1978，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》751920。
制備方法本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)這樣一種菌株，它的野生型能夠產(chǎn)生多肽，制得包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。優(yōu)選地，該菌株是鐮孢屬，更優(yōu)選為Fusarium venenatum。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含突變的核酸序列，該序列在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)具有至少一種突變，其中該突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2之氨基酸21至679組成的多肽；和(b)回收多肽。
在本發(fā)明的制備方法中，利用本領(lǐng)域已知的方法，在適合于多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以這樣培養(yǎng)，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐內(nèi)、在適合的培養(yǎng)液中進(jìn)行，在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行。利用本領(lǐng)域已知的操作，在包含碳與氮源和無(wú)機(jī)鹽的適合的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。適合的培養(yǎng)液可從供應(yīng)商處獲得，或者可以按照已公開的組成制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄)。如果多肽被分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中，可以直接從培養(yǎng)液中回收多肽。如果沒有分泌多肽，則可以從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收之。
多肽可以利用對(duì)多肽來說是特異性的本領(lǐng)域已知方法加以檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可以包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的生成或酶底物的消失。例如，如本文所述，酶測(cè)定法可以用于測(cè)定多肽的活性。
所得多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法加以回收。例如，多肽可以通過常規(guī)操作從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中回收，這些操作包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
本發(fā)明的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的各種操作加以純化，這些操作包括但不限于色譜法(例如離子交換、親合、疏水性、色譜聚焦和體積排阻)、電泳操作(例如制備型等電位聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(例如參見《蛋白質(zhì)純化》(Protein Purification)J.-C.Janson和Lars Ryden，編輯，VCHPublishers，New York，1989)。
植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，它們已經(jīng)用本發(fā)明的編碼具有半乳糖氧化酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化，以便以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生多肽。多肽可以從植物或植物部分中回收?；蛘撸兄亟M多肽的植物或植物部分本身可以用于提高食品或飼料的質(zhì)量，例如提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、可口性和流變性質(zhì)，或者破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例是禾草，例如草地早熟禾(早熟禾，早熟禾屬)，飼用牧草，例如羊茅屬、黑麥草屬，溫帶草，例如剪股穎屬，和谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻米、高梁和玉蜀黍(玉米)。
雙子葉植物的實(shí)例是煙草，豆類，例如白羽扇豆，馬鈴薯，甜菜，豌豆，蠶豆和大豆，和十字花科植物(蕓苔科)，例如花椰菜、蕓苔籽，和密切相關(guān)的典型生物擬南芥。
植物部分的實(shí)例是莖、愈合組織、葉、根、果實(shí)、種子和塊莖。特殊的植物組織也被認(rèn)為是植物部分，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、空泡、過氧物酶體和細(xì)胞質(zhì)。此外，任何植物細(xì)胞都被認(rèn)為是植物部分，無(wú)論組織起源如何。
還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。
表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以按照本領(lǐng)域已知的方法加以構(gòu)建。簡(jiǎn)言之，植物或植物細(xì)胞是這樣構(gòu)建的，將一種或更多編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體摻入到植物宿主基因組中，使所得經(jīng)過修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖成為轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞。
表達(dá)構(gòu)建體適宜為核酸構(gòu)建體，它包含編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，在操作上可與適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄性谒x的植物或植物部分中表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含可選擇的標(biāo)記物，用于鑒別已經(jīng)整合表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞和構(gòu)建體引入到所述植物中所必要的DNA序列(后者取決于所使用的DNA引入方法)。
在需要多肽何時(shí)、何處和如何表達(dá)的基礎(chǔ)上，決定調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子與終止子序列和可選的信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或可誘導(dǎo)的，或者可以是發(fā)展的、階段或組織特異性的，基因產(chǎn)物可以定向于特殊的組織或植物部分，例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列例如描述在Tague等，1988，《植物生理學(xué)》(Plant Physiology)86506中。
關(guān)于組成型表達(dá)，可以使用35S-CaMV啟動(dòng)子(Franck等，1980，《細(xì)胞》(Cell)21285-294)。器官特異性啟動(dòng)子例如可以是來自貯藏組織、例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)或來自代謝組織、例如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等，1994，《植物分子生物學(xué)》(Plant Mol.Biol.)24863-878)，種子特異性啟動(dòng)子，例如來自稻米的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白(Wu等，1998，《植物與細(xì)胞生理學(xué)》(Plant and Cell Physiology)39885-889)，來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動(dòng)子和來自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad等，1998，《植物生理學(xué)雜志》(Journal of Plant Physiology)152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動(dòng)子(Chen等，1998，《植物與細(xì)胞生理學(xué)》39935-941)，來自蔓菁的貯藏蛋白napA，或本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動(dòng)子，例如描述在WO 91/14772中。此外，啟動(dòng)子可以是葉特異性啟動(dòng)子，例如來自稻米或馬鈴薯的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，《植物生理學(xué)》102991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，《植物分子生物學(xué)》2685-93)或來自稻米的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》248668-674)，或傷口可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，《植物分子生物學(xué)》22573-588)。
還可以使用啟動(dòng)子增強(qiáng)元件，以實(shí)現(xiàn)酶在植物中的更高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)元件可以是內(nèi)含子，它被放置在啟動(dòng)子與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如，Xu等，1993，出處同上公開了稻米肌動(dòng)蛋白1基因的第一種內(nèi)含子用于增強(qiáng)表達(dá)。
可選擇的標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以從本領(lǐng)域可得到的那些中選擇。
按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)工藝將核酸構(gòu)建體摻入到植物基因組中，包括土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量注射、粒子轟擊、生物分解轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，《科學(xué)》2441293；Potrykus，1990，《生物技術(shù)》(BioTechnology)8535；Shimamoto等，1989，《自然》(Nature)338274).
目前，根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于生成轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的所選方法(關(guān)于評(píng)論，參見Hooykas和Schilperoort，1992，《植物分子生物學(xué)》1915-38)。不過，還能夠用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管其他轉(zhuǎn)化方法一般也是這些植物所優(yōu)選的。目前，用于生成轉(zhuǎn)基因單子葉植物的所選方法是embryonic calli或正在發(fā)育的胚胎的粒子轟擊(細(xì)微的金或鎢粒子涂以轉(zhuǎn)化DNA)(Christou，1992，《植物雜志》(Plant Journal)2275-281；Shimamoto，1994，《生物技術(shù)流行觀點(diǎn)》(Current Opinion Biotechnology)5158-162；Vasil等，1992，《生物技術(shù)》10667-674)。單子葉植物轉(zhuǎn)化的另一種方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的，如Omirulleh等，1993，《植物分子生物學(xué)》21415-428所述。
轉(zhuǎn)化之后，按照本領(lǐng)域熟知的方法選擇其中摻入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，再生為全植物。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其中包含編碼本發(fā)明的具有半乳糖氧化酶活性的多肽的核酸序列；和(b)回收多肽。
半乳糖氧化酶活性的除去或減少本發(fā)明還涉及制備母體細(xì)胞的突變細(xì)胞的方法，該方法包括破裂或刪去編碼多肽的核酸序列或其控制序列，導(dǎo)致當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞比母體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽。
半乳糖氧化酶活性減少的菌株的構(gòu)建可以適宜這樣實(shí)現(xiàn)，修飾或滅活對(duì)具有半乳糖氧化酶活性的多肽在細(xì)胞中的表達(dá)來說必要的核酸序列。所要修飾或滅活的核酸序列例如可以是編碼對(duì)表達(dá)半乳糖氧化酶活性來說必要的多肽或其部分的核酸序列，或者是可以具有多肽從核酸序列的編碼序列表達(dá)所需的調(diào)節(jié)功能的核酸序列。這樣一種調(diào)節(jié)或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響多肽表達(dá)的部分。關(guān)于可能的修飾，其他控制序列如上所述。
核酸序列的修飾或滅活可以這樣進(jìn)行，使細(xì)胞受到誘變作用，選擇或篩選其中半乳糖氧化酶產(chǎn)生能力已經(jīng)減少的細(xì)胞。誘變可以是特異性的或隨機(jī)的，例如可以這樣進(jìn)行，利用適合的物理或化學(xué)誘變劑，利用適合的低聚核苷酸，或者使DNA序列受到PCR生成的誘變作用。此外，可以利用這些誘變劑的任意組合進(jìn)行誘變。
適合于該目的的物理或化學(xué)誘變劑實(shí)例包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
當(dāng)使用這樣的試劑時(shí)，誘變通常這樣進(jìn)行，在適合條件下、在誘變劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，使其發(fā)生誘變，選擇表現(xiàn)出減少的半乳糖氧化酶活性或產(chǎn)生的細(xì)胞。
本發(fā)明多肽產(chǎn)生的修飾或滅活可以這樣實(shí)現(xiàn)，引入、取代或除去編碼多肽的核酸序列或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件中的一個(gè)或更多核苷酸。例如，可以插入或除去核苷酸，以導(dǎo)致終止密碼子的引入、起始密碼子的除去或可讀框架的改變。這些修飾或滅活可以這樣實(shí)現(xiàn)，按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行指向位點(diǎn)的誘變或PCR生成的誘變。盡管在原則上，修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)所要修飾的核酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，不過優(yōu)選的是修飾是在體外進(jìn)行的，如下例示。
消除或減少宿主細(xì)胞產(chǎn)生的常規(guī)方法實(shí)例是通過基因替代或基因間斷。在基因間斷方法中，體外誘變相當(dāng)于有關(guān)內(nèi)源性基因或基因片段的核酸序列，產(chǎn)生有缺陷的核酸序列，后者然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生有缺陷的基因。通過同源重組，有缺陷的核酸序列替代內(nèi)源性基因或基因片段。也可能可取的是，有缺陷的基因或基因片段也編碼標(biāo)記物，后者可以用于選擇其中編碼多肽的基因已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。
或者，核酸序列的修飾或滅活可以采用與多肽編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列的既定反義工藝進(jìn)行。更具體地說，通過引入與編碼多肽的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該多肽可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，并且能夠與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多肽mRNA雜交，可以減少或消除由細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。在允許互補(bǔ)反義核苷酸序列與多肽mRNA雜交的條件下，減少或消除了所翻譯的多肽的量。
優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的方法所要修飾的細(xì)胞是微生物起源的細(xì)胞，例如適合于產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物的真菌菌株，與細(xì)胞是同源的或異源的均可。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及母體細(xì)胞的突變細(xì)胞，包含編碼多肽的核酸序列或其控制序列的破裂或缺失，導(dǎo)致突變細(xì)胞產(chǎn)生比母體細(xì)胞更少的多肽。
如此創(chuàng)建的多肽缺陷型突變細(xì)胞特別可用作宿主細(xì)胞，用于同源和/或異源多肽的表達(dá)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備同源或異源多肽的方法，包括(a)在有助于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收多肽。術(shù)語(yǔ)“同源多肽”在本文中被定義為不是宿主細(xì)胞天生的多肽、其中已經(jīng)經(jīng)過修飾而改變天生序列的天生蛋白質(zhì)或作為重組DNA工藝處理宿主細(xì)胞的結(jié)果其表達(dá)被定量改變的天生蛋白質(zhì)。
本發(fā)明在進(jìn)一步的方面涉及制備基本上沒有半乳糖氧化酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，該方法是發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明多肽以及有關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細(xì)胞，發(fā)酵的方法是在發(fā)酵之前、發(fā)酵期間或發(fā)酵已經(jīng)完成之后向發(fā)酵肉湯中加入有效量的能夠抑制半乳糖氧化酶活性的試劑，從發(fā)酵肉湯中回收有關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可選地對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
本發(fā)明在進(jìn)一步的方面涉及制備基本上沒有半乳糖氧化酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，該方法是在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)所得培養(yǎng)肉湯進(jìn)行聯(lián)合的pH與溫度處理，以便從實(shí)質(zhì)上減少半乳糖氧化酶活性，從培養(yǎng)肉湯中回收產(chǎn)物?；蛘撸梢詫?duì)從培養(yǎng)肉湯中回收的酶制劑進(jìn)行聯(lián)合的pH與溫度處理。聯(lián)合的pH與溫度處理可以可選地用在與半乳糖氧化酶抑制劑的組合處理中。
按照發(fā)明的這個(gè)方面，有可能除去至少60％、優(yōu)選為至少75％、更優(yōu)選為至少85％、進(jìn)而更優(yōu)選為至少95％、最優(yōu)選為至少99％的半乳糖氧化酶活性。利用這種方法可以完全除去半乳糖氧化酶活性。
聯(lián)合的pH與溫度處理優(yōu)選地是這樣進(jìn)行的，在6.5-7的pH下，在40-70℃的溫度下，處理足夠的時(shí)間階段以達(dá)到所需效果，通常，30至60分鐘足矣。
用于培養(yǎng)和純化有關(guān)產(chǎn)物的方法可以是本領(lǐng)域已知的方法。
用于制備基本上不含半乳糖氧化酶的產(chǎn)物的本發(fā)明方法在真核生物多肽的制備中是特別有意義的，特別是真菌蛋白，例如酶。酶例如可以選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、碳水化物酶、羧基肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)素酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、鹽過氧化酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠糖分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。半乳糖氧化酶缺陷型細(xì)胞也可以用于表達(dá)藥物意義上的異種蛋白，例如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。
不言而喻的是術(shù)語(yǔ)“真核生物多肽”不僅包括天生的多肽，而且包括這樣的多肽，例如酶，它們已經(jīng)經(jīng)過氨基酸取代、刪去或加成的修飾，或者其他修飾，以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等。
本發(fā)明在進(jìn)一步的方面涉及基本上沒有半乳糖氧化酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它是用本發(fā)明的方法制備的。
用途本發(fā)明還涉及使用具有半乳糖氧化酶活性的多肽的方法。
本發(fā)明的多肽可以用于半乳糖的定量測(cè)定，采用Buglova，1983，Mikrobiol.Zh.4570-77所述方法。
本發(fā)明的多肽還可以用于產(chǎn)生過氧化氫。
信號(hào)肽本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，它包含編碼在操作上可連接到核酸序列上的蛋白質(zhì)的基因，該核酸序列由SEQ ID NO1之核苷酸1至60組成，后者編碼由SEQ ID NO2之氨基酸1至20組成的信號(hào)肽，其中該基因?qū)υ摵怂嵝蛄衼碚f是外來的。
本發(fā)明還涉及包含這樣一種核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)這樣一種重組宿主細(xì)胞；和(b)回收蛋白質(zhì)。
核酸序列在操作上可以與其他控制序列連接到外來基因上。這些其他控制序列是如上所述的。
蛋白質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞來說可以是天生的或異種的。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在本文中不表示具體長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”也涵蓋兩種或更多結(jié)合形成編碼產(chǎn)物的多肽?！暗鞍踪|(zhì)”還包括雜種多肽，它包含從至少兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)獲得的部分或完全多肽序列的組合，其中一個(gè)或以上蛋白質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞來說可以是異源的或天生的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括天然存在的上述蛋白質(zhì)與雜種蛋白質(zhì)的等位與工程變體。
優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分或報(bào)告基因。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在進(jìn)而更優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是氨基肽酶、淀粉酶、碳水化物酶、羧基肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)素酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠糖分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
基因可以從任何原核生物、真核生物或其他來源獲得。出于本發(fā)明的目的，本文所用的與給定來源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“從……獲得”應(yīng)當(dāng)表示蛋白質(zhì)是由該來源產(chǎn)生的，或者是由其中已經(jīng)插入來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例加以進(jìn)一步描述，它們不應(yīng)被解釋為限制發(fā)明的范圍。
實(shí)施例作為緩沖劑和底物使用的化學(xué)品是至少為試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。
培養(yǎng)液和溶液每升COVE痕量金屬溶液的組成為0.04g NaB4O7·10H2O、0.4gCuSO4·5H2O、1.2g FeSO4·7H2O、0.7gMnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H2O和10g ZnSO4·7H2O。
每升50X COVE鹽溶液的組成為26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76gKH2PO4和50ml COVE痕量金屬。
每升COVE培養(yǎng)液的組成為342.3g蔗糖、20ml 50X COVE鹽溶液、10mi 1M乙酰胺、10ml 1.5M CsCl2和25g Noble瓊脂。
每升50X Vogels培養(yǎng)液的組成為150g檸檬酸鈉、250g KH2PO4、10g MgSO4·7H2O、10g CaCl2·2H2O、2.5ml生物素儲(chǔ)備溶液和5.0mlAMG痕量金屬溶液。
每升COVE頂層瓊脂糖的組成為20ml 50X COVE鹽、0.8M蔗糖、1.5M氯化銫、1.0M乙酰胺和10g低熔點(diǎn)瓊脂糖，pH調(diào)為6.0。
每升RA孢子形成培養(yǎng)液的組成為50g琥珀酸、12.1g NaNO3、1g葡萄糖、20ml 50X Vogels和0.5ml 10mg/ml NaMoO4儲(chǔ)備溶液，pH調(diào)為6.0。
每升YEPG培養(yǎng)液的組成為10g酵母浸膏、20g胨和20g葡萄糖。
STC的組成為0.8M山梨糖醇、25mM Tris pH 8、25mM CaCl2。
SPTC的組成為40％PEG 4000、0.8M山梨糖醇、25mM Tris pH8、25mM CaCl2。
每升M400Da培養(yǎng)液的組成為50g麥芽糖糊精、2g MgSO47H2O、2g KH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母浸膏、2g尿素和1ml COVE痕量金屬溶液。
實(shí)施例1Fusarium venenatum菌絲的分離Fusarium venenatum CCl-3是鐮孢屬菌株ATCC 20334的形態(tài)突變體(Wiebe等，1991，《真菌學(xué)研究》(Mycol.Research)951284-1288)，使其在兩升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵流程，使用NUTRIOSETM(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，F(xiàn)rance)作為碳源和酵母浸膏。在飼料中提供磷酸銨。pH保持在6至6.5，溫度保持在30℃，含有陽(yáng)性(positive)溶解氧。
在接種后2、4、6和8天收獲菌絲樣本，在液氮中快速冷凍。將樣本貯藏在-80℃下，直到將它們破裂用于RNA提取。
實(shí)施例2cDNA文庫(kù)的構(gòu)建按照Timberlake和Barnard的方法(1981，《細(xì)胞》2629-37)，從實(shí)施例1所述菌絲樣本中提取全細(xì)胞RNA，從1％甲醛-瓊脂糖凝膠得到印跡，用RNA雜交分析RNA樣本(Davis等，1986，《分子生物學(xué)基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier《科學(xué)》Publishing Co.，Inc.，N.Y.)。按照廠商的教導(dǎo)，用mRNASeparator KitTM(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，Caiif.)從全RNA中分離多腺苷酸化的mRNA部分。按照Gubler和Hoffman的方法(1983，《基因》25263-269)，利用大約5μg poly(A)+mRNA合成雙鏈cDNA，但是使用NotI-(dT)18引物(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，N.J.)引發(fā)第一條鏈的合成。將cDNA用綠豆核酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，Ind.)處理，末端用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，Mass.)鈍化。
將cDNA用NotI消化，用瓊脂糖凝膠電泳選擇大小(約0.7-4.5kb)，與pZErO-2.1(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)連接，后者已經(jīng)用NotI加EcoRV裂解，用小牛腸堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN)脫磷酸化。連接混合物用于轉(zhuǎn)化活性大腸埃希氏桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。在2YT瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體(Miller，1992，《細(xì)菌遺傳學(xué)速成》(A Short Course inBacterial Genetics).《大腸埃希氏桿菌與有關(guān)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室指南和手冊(cè)》(A Laboratory Manual and Handbook for Escherichiacoli and Related Bacteria)，Cold Spting Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)，平板含有最終濃度為50μg/ml的卡那霉素。
利用質(zhì)?？寺≥d體pZErO-2.1構(gòu)建兩種獨(dú)立的方向性cDNA文庫(kù)。利用來自第四天收獲的菌絲的mRNA制備文庫(kù)A，利用來自第六天的mRNA構(gòu)建文庫(kù)B。兩種cDNA文庫(kù)都不擴(kuò)增，目的是檢查細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)概況的代表性“瞬間圖象”。反而將文庫(kù)平板接種、滴定，通過DNA測(cè)序分析彼此獨(dú)立的克隆。
文庫(kù)A(4天細(xì)胞)由約7.5×104個(gè)獨(dú)立的克隆組成，文庫(kù)B(6天細(xì)胞)由約1.2×105個(gè)克隆組成。從每個(gè)文庫(kù)的四十個(gè)菌落中分離小量制備的DNA，檢查cDNA插入片段的存在和大小。在本項(xiàng)分析中，來自文庫(kù)A的40個(gè)菌落中有39個(gè)(97.5％)含有插入片段，大小為600bp至2200bp(平均＝1050bp)。類似地，取自文庫(kù)B的40個(gè)菌落中有39個(gè)(97.5％)具有插入片段，大小為800bp至3600bp(平均＝1380bp)。
實(shí)施例3模板制備和核苷酸測(cè)序從每個(gè)實(shí)施例2所述cDNA文庫(kù)中，直接將轉(zhuǎn)化平板中的1192個(gè)轉(zhuǎn)化體菌落拾取到96孔微量滴定皿中，后者含有200μl 2YT肉湯(Miller，1992，出處同上)和50μg/ml卡那霉素。將平板在37℃下培養(yǎng)過夜，無(wú)需搖動(dòng)。培養(yǎng)后，向每孔中加入100μl無(wú)菌的50％甘油。將轉(zhuǎn)化體復(fù)制到次級(jí)深皿96孔微量培養(yǎng)平板(AdvancedGenetic Technologies Corporation，Gaithersburg，Md.)中，后者含有1ml Magnificent BrothTM(MacConnell Research，SanDiego，CA)，在每孔每ml中補(bǔ)充有50μg卡那霉素。將初級(jí)微量滴定平板冷凍貯藏在-80℃下。將次級(jí)深皿平板在37℃下培養(yǎng)過夜，并在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上劇烈攪拌(300rpm)。為了防止溢出和交叉污染，也為了充分換氣，將每個(gè)次級(jí)培養(yǎng)平板蓋上聚丙烯墊(AdvancedGenetic Technologies Corporation，Gaithersburg，Md.)和塑料微量滴定皿蓋。
利用經(jīng)過Utterback等(1995，《基因組科學(xué)技術(shù)》(Genome Sci.Technol.)11-8)改進(jìn)的、Advanced Genetic Technologies公司(Gaithersburg，Md.)的96孔小量制備試劑盒方案從每孔中分離DNA。利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，《病毒學(xué)方法雜志》(Journal of Virology Methods)3847-60)和逆轉(zhuǎn)lac排序引物，用Perkin-Elmer Applied Btosystems 377型測(cè)序儀XL(Perkin-Elmer Appl ied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行單程DNA測(cè)序。
實(shí)施例4DNA序列數(shù)據(jù)的分析仔細(xì)檢查核苷酸序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量，將給出不正確間距的樣本或不定性水平超過2％的樣本放棄掉或者重新進(jìn)行。借助FACTURATM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Calif.)除去載體序列。另外，當(dāng)不確定的堿基訪問數(shù)增加時(shí)，在每個(gè)樣本末端截短序列。利用AutoAssemblerTM軟件(Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Calif.)彼此比較所有序列，以測(cè)定多重性。最后，使用閾值為70的BLOSUM 62矩陣，采用改進(jìn)的Smith-Waterman算法，利用GeneAssistTM軟件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Calif.)在三個(gè)框架內(nèi)翻澤所有序列，檢索非多余性數(shù)據(jù)庫(kù)(NRDB)。NRDB是從Genpept，Swiss-Prot和PIR數(shù)據(jù)庫(kù)集合的。
實(shí)施例5部分半乳糖氧化酶cDNA克隆的鑒定公認(rèn)的半乳糖氧化酶克隆是這樣鑒定的，按照廠商的教導(dǎo)，利用Applied Biosystems 377XL型自動(dòng)DNA序列分析儀進(jìn)行隨機(jī)cDNA克隆的部分測(cè)序，如實(shí)施例4所述，將所演繹的氨基酸序列與樹狀指孢半乳糖氧化酶(EMBL M86819)的氨基酸序列進(jìn)行比較。在其按樹狀指孢半乳糖氧化酶的氨基酸序列排列的基礎(chǔ)上假定克隆是部分的片段。這種克隆稱為大腸埃希氏桿菌FD0728(pFD0728)。使用部分片段作為探針，篩選Fusarium venenatum基因組文庫(kù)。
實(shí)施例6Fusarium venenatum基因組DNA提取在28℃和150rpm下，使Fusarium venenatum CCl-3在25ml YEG培養(yǎng)液中生長(zhǎng)24小時(shí)，每升培養(yǎng)液的組成為5g酵母浸膏和20g葡萄糖。然后通過Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)過濾收集菌絲，用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗滌一次。排出菌絲中的過量緩沖液，隨后冷凍在液氮中。在電動(dòng)咖啡研磨機(jī)中將冷凍后的菌絲研磨成微細(xì)粉末，在一次性塑料離心試管內(nèi)將粉末加入到20ml TE緩沖液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。將混合物小心地顛倒數(shù)次以確?；旌?，用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取兩次。加入乙酸鈉(3M溶液)，得到最終體積為0.3M，用2.5體積的冰冷乙醇使核酸沉淀出來。將試管在15，000Xg下離心30分鐘，使顆粒狀物風(fēng)干30分鐘，然后重新懸浮在0.5ml TE緩沖液中。加入不含DNA酶的核糖核酸酶A至濃度為100μg/ml，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后加入蛋白酶K(200ug/ml)，混合物在37℃下額外培養(yǎng)一小時(shí)。最后，將混合物用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取兩次，然后按照標(biāo)準(zhǔn)操作用乙酸鈉和乙醇沉淀出DNA。將DNA顆粒狀物在真空下干燥，重新懸浮在TE緩沖液中，貯藏在4℃下。
實(shí)施例7基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選按照廠商的教導(dǎo)(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)，在λZipLox中構(gòu)建Fusarium venenatum的基因組文庫(kù)。將Fusariumvenenatum基因組DNA用Tsp509I部分消化，在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分級(jí)。切除在3-7kb大小范圍內(nèi)移行的DNA片段，利用Prep-a-Gene試劑(BioRad，Hercules，Calif.)從瓊脂糖凝膠切片中洗脫。將洗脫后的DNA片段與EcoRI-裂解和脫磷酸的λZipLox載體臂(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)連接起來，利用市售包裝提取物(Stratagene，La Jolla，Calif.)包裝連接混合物。在大腸埃希氏桿菌Y1090ZL細(xì)胞內(nèi)平板接種和擴(kuò)增包裝后的DNA文庫(kù)。
在45℃高嚴(yán)格條件下(高嚴(yán)格性＝50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切與變性的鮭魚精液DNA)，利用Fusariumvenenatum半乳糖氧化酶基因的放射性標(biāo)記探針片段，通過噬斑雜交(Davis等，1980，出處同上)從文庫(kù)中篩選大約40，000個(gè)噬斑。將給出雜交信號(hào)的噬斑在大腸埃希氏桿菌Y1090ZL細(xì)胞中純化一次，隨后從λZipLox載體中切除單個(gè)克隆，作為pZLl-衍生物(D’Alessio等，1992，F(xiàn)ocus.RTM.14∶7)。
鑒定出有六個(gè)噬斑與Fusarium venenatum半乳糖氧化酶基因探針強(qiáng)烈地雜交，隨后從λZipLox載體中切除每個(gè)潛在的克隆，作為pZL1-衍生物(D’Alessio等，1992，出處同上)。按照廠商的教導(dǎo)，使克隆通過大腸埃希氏桿菌DH10B細(xì)胞(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)，分離質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒用EcoRI和NotI消化，以確定克隆是否等同。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定所克隆的插入片段的大小。通過消化，最大的插入片段包含大約4.3kb的DNA片段。這種克隆稱為大腸埃希氏桿菌DH10B-pEJG45，選擇它用于序列分析。
實(shí)施例8Fusarium venenatum基因組半乳糖氧化酶克隆的核苷酸測(cè)序和特征鑒定利用染料-終止子化學(xué)，用Applied Biosystems 377XL型自動(dòng)DNA序列分析儀進(jìn)行DNA測(cè)序。利用轉(zhuǎn)位子插入策略生成鄰近的序列(Primer Island Transposition Kit，Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Calif.)。對(duì)實(shí)施例7所述來自大腸埃希氏桿菌DH10B-pEJG45的半乳糖氧化酶基因組克隆進(jìn)行測(cè)序，平均冗余度為5.5。
半乳糖氧化酶克隆具有編碼679個(gè)氨基酸的多肽的2037bp可讀框架。核苷酸序列(SEQ ID NO1)和所演繹的氨基酸序列(SEQ IDNO2)如
圖1所示。利用SignalP程序(Nielsen等，1997，《蛋白質(zhì)工程》(Protein Engineering)101-6)，預(yù)測(cè)20個(gè)殘基的信號(hào)肽相當(dāng)于核苷酸1至60。
使用閾值為70的BLOSUM 62矩陣，采用改進(jìn)的Smith-Waterman算法，利用GeneAssistTM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Calif.)進(jìn)行半乳糖氧化酶序列的對(duì)比排列。
對(duì)比排列顯示，F(xiàn)usarium venenatum半乳糖氧化酶的演繹氨基酸序列與來自樹狀指孢(EMBL M86819)的半乳糖氧化酶蛋白共享61.48％的同一性區(qū)域。
實(shí)施例9質(zhì)粒pSheB1的構(gòu)建通過pDM181(WO 98/20136)的修飾生成Fusarium venenatum表達(dá)載體pSheB1(圖2)。修飾包括(a)除去pDM181序列內(nèi)的兩個(gè)NcoI位點(diǎn)，和(b)恢復(fù)尖孢鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子的天然翻譯開始(在ATG起始密碼子上重建NcoI位點(diǎn))。
按照廠商的教導(dǎo)，利用QuikChangeTM指向位點(diǎn)的誘變?cè)噭┖?Stratagene Cloning Systems，La Jolla，Calif.)與下對(duì)誘變引物除去pDM181序列內(nèi)的兩個(gè)NcoI位點(diǎn)5’-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3’加(SEQ ID NO3)5’-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3’(SEQ ID NO4)5’-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’加(SEQ ID NO5)5’-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3’ (SEQ ID NO6)恢復(fù)尖孢鐮孢胰蛋白酶啟動(dòng)子的天然翻譯開始也是利用Stratagene QuikChangeTM指向位點(diǎn)的誘變?cè)噭┖薪Y(jié)合下對(duì)誘變引物來完成的5’-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3’ 加(SEQ ID NO7)5’-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3’(SEQID NO8)所有指向位點(diǎn)的變化都得到適當(dāng)載體區(qū)域的DNA序列分析的確認(rèn)。
實(shí)施例10表達(dá)載體pEJG43的構(gòu)建如下構(gòu)建半乳糖氧化酶表達(dá)載體pEJG43。利用下對(duì)引物從基因組克隆pEJG45擴(kuò)增半乳糖氧化酶編碼區(qū)5’-AAATCTTTCTACACCTTGGCC-3’(正向)(SEQ ID NO9)和5’-GGGGTTAATTAATCAAACTGTCACCTTAATCG-3’(反向)(SEQ IDNO10)。將反向引物引入終止密碼子后的PacI位點(diǎn)。
擴(kuò)增反應(yīng)物(50μl)含有下列組分0.5μg基因組克隆pEJG45、50pmol正向引物、50pmol反向引物、各為250μM的dATP、dCTP、dGTP與dTTP、1X Pwo DNA聚合酶緩沖液和2.5單位Pwo DNA聚合酶。在Perkin-Elmer 480型熱循環(huán)裝置內(nèi)，將反應(yīng)物按下列程序培養(yǎng)95℃2分鐘為1個(gè)循環(huán)；94℃45秒鐘、55℃45秒鐘和72℃2分鐘為10個(gè)循環(huán)；94℃45秒鐘、55℃45秒鐘和72℃2分鐘為17個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延長(zhǎng)20秒鐘；72℃10分鐘為1個(gè)循環(huán)；和一個(gè)4℃浸泡循環(huán)。在1％瓊脂糖凝膠(Eastman Kodak，Rochester，N.Y.)上分離反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠中切除2kb產(chǎn)物帶，按照廠商的教導(dǎo)，利用Qiaex II(Qiagen，Chatsworth，CA)純化。
將擴(kuò)增后的半乳糖氧化酶區(qū)段用PacI消化，用Qiaquik(Qiagen，Chatsworth，CA)純化，連接到以前已經(jīng)用NcoI裂解的載體pSheB1上，用Klenow處理，用PacI裂解。所得表達(dá)質(zhì)粒稱為pEJ643(圖3)。
實(shí)施例11半乳糖氧化酶基因在Fusarium venenatum中的表達(dá)Fusarium venenatum CC1-3(MLY-3)的孢子是這樣生成的在燒瓶?jī)?nèi)含有500ml RA孢子形成培養(yǎng)液，帶有來自1X Vogels培養(yǎng)液平板(2.5％Noble瓊脂)的10個(gè)塞子，補(bǔ)充有2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸鈉，在28℃、150rpm下培養(yǎng)2至3天。通過Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收獲孢子，在Sorvall RC-5B離心器(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)中、在7000rpm下離心20分鐘。將沉淀的孢子用無(wú)菌蒸餾水洗滌兩次，重新懸浮在少量水中，然后利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
原生質(zhì)體是這樣制備的，將l00ml YEPG培養(yǎng)液與4×107個(gè)Fusarium venenatum CC1-3孢子在24℃、150rpm下培養(yǎng)16小時(shí)。在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，Del.)中，將培養(yǎng)物在3500rpm下離心7分鐘。將沉淀用30ml 1M MgSO4洗滌兩次，重新懸浮在15ml 5mg/ml NOVOZYME234TM(批號(hào)PPM 4356，Novo Nordisk A/S，Bagsvxrd，Denmark)的lM MgSO4溶液中。將培養(yǎng)物在24℃和150rpm下培養(yǎng)，直到生成原生質(zhì)體。向原生質(zhì)體消化物中加入體積為35ml的2M山梨糖醇，混合物在2500rpm下離心10分鐘。重新懸浮沉淀，用STC洗滌兩次，在2000rpm下離心10分鐘，使原生質(zhì)體形成沉淀。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)原生質(zhì)體，重新懸浮在8∶2∶0.1的STCSPTCDMSO溶液中，最終濃度為1.25×107個(gè)原生質(zhì)體/ml。在Nalgene Cryo 1℃冷凍容器(VWR Scientific，Inc.，San Francisco，Calif.)中進(jìn)行控速冷凍后，將原生質(zhì)體貯藏在-80℃下。
將冷凍后的Fusarium venenatum CCl-3原生質(zhì)體在冰上融化。向50ml無(wú)菌聚丙烯試管中加入5μg實(shí)施例10所述pEJG43和5μl肝素(5mg/ml的STC溶液)。加入100μl原生質(zhì)體，小心地混合，在冰上培養(yǎng)30分鐘。加入1ml SPTC，在室溫下培養(yǎng)20分鐘。加入25ml 40℃COVE頂層瓊脂糖后，將混合物倒在空的直徑150mm的平板上，在室溫下培養(yǎng)過夜。然后在平板頂部倒上含有10mg BASTATM/ml的額外25ml 40℃COVE頂層瓊脂糖，在室溫下培養(yǎng)至多14天。除草劑BASTATM中的活性成分是膦絲菌素。BASTATM是從AgrEvo(HoechstSchering，Rodovre，Denmark)得到的，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取兩次，用氯仿∶異戊醇(24∶1)提取一次備用。
直接從選擇平板拾取43個(gè)轉(zhuǎn)化體(下面為COVE，上面為COVE-BASTATM)，在125ml搖瓶?jī)?nèi)含有25ml M400Da培養(yǎng)液，補(bǔ)充有1mM CaCl2和100μg/ml氨芐西林(防止細(xì)菌污染)，在平臺(tái)搖動(dòng)器上、在28℃200rpm下培養(yǎng)7天。還包括未轉(zhuǎn)化的受體菌株作為陰性對(duì)照。
在2、3、4和7天時(shí)取樣，測(cè)定半乳糖氧化酶活性。測(cè)定溶液含有0.1M半乳糖、17μg辣根過氧化酶/ml、1mM ABTS、74mM磷酸鈉pH 7和半乳糖氧化酶，其含量足以在405nm和24℃下產(chǎn)生0.03-3個(gè)單位的吸光度變化，這是在1-cm徑長(zhǎng)比色杯中、用ShimadzuUV160U分光光度計(jì)測(cè)量的，或者是在96孔平板中、用MolecularDevices Thermomax微量滴定板讀數(shù)器測(cè)量的。
半乳糖氧化酶活性測(cè)定的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生可檢測(cè)的半乳糖氧化酶。
生物材料的保藏下列生物材料已經(jīng)按照《布達(dá)佩斯條約》條款保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center)，1815University Street，Peoria，Illinois.，61604中，給出下列入藏號(hào)保藏物 入藏號(hào)保藏日期大腸埃希氏桿菌DH10B(pETB45)NRRL B-300761998年10月27日菌株已經(jīng)保藏在這樣的條件下，以保證按照37 C.F.R..sctn.§1.14和35 U.S.C..§122，受專利與商標(biāo)局長(zhǎng)官指定的人員在本專利申請(qǐng)懸而未決期間可以獲得培養(yǎng)物。保藏物代表所保藏菌株基本上純的培養(yǎng)物。根據(jù)外國(guó)專利法的需要，在本申請(qǐng)的相應(yīng)的或其后續(xù)申請(qǐng)所提交的國(guó)家也可以獲得保藏物。不過應(yīng)當(dāng)這樣理解，保藏物的可利用性并不構(gòu)成在由政府行為授予的專利權(quán)廢除的情況下實(shí)施本發(fā)明的許可。
本文所述和要求保護(hù)的發(fā)明并不限于本文所公開的具體實(shí)施方式
的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方式僅供闡述發(fā)明的若干方面。任何等同的實(shí)施方式都有意落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。的確，通過上述說明，除了本文這些明示和描述的內(nèi)容，發(fā)明的各種變例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些變例也有意落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。萬(wàn)一發(fā)生抵觸，包括定義的公開內(nèi)容將受到節(jié)制。
各種參考文獻(xiàn)引用在這里，其全文結(jié)合在此作為參考。
權(quán)利要求
1.具有半乳糖氧化酶活性的分離多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2之氨基酸21至679具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)被在中等嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；(c)具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽變體，包含一個(gè)或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)具有半乳糖氧化酶活性的(a)、(b)或(d)的片段。
2.權(quán)利要求1的多肽，具有這樣一個(gè)氨基酸序列，它與SEQ IDNO2之氨基酸21至679具有至少65％的同一性。
3.權(quán)利要求2的多肽，具有這樣一個(gè)氨基酸序列，它與SEQ IDNO2之氨基酸21至679具有至少70％的同一性。
4.權(quán)利要求3的多肽，具有這樣一個(gè)氨基酸序列，它與SEQ IDNO2之氨基酸21至679具有至少80％的同一性。
5.權(quán)利要求4的多肽，具有這樣一個(gè)氨基酸序列，它與SEQ IDNO2之氨基酸21至679具有至少90％的同一性。
6.權(quán)利要求4的多肽，具有這樣一個(gè)氨基酸序列，它與SEQ IDNO2之氨基酸21至679具有至少95％的同一性。
7.權(quán)利要求1的多肽，包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1的多肽，由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段組成。
9.權(quán)利要求8的多肽，由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。
10.權(quán)利要求9的多肽，由SEQ ID NO2之氨基酸21至679組成。
11.權(quán)利要求1的多肽，它被在中等嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列所編碼(i)SEQ ID NO1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈。
12.權(quán)利要求11的多肽，它被在中等嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列所編碼(i)SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈。
13.權(quán)利要求1的多肽，它被在高嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列所編碼(i)SEQ ID NO1之核苷酸61至2037；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸61至2037中的cDNA序列；(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈。
14.權(quán)利要求13的多肽，它被在高嚴(yán)格條件下與下列雜交的核酸序列所編碼(i)SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318；(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈。
15.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽是具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽變體，包含一個(gè)或更多氨基酸的取代、缺失和/或插入。
16.權(quán)利要求1的多肽，它被包含在質(zhì)粒pEJG45 NRRL中的核酸序列所編碼，該質(zhì)粒是包含在大腸埃希氏桿菌NRRL B-30076。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽，它具有至少20％的SEQ ID NO2的半乳糖氧化酶活性。
18.具有與權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的多肽相同半乳糖氧化酶活性的多肽。
19.分離的核酸序列，包含編碼權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的多肽的核酸序列。
20.分離的核酸序列，包含在SEQ ID NO1之成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變的核酸序列，其中該突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2之氨基酸21至679組成的多肽。
21.分離的核酸序列，是如下制備的(a)在中等嚴(yán)格條件下，雜交DNA與(i)SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318、(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列、(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；和(b)分離該核酸序列。
22.權(quán)利要求21的分離的核酸序列，是如下制備的(a)在高嚴(yán)格條件下，雜交DNA與(i)SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318、(ii)包含在SEQ ID NO1之核苷酸2342至4318中的cDNA序列，(iii)至少100個(gè)核苷酸的(i)或(ii)序列、或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；和(b)分離該核酸序列。
23.核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求19的核酸序列，在操作上可連接到一個(gè)或更多控制序列上，該控制序列指向多肽在適合的表達(dá)宿主中的產(chǎn)生。
24.包含權(quán)利要求23的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
25.包含權(quán)利要求23的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
26.制備突變核酸序列的方法，包括(a)向SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列引入至少一個(gè)突變，其中該突變的核酸序列編碼由SEQID NO2之氨基酸21至679組成的多肽；和(b)回收該突變的核酸序列。
27.由權(quán)利要求26的方法制備的突變核酸序列。
28.制備多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)包含權(quán)利要求27的編碼該多肽的突變核酸序列的菌株，制得包含該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。
29.制備權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)菌株，制得包含該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。
30.制備權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在適合于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該構(gòu)建體包含編碼該多肽的核酸序列；和(b)回收該多肽。
31.制備多肽的方法，包括(a)在有助于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變的突變核酸序列，其中該突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2之氨基酸21至679組成的多肽；和(b)回收該多肽。
32.制備細(xì)胞突變體的方法，該方法包括破裂或刪去編碼權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的多肽的核酸序列或其控制序列，導(dǎo)致突變體產(chǎn)生比細(xì)胞更少的多肽。
33.由權(quán)利要求32的方法制備的突變體。
34.權(quán)利要求33的突變體，進(jìn)一步包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列。
35.制備異源多肽的方法，包括(a)在有助于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求34的突變體；和(b)回收該多肽。
36.核酸構(gòu)建體，包含編碼這樣一種蛋白質(zhì)的基因，它在操作上可連接到編碼由SEQ ID NO1之核苷酸1至60組成的信號(hào)肽的核酸序列上，其中該基因?qū)υ摵怂嵝蛄衼碚f是外來的。
37.包含權(quán)利要求36的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
38.包含權(quán)利要求36的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
39.制備蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于該蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求38的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收該蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有半乳糖氧化酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及制備和使用該多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1344324SQ00805437
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2000年2月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月24日
發(fā)明者E·格萊特利, R·M·博卡, M·W·雷 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司