專利名稱：組合的復(fù)合糖庫及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及組合的復(fù)合糖庫和它們的制備方法和應(yīng)用。更具體地，涉及在固相支持體上通過逐級(jí)酶促合成法制備的此糖庫，涉及由此提供復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的組合陣列。按照本發(fā)明合成的組合的復(fù)合糖庫可以在多種途徑中加以開發(fā)，包括但不限于(i)復(fù)合糖藥物的鑒定；(ii)與復(fù)合糖相關(guān)的受體或蛋白作為藥物治療的新的潛在的與糖相關(guān)的靶的鑒定；(iii)生物活性復(fù)合糖的鑒定；(iv)作為藥物療法的潛在新靶標(biāo)的特異性復(fù)合結(jié)構(gòu)糖單元的鑒定；(v)已知復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)的鑒定；(vi)復(fù)合糖結(jié)構(gòu)中新的糖標(biāo)記的鑒定；和(vii)形成的對(duì)癌癥相關(guān)性糖表位或其它疾病相關(guān)性糖抗原的抗體的發(fā)現(xiàn)。
藥物發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代藥物研究和開發(fā)擔(dān)當(dāng)起了利用現(xiàn)代化學(xué)將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化為藥物的發(fā)現(xiàn)和分離的任務(wù)。從二十世紀(jì)五十年代開始，藥物發(fā)現(xiàn)集中在用多種動(dòng)物模型測(cè)試大量候選化合物，以努力鑒定出藥學(xué)活性化合物。所以，新候選藥物的發(fā)現(xiàn)要求篩選多種來源的化合物的潛在治療活性。這些來源包括，例如，用于尋找新治療活性的已知化合物和藥物，發(fā)酵肉湯和從植物或海洋生物排泄和/或提取的化合物等(Granellin，1992)。
在二十世紀(jì)七十至八十年代，生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)(和動(dòng)能)生物學(xué)領(lǐng)域中的進(jìn)展使人們更好地了解到導(dǎo)致各種疾病惡化和進(jìn)展的生物化學(xué)和分子學(xué)過程。由此開發(fā)出基于蛋白質(zhì)的初級(jí)篩選試驗(yàn)，其代替了在動(dòng)物模型中篩選候選藥物的繁瑣且耗時(shí)的方法(Nicholls，1991)。
此外，X射線結(jié)晶學(xué)和計(jì)算機(jī)化學(xué)的發(fā)展闡明了調(diào)節(jié)分子識(shí)別的自然過程和受體及其配體之間的相互作用，由此開發(fā)出了被稱作“合理藥物設(shè)計(jì)(rational drug design)”的方法(Hendrickson，1991)。
由于了解了肽和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并且具備了通過在分子模型化和物理上利用分子克隆技術(shù)操縱此類結(jié)構(gòu)的能力，研究人員能夠開發(fā)出新的候選藥物。
不幸的是，由于需要非常高水平的技術(shù)人員以及專用和復(fù)雜的設(shè)備，“合理藥物設(shè)計(jì)”無法給科研人員提供他們所希望的藥物設(shè)計(jì)(Jacobs，1994)。
因此，在二十世紀(jì)九十年代早期，主導(dǎo)性的生物工程和藥物學(xué)堅(jiān)定轉(zhuǎn)向機(jī)器人學(xué)和自動(dòng)化，嘗試補(bǔ)充“合理藥物設(shè)計(jì)”方法。自動(dòng)化確保了藥物發(fā)現(xiàn)的“鳥槍式”方法，能夠針對(duì)希望的生物活性快速篩選成千上萬的化合物。新方法包括(i)組合體(combinatorics)，作為新化合物的來源；(ii)基因組，作為新靶向的來源；和(iii)高通量篩選(HTS)，作為交叉篩選不同化合物/靶標(biāo)的一種方法。因此，“鳥槍式”途徑允許科研人員忽略現(xiàn)有方法中有關(guān)的技術(shù)障礙，而把精力集中在關(guān)鍵問題上，例如“要做什么”或“產(chǎn)生正性結(jié)果需要多少多樣性”(Hogan Jr.，1997)。
組合庫在新候選藥物的研究中，研究人員注意到業(yè)已經(jīng)廣泛篩選的天然化合物的補(bǔ)體，其分子上帶有在自然狀態(tài)下未被發(fā)現(xiàn)的新的和多樣化的基團(tuán)。所以，新合成出包含核酸或氨基酸序列的新化合物的組合庫并且篩選潛在的候選藥物。
此類新化合物或新靶標(biāo)的組合庫可以分為三個(gè)主要種類。
第一種涉及基質(zhì)或平臺(tái)，在它們的上面顯示和/或構(gòu)建所述庫(Blondelle，1996)。因此，組合庫可以被提供(i)在化學(xué)固相支持體的表面上，例如微粒、珠?；虮馄狡脚_(tái)；(ii)通過生物來源(如細(xì)菌或嗜菌體)表現(xiàn)；和(iii)含在溶液內(nèi)。此外，多種由計(jì)算機(jī)生成的組合分子的三維結(jié)構(gòu)可以通過計(jì)算機(jī)計(jì)算法篩選(Gaasterland，1998)。
組合庫可以進(jìn)一步按照庫中所表示的分子的類型來分類，其可以包括(i)小化學(xué)分子類；(ii)核酸(DNA、RNA等)類；(iii)肽類或蛋白類；和(iv)糖類。
組合庫的第三種涉及合成化合物或靶標(biāo)所用的方法，這些合成一般通過下列方法完成(i)就地化學(xué)合成(Borman，1996)；(ii)利用分子克隆的體內(nèi)合成(Kenan，1994)；(iii)通過純化酶或從微生物的提取物體外生物合成(Michels，1998)；和(iv)利用專用計(jì)算機(jī)計(jì)算法in silico(Sansom，1997)。
由任何上述合成方法代表的組合庫可以進(jìn)一步通過下列方法特征化(i)裂分(split)或平行模式的合成(ii)分子大小和復(fù)雜度；(iii)篩選技術(shù)；和(iv)制備/篩選中自動(dòng)化的等級(jí)。
在分混合成方法中，譬如，在微?；蛑榱５谋砻嫔虾铣傻慕M合庫被劃分為數(shù)個(gè)組，其中唯一的第一合成建筑塊(building block)被連結(jié)在珠粒上。隨后，將這數(shù)個(gè)組的珠?；旌喜⑶曳蛛x形成獨(dú)特多樣性的新組，再加入下面的建筑塊，重復(fù)上述過程直至獲得所需的復(fù)雜度。在平行合成法中，分別在溶液中或固定在基質(zhì)上合成組合庫的各個(gè)化合物，對(duì)于庫的各種化合物而言需要唯一和獨(dú)立的合成方式。
組合庫中分子的復(fù)雜度取決于初級(jí)建筑塊的多樣性及其可能的聯(lián)合形式。此外，若干附加參數(shù)也可以測(cè)定組合庫的復(fù)雜度。這些參數(shù)包括(i)最終合成產(chǎn)物的分子大小(例如，低聚物或化學(xué)小分子)；(ii)各合成步驟中所產(chǎn)生的價(jià)鍵的數(shù)目(例如，一次一個(gè)鍵或有時(shí)的數(shù)個(gè)特定價(jià)鍵)；(iii)所用不同合成步驟的數(shù)目；和(iv)最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度(例如直鏈或支鏈分子)。
用組合庫技術(shù)可以合成若干類型的初級(jí)分子，包括但不限于，核酸和氨基酸和糖。由于其固有單鍵種類的復(fù)雜度，合成核酸和氨基酸組合庫一般只需要一類合成反應(yīng)。另一方面，由于其固有價(jià)鍵種類的復(fù)雜度，合成復(fù)合糖組合庫需要多種不同的合成反應(yīng)。
所以，核酸和氨基酸的簡(jiǎn)單化和重復(fù)使如此組成的組合庫的合成方法相對(duì)簡(jiǎn)化。另一方面，由于低聚糖在結(jié)構(gòu)上更為復(fù)雜，所以難以合成復(fù)合糖的組合庫。因此，迄今為止合成的復(fù)合糖組合庫具有非常低的復(fù)雜度，并且一般包括由不超過三種建筑塊構(gòu)成的復(fù)合糖分子。
核酸和氨基酸組合庫的進(jìn)展迫使應(yīng)用能夠利用此類庫的獨(dú)特性質(zhì)的篩選技術(shù)，從而可以完成對(duì)多樣化庫的快速篩選。
譬如，為了識(shí)別“探針”和庫組分之間的特性性相互作用，可以構(gòu)建一種庫使每一個(gè)組分的身份和定位已知或在合成階段進(jìn)行控制。這樣的庫被稱作可編址庫。利用照相平版法可以產(chǎn)生光定向-空間可編址、可平行合成的肽或低聚核苷酸庫(Ramsay，1997)。此外，帶有微流系統(tǒng)的封閉反應(yīng)室微裝配陣列可用于“芯片上實(shí)驗(yàn)室(Lab on achip)”的低聚核苷酸或化學(xué)可編址庫的合成(U.S.專利Nos.5,643,738；5,681,484；和5,585,069，它們?cè)诖艘胱鳛閰⒖?。利用此類可編址技術(shù)能夠在合成中測(cè)定庫組分的性質(zhì)和定位。
相比之下，采用“一珠一分子”方法合成的庫，其多樣性通過“分與混”合成法產(chǎn)生，此類庫可以利用和可檢測(cè)部分(如熒光分子或酶)相結(jié)合的探針來篩選，從而可以鑒定出與標(biāo)記探針相互作應(yīng)的珠粒，分離并且分析其組成(Schullek，1997)。
由于此類篩選方法耗時(shí)，所以開發(fā)出標(biāo)記庫途徑，它主要用于通過分混法產(chǎn)生的庫。為了加速分析分離出的感興趣的分子，標(biāo)記庫方法聯(lián)合庫成員合成與標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)建筑塊的平行正交合成(Janda，1994；Chabala，1995)或射頻標(biāo)記記憶設(shè)計(jì)(Borman，1996)。
為了篩選大的陣列，將機(jī)器人和小型化設(shè)備應(yīng)用在高通量篩選(HTS)試驗(yàn)中。以往，HTS試驗(yàn)基本上是大規(guī)模(upscaled)的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。因此，根據(jù)被篩選分子的多樣性，相對(duì)簡(jiǎn)化的試驗(yàn)對(duì)HTS的適應(yīng)包括液相處理的微型化和自動(dòng)化，由此可以比較迅速地篩選出大量獨(dú)立的分子。目前，對(duì)于HTS開發(fā)并實(shí)施了更多的集成方法。這些方法稱作“超級(jí)技術(shù)”(UT，Sittampalam，1997)或“新技術(shù)”(NT，Burbaum，1997)。此類HTS方法學(xué)介于分混合成法或平行合成法之間變化。在分混合成法中，微粒經(jīng)過用鑒定試劑預(yù)處理既可用于合成也可用于篩選(Stinson，1998)。改進(jìn)的平行合成法需要另外的支持基質(zhì)小型化(Cargill，1997)。例如，如果每年用200種探針試驗(yàn)106種化合物，這可轉(zhuǎn)化為2×108個(gè)試驗(yàn)。如果這些試驗(yàn)分別采用100μL的孔體積，每孔中含有分子量約500g/mol的待測(cè)化合物10μL粗略估計(jì)需要2百萬個(gè)96孔的微量滴定平板，20,000L的每種靶標(biāo)溶液和100克的各種化合物。
所以，人們提出使支持基質(zhì)小型化的新技術(shù)。此類技術(shù)分為開放和密閉式容器形式。開放容器技術(shù)保持了標(biāo)準(zhǔn)96孔平板的兼容性并且遵循N＝n2×96的幾何級(jí)數(shù)，其中N是孔的數(shù)目，和n是描述線性陣列的可能填充密度的整數(shù)，按照這種推理，微升容量限度和合適填充密度之間的平衡點(diǎn)是利用具有1536個(gè)孔容量為1-2μl的孔的平板來獲得。
較大陣列的篩選需要進(jìn)一步減小孔容量至納升量，其進(jìn)一步迫使采用密閉容器形式以防止蒸發(fā)。利用由半導(dǎo)體工藝開創(chuàng)的裝配技術(shù)，可以實(shí)施納升反應(yīng)容量的合成和分析，由此一個(gè)四平方英寸的硅片可以支持105個(gè)獨(dú)立合成和生物鑒定反應(yīng)(Cheng，1998)。
現(xiàn)在，化學(xué)合成的有機(jī)小分子如核酸(DNA、RNA和反義RNA)、肽和肽的生物模擬物(如類胨和半類胨等)的組合庫的制備方法在所屬領(lǐng)域中建成，這些技術(shù)業(yè)已在上述大多種類和分支(divisions)(參見表1)中得到證實(shí)。
表1組合庫的分類
表1(續(xù))
圖標(biāo)符號(hào)+可利用；-不能利用盡管糖在性質(zhì)及其在許多生物過程中的重要作用上多種多樣，但還未證實(shí)高度多樣化和復(fù)雜的糖庫(Borman，1996)。此外，雖然糖苷鍵產(chǎn)物的固相化學(xué)合成已經(jīng)在約30年之前提出(Frechest，1971，1972；Guthrie，1971)，糖組合庫的化學(xué)合成僅僅在近年來才加以驗(yàn)證，并且由于化學(xué)合成的限制(下文將作詳細(xì)描述)，此類庫構(gòu)成相當(dāng)簡(jiǎn)單的可溶性非標(biāo)記三糖組分陣列。
Hindsgaul及其同事證明用“隨機(jī)糖基化”化學(xué)方法合成庫，其包括將保護(hù)的糖基供體與含有3-5個(gè)自由羥基的糖受體偶聯(lián)，生成6-8個(gè)不同糖產(chǎn)物的混合物(Kanie，1995)。按照這種方法，在糖基化步驟之后，脫去保護(hù)基，隨后經(jīng)反相色譜將起始單糖建筑塊與偶聯(lián)產(chǎn)物分離。
Boons及其同事報(bào)導(dǎo)了更加直接的化學(xué)合成途徑。為了能夠形成區(qū)域?qū)Ｒ恍缘奶擒真I，他們合成了10種各自含有一個(gè)游離羥基的保護(hù)的二糖接納體。每種保護(hù)的接納體分別和糖基供體反應(yīng)生成32種確定的二糖。隨后混合二糖產(chǎn)物，采用脫保護(hù)過程，并將混合物劃分為4個(gè)亞組。各亞組進(jìn)而與不同的供體反應(yīng)得到4個(gè)庫，各個(gè)庫包含64種三糖。最后，用冗長(zhǎng)的大小排阻色譜的方法分離產(chǎn)物(Boons，1996)。
組合糖庫在固相支持體上的化學(xué)合成業(yè)已由Kahne及其同事(Liang，1996)驗(yàn)證。U.S.專利No.5,700,916在此方面涉及了由1300種標(biāo)記二-和三糖組成的糖庫。這種庫是利用分混法通過將12種不同的糖基供體偶聯(lián)在6種不同的聚合物鍵合的接納體上合成的，其中采用糖基化方法以端基異構(gòu)亞砜作為糖基供體摻混。
若干其它研究組也描述了制備組合糖庫的化學(xué)方法(Rademann，1996；Rodebaugh，1997；Liang 1997，Kahne的綜述，1997；Arya，1997，WO 97/34623；WO 97/35202；WO 98/08799；WO 98/40410；和美國(guó)專利5,780,603)。上述方法公開了化學(xué)方法制備的糖庫，其中糖組分經(jīng)糖苷鍵連結(jié)在非糖部分，或者低結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的糖組分，例如均勻多價(jià)長(zhǎng)鏈或具有0-1個(gè)分支的雙四糖。
最近，已經(jīng)證明合成的低聚糖模擬物能夠用酰胺鍵代替糖苷鍵，由此形成“碳類胨(carbopeptoids)”(Nicolaou，1995)和“糖苷酸(glycotide)”(McDevitt，1996)，或用磷酸二酯鍵代替糖苷鍵，由此形成“碳核苷酸(carbonucleotide)”(Nicolaou，1995)盡管這些糖模擬物比以前合成的糖更復(fù)雜，但其復(fù)雜程度遠(yuǎn)不如天然存在的復(fù)合糖。(例如，參見


圖1)。
Wong及其同事(Wong，1998)通過化學(xué)方法合成了具有四種不同的可選擇性脫除保護(hù)基的核心建筑塊，生成具有4個(gè)正交糖苷鍵的五糖模擬物。
雖然利用不同的化學(xué)方法合成了具有有限復(fù)雜度的糖庫，但迄今沒有制備過具有類似于天然復(fù)合糖的高等級(jí)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的復(fù)合糖組合庫(例如高度支化結(jié)構(gòu))。此外，現(xiàn)有技術(shù)從未建議或探討過利用能夠快速篩選庫組分的可編址平行合成方法來合成此類庫。
這可能歸因于化學(xué)合成方法仍然受到經(jīng)典選擇性保護(hù)/脫保護(hù)策略的局限的事實(shí)，致使合成分子的長(zhǎng)度是其復(fù)雜度的主要貢獻(xiàn)者(Grout，1998)。根據(jù)計(jì)算，包括所有可能的直鏈或支鏈的六聚低聚糖異構(gòu)體，需要1012種以上的不同結(jié)構(gòu)形式(Laine，1994)。通過化學(xué)合成方法、利用選擇性保護(hù)-脫保護(hù)基團(tuán)合成這樣的陣列是不切實(shí)際的。在此類方法中，端基異構(gòu)體混合物的形成是無法避免的，而端基異構(gòu)體混合物的形成無法或終止直接糖特異性鏈的形成，因此不可能控制在合成過程中產(chǎn)生的此類端基異構(gòu)中心的形成。
為了合成具有高級(jí)復(fù)雜度和多樣性的復(fù)合糖組合庫，人們必須尋找其它非化學(xué)的合成方法。
酶是高準(zhǔn)確性的生物催化劑，其普遍應(yīng)用在有機(jī)化合物的合成中。因此，酶可以用在糖合成方法中，其避免了上述現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)合成方法所固有的局限性。糖苷鍵的酶促合成法具有高度的立體-和區(qū)域選擇性，所以，將酶應(yīng)用于復(fù)合糖的合成中廢除了對(duì)保護(hù)的單體的需求，并且消除了摻混此類保護(hù)的建筑塊所固有的問題(Grout，1998)。
自然界在糖苷鍵的體內(nèi)生物合成中利用4種類型的酶(參見下表2)。基本通用分類是按照Leloir氏途徑(Leloir，1971)和非Leloir氏途徑劃分這些酶。Leloir氏途徑的酶在哺乳動(dòng)物體系中負(fù)責(zé)絕大多數(shù)N-和O-聯(lián)糖蛋白和其它糖綴合物的生物合成。N聯(lián)途徑包括多萜醇焦磷?；途厶侵虚g體于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中在甘露糖基和N-乙酰基葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用下的起始生物合成。這種低聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步糖基化，隨后在低聚糖轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)肽鏈的天冬酰胺殘基(Kornfeld，1985)。在轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基氏體(GA)之前，在糖苷酶作用下脫除葡萄糖和一些甘露糖殘基，顯露出核心五糖。此后，在稱作O聯(lián)糖基化的過程中通過糖基轉(zhuǎn)移酶向GA中添加附加的單糖，其在GA中開始經(jīng)糖苷鍵向絲氨酸或蘇氨酸添加單糖并且通過順序添加的單糖繼續(xù)下去(Kornfeld，1985)。Leloir途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶僅僅利用8種核苷糖作為單糖供體用于合成大部分的低聚糖(參見下表3)。表2用于體外合成配糖鍵的酶的類型
表3Leloir途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶
非Leloir途徑利用附加單糖，例如陰離子或硫酸化糖，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)。但微生物、植物和無脊椎動(dòng)物還存在其它附加單糖的非常多樣化的聯(lián)合，這些單糖是上述途徑不曾利用的(例如鼠李糖和阿拉伯糖；參見下表4)(Oths，1990；Mengling，1998)。
表4僅存在于微生物和植物中的單糖(Gleeson，1998)
主要提出了兩種策略用于低聚糖的體外酶催化合成。按照第一種策略，在可逆性水解反應(yīng)中使用糖苷酶或糖基水解酶(WO 87/05936；WO 98/40512；and U.S.Pat.No.5,532,147，Nilsson，1988 and1996；Watt，1997)，按照第二種策略，糖基轉(zhuǎn)移酶用于順序合成法(Hunez，1980；Toone，1989)。由于第二種策略表現(xiàn)出高收率和高立體-和區(qū)域選擇特異性，它被認(rèn)為是優(yōu)選途徑(David，1991；Wong，1992)。第二種策略已在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛探討(參見，例如Grout，1998；Watt，1997；Ichikawa，1997；Wong，1996；U.S.Pat.No.5,583,042；和WO 96/32492)，它被利用來合成非常窄幅度的低聚糖分子，大小在2至5個(gè)單元，該合成采用8個(gè)Liloir單糖物種中的7個(gè)，只生成0-1個(gè)支化鍵。
自然界中，聯(lián)合利用全部四種酶(參見上表2)制備復(fù)合陣列的低聚糖。另一方面，有關(guān)體外糖苷鍵合成的聯(lián)合酶促方法的報(bào)導(dǎo)十分有限。
此類方法可以聯(lián)合使用糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶(β-半乳糖苷酶和(2，6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)制備窄幅的低聚糖產(chǎn)物(Herrmann，1993；Nilsson 1988)。另外，轉(zhuǎn)糖苷酶也可以與上述酶合用(例如克室錐蟲產(chǎn)生的轉(zhuǎn)唾液酸酶，Schenkman，1991)。利用磷酸化酶將糖1-磷酸供體轉(zhuǎn)化成2-酮基-糖也早在1950年間公開(Hassid，1950)，但這種策略沒有被進(jìn)一步實(shí)行。
復(fù)合糖在固相支持體上的酶促合成首先在二十世紀(jì)八十年代由Zehavi等提出(1983 and 1984)。Zehavi及其同事將一個(gè)糖基單元連結(jié)在4-羥甲基-3-硝基苯甲酸酯上生成不耐光連接體。這種糖連接體與氨基官能化水相容性載體通過酰胺鍵偶聯(lián)，例如聚丙烯酰胺-凝膠聚合物或聚乙烯醇(Zehavi，1984)。聚合物鍵合的糖苷隨后用1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶半乳糖苷化。
通過合用化學(xué)合成步驟和酶促糖鏈延伸步驟，實(shí)行了Lewis X糖肽抗原的固相化學(xué)-酶促合成(Halcomb，1994；Seitz，1997)，以及唾液酸化十一糖-天冬酰胺偶聯(lián)物的合成，其中α-2，6唾液酰殘基在酶作用下添加到化學(xué)合成的十糖上(Unverzagt，1996)。此外，唾液酸化Lewis X抗原的酶促合成也已經(jīng)在活化二氧化硅載體上完成(Schuster，1994)。通過三個(gè)重復(fù)性糖基化步驟使4個(gè)附加糖單元位于肽上，從而生成較高收率的這種糖肽。據(jù)報(bào)導(dǎo)糖肽的合成經(jīng)過聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物固相支持體的酶促糖基化也具有良好的收率(Meldal，1994)。
迄今為止，新的糖衍生藥物的發(fā)現(xiàn)仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其它種類的分子，例如蛋白質(zhì)。這種滯后主要?dú)w咎于可用于制備多樣化和復(fù)雜化糖類物質(zhì)的有效且綜合的方法的不實(shí)用性。由于復(fù)合糖難以合成并難以分析，利用現(xiàn)有技術(shù)的方法無法完成這樣的任務(wù)。
盡管存在這些限制，糖藥物化學(xué)和生物化學(xué)的三個(gè)方面得到了廣泛研究(i)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成的特異性干擾(Mengling，1998)；(ii)對(duì)惡性腫瘤的獨(dú)特標(biāo)記(Orntoft，1995；Kobata，1998)；和(iii)在細(xì)胞和細(xì)胞間的通訊、細(xì)胞粘附、細(xì)胞感染和細(xì)胞分化中參與細(xì)胞表面低聚糖標(biāo)記(Simon，1996)。
糖的藥物化學(xué)和生物化學(xué)的這些方面是利用化學(xué)上合成的復(fù)合糖物質(zhì)進(jìn)行研究。已經(jīng)證明合成的復(fù)合糖是開發(fā)糖治療領(lǐng)域中的重要工具，但化學(xué)合成方法及其制備的多樣性組合庫所固有的局限性阻礙了在這個(gè)領(lǐng)域中的顯著進(jìn)步。
譬如，CarbBank數(shù)據(jù)庫(復(fù)合糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫-CCSD)包括48,956條記錄(22,048個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu))，其來自公開的文獻(xiàn)并由GeorgiaUniversity project-Complex Carbohydrate Research Center(CCRC)匯編。在圖2中這些糖按照復(fù)雜度分組。58％以上的條目為支化分子結(jié)構(gòu)，其事實(shí)上不可能利用目前的化學(xué)合成方法來合成。圖3是一個(gè)直方圖，以百分比表示在CarbBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合糖中所存在的糖殘基數(shù)量的分布。雖然數(shù)據(jù)庫中全部復(fù)合糖中的44％具有6種或更多的殘基，但此類復(fù)合糖的化學(xué)和酶促合成不曾被廣泛實(shí)踐，特別是在庫的背景中。
當(dāng)人們希望構(gòu)建此類實(shí)體的組合庫，需要平行合成大批量的復(fù)合糖時(shí)會(huì)進(jìn)一步遇到困難。所以，利用現(xiàn)有化學(xué)合成方法來合成可編址復(fù)合糖實(shí)體的組合陣列成為首要的挑戰(zhàn)。
所以，普遍認(rèn)識(shí)到需要并且非常有利獲得合成和篩選大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和多樣性的復(fù)合糖組合庫的方法。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種組合的復(fù)合糖庫，其含有多數(shù)可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。
按照本發(fā)明的另一方面提供一種制備可編址組合的復(fù)合糖庫的方法，該方法包括步驟(a)提供具有多個(gè)位置的固相支持體；和(b)酶促合成多數(shù)的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，多數(shù)的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的每種結(jié)構(gòu)連結(jié)在多個(gè)位置中的至少一個(gè)可編址位置，由此生成可編址組合的復(fù)合糖庫.
按照本發(fā)明下述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，每種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)連結(jié)在固相支持體上。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，每種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與固相支持體的連結(jié)通過連接體實(shí)行。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特征，所述連接體包括至少兩個(gè)鄰接共價(jià)鍵。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案的中的其它特征，所述連接體選自氨基酸、肽、非糖基化蛋白、脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺、多萜醇磷酸酯、環(huán)糊精、低聚糖、單糖、烷基鏈和核酸。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，該連接體的長(zhǎng)度至少為20埃(埃)。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述固相支持體選自可編址微粒、可編址珠粒和扁平平臺(tái)。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述扁平平臺(tái)選自微量滴定平板、薄膜和嵌片(chip)。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述微量滴定平板是補(bǔ)充有微流體系的封閉反應(yīng)室的可編址微裝配陣列。反應(yīng)室的密度優(yōu)選為4-25/平方厘米，各自具有50-1000納升的容量。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，該固相支持體為嵌片，而且其中多種可編址復(fù)合糖的不同復(fù)合糖結(jié)構(gòu)以斑片排列，這些斑片中心和中心的間距不超過2.25mm。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，該固相支持體是選自下列組成的物質(zhì)與二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物、聚酰胺。聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、二氧化硅、石英、塑料和纖維素。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多數(shù)可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一種包含至少兩個(gè)一種類型的鄰接糖單元。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案的其它特征，多數(shù)的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一種包含至少一個(gè)分支。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，至少一個(gè)分支的至少一種形成相同的核心和分支糖單元。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多數(shù)可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)含有至少5個(gè)糖單元。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多數(shù)的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是一個(gè)包含非天然復(fù)合糖的代表。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多數(shù)的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是包含天然復(fù)合糖的代表。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述天然復(fù)合糖來自人體來源。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述人體來源選自組織、細(xì)胞和體液。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多數(shù)的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是至少一個(gè)天然復(fù)合糖的結(jié)構(gòu)域的代表。
按照本發(fā)明的另一方面提供一種鑒定能夠結(jié)合實(shí)體的復(fù)合糖的方法，該方法包括步驟(a)制備可編址組合的復(fù)合糖庫，通過(i)提供具有多種位置的固相支持體；和(ii)酶促合成多種復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，多種復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的每種結(jié)構(gòu)連結(jié)在多種位置的至少一個(gè)編址位置，由此制備可編址組合的復(fù)合糖庫；和(b)用實(shí)體篩選可編址組合的復(fù)合糖庫，鑒定出能夠結(jié)合實(shí)體的復(fù)合糖。
按照本發(fā)明下列優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述實(shí)體是生物活性物質(zhì)的候選物，該方法適合于鑒定是生物活性物質(zhì)的候選物的靶標(biāo)的復(fù)合糖。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，該實(shí)體是能夠結(jié)合特異性天然復(fù)合糖的配體，而且其中可編址組合的復(fù)合糖庫是特異性天然復(fù)合糖的結(jié)構(gòu)域的代表，該方法適于鑒定結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)構(gòu)域。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，該實(shí)體是潛在藥物。
按照本發(fā)明的另一方面提供一種診斷以自身或非自身復(fù)合糖結(jié)構(gòu)為特征且誘導(dǎo)其對(duì)抗抗體的疾病的方法，該方法包括步驟(a)制備代表自身或非自身復(fù)合糖的可編址組合的復(fù)合糖庫，通過(i)提供具有多個(gè)位置的固相支持體；和(ii)酶促合成多種復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，多種復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的每種結(jié)構(gòu)結(jié)合在多個(gè)位置的至少一個(gè)編址位置，由此制備可編址組合的復(fù)合糖庫；和(b)可編址組合的復(fù)合糖庫與得自患者的抗體反應(yīng)，該患者被懷疑患有所述疾病，由此產(chǎn)生結(jié)合抗體的位置的圖式，由此通過將該圖式與健康個(gè)體所特有的已知圖式對(duì)比，獲取對(duì)該疾病的診斷。
本發(fā)明成功地利用組合的復(fù)合糖庫及其制備和篩選方法克服了現(xiàn)有構(gòu)型的缺點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明在此僅以舉例的方式參考附圖進(jìn)行描述，其中
圖1是具有5種不同種類和三個(gè)支化點(diǎn)的14個(gè)單糖單元的復(fù)合糖的公式。這種可以通過本發(fā)明的方法來實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜度是所屬領(lǐng)域中任何已知的化學(xué)或酶促合成方法都無法實(shí)現(xiàn)的。
該圖顯示了單糖類型的名稱、端基異構(gòu)體(反應(yīng)中心)和價(jià)鍵種類，以及支化點(diǎn)。
圖2表示有關(guān)CCSD數(shù)據(jù)庫的復(fù)合糖記錄中支化發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究。CCSD數(shù)據(jù)庫包含48,956條記錄，其來源于公開的文獻(xiàn)并且由Georgia University Project-Complex Carbohydrate ResearchCenter-CCRC匯編。餅圖的各個(gè)部分以百分率表示數(shù)據(jù)庫的復(fù)合糖中存在的分支的數(shù)量(0-26)。利用CarbBank 3.2.009進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
圖3是一個(gè)直方圖，以百分比表示在CarbBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合糖中所存在的糖殘基數(shù)量的分布。雖然數(shù)據(jù)庫中全部復(fù)合糖中的44％具有6種或更多的殘基，但此類復(fù)合糖的化學(xué)和酶促合成不曾被廣泛實(shí)踐，特別是在庫的背景中。
圖4是一個(gè)表，表示
圖1的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的逐級(jí)酶促合成。在各步驟中，列出了酶促反應(yīng)(ER)(詳見表7)并且加入的單糖單元用灰色背景表示，“S”代表固相支持體，其上固定了復(fù)合糖并且發(fā)生合成反應(yīng)。
圖5描述GlcNAc與氰尿酰氯活化的Covalink NH的共價(jià)固定化，該固定化構(gòu)成本發(fā)明所述復(fù)合糖庫合成的第一步。
圖6描述GlcNAc和NHS/EDC活化Covalink NH的共價(jià)固定化，該固定化構(gòu)成本發(fā)明所述復(fù)合糖庫合成的第一步。
圖7a描述WGA與偶聯(lián)在Covalink NH平板上的PNP-GlcNAc在氰尿酰氯活化的存在或不存在下的結(jié)合作用；這種結(jié)合作用通過WGA偶聯(lián)的過氧化物酶來顯示，在實(shí)施例部分將作進(jìn)一步說明。
圖7b是描述不同封阻方法對(duì)于WGA與偶聯(lián)在Covalink NH上的GlcNAc-COOH的結(jié)合作用的影響的圖示；這種結(jié)合作用通過WGA偶聯(lián)的過氧化物酶來顯示，在實(shí)施例部分將作進(jìn)一步說明。
圖7c是描述WGA和偶聯(lián)在氰尿酰氯活化Covalink NH上的GlcNAc的結(jié)合的圖示；這種結(jié)合作用通過WGA偶聯(lián)的FITC顯示，在實(shí)施例部分將作進(jìn)一步說明。
圖8a是描述WGA結(jié)合涂層在Maxisorb平板的BSA-GlcNAc的圖示；這種結(jié)合作用通過WGA偶聯(lián)的過氧化物酶來顯示，在實(shí)施例部分將作進(jìn)一步說明。
圖8b是一個(gè)圖式，描述圖8a中的結(jié)合作用作為所用洗滌步驟的次數(shù)的函數(shù)。
圖8c是描述利用ECorA凝集素結(jié)合驗(yàn)證β-D-半乳糖向平板固定的苯基-p-D-GlcNAc(22個(gè)原子連接體)的轉(zhuǎn)移。
圖9描述合成固定在平板上的由表17中所述結(jié)構(gòu)構(gòu)成的庫所需要的步驟，給出了微量滴定平板的組合、各步中進(jìn)行的酶促反應(yīng)和凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)。
圖10a描述了在用α，β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物(D7)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后RCA120的結(jié)合作用。
圖10b描述了用α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物(D3)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后BS-1的結(jié)合作用。
圖10c描述了用α1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶VI反應(yīng)混合物(B2)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后TGP-1的結(jié)合作用。
圖10d描述了用α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物(A2)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后TML的結(jié)合作用。
圖10e描述了用α2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物(A3)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后TML的結(jié)合作用。
圖10f描述了用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶VI反應(yīng)混合物(B2)(實(shí)線)培育之后或?qū)φ辗磻?yīng)(虛線)之后抗唾液酰基Lewis X小鼠IgM的結(jié)合作用。
圖11描述了庫(參見庫2)合成的各步驟中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，凝集素結(jié)合試驗(yàn)用來驗(yàn)證不同酶促步驟的效率。
圖12描述了在用β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物(D7)培育后在不同時(shí)間點(diǎn)RCA120與Maxisorb平板鍵合的BSA-GlcNAc的結(jié)合作用。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及組合的復(fù)合糖庫及其合成方法，其可以用于(i)復(fù)合糖藥物的鑒定；(ii)復(fù)合糖相關(guān)性受體或蛋白作為藥物治療的新的潛在糖相關(guān)靶標(biāo)的鑒定；(iii)生物活性復(fù)合糖的鑒定；(iv)作為藥物療法的潛在新靶標(biāo)的特異性復(fù)合結(jié)構(gòu)糖單元的鑒定；(v)已知復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)的鑒定；(vi)復(fù)合糖結(jié)構(gòu)中新的糖標(biāo)記的鑒定；和(vii)對(duì)癌癥相關(guān)性糖標(biāo)記或其它疾病相關(guān)性糖抗原形成的抗體的鑒定。
參考附圖和所附的描述可以更好地理解按照本發(fā)明所述組合的復(fù)合糖庫的原理和操作及其合成方法。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明不局限于在下面的描述或附圖舉例中提出的組分的構(gòu)建和排列的具體描述。本發(fā)明能夠以多種途徑實(shí)施或進(jìn)行其它實(shí)施方案。另外，應(yīng)理解在此所用的說法和術(shù)語目的在于說明而不受限定。
合成復(fù)合糖庫的酶按照本發(fā)明復(fù)合糖組合庫的酶促合成是利用糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶和轉(zhuǎn)糖苷酶實(shí)現(xiàn)的。這些酶可以從不同來源利用下面所述的不同策略來獲得。
由天然來源的酶目前，業(yè)已廣泛表征了200種以上不同種類的對(duì)大量底物和供體有效的糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)糖苷酶和糖苷酶。發(fā)現(xiàn)這些酶存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、無脊椎動(dòng)物細(xì)胞和微生物中，(參見Palcic，1994 and Nilsson，1996，其在此全文引入作為參考)。
重組酶許多糖基轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)糖苷酶的編碼序列已經(jīng)被克隆，并且由此表征了各種重組酶編碼的接納體底物的特異性。下表5列出了一些克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶及其各自的接納體底物特異性。利用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)可以制備出足夠量的已克隆編碼序列的酶。由于這些酶中的大多數(shù)需要對(duì)官能度進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，所以表達(dá)適宜在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行(Toki，1997；Tan，1995)。此外，在催化結(jié)構(gòu)域已表征的可溶性酶的情況中，可以只對(duì)域序列完成表達(dá)，條件是保持其催化活性和全酶的底物特異性(Vries，1997)?？扇苄蕴腔D(zhuǎn)移酶的其它可能表達(dá)體系還包括哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的分泌物(參見，例如U.S.5,032,519，其在此全文引入作為參考)。
表5克隆糖基轉(zhuǎn)移酶及其接納體的部分目錄
表5(續(xù))
鑒定和克隆新的酶的方法除了目前可利用的天然和重組糖基轉(zhuǎn)移酶以外，可以進(jìn)行新糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定和分離。適用于復(fù)合糖庫合成的糖基轉(zhuǎn)移酶可以從細(xì)胞類中鑒定和分離出來，其具有一般通過這些預(yù)期糖基轉(zhuǎn)移酶合成的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。具有固定接納體作為配體的親和色譜技術(shù)為所屬領(lǐng)域熟知并且確保所需糖基轉(zhuǎn)移酶的簡(jiǎn)單一步式分離(這方面參見U.S.Pat.No.5,288,637，其在此引入作為參考)。糖基轉(zhuǎn)移酶一旦被鑒定并分離，可以部分測(cè)序并且由此克隆編碼基因。克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因的技術(shù)已經(jīng)建立，現(xiàn)有技術(shù)評(píng)述了克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因的的許多實(shí)施例和策略(參見，例如Schachter，1994和WO 95/02683，其在此引入作為參考)。
另一種新糖基轉(zhuǎn)移酶序列的可能性來源存在于DNA和蛋白數(shù)據(jù)庫中。由于新的DNA和蛋白序列數(shù)據(jù)的迅速積累，序列對(duì)比技術(shù)可以用來鑒定新的糖基轉(zhuǎn)移酶。例如，從動(dòng)物、酵母、植物和細(xì)菌鑒定了110種特殊cDNA和基因，其蛋白產(chǎn)物含有UDP糖基轉(zhuǎn)移酶基因總科的特有“特征序列”(Mackenzie，1997)。利用這些特征序列或基序，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選新糖基轉(zhuǎn)移酶的有關(guān)數(shù)據(jù)庫。例如，利用序列同源性對(duì)比從包皮垢分支桿菌得到的阿糖轉(zhuǎn)移酶基因，在結(jié)核分支桿菌的完全測(cè)序基因組中鑒定出三種新的阿糖轉(zhuǎn)移酶基因(Cole，1998)。
利用通過直接演化修飾的酶在某些復(fù)合糖的合成中也可以采用具有修飾的親和力或改變的底物供體或接納體特異性的酶。例如，在合成由以同一區(qū)域特異性取向相連的相同重復(fù)單糖單元組成的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的合成中，例如D-man-α(1，2)-D-Man-α(1，2)-D-man-α(1，2)-R，需要采用α-1，2甘露糖轉(zhuǎn)移酶和對(duì)α-1，2甘露糖具有特異性的接納體。在GDP-甘露糖的存在下利用天然酶和固定在固相支持體上的D-man-α(1，2)-R，應(yīng)得到未控制的聚合反應(yīng)，其產(chǎn)生低聚甘露糖的長(zhǎng)聚合鏈，[D-Man-α(1，2)]n-R。為了合成具有指定數(shù)量的甘露糖單元的低聚甘露糖(上述實(shí)例中的三種)，需要一種控制分步方法。利用修飾的糖基供體以及具有修飾供體特異性的特定糖基轉(zhuǎn)移酶可以獲得控制非預(yù)期聚合反應(yīng)的能力。這種修飾酶，用來把修飾的GDP-Man增加到固定的接納體D-manα(1，2)-R上。隨后GDP-Man的甘露糖苷部分的修飾作用將防止下一甘露糖部分的添加，因?yàn)閷?duì)于這種甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶的接納體是D-man-α(1，2)-R而不受D-(修飾的man)-α(1，2)-D-man-α(1，2)-R。該反應(yīng)之后，洗滌去任何過量的修飾供體和酶，除去修飾基團(tuán)，由此能夠連續(xù)重復(fù)相同酶促步驟。連續(xù)進(jìn)行這種控制過程直至將預(yù)期數(shù)量的甘露糖分子裝配成為新的糖。所以，修飾基團(tuán)可以是連結(jié)在供體除1位之外任何位置時(shí)的化學(xué)基團(tuán)。此后，通過酶促或化學(xué)反應(yīng)選擇性地脫去修飾基團(tuán)，由此釋放修飾基團(tuán)同時(shí)不損害復(fù)合糖分子。
表6列出了一些目前可利用的糖修飾基團(tuán)，按照其脫除方法進(jìn)行分類(Kunz，1997，其全文及其中引用的文獻(xiàn)在此引入作為參考)。附加單糖也可以用作修飾基團(tuán)，因此利用不影響現(xiàn)存復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的特異性糖苷酶可以將它們脫除(Peieto，1995)。
表6按照其裂解方式分類的可利用糖修飾基團(tuán)(Kunz and Schultz，1997；和其中引入的參考文獻(xiàn))
所以，具有修飾供體和/或接納體特異性的酶可以利用直接演化途徑制備。隨著蛋白工程領(lǐng)域中的最新進(jìn)展，公開了許多通過直接演化法獲得的具有改造特異性的酶的實(shí)例(這個(gè)領(lǐng)域可以參見Kuchner，1997；Harris，1998，其在此引入作為參考)。通過基因或編碼酶基因的區(qū)域定向或位點(diǎn)定向誘變的隨機(jī)順序產(chǎn)生獲得酶特異性的直接演化，隨后選擇或篩選表現(xiàn)出預(yù)期特異性和活性的克隆。譬如，Moore及其同事進(jìn)行了7個(gè)循環(huán)的DNA改組來改變對(duì)-硝基芐基酯酶對(duì)新抗生素底物的底物特異性(Moore，1996)。Zhang及其同事從半乳糖苷酶通過DNA改組進(jìn)行了巖藻糖苷酶的直接演化(Zhang，1997)。Shan及其同事改組了非天然核苷酸對(duì)魯斯氏肉瘤病毒酪氨酸激酶的特異性(Shan，1997)。Paulson及其同事完成了唾液酸轉(zhuǎn)移酶S-唾液?；虻耐蛔?，改變了供體和接納體底物的動(dòng)力學(xué)(Datta，1998)。
組合的復(fù)合糖庫的平行可編址酶促合成下面的部分一步步描述按照本發(fā)明教導(dǎo)的組合的復(fù)合糖庫的酶促制備方法。
酶促組合的復(fù)合糖庫設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明，酶促組合的復(fù)合糖庫設(shè)計(jì)包括，按照其擬想的應(yīng)用測(cè)定特異性庫中包括的復(fù)合糖組分。
復(fù)合糖組成的測(cè)定包含在(？)。
譬如，為了利用本發(fā)明的酶促組合的復(fù)合糖庫來鑒定發(fā)揮靶向藥物作用的復(fù)合糖，所述庫的復(fù)合糖成員優(yōu)選是存在于人體細(xì)胞中的復(fù)合糖的衍生物或修飾物。用由其它來源衍生的其它分子，如特定的人體細(xì)胞或其病原體，篩選此類庫，可以確保鑒定出新的復(fù)合糖，它們能夠充當(dāng)這些分子的受體，在體內(nèi)用作病原體受體，或參與細(xì)胞和細(xì)胞之間的識(shí)別過程。
同樣地，為了利用本發(fā)明的酶促組合的復(fù)合糖庫來鑒定潛在藥物，優(yōu)選按照類似于或相同于人體細(xì)胞中所存在的天然復(fù)合糖來合成庫的復(fù)合糖成員。利用由不同天然和合成來源衍生的候選藥物篩選此類庫，確保了與一種或多種庫的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)結(jié)合的候選藥物的鑒定。
按照本發(fā)明的另一特異性庫包含專門用于鑒定候選新藥的復(fù)合糖。在這種情況中，產(chǎn)生了最大復(fù)合糖多樣性的庫，這種多樣性表現(xiàn)出自然界中不曾發(fā)現(xiàn)過的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。此后，篩選此類庫對(duì)于病原體或病原體衍生分子的潛在結(jié)合作用。另外，篩選此類庫對(duì)其它致病分子的潛在結(jié)合作用。
為了識(shí)別已知復(fù)合糖中的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，按照本發(fā)明制備出表現(xiàn)該復(fù)合糖的全部可能性結(jié)構(gòu)域的庫。對(duì)此類庫的結(jié)合作用或生物活性的篩選使人們能夠鑒定出已知復(fù)合糖的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域。
為了檢測(cè)對(duì)抗例如癌相關(guān)性糖表位(標(biāo)記)、器官移植相關(guān)性糖標(biāo)記或其它血清中的糖標(biāo)記所產(chǎn)生的抗體，制備并篩選糖標(biāo)記的特定聯(lián)合形式的復(fù)合糖庫。例如，一個(gè)特異性庫可以表現(xiàn)數(shù)種癌癥的糖標(biāo)記。隨后用由人體血清衍生的抗體篩選此類庫，鑒定出對(duì)一種或多種上述糖標(biāo)記抗體的存在。
為了描繪與例如癌癥或器官移植有關(guān)的糖標(biāo)記，制備并篩選糖成員特定聯(lián)合的復(fù)合糖庫，糖成員一般是與此類病癥有關(guān)的糖標(biāo)記的結(jié)構(gòu)變型。
其它專用于其它用途的酶促組合的復(fù)合糖庫也屬于本發(fā)明最廣義的范圍內(nèi)。
酶組件(EM)的建造EM的建造包括對(duì)必要酶促反應(yīng)(ER)、糖基供體和接納體以及合成庫的各種復(fù)合糖所需要酶進(jìn)行評(píng)估。EM的建造還包括必要ER的優(yōu)化和加工開發(fā)并且考慮反應(yīng)的時(shí)間、溫度和反應(yīng)物濃度。EM的構(gòu)建進(jìn)一步包括確定每個(gè)EM所采用的ER的特定次序。
為了保證所采用的合成反應(yīng)，要為指定庫的各個(gè)復(fù)合糖組分確定酶促反應(yīng)(ER)的特定順序。對(duì)于直鏈非分支結(jié)構(gòu)的復(fù)合糖，ER的順序是以分步形式按照這種直鏈非分支結(jié)構(gòu)的單糖序列的順序。對(duì)于具有分支結(jié)構(gòu)和/或以直鏈裝配排列的重復(fù)單糖單元的復(fù)合糖，應(yīng)利用特殊的EM設(shè)計(jì)獨(dú)特的合成方法。
下面的實(shí)施例提供了選擇特定ER的合理性，為特殊復(fù)合糖的合成提供專用EM。
圖1描述了最終的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，并且圖4和表7描述了設(shè)計(jì)方法。按照本發(fā)明，可以為指定庫存在中的各個(gè)復(fù)合糖設(shè)計(jì)EM。下文將作詳細(xì)說明，在按本發(fā)明建庫時(shí)，當(dāng)實(shí)際中完成了各種EM可以認(rèn)為有效。
表7包括其給體、接受體和索引的ERs的部分目錄
表7(續(xù))
進(jìn)行
圖1所示復(fù)合糖合成中的第一步，如圖4所示，將第一結(jié)構(gòu)單元GalNAc通過適當(dāng)?shù)倪B接體連結(jié)在固相支持體(S)上，該連接體將下文中作進(jìn)一步描述。
圖1所示復(fù)合糖合成中的第二步(D5，詳情參見表7和圖4)包括用β(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.112)將Gal從UDP-Gal轉(zhuǎn)移至GalNAc-S。
圖1中所示復(fù)合糖合成中的第三步(H1，詳情參見表7和圖4)包括利用β(1，3)N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.146)將乙酰基葡糖胺從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移到Gal-β(1，3)-GalNAc-S。
隨后，把半乳糖單元而不是巖藻糖單元添加到接納體上(參見圖4)，因?yàn)槊甫?1，3)-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.152)對(duì)于接納體Gal-β(1，4)-GlcNAc-R而不是裸露GlcNac具有特異性。
所以，在
圖1所示復(fù)合糖合成中的第四步中(D7，詳情參見表7和圖4)，利用酶β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.38)把半乳糖添加到GlcNAc-R上。
經(jīng)過上述第四合成步驟之后，合成過程被復(fù)雜化，因?yàn)榘肴樘菃卧种閮蓚€(gè)觸角(分枝)。由于這些觸角的結(jié)構(gòu)在支化點(diǎn)處等同，但其非還原端不同，所以同時(shí)形成兩個(gè)觸角的同一部分的相同分步合成過程將不能保證各觸角特定還原端的后繼合成。因此，各觸角的兩個(gè)特定部分的合成以各自的分步方式進(jìn)行。在任何情況中，在所給的實(shí)施例中，首先合成β(1，3)支鏈，因?yàn)樵撚|角需要巖藻糖化。如果合成方法是從其它支鏈開始，就無法實(shí)現(xiàn)預(yù)期支鏈的直接巖藻糖化。
所以，在
圖1所示復(fù)合糖合成中的第五步(H3，詳情參見表7和圖4)是利用β(1，3)N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.149)把乙酰基葡糖胺從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移到Gal-β(1，4)-GlcNAc-R。
在
圖1所示復(fù)合糖合成中的第六步中(D7，詳情參見表7和圖4)，利用β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.38)把半乳糖殘基添加到GlcNAc-R。
在
圖1所示復(fù)合糖合成中的第七步中(D3，詳情參見表7和圖4)，利用α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.151)把附加的半乳糖殘基添加到Gal-α(1，4)-GlcNAc-R。
在
圖1所示復(fù)合糖合成中的第八步中(H14，詳情參見表7和圖4)，利用β(1，6)N-乙酰基葡糖胺轉(zhuǎn)移酶在Gal[GlcNAc-β(1，3)]β(1，4)-GlcNAc-R接納體底物上分支化。
圖1所示復(fù)合糖合成中的第九步(B2，詳情參見表7和圖4)涉及四個(gè)GlcNAc單體中的兩個(gè)并且利用α(1，3)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.152)完成將巖藻糖轉(zhuǎn)移至Gal-β(1，4)-GlcNAc-R。
圖1所示復(fù)合糖合成中的第十步(D7，詳情參見表7和圖4)進(jìn)一步用β(1，4)半乳糖轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.38)在GlcNAc-R接納體底物上完成第二觸角的延伸。
在
圖1復(fù)合糖合成中的第十一步中(A3，詳情參見表7和圖4)中，利用α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.99.6)將唾液酸單體以α(1，6)取向附加在觸角的Gal-α(1，4)GlcNAc-R。
圖1所示復(fù)合糖合成中第十二步(A6，詳情參見表7和圖4)進(jìn)一步利用(2，8)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.99.8)完成這個(gè)觸角的延伸，由此在NeuAC-α(2，3)-Gal-R底物接納體上附加另一個(gè)NeuAC單元。
這個(gè)觸角的進(jìn)一步延伸需要利用對(duì)NeuAC-α(2，8)-NeuAC-R底物接納體具有特異性的(2，8)聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶。不幸的是，利用此類酶的酶促反應(yīng)將導(dǎo)致多個(gè)唾液酸單體的不可控聚合反應(yīng)而不是預(yù)期的單一唾液酸單體的附加。在各個(gè)ER步驟中單一唾液酸單體的可控附加必須采用具有修飾供體特異性的酶。所以，代替CMP-NeuAC用作供體底物，這種修飾的酶在聚糖末端摻雜修飾基團(tuán)。該修飾基團(tuán)的存在防止了不需要的多個(gè)唾液酸單體的聚合，因?yàn)檫@種酶無法將唾液酸附加在接納體NeuAC(修飾)-α(2，8)-NeuAC-R上。在ER的最后步驟中脫去修飾基團(tuán)。
所以，在
圖1所示復(fù)合糖合成中的最后步驟中(A7，詳情參見表7和圖4)，修飾酶α(2，8)聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶與修飾的供體CMP-NeuAC和接納體NeuAC(修飾)-α(2，8)-NeuAC-R合用，由此生成
圖1所示的復(fù)合糖。
下表8概述了
圖1所示復(fù)合糖的合成步驟，如圖4所示。表8
為提供預(yù)期ER的ER選擇是利用考慮復(fù)合糖結(jié)構(gòu)和可利用的ER的計(jì)算機(jī)算法產(chǎn)生的。此類算法可以很容易地由所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)多種可利用糖基轉(zhuǎn)移酶糖苷酶和轉(zhuǎn)糖基酶的供體-接納體特異性來編程。
自動(dòng)化合成和篩選按照本發(fā)明組合的復(fù)合糖庫的建造中所采用的EM利用自動(dòng)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了鍵合在固相支持體上的組合的復(fù)合糖庫的制備。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，利用自動(dòng)化技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)篩選，鑒定出與感興趣探針交叉反應(yīng)的生物活性復(fù)合糖。
特定庫的每一種復(fù)合糖的不同結(jié)構(gòu)特征需要大批特殊合成方案。所以，本發(fā)明所述的庫適宜于由平行合成法產(chǎn)生，其中優(yōu)先考慮保證執(zhí)行最少數(shù)量的步驟。例如，機(jī)器人系統(tǒng)容許來自試劑容器的試劑的平行可編址分配。在這樣的情況中，最低數(shù)量的步驟意味著各個(gè)試劑容器以最少的次數(shù)選派。因此，應(yīng)考慮合成步驟的順序，保證通過以最低次數(shù)選派各個(gè)試劑容器來完成庫的全部復(fù)合糖的合成。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易開發(fā)出專用算法，設(shè)計(jì)出滿足上述要求的自動(dòng)庫的合成方案。事實(shí)上，已經(jīng)為低聚核苷酸(Pease，1994)和肽(Fodor，1991)在微片上的平行可編址合成開發(fā)出了類似算法(它們?cè)诖巳囊胱鳛閰⒖?。
在過去的數(shù)年中已經(jīng)廣泛開發(fā)了能夠自動(dòng)高通量平行可編址的合成技術(shù)?？梢钥刂撇⑶彝瑫r(shí)可以進(jìn)行多種不同的固相合成方案的自動(dòng)合成儀現(xiàn)在可以購得(Rivero，1997)。這些技術(shù)按照合成所采用的固相底物的種類、試劑引入和除去的方法以及反應(yīng)室的設(shè)計(jì)來劃分。
能夠自動(dòng)高通量固相平行合成的技術(shù)可以按照本發(fā)明應(yīng)用。此類技術(shù)包括，例如(i)開放式反應(yīng)器系統(tǒng)(例如常規(guī)微量滴定平板)；(ii)密閉反應(yīng)器系統(tǒng)或半密閉反應(yīng)器系統(tǒng)(例如lab-on-chip)；(iii)反應(yīng)封閉系統(tǒng)(reaction block systems)；(iv)在聚合物針上合成；(v)在聚合物薄片上合成；和(vi)在微嵌片上合成。有關(guān)這些技術(shù)和系統(tǒng)的全面評(píng)述參見Cargil，1997，其在此全文引入作為參考。
固相支持體按照本發(fā)明這些庫優(yōu)選在固相支持體上合成。所以，第一個(gè)建筑塊為與支持體結(jié)合提供適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)。適用的結(jié)合基團(tuán)包括羥基、羰基、羧基、胺、鹵化物、硫醇、酯、硼酸酯、甲硅烷氧基、氮雜、氧代、環(huán)氧乙烯或任何不飽和基團(tuán)。
若干種固相基質(zhì)支持體非常適合制備生產(chǎn)本發(fā)明的糖庫，例如但不限于，用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯(Merrifield，1963)、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物(PEG-PS，Bayer，1991)、聚酰胺(Dryland，1986)、聚丙烯酰胺(Ashardy，1979)、聚甲基丙烯酰胺(Hsiau，1997)和纖維素(Frank，1988)。通過標(biāo)準(zhǔn)半導(dǎo)體加工工藝生產(chǎn)的微裝配的基于硅的陣列(Fodor，1991；Sosnowski，1997；Cheng，1998，U.S.Pat.Nos.5,643,738；5,681,484；and 5,585,069)也可以用作固相支持體。
在固相支持體上連接第一個(gè)糖建筑塊第一個(gè)糖建筑塊優(yōu)選經(jīng)過一個(gè)原子(例如固相官能團(tuán))或連接體以共價(jià)方式連接在固相基質(zhì)上。連接體的一般特性包括具有能夠連接固相支持體和起始建筑塊的雙官能團(tuán)，并由此確定結(jié)構(gòu)(Atherton，1989)。由于酶對(duì)固定糖的可接近性非常重要，所以連接體長(zhǎng)度和柔性是高收率的關(guān)鍵。所以，按照本發(fā)明適于合成的連接體可以包括，例如氨基酸、肽、非糖基化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脂質(zhì)A、神經(jīng)酰胺、多萜醇磷酸酯、環(huán)糊精、低聚糖、單糖、烷基鏈、核酸或其它間隔分子。這些連接體可以可裂解或不可裂解的，并且可以由簡(jiǎn)單、復(fù)合、環(huán)狀或分支的實(shí)體組成。
庫排列按照本發(fā)明庫組分的優(yōu)選排列采取在固相支持體上以各種幾何形式和設(shè)計(jì)合成的陣列，例如二維陣列、多層陣列、三維陣列(例如堆積微量滴定)，和在球形圓盤或錐形上表現(xiàn)的陣列。另外，庫組成可以連結(jié)在反應(yīng)室(開放或密閉)中的聚合物珠粒上并且排列在二維或三維支持體上。按照本發(fā)明可以采用任何能夠易化EM收集的自動(dòng)可編址操作的排列。優(yōu)選關(guān)注庫的復(fù)合糖的空間分布以確保多數(shù)相似糖之間距離最短，由此保證自動(dòng)合成過程的效率。微流體系可以并且優(yōu)選被采用(U.S.Pat.Nos.5,643,738；5,681,484；和5,585,069)。
自動(dòng)庫篩選所屬領(lǐng)域常用的多種篩選技術(shù)和方法可以應(yīng)用來篩選本發(fā)明的復(fù)合糖庫。有關(guān)綜述可以參見Broach，1996和Burbaum，1997，其在此全文引入作為參考。所以，適合結(jié)合或生物活性的高通量篩選技術(shù)可以基于(i)放射性檢測(cè)方法；(ii)熒光檢測(cè)方法；(iii)以ELISA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法；和(iv)利用報(bào)道基因基于細(xì)胞的試驗(yàn)體系。
可以檢測(cè)與指定庫的復(fù)合糖相結(jié)合的放射性標(biāo)記探針，例如通過閃爍接近測(cè)定法(SPA，Cook，1996)。SPA的主要優(yōu)點(diǎn)在于(i)不需要除去游離放射標(biāo)記分子；和(ii)易于自動(dòng)化。還可以采用其它方法，例如熒光法，或者利用熒光標(biāo)記的鍵合分子的直接熒光檢測(cè)，或者例如采用均勻時(shí)間分辨熒光(Homogenous Time-ResolvedFluorescence)(HTRF，Mathis，1995)或熒光偏振測(cè)定(PFA)技術(shù)(Checovich，1995)。上述后面的技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)在于能夠利用“混合并測(cè)量”的方案，無需增加其它復(fù)雜步驟。此外，許多酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)法也可以用于本發(fā)明。
按照本發(fā)明庫的各種復(fù)合糖的生物活性和結(jié)合能力可以利用基于細(xì)胞的試驗(yàn)體系來評(píng)估。人們深入研究了適合高通量篩選的基于細(xì)胞的試驗(yàn)體系，并且介紹了選擇適當(dāng)篩選體系的準(zhǔn)則(Rose，1996)。利用哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞以及酵母和細(xì)菌細(xì)胞的試驗(yàn)體系業(yè)已被詳盡公開(Broach，1996；Rose，1996；Suto，1997)。
一種最常用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的分子和能夠結(jié)合此類細(xì)胞的配體之間的相互作用的方法是采用報(bào)道基因。這包括將將具有報(bào)道基因的編碼序列的靶向基因的轉(zhuǎn)錄控制因子剪接到載體中，將該載體引入適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，從而建立對(duì)靶向的調(diào)制有響應(yīng)的檢測(cè)體系，在這種情況中采用來源于可編址庫的復(fù)合糖。報(bào)道基因的普通實(shí)例是酶，例如堿性磷酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲和細(xì)菌的熒光素酶和β-半乳糖苷酶。利用比色、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光檢測(cè)法可以檢測(cè)出這些酶的低水平活性。還可以采用非酶報(bào)道基因例如綠色、紅移和藍(lán)色熒光蛋白(Phillips，1997)。
所以，按照本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種組合的復(fù)合糖庫。按照本發(fā)明組合的復(fù)合糖庫包括多種的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。
按照本發(fā)明的另一方面提供一種制備可編址組合的復(fù)合糖庫的方法。按照本發(fā)明通過酶促合成多種的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)實(shí)施該方法，其各自連結(jié)在固相支持體的多種位置的至少一個(gè)可編址位置，得到可編址組合的復(fù)合糖庫。
在本說明書和后面的權(quán)利要求書部分中所用的術(shù)語“可編址”和“編址的”是指定位和同一性。所以，按照本發(fā)明庫的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的定位和同一性(組成)預(yù)先已知并且因此可以編址糖結(jié)構(gòu)。應(yīng)理解短語“復(fù)合糖結(jié)構(gòu)”是指多數(shù)復(fù)合糖分子均具有相同結(jié)構(gòu)并且位于固相支持體上的特定和可編址位置上。
按照本發(fā)明庫的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)優(yōu)選經(jīng)連接體(間隔基)連接在固相支持體上。按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案連接體包括至少兩個(gè)連接共價(jià)鍵，并且長(zhǎng)度至少為20埃。適用的連接體包括，但不限于氨基酸、肽、非糖基化蛋白、脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺、多萜醇磷酸酯、環(huán)糊精、低聚糖、單糖、烷基鏈和核酸(例如低聚核苷酸)。
按照本發(fā)明庫的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)所連結(jié)的固相支持體包括可編址微?；蛑榱?，或扁平平臺(tái)。可編址微?；蛑榱Ｅ帕性诶缥⒘康味ㄆ桨宓目字?。另外，微量滴定平板、薄膜或嵌片(例如聚硅氧烷嵌片)按照本發(fā)明可以用作扁平平臺(tái)固相支持體。
按照本發(fā)明目前的優(yōu)選實(shí)施方案，固相支持體為嵌片，并且多種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的不同復(fù)合糖結(jié)構(gòu)在嵌片的表面上形成彼此間隔(中心之間)不超過2.25mm的斑片，因此提供了密度為至少為每平方厘米20個(gè)不同可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。
制備固相支持體的物質(zhì)可以是，例如用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、纖維素、玻璃、石英、塑料或二氧化硅。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明庫的多種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一種、優(yōu)選至少三種、更優(yōu)選至少10種、更優(yōu)選至少100種、更優(yōu)選至少1000種包含至少2、3、4或至少5個(gè)或更多的單一種類的連接糖單元。上述此類結(jié)構(gòu)由于不受控聚合反應(yīng)難以進(jìn)一步詳述和決定。
按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明庫的多種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一種、優(yōu)選至少三種、更優(yōu)選至少十種、更優(yōu)選至少100種、更優(yōu)選至少1000種包含至少1、2、3、4或至少5個(gè)或更多的支鏈。
按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，至少1、2、3或至少4個(gè)支鏈形成相同核心和分支的糖單元。上述此類結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步詳述和決定比較困難，尤其是如果連結(jié)到各支鏈上的觸角與糖單元組合物不同時(shí)。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，多種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的至少一種、優(yōu)選至少三種、更優(yōu)選至少十種、更優(yōu)選至少100種、更優(yōu)選至少1000種包含至少4個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、更優(yōu)選至少7個(gè)、更優(yōu)選至少9個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少12個(gè)、更優(yōu)選至少15、20、25或至少30個(gè)、更優(yōu)選至少50或更多個(gè)糖單元。
根據(jù)其預(yù)期用途，如下文所述，本發(fā)明庫的多種可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)可以是含有非天然或天然復(fù)合糖的代表，例如衍生自人體來源，如人類的組織、細(xì)胞或體液。另外，可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的多元性可以是至少一種天然復(fù)合糖的結(jié)構(gòu)域(片段)的代表。如下所述，這樣的庫可以用來鑒定天然復(fù)合糖的活性位點(diǎn)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種鑒定能夠結(jié)合實(shí)體的復(fù)合糖的方法。按照本發(fā)明的這個(gè)方面，該方法是通過提供任一本發(fā)明所述實(shí)施方案的可編址組合的復(fù)合糖庫并且用實(shí)體篩選該可編址組合的復(fù)合糖庫，鑒定出能夠結(jié)合該實(shí)體的復(fù)合糖。
如下文所例舉的，任何實(shí)體都可以用來篩選本發(fā)明的可編址組合的復(fù)合糖庫。例如，所述實(shí)體可以是生物活性物質(zhì)的候選物，例如由天然或合成來源衍生的候選藥物。在這種情況中，按照本發(fā)明的這個(gè)方面，該方法可以用來鑒定出是該生物活性物質(zhì)的候選物目標(biāo)的復(fù)合糖。另外，所述實(shí)體可以是結(jié)合特異性天然復(fù)合糖的配體。在這種情況中，可編址組合的復(fù)合糖庫可以是該特異性天然復(fù)合糖的結(jié)構(gòu)域的代表，而該方法此時(shí)可以用來鑒定出結(jié)構(gòu)域中與該配體結(jié)合的特異性結(jié)構(gòu)域，由此鑒定出天然復(fù)合糖的活性位點(diǎn)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種診斷以自身或非自身復(fù)合糖結(jié)構(gòu)和抗體的誘導(dǎo)為特征的疾病的方法。按照本發(fā)明的這個(gè)方面，該方法利用在此所述的任何庫合成方法提供代表自身和/或非自身復(fù)合糖的可編址組合復(fù)合糖庫。可編址組合的復(fù)合糖庫此后與從被懷疑患有所述疾病的患者獲得的抗體反應(yīng)，由此產(chǎn)生結(jié)合抗體的位置的圖式，通過將該圖式與健康個(gè)體特有的已知圖式比較，診斷出該疾病。
與產(chǎn)生或引入自身和/或非自身復(fù)合糖結(jié)構(gòu)有關(guān)的已知疾病包括，但不限于，腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、妊娠、血管疾病、心臟病、神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病和器官移植。神經(jīng)變性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、基底神經(jīng)節(jié)變性疾病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、羊遲發(fā)性病毒感染(Scrapie)、海綿狀腦病和Creutzfeldt-Jakob氏病、不育癥、變應(yīng)性、胚胎發(fā)生、細(xì)胞編程性死亡和神經(jīng)變性疾病。
下面是一些在篩選通過本發(fā)明方法所產(chǎn)生的特異性庫時(shí)采用的策略。
所以，為了鑒定復(fù)合糖受體、有關(guān)蛋白質(zhì)、凝集素和/或靶向藥物，由人體細(xì)胞產(chǎn)生的已知復(fù)合糖結(jié)構(gòu)和由還原作圖產(chǎn)生的新糖結(jié)構(gòu)組成的酶促組合復(fù)合糖陣列用多種標(biāo)記探針進(jìn)行了篩選，所述探針來源于例如標(biāo)記的人體組織勻漿、標(biāo)記受體、由EST保藏標(biāo)本編碼的標(biāo)記蛋白質(zhì)、標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)、噬菌體顯示庫，由人體組織、病原體或溶液獲得的標(biāo)記細(xì)胞，該溶液含有從人體組織來源或致病細(xì)胞獲得的標(biāo)記蛋白分子的混合物。此類篩選的目的在于鑒定由上述來源獲得的、特定地結(jié)合庫的復(fù)合糖的標(biāo)記分子。分離和定性之后，這些分子可以進(jìn)一步作為藥物治療潛在的候選物或藥物治療的靶進(jìn)行試驗(yàn)。這些策略也可用于鑒定與庫的特定復(fù)合糖組分相結(jié)合的新受體、凝集素或任何蛋白質(zhì)或分子。
為了鑒定出結(jié)合特定復(fù)合糖的先導(dǎo)化合物，可以針對(duì)不同組的標(biāo)記分子篩選酶促組合物的復(fù)合糖庫，這些庫由人體細(xì)胞的已知復(fù)合糖結(jié)構(gòu)或新的糖結(jié)構(gòu)組成，其中新的糖結(jié)構(gòu)是由正常和/或致病細(xì)胞或病原體的還原作圖產(chǎn)生。這種篩選的目的在于更清楚地了解復(fù)合糖在發(fā)現(xiàn)它們的細(xì)胞中或細(xì)胞上與其各自配體之間的特定相互作用。被分離和定性的配體隨后可以用作重要生物活性的調(diào)制劑，例如細(xì)胞和細(xì)胞之間的通訊、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞發(fā)育和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
為了鑒定出新的生物活性復(fù)合糖，按照本發(fā)明，制備由多種陣列的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)組成的復(fù)合糖庫，包括自然界中未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。然后用基于細(xì)胞的試驗(yàn)體系，或用規(guī)定的人體或微生物標(biāo)記的靶分子(如凝集素或受體)，篩選該復(fù)合糖庫。這樣的篩選能夠鑒定出新的基于復(fù)合糖的候選藥物。另外，這樣的篩選能夠鑒定出與疾病相關(guān)的復(fù)合糖。這些疾病相關(guān)性復(fù)合糖可以用來誘導(dǎo)其抗體，此后用抗體鑒定和分離錨泊該疾病相關(guān)性復(fù)合糖的糖蛋白，由此鑒定出與該疾病有關(guān)的新蛋白質(zhì)和基因。
為了鑒定出已知或新的復(fù)合糖的活性位點(diǎn)，按照本發(fā)明，制備包含這種特定復(fù)合糖的全部可能結(jié)構(gòu)域片段的庫。因此，此后可以用標(biāo)記受體篩選這些結(jié)構(gòu)域片段，所述受體正常結(jié)合包含此類結(jié)構(gòu)域的復(fù)合糖。由此獲得各結(jié)構(gòu)域片段的結(jié)合特異性，從而能夠分離特定復(fù)合糖引發(fā)該結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域片段，即活性位點(diǎn)。這個(gè)目的可以在多個(gè)充分定性的復(fù)合糖-受體對(duì)并列中完成。
本發(fā)明還能夠圖示患者血清中發(fā)現(xiàn)的抗其自身或非自身糖標(biāo)記的抗體。因此，按照本發(fā)明，合成含有多種陣列的存在于患者血清中的糖標(biāo)記的復(fù)合糖庫。隨后，對(duì)由該患者獲得的血清抗體的標(biāo)記庫篩選這個(gè)庫，所得產(chǎn)生抗體的性能可以用作癌癥和器官移植相容性的預(yù)診斷工具。
特定陣列的糖抗原也可以用來鑒定新的與癌癥、心血管疾病或器官移植有關(guān)的糖標(biāo)記。按照本發(fā)明用得自不同群體的標(biāo)記血清抗體篩選此類糖抗原陣列?？梢园鸦疾€(gè)體的抗體性能與健康群體的性能進(jìn)行比較。這種對(duì)比提供了抗體的獨(dú)特性能，其與對(duì)該病癥的免疫應(yīng)答有關(guān)，由此，特定的復(fù)合糖與該性能獨(dú)特的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生該特定疾病的診斷標(biāo)記。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和新的特征在考察下列實(shí)施例以后對(duì)于所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說變得更加清楚，這些實(shí)施例不起限定作用。另外，在上文中描述并且在下面的權(quán)利要求書部分請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的多種實(shí)施方案和方面分別得到下列實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例下列的實(shí)施例現(xiàn)供參考，這些實(shí)施例結(jié)合上面的說明書，以非限定方式舉例說明本發(fā)明。
下列實(shí)施例詳細(xì)描述了利用一組特別選擇的酶合成的復(fù)合糖的結(jié)構(gòu)。通常，在此所用的名稱和下文中的生化試驗(yàn)方法是所屬領(lǐng)域中熟知和常用的。所以，應(yīng)理解所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易實(shí)施下面的合成方法。
鑒于發(fā)現(xiàn)糖蛋白的糖殘基在控制細(xì)胞功能和細(xì)胞識(shí)別中發(fā)揮重要作用，病理學(xué)狀態(tài)下糖功能的研究已經(jīng)提出某些復(fù)合糖成為腫瘤特異性標(biāo)記的任務(wù)(Orntoft，1995)。蛋白糖基化中的巨大變化幾乎發(fā)生在各種癌中(Hakomori，1989)，其常常反映出生物合成途徑中的變化。
譬如，封阻糖基化生物合成途徑會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的超量產(chǎn)生，這些結(jié)構(gòu)在正常細(xì)胞中通常發(fā)現(xiàn)少量。此外，糖基化途徑的改變可能導(dǎo)致其它途徑的利用，也就是說，導(dǎo)致新復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的形成，正常情況下在細(xì)胞中或細(xì)胞上不存在這些新復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。細(xì)胞中糖基化途徑的這種調(diào)節(jié)通?？梢詺w因于糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
不同腫瘤組織的糖蛋白的改變了的糖結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞異常行為的基礎(chǔ)，所述行為包括腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵入健康組織(Kobata，1998)。
腫瘤標(biāo)記對(duì)于惡性細(xì)胞的診斷和治療非常重要。蛋白標(biāo)記可以是由腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)的任何特定表位，例如肽、糖肽、糖脂或其任何聯(lián)合形式。利用單克隆抗體可以特異性地鑒定出這些獨(dú)特的表位，所以此類獨(dú)特的糖基化模式作為癌癥免疫療法和診斷的潛在腫瘤標(biāo)記已經(jīng)并正在繼續(xù)得到深入研究(Ronin，1998)。
本發(fā)明使腫瘤標(biāo)記不但能夠在免疫療法或診斷學(xué)中應(yīng)用，也可以在藥物治療中作為潛在的靶。至此，含有腫瘤特異性復(fù)合糖(TSCC)和正常糖結(jié)構(gòu)的組合陣列能夠通過鑒定那些與腫瘤病癥有關(guān)的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)特異性和專一性地結(jié)合的分子分離出新的候選藥物。
實(shí)施例1肺癌是一種幾乎流行的疾病。在1990年記錄了約157000個(gè)新病例引起142000人死亡(Faber，1991)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)型的鱗狀肺癌(SLC)占全部肺癌的約35％。它與吸煙有密切關(guān)系，被診斷的大多為男性。鱗狀癌起源于肺的中央和肺門區(qū)并且當(dāng)在外周位置發(fā)現(xiàn)時(shí)可能成穴。它被分為重度和惡性形式的癌癥。雖然區(qū)別很小，SLC顯示與膜結(jié)合糖蛋白和粘蛋白樣分子有關(guān)的獨(dú)特復(fù)合糖抗原，其在循環(huán)系統(tǒng)中釋放并且用作血清標(biāo)記(Martensson，1988)。
下表描述了合成復(fù)合糖庫所必需的組分和酶組件(EM)，該庫可用于篩選和分離特異性結(jié)合SLC標(biāo)記的化合物、蛋白質(zhì)或其它分子。此類分子可以作為潛在的新候選藥物或用于防止鱗狀肺癌遷移的藥物。
表9-10表示釋放至循環(huán)系統(tǒng)中的SLC糖鏈的異常結(jié)構(gòu)的復(fù)合糖(標(biāo)記的A1、A2、A3、A8、A9和A10)，由此類SLC糖鏈衍生的所有可能片段(分別通過al、a2、a3、a8、a8和al0與A1、A2、A3、A8、A9和A10連結(jié))，正常血液抗原(標(biāo)記的A4、A5、A6、A7、A11和A12)和所有可能的由其衍生的正常血液抗原片段(分別通過a4、a5、a6、a7、al1和al2與A4、A5、A6、A7、A11和A12連結(jié))。
表9 表10
表10(續(xù)) *α-L-rucp-(1+4)-β-D-GlcpNAc-(1+3)-β-D-Galp-(1+4)-β-D-GlcpNAc-(1+3)-β-D-Galp-(1+4)-D-Gle表10(續(xù)) 表10(續(xù)) 表10(續(xù)) 表10(續(xù)) 表10(續(xù)) 表10(續(xù))
表11包括合成表9-10中所述復(fù)合糖集合所需的EM的列表。表11
表11(續(xù))
表11(續(xù))
表11(續(xù))
表11(續(xù))
實(shí)施例2人絨毛膜促性腺激素(hCG)是一種由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白激素。在從多種滋養(yǎng)層疾病的患者采集的血液和尿樣中可以檢測(cè)到高水平的hCG。所以，尿和血清的hCG水平已經(jīng)作為有效標(biāo)記用于滋養(yǎng)層疾病的診斷和預(yù)后，并且成為妊娠的標(biāo)記。由妊娠婦女尿中提純的hCG所釋放的復(fù)合糖與由患有滋養(yǎng)層疾病的患者采集的尿提純的那些復(fù)合糖的對(duì)比研究揭示出，由后者提純的hCG的糖鏈存在若干變化(Mizuochi，1983；Endo，1987)，表12-14表示合成用于篩選和分離特異性結(jié)合異常hCG標(biāo)記及其亞片段的分子的復(fù)合糖庫所需要的組分和EM。表12～13列出了摻雜在hCG特定陣列中的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)包括惡性滋養(yǎng)層疾病中存在于此類hCG中表示的異常糖鏈(標(biāo)為B5、B6、B7和B8)，惡性滋養(yǎng)層疾病中存在于此類hCG的所有可能片段化糖鏈(分別通過b5、b6、b7和b8與B5、B6、B7和B8連結(jié))，通常在妊娠婦女尿中存在的hCG內(nèi)發(fā)現(xiàn)的正常糖鏈(標(biāo)為B1、B2、B3和B4)及其全部可能片段(分別通過b1、b2、b3和b4與B1、B2、B3和B4相連)。表14表示合成表12-13的復(fù)合糖所需要的EM集合。表12
表13
表13(續(xù)) 表13(續(xù)) 表13(續(xù))
表14包括合成表12-13中所述復(fù)合糖集合所需的EM的列表。表14
表14(續(xù))
表14(續(xù))
實(shí)施例3在本世紀(jì)的后半葉中，業(yè)已證實(shí)許多細(xì)菌、真菌和植物多糖具有抗病毒、抗凝集、抗血栓、抗心血管和抗腫瘤活性(Witczak，1997)。還發(fā)現(xiàn)，通用結(jié)構(gòu)模式適用于所有的這些復(fù)合糖。這些復(fù)合糖的多數(shù)包括一個(gè)或兩個(gè)重復(fù)的單糖單元，其通過一種或兩種糖苷鍵相連并且被恒定長(zhǎng)度的分支點(diǎn)修飾。
表15概括了此類獨(dú)特結(jié)構(gòu)的部分實(shí)例。表15
粘度研究和X射線分析揭示，可能螺旋和三螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生上述活性(Misaki，1997)。然而，進(jìn)一步的研究證實(shí)，由這些復(fù)合糖的不完全水解衍生的片段也具有某些治療活性(Misaki，1980)。
因此，本發(fā)明可以用來篩選包含由上述復(fù)合糖衍生的短低聚物的組合低聚糖庫。例如，所述片段可以包含一個(gè)或兩個(gè)通過一種或兩種糖苷鍵彼此相連的重復(fù)單糖單元。當(dāng)需要時(shí)，此類片段也可以含有適當(dāng)分支。多糖的這種組合陣列可以用來分離新的抗病毒、抗凝集、抗血栓形成、抗心血管和抗腫瘤劑。
實(shí)施例4下面的實(shí)施例表示包括β(1，3)D-葡萄糖和β(1，6)葡萄糖支鏈的合成復(fù)合糖。所示各個(gè)低聚體含有7個(gè)單體。應(yīng)理解包含2至30個(gè)或更多單元組成的低聚體也可以通過在此所述的本發(fā)明方法合成。 實(shí)施例5下面的實(shí)施例表示由β(1，3)D-葡萄糖單元的主鏈和α(1，5)-阿糖支鏈組成的合成復(fù)合糖，所述支鏈位于主鏈上任何所需的位置。如下所示的每個(gè)低聚體含有12個(gè)單體。應(yīng)理解由2至40或更多單元組成的低聚體也可以通過本發(fā)明的方法合成。
實(shí)施例6下面的實(shí)施例表示由在3位帶有分支或第二硫酸酯單元的α(1，2)連接的α-L-巖藻糖或α-L-巖藻糖-4-硫酸酯組成的合成復(fù)合糖。如下所示的每個(gè)低聚體包含6個(gè)糖單體。應(yīng)理解由2至20或更多單元組成的低聚體也可以通過本發(fā)明的方法合成。 實(shí)施例7下面的實(shí)施例代表由(1，3)-連接的α-D-甘露糖或在2和/或6位硫酸化的α-D-甘露糖組成并且包含β(1，2)木糖殘根的合成復(fù)合糖。如下所示的每個(gè)低聚體包含5個(gè)糖單體。應(yīng)理解由3-20或更多單元組成的低聚體也可以通過本發(fā)明的方法合成。 實(shí)施例8下面的實(shí)施例表示由α(1，5)D-阿糖和α(1，2)D-甘露糖單元組成的合成復(fù)合糖，所述甘露糖單元帶有α-D-阿糖單元的核心，該核心與α-D-阿糖在2位相連或與α-D-甘露糖單元在任意位置相連。如下所示的每個(gè)低聚體包含9個(gè)糖單體。應(yīng)理解由2至70或更多單元組成的低聚體也可以通過本發(fā)明的方法合成。1α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+5)-α-D-Araf2α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+2)-α-D-Manp-(1+5)-α-D-Araf...nα-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf實(shí)施例9下面的實(shí)施例表示由α-1，5-D-阿糖和連結(jié)在單核心β-D-阿糖單元上的α-1，2-D-甘露糖單元組成的合成復(fù)合糖，β-D-阿糖單元與α-D-阿糖單元在2位或與α-D-甘露糖單元在任意位置相連。該復(fù)合糖還包含分支的β-D-阿糖，其位于3位。支鏈觸角包括一個(gè)核心β-D-阿糖單元作為主要低聚體，該單元與α-D-阿糖單元在2位或與α-D-甘露糖單元在任意位置相連。如下所示的每個(gè)低聚體包含14個(gè)糖單元。應(yīng)理解由2至70或更多單元組成的低聚體也可以通過本發(fā)明的方法制備。 復(fù)合糖庫的合成下面的實(shí)施例詳細(xì)描述了證明本發(fā)明所教導(dǎo)的復(fù)合糖庫的順序酶促合成的實(shí)驗(yàn)。
材料和方法下文所用的縮寫B(tài)SA-牛血清白蛋白；GlcNAc-N-乙酰基葡糖胺；PNP-GlcNAc-p-硝基苯基-N-乙?；?β-D-GlcNAc；GlcNAc-COOH-2-(2-羧乙基硫基)-乙基2-β-D-GlcNAc；NHS-N-羥基琥珀酰亞胺；EDC-1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺；O.D.-光密度；WGA-小麥胚凝集素；RCA120-由蓖麻獲得的凝集素；BS-I-得自Bandeiraea Simplicifolia的凝集素；TGP-得自Tereagonolobuspurpuras的凝集素；TML-得自mobilensis三毛滴蟲的凝集素；ECorA-得自龍芽菜的凝集素；FITC-熒光素異硫氰酸酯。
通用材料PBS-0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.5，0.15M NaCl(SigmaS-7653)；TBS-50mM Tris/HCl pH7.5(Sigma T-6791)，0.15M NaCl；TBST-TBS，0.05％吐溫20(Sigma P-9416)；高離子強(qiáng)度洗滌緩沖液-PBS，2M NaCl，60mM MgSO4，0.05％吐溫20。過氧化物酶底物溶液通過在水中混合鄰亞苯基二胺二鹽酸鹽，0.4mg/ml，過氧化氫脲，0.4mg/ml，磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，0.05M(由SIGMA FAST過氧化物酶底物試劑盒P-9187制備)制成。Covalink NH購自NUNC(Cat.No.478042)。光密度和熒光用多標(biāo)記計(jì)數(shù)器VICTOR2(Wallac OY，F(xiàn)inland)測(cè)量。所有微量滴定平板的培育是在受控振蕩速度和溫度下利用購自Anthos Thermostar Shaker/Incubator，Rosys Anthos GmbH SalzburgAustria(Cat.No.8850001)的微量滴定平板培養(yǎng)箱進(jìn)行。
通用酶促反應(yīng)混合物和條件(ER)D7100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、10mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml UDP-Gal(Calbiochem670111)和20毫單位/ml的重組β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem345650)在pH7.4下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩4小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
A2100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、l0mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、0.5mg/ml CMP-NeuAC(Calbiochem 233263)和5毫單位/ml的重組α2，3(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem 566218)在pH7.4下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩4小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
B2100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、10mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml GDP-Fuc(Calbiochem371443)和5毫單位/ml的重組α1，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem344323)在pH7.2下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩4小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
D3100μl的100mM二甲基胂酸鈉緩沖液(SIGMA C-4945)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/mlUDP-Gal(Calbiochem 670111)和5毫單位/ml的重組α1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem 345648)在pH6.5下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩4小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
A3100μl的50mM二甲基胂酸鈉緩沖液(SIGMA C-4945)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、0.5mM CMP-NeuAC(Calbiochem 233263)和5毫單位/ml的重組α2，6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem 566222)在pH6.0下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩4小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
H3100μl的50mM二甲胂酸鈉緩沖液(SIGMA C-4945)、20mMMnCl2(SIGMA M-9522)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、5％二甲基亞砜、0.5mM UDP-GlcNAc(Calbiochem 670107)、0.75mmol三磷酸腺苷和5毫單位/ml的重組β1，3 N乙酰基葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(按照Zhou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96 pp.406-411所述方法制備)在pH7.0下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振蕩10小時(shí)。培育后，移出反應(yīng)混合物，孔用200μl的TBST沖洗三次，最后一次沖洗包括浸泡15分鐘。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，將平板儲(chǔ)藏在4℃下以備后繼的酶促反應(yīng)。
當(dāng)酶促反應(yīng)在含有共價(jià)偶聯(lián)單糖的Covalink NH平板中進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)混合物的BSA被省略，洗滌步驟用高離子強(qiáng)度緩沖液代替TBST進(jìn)行。
凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)WGA取100μl 5μg/ml的與過氧化物酶偶聯(lián)的WGA凝集素(SIGMAL-3892，150個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分別10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。為了檢測(cè)過氧化物酶標(biāo)記的WGA，加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
RCA120取100μl 10μg/ml的與過氧化物酶偶聯(lián)的RCA120凝集素(SIGMA L-2758，11個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白質(zhì))加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分別10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的0.D.。
TGP取100μl 20μg/ml的與過氧化物酶偶聯(lián)的TGP凝集素(SIGMAL-1508，10個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白質(zhì))加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分別10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
BS-I取100μl 20μg/ml的與生物素偶聯(lián)的BS-I(SIGMA L-3759)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分別10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘，隨后將100μl的含有1％BSA和5μg/ml與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)。孔用200μlTBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
TML取100μl 20μg/ml的與生物素偶聯(lián)的TML(Calbiochem431803)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘，隨后將100μl的含有1％BSA和5μg/ml與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)?？子?00μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
抗唾液酸Lewis X取100μl 10μg/ml的得自小鼠的抗唾液酸Lewis X IgM(Calbiochem 565953)加入微量滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)?？子?00μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘，隨后，將含有1％BSA和100μl 5μg/ml與生物素偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgM(SIGMA b-9265)加入微量滴定平板中并在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)?？子?00μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘，隨后用100ml的含有1％BSA和5μg/ml與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白)的TBS在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)。孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
EcorA取100μl 20μg/ml的與生物素偶聯(lián)的ECorA(SIGMA L-0893)加入微量滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分別10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培養(yǎng)1小時(shí)，孔用200μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘，隨后，將100μl的含有1％BSA和5μg/ml與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40個(gè)過氧化物酶單位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)?？子?00μl TBST洗滌三次，最后一次包括浸泡15分鐘。加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后(在450nm下)測(cè)定溶液的O.D.。
當(dāng)上述結(jié)合試驗(yàn)在共價(jià)偶聯(lián)單糖接納體上進(jìn)行時(shí)，例如使用Covalink NH平板，用TBST代替TBS培養(yǎng)液，并且用高離子強(qiáng)度緩沖液代替TBST進(jìn)行洗滌步驟。
實(shí)施例10接納體的固定—第一步減少本發(fā)明實(shí)施將單糖接納體固定在微量滴定平板上的若干方法是完善的。單糖接納體通過連接體結(jié)合在微量滴定平板表面上，并且利用凝集素或直接抗合成復(fù)合糖的抗體測(cè)定結(jié)合效率，如上文所述。
第一個(gè)單糖接納體結(jié)構(gòu)單元的平板固定通過以下方法進(jìn)行(i)令新糖蛋白BSA-GlcNAc(β-D-GlcNAc偶聯(lián)至BSA)吸附在微量滴定平板表面；或(ii)利用適當(dāng)連接體共價(jià)固定。采用氰尿酰氯活化(圖5)或NHS/EDC活化(圖6)CovaLink NH進(jìn)行上述共價(jià)固定。氰尿酰氯活化的應(yīng)用能夠在各個(gè)延伸循環(huán)中使連接體延長(zhǎng)約1.5納米。按照凝集素結(jié)合試驗(yàn)、利用偶聯(lián)至過氧化物酶或FITC的WGA凝集素測(cè)定固定單糖(GlcNAc)的存在。用比色法或熒光信號(hào)檢測(cè)法定量結(jié)合作用，如圖7a-c所示。
材料和方法和BAS偶聯(lián)的GlcNAc在Maxisorb平板上的吸附含有0-3000ng的BSA-GlcNAc(按照MoRsigny等.，Biol.Cell，51，187 1984所述方法制備)的0.1M Na2CO3pH9.6溶液等分為100μl等份試樣，將該試樣加入Maxisorb微量滴定平板(NUNC Cat.No.469914)的孔中，平板在4℃下培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)后，除去溶液，將200μl的含有1％BSA的0.1M Na2CO3pH9.6加入各孔，平板繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，以便封阻蛋白(例如酶或凝集素)對(duì)孔表面的非特異性結(jié)合。封阻后，BSA-GlcNAc溶液被TBS緩沖液/0.2％NaN3/BSA 1％代替，并且將平板儲(chǔ)藏在4℃。
按照上文所述過氧化物酶偶聯(lián)WGA檢驗(yàn)BSA-GlcNAc的吸附。
結(jié)果一個(gè)66kDa BSA分子的表面積(約50nm2)被約25個(gè)GlcNAc基團(tuán)覆蓋。在用BSA-GlcNAc完全覆蓋的Maxisorb表面上，相鄰GlcNAc基團(tuán)之間的平均距離約為1.0nm并且凝集素的糖識(shí)別位點(diǎn)的直徑約為2nm。所以，為了防止相鄰的鍵合凝集素之間或鍵合凝集素和其它單糖之間的空間干擾，固定單糖的密度應(yīng)不超過1014/cm2。鑒于這種情況，固定的單糖構(gòu)成鍵合蛋白分子的一部分，其直徑約為5nm，單糖基團(tuán)位于距平板表面上方約5納米，因此可以在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下為酶促反應(yīng)利用。圖8a表示結(jié)合在Maxisorb微量滴定平板上的BSA-GlcNAc的飽和曲線。
BSA-GlcNAc結(jié)合之后，用TBST沖洗以平板除去非特異性結(jié)合的凝集素，TBST這是一種含有中等離子強(qiáng)度洗滌劑(0.15M NaCl)的緩沖液。該洗滌步驟不會(huì)除去鍵合的BSA，由此能夠按順序進(jìn)行酶促反應(yīng)。如圖8b所示，這種鍵合的BSA在經(jīng)歷12次徹底洗滌循環(huán)后保持穩(wěn)定。經(jīng)過每個(gè)洗滌步驟之后，利用上述WGA凝集素結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定BSA-GlcNAc(200ng/孔開始)的量。
GlcNAc共價(jià)固定到Covalink NH，以及在每個(gè)后繼延伸循環(huán)中用13個(gè)附加原子對(duì)Covalink NH的延伸如圖5所示。氰尿酸介導(dǎo)的WGA固定到β-D-GlcNAc(利用一個(gè)延伸循環(huán))或NHS/EDC活化的CovaLink NH的結(jié)合結(jié)果如圖7a-b所示。Covalink NH表面上氨基的密度為1014/cm2，并且GlcNAc基團(tuán)之間的平均距離為1nm，這個(gè)距離足以結(jié)合凝集素。與反應(yīng)混合物D7(1，4半乳糖轉(zhuǎn)移酶，如圖8c所示)培養(yǎng)后，利用上述ECorA凝集素結(jié)合試驗(yàn)檢驗(yàn)β-D-半乳糖向平板苯基-β-D-GlcNAc(22個(gè)原子的連接體)的轉(zhuǎn)移作用。沒檢測(cè)到β-D-半乳糖向平板固定的β-D-GlcNAc(具有20原子連接體的NHS/EDC活化平板)的轉(zhuǎn)移作用。這可能是歸因于連接體長(zhǎng)度的不同。
上述共價(jià)固定法能夠在后繼洗滌步驟中使用離子強(qiáng)度非常高的緩沖液(例如，6M胍HCl或100mM NaOH)，由此能夠準(zhǔn)確“就地”驗(yàn)證該方法所采用的各個(gè)酶促步驟。
非特異性鍵合分子的脫除對(duì)于正確的庫合成非常關(guān)鍵。由于糖基轉(zhuǎn)移酶是其外表面上存在復(fù)合糖的糖蛋白，所以酶的非特異性吸附作用可能干擾合成，或在合成中造成錯(cuò)誤。凝集素和抗體也是糖蛋白，因此其非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)預(yù)報(bào)。酶促反應(yīng)中常用的標(biāo)準(zhǔn)封阻劑是脫脂奶。由于脫脂奶含有多種糖偶聯(lián)蛋白，所以它不適合復(fù)合糖的酶促合成。取而代之的是，按照本發(fā)明進(jìn)行的合成反應(yīng)利用BSA作為封阻劑，因?yàn)樗刺腔?。如圖7b所示，化學(xué)封阻劑干擾凝集素結(jié)合，用BSA封阻使凝集素能夠特異性結(jié)合，同時(shí)基本上減少非特異性結(jié)合。在實(shí)踐中認(rèn)識(shí)到，因?yàn)榍枘蝓Ｂ然罨陌被谒凶园l(fā)水解，當(dāng)用這種平板偶聯(lián)方法時(shí)無需進(jìn)一步封阻。
實(shí)施例11庫的合成高產(chǎn)率對(duì)于反復(fù)性固相酶促合成非常關(guān)鍵。由于糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基從活化的磷酸化核苷酸糖供體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)慕蛹{體，核苷酸糖的磷酸二酯能量鍵的降解是不可逆的。因此，所述合成反應(yīng)的完成在理論上不存在障礙。適宜地，反應(yīng)的核苷酸糖濃度應(yīng)比酶對(duì)供體的Km值高10至20倍，其范圍為數(shù)mmol至數(shù)百mmol。在一個(gè)含有約100μl溶液的微量滴定平板孔中，酶促反應(yīng)利用0.2納摩爾的孔結(jié)合糖基。因此，等于或高于1mmol的核苷酸糖濃度足以。
材料和方法NHS/EDC活化和β-D-GlcNAc的偶聯(lián)將50μl等份的2-(2-羧乙基硫基)-乙基2-β-D-GlcNAc(NNI SS-01-003)溶液分配在CovaLinkNH條上，并將這些條帶在含有50μl溶液的孔中培養(yǎng)，該溶液含有3mg/ml的1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)(SigmaE-7750)和3mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Sigma H-7377)。將孔密封，平板在50RPM、37℃下振搖24小時(shí)。孔用蒸餾水沖洗3次，孔內(nèi)未反應(yīng)的氨基在300ml含有甲醇/乙酸酐/水(分別為85/10/5V/V/V)的溶液中封阻。用蒸餾水沖洗4次后，將平板風(fēng)干，用PBS中含有1％BSA的封阻溶液培養(yǎng)12小時(shí)。
氰尿酰氯的活化攪拌下，將含有48mg溶于3ml丙酮中的氰尿酰氯(Aldrich，Cat.No.C95501)溶液加到45ml 0.1M的磷酸鹽緩沖液中。將該溶液的試樣(200μl)快速2分鐘內(nèi)加入到Covalink NH平板的各孔中。令平板在室溫下培養(yǎng)5分鐘，隨后丟棄溶液，平板用雙蒸水洗滌3次，在50℃下干燥30分鐘。
氨基連接體的延伸循環(huán)將100μl的1，8-二氨基3，6(MERCK818116)溶液(3ml，存在于50ml的0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中)或1，8-二氨基辛烷(ALDRICH D2，240-1)溶液(100mg/ml 0.1M碳酸鹽緩沖液pH9.6)加到氰尿酰氯活化平板的各孔中。將孔密封，并將平板在25℃下培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)后，孔用水洗滌4次，按照上述方法用氰尿酰氯活化平板。重復(fù)1，8-二氨基-3，6-二氧雜辛烷的延伸循環(huán)直至獲得預(yù)期的連接體長(zhǎng)度。
β-D-GlcNAc(第一單糖建筑糖)的偶聯(lián)將GlcNAc單糖分子連接到如上所述的活化平板上。利用下面的方法完成連接把在0.1M碳酸鈉中含有60mg/ml聯(lián)二亞硫酸鈉的溶液加入平板的B-H排的各個(gè)孔內(nèi)。將200μl等份溶于6ml雙蒸水中且用3ml 0.1M碳酸鈉(pH9.6)滴定至pH7.5的、含有20mg對(duì)硝基苯基-N-乙?；?β-D-GlcNAc(Calbiochem Cat.No.487052)和200mg聯(lián)二亞硫酸鈉(FlukaCat.No.71700)的第二溶液從A至H排連續(xù)稀釋兩倍。將孔密封，在室溫下下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，孔用雙蒸水洗滌4次，再用甲醇(200μl/孔)洗滌3次，第三次洗滌包括在室溫下浸泡15分鐘。丟棄甲醇，風(fēng)干平板，保存在4℃下。
WGA與關(guān)價(jià)偶聯(lián)的β-D-GlcNAc的結(jié)合通過偶聯(lián)過氧化物酶或熒光素-異硫氰酸酯(FITC)的WGA結(jié)合檢驗(yàn)共價(jià)鍵合的β-D-GlcNAc的存在。檢測(cè)按照下面的方法進(jìn)行將100μl在TBST中制得的5μg/ml過氧化物酶(SIGMA L-3892，150過氧化物酶單位/mg蛋白)或偶聯(lián)FITC的WGA(SIGMA L-4895)在各孔內(nèi)于25℃下培養(yǎng)1小時(shí)，所述TBST含有10mM的MnCl2和10mM的CaCl2?？子?00μl高離子強(qiáng)度的洗滌液洗滌3次，并且末次洗滌包括浸泡15分鐘。為了顯象過氧化物酶標(biāo)記的WGA，加入100μl的新制過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后在450nm下測(cè)定O.D.。激發(fā)(485nm)與鍵合在β-D-GlcNAc-白色Covalink NH條(NUNC 453690)上的偶聯(lián)FITC的WGA并且測(cè)定由其發(fā)射的熒光(520nm)。
β1，4半乳糖向共價(jià)連接的β-D-GlcNAc的轉(zhuǎn)移將100μl的50mMMOPS pH7.4(SIGMA M-9027)、0.2％Triton CF 32(Sigma)、20mMMnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml UDP-Gal(Calbiochem 670111)和20毫單位/ml的重組β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(Calbiochem 345650)加入到與β-D-GlcNAc偶聯(lián)的平板的各孔中。平板在50RPM、37℃下振搖12小時(shí)。培養(yǎng)后，除去反應(yīng)混合物，孔用200μl的高離子強(qiáng)度緩沖液洗滌三次，末次洗滌包括15分鐘的浸泡。β1，4-半乳糖的轉(zhuǎn)移按照下列方法利用生物素偶聯(lián)凝集素(Erythourina corallodenronECorA)檢測(cè)將一等份在TBST中制成的含有20μg/ml與生物素偶聯(lián)的ECorA(SIGMA L-0893，5摩爾的生物素/mol蛋白)試樣加入各孔中，TBST含有10mM MnCl2和10mM CaCl2，平板在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)?？子?00μl的高離子強(qiáng)度緩沖液洗滌三次，末次洗滌包括浸泡15分鐘。用100ml和過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(5μg/ml，在TBST中)培養(yǎng)后，孔用200μl的高離子強(qiáng)度緩沖液洗滌三次，末次洗滌包括浸泡15分鐘。為了檢測(cè)結(jié)合作用，加入新制的過氧化物酶底物溶液，1小時(shí)后在450nm下測(cè)定O.D.。
β1，4半乳糖轉(zhuǎn)移酶(D7)在固相中的動(dòng)力學(xué)測(cè)定除了3.9毫單位/ml β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶以外采用對(duì)D7所述的酶促反應(yīng)混合物。固相由用3μg/孔的BSA-GlcNAc涂布的Maxisorb平板組成。以10分鐘的間隔將酶混合物加入各孔中。隨后用TBST洗滌孔3次，按照上述方法測(cè)定RCA120的結(jié)合。
結(jié)果實(shí)施本發(fā)明獲得的結(jié)果表明，固相反應(yīng)比液相反應(yīng)慢。如
圖12所示，半乳糖在0.5mU的β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶作用下酶促轉(zhuǎn)移到0.5納摩爾的鍵合GlcNAc需要約1小時(shí)完成，相比之下，相同的反應(yīng)在溶液中反應(yīng)需要1分鐘。所以，為了獲得最高收率，0.5毫單位的各種酶分別使用3-4小時(shí)。
由核苷酸糖分解生成的磷酸核苷酸(UDP、CMP、GDP)是這些酶促反應(yīng)的副產(chǎn)物。已觀察到這些副產(chǎn)物抑制糖轉(zhuǎn)移酶的活性。所以，為降低釋放的磷酸核苷酸加入磷酸酶可以極大提高了固相反應(yīng)的速率。
連接體長(zhǎng)度、復(fù)合糖的柔性、糖基的固定和位阻也是影響合成效率的重要因素。如本研究的部分試驗(yàn)所揭示的，可以有效利用新生糖蛋白涂層的Maxisorb表面固定第一單糖，實(shí)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)并避免位阻問題?；谇枘蛩岷蛯?duì)-硝基苯基的延伸共價(jià)連接體能夠?qū)⒌谝粏翁桥悸?lián)在2-8納米的連接體上，由此在第一單糖與表面共價(jià)鍵合時(shí)避免位阻，實(shí)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)。
實(shí)施例12庫1圖9描述了合成固定在平板上由表17所示結(jié)構(gòu)組成的庫要求的酶促步驟，給出微量滴定平板的組成，各個(gè)步驟進(jìn)行的酶促反應(yīng)和凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)。各個(gè)酶促步驟與不含有附加核苷酸糖的對(duì)照條帶對(duì)比驗(yàn)證。
按照本發(fā)明開發(fā)的方法在各條帶中進(jìn)行不同系列的酶促反應(yīng)(詳情見上文)。下表詳細(xì)描述了為構(gòu)建這種庫所采用的各種反應(yīng)和組分。表16概括了合成第一庫所用的酶促反應(yīng)。表17描述了酶組件(EM的，在實(shí)施例1-9中進(jìn)一步描述)，形成的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)和對(duì)每條帶進(jìn)行的凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)，同時(shí)表18描述用來檢驗(yàn)每一酶促步驟后所形成的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)。
表16合成第一庫所用的酶促反應(yīng)(供體、接納體和編號(hào))
表17EMs表
表18凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)
結(jié)果
圖10a-f描述了在各條帶上各個(gè)酶促反應(yīng)之后進(jìn)行的凝集素/抗體結(jié)合試驗(yàn)。RCA120的結(jié)合作用的增強(qiáng)(
圖10a)表明β-D-半乳糖向GlcNAc的轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定β-1，4糖苷鍵的形成。BS-I結(jié)合的提高驗(yàn)證了第二酶促條帶的效率(
圖10b)，它是α-D-半乳糖向Galβ-1，4GlcNAc轉(zhuǎn)移和其中穩(wěn)定α-1，3-糖苷鍵形成的指標(biāo)。TGP結(jié)合的升高(
圖10c)是α-L-巖藻糖向Galβ-1，4 GlcNAc轉(zhuǎn)移和其中穩(wěn)定的α-1，3-糖苷鍵形成的指標(biāo)。由該反應(yīng)生成的支鏈低聚糖苷是Lewis X抗原。如
圖10d-e所示，YML結(jié)合的提高表明α-D-NeuAC向Galβ-1，4 GlcNAc的轉(zhuǎn)移，其中形成穩(wěn)定α-2，6-2，3糖苷鍵?？雇僖核酟ewis X IgM結(jié)合的提高(
圖10f)表明α-L-巖藻糖向NeuACα-2，3 Gal β-1，4 GlcNAc的轉(zhuǎn)移形成穩(wěn)定的α-1，3糖苷，并且生成由四種不同單糖組成的唾液酸Lewis X抗原。
實(shí)施例13庫2下列庫舉例說明了本發(fā)明合成方法合成不同長(zhǎng)度的聚N-乙?；樘前稩I型鏈的能力。
圖11描述了微量滴定平板的組成、各步驟中進(jìn)行的酶促反應(yīng)和可以用來確定各酶促步驟的效率的凝集素結(jié)合試驗(yàn)。對(duì)比不含有附加核苷酸糖的對(duì)照條帶檢驗(yàn)每個(gè)酶促步驟。各條帶經(jīng)歷不同系列的酶促反應(yīng)(酶組件-EM)，其按照本發(fā)明開發(fā)的方法進(jìn)行。
表19描述了按照本發(fā)明的教導(dǎo)用于合成聚N-乙?；樘前穾斓拿复俜磻?yīng)混合物和條件(詳情如上文所述)。表20描述了酶組件(EM)和復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。在如上所述的每一酶促步驟之后進(jìn)行RCA120結(jié)合試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)半乳糖(RCA120結(jié)合)或GlcNAc(RCA120結(jié)合的消失)向延伸的聚N-乙?；樘前坊啺?N-acetyllaetoseaminide)鏈的增加。
表19用來合成聚N-乙?；樘前坊啺穾斓拿复俜磻?yīng)表(供體、接納體和編號(hào))
表20EM表
實(shí)施例14庫3下面的庫舉例說明本發(fā)明的合成方法合成不同鏈長(zhǎng)和修飾的聚N-乙?；樘前稩I型鏈的能力。該庫包括帶有兩個(gè)支鏈的低聚糖結(jié)構(gòu)。第一單糖經(jīng)BSA鍵合在表面。表21描述了合成所用的酶促反應(yīng)，同時(shí)表22描述了所用的酶組件(EM)和由此形成的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證順序酶促合成的精確度，利用蛋白酶釋放結(jié)合孔的低聚糖并且用HPLC進(jìn)行分析，甲基化分析或MALD-TOF-MS(Rudd，P.M.Dwek，R.A.(1997)Current Opinion in biotechnology 8 488-497)。
表21庫3的合成中所用的酶促反應(yīng)
表22EM表
所以，本發(fā)明提供了有效和精確的用于固相合成支鏈或非支鏈結(jié)構(gòu)復(fù)合糖的方法。
雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但顯然，許多替代、修飾和變化對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和廣義范圍包括全部這些替代、修飾和變化。
1. Arya，P. and Ben，R.N.(1997)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.361280-1282.2. Ashardy，E.，Atherton，E.，Gait，M.J.Lee，K.and Sheppard，R.C.(1979)J.Chem.Soc.Chem.Commun.423-425.3. Atherton，E.and Sheppard，R.C.(1989)in Solid phase peptidesynthesisA practical approach，IRLOxford.4. Bayer，E.(1991)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30 113-129.5. Bergh，M.L.and van den Eijnden，D.H.(1983)Eur.J.Biochem.136 113-8.6. Bierhuizen，M.F.，Mattei，M.G.and Fukuda，M.(1993)Genes Dev. 7468-478.7. Bierthuizen，M.F.and Fukuda，M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89 9326-9330.8. Blondelle，S.E.and Houghten R.A.(1996)TIBTECH 14 60-65.9. Boons，G.J.，Heskamp，B.and Hout，F(xiàn).(1995)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35 2845-2847.10.Borman，S.(1996)C&EN 12 29-54.11.Bosio，A.，Binczek，E.，Le Beau，M.M.，F(xiàn)ernald，A.A.and Stoffel，W.(1996)Genomics 34 69-75.12.Brockhausen，I.，Matta，K.L.，Orr，J.and Schachter，H.(1985)Biochemistry 24 1866-1874.13.Brockhausen，I.，Rachaman，E.S.，Matta，K.L.and Schachter，H.(1983)Carbohydr.Res.120 3-16.14.Brockhausen，I.，Hul，l E.，Hindsgaul，O.，Schachter，H.，Shah，R.N.，Michnick，S.W.，and Carver，J.P.(1989)J.Biol.Chem.264 11211-11221.15.Burbaum，J.J.and Sigal，N.H.(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1 72-78.16.Cadwell，R.C.and Joyce，G.F.(1994)in Mutagenic PCR cold springharbor laboratory.17.Cargill，J.F.and Lebl，M.(1997)Curr.Opin.Chem..Biol.1 67-71.18.Chabala，J.C.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6 632-639.19.Chang，M.L.，Eddy，R.L.，Shows，T.B.and Lau，J.T.(1995)Glycobiology 5 319-325.20.Chatterjee，D.and Khoo，K.-H.(1998)Glycobiology 8 113-120.21.Cheng，J.，Sheldon，E.L.，Wu，L.，Uribe，A.，Gerrue，L.O.，Carrino，J.，Heller M.J.and O’Connell，J.P.(1998)Nat.Biotechnol.16 541-546.22.Cole，S.T.，Brosch，R.，Parkhill，J.，Garnier，T.，Churcher，C.，Harris，D.，Gordon，S.V.，Eiglmeier，K.，Gas，S.，Barry，C.E.3rd，Tekaia，F(xiàn).，Badcock，K.，Basham，D.，Brown，D.，Chillingworth，T.，Connor，R.，Davies，R.，Devlin，K.，F(xiàn)eltwell，T.，Gentles，S.，Hamlin，N.，Holroyd，S.，Hornsby，T.，Jagels，K.and Barrell，B.G.(1998)Nature 393 537-44.23.Datta，A.K.，Sinha，A.and Paulson，J.C.(1998)JBC 273 9608-9614.24.David，S.，Auge，Cand Gautheron，C.(1991)Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.49 175-237.25.Douglas，R.H.，Ballou，C.E.(1982)Biochemistry 21 1561-1570.26.Drews，J.(1996)Drug Infor.J.30 97-108.27.Drews，J.(1996)Nat. Biotechnol.14 1516-1518.28.Dryland，A.and Sheppard，R.C.(1986)J.Chem.Soc.，Perkin Trans. 1125-137.29.Endo，T.，Nishimura，R.，Kawano，T.，M，M.and Kobata，A.(1987)Cancer Res. 47 5242-5245.30.Faber，L.P.(1991)in Clinical Oncocology， Holleb，A.I.，(eds)，Americancancer society，pp.195-210.31.Fodor，S.P.A.，Read，J.L.，Pirrung，M.C.，Stryer，Lu，A.T.L. and Solas，D.(1991)Science 251 767-773.32.Frank，R.and Doring，R.(1988)Tetrahedron Lett.19 6031-6040.33.Frechest，J.M.and Schuerch，C.(1971)JACS 93 492-494.34.Frechest，J.M.and Schuerch，C.(1972)C.J.Am.Chem.Soc.9 604-605.35.Frechest，J.M.and Schuerch，C.(1972)Carbohydr.Res.22 399-402.36.Furukawa，K.and Roth，S.(1985)Biochem.J.227 573-582.37.Gaasterland，T.(1998)Nat.Biotechnol.16 625-627.38.Gillespie，W.，Kelm，S.and Paulson，J.，C.(1992)J.Biol.Chem.26721004-21010.39.Granellin，C.R.(1992)in Medicinal Chemistry for the 21stCentuary，eds. Wwrmuth，C.G.，Koga，N.，Koning，H.and Metcalf，B.W.(Blackwell，London)，pp.3-12.40.Gleeson，P.A.(1988)Current topics in microbiology and immunology139 1-34.41.Grout，D.HG.And Vic，G.(1998)Curr.Opin.Chem.Biol.2 98-111.42.Grundmann，U.，Nerlich，C.，Rein，T.and Zettlrneissl G.(1990)NucleicAcids Res.18 667.43.Guthrie，R.D.，Jenkins，A.D.and Stehilcek，J.(1971)J.Chem Soc.C2690-2691.44.Hagen，F(xiàn).K.，Van Wuyckhuyse，B.and Tabak，L.A.(1993)JBC 26818960-18965.45.Hakomori，S.(1989)Adv.Cancer Res.52 257-331.46.Halcomb，R.L.，Huang，H.and Wong，C.-H.(1994)JACS 116 11315-11322.47.Hamamoto T.，Kawasaki M.，Kurosawa N.，Nakaoka T.，Lee Y.C.，TsujiS.(1993)Bioorg.Med.Chem.1 141-145.48.Harris，J.L.and Craik，C.S.(1998)Current Opinion in ChemicalBiology 2 127-132.49.Hassid，W.Z.and Doudoroff，M.(1950)Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.5 29-48.50.Hendrickson，W.(1991)Science 25 51-58.51.Herrmann，G.H.，Ichikawa，Y.，Wandrey，C.，Gaeta，F(xiàn).C.A.，Paulson，J.C.and Wong，C.-H. (1993)Tetrahedron lett.34 3091-3094.52.Hidari，J.K.，Ichikawa，S.，F(xiàn)urukawa，K.，Yamasaki，M.and Hirabayashi，Y.(1994)Biochem.J.303 957-965.53.Hitoshi，S.，Kusunoki，S.，Kanazawa，I.and Tsuji，S.(1995)JBC 2708844-8850.54.Hogan Jr.，J.C.(1997)Nat. Biotechnol.15 328-330.55.Hoheisel，J.D.(1997)TIBTECH 15 465-469.56.Hosomi，O.，Takeya，A.and Kogure，T.(1984)J. Biochem.95 1655-16.57.Hsiau，L.T.，Lee，W.C.and Wang，F(xiàn).S.(1997)Appl.Biochem.Biotechnol.62 303-315.58.Nunez，H.A.and Barker，R.(1980)Biochemistry 19 485-489.59.Ichikawa，Y.，Look，G.C.and Wong，C.-H.(1992)Anal. Biochem.202215-238.60.Ichikawa，Y.(1997)in Glycopeptides and Related Compounds，eds.Large，D.G.and Warren，C.D.PP.79-205.61.Ichikawa，Y.，Look，G.C.and Wong，C.-H.(1992)Anal.Biochem.202215-238.62.Ichikawa，S.，Sakiyama，H.，Suzuki，G.，Hidari，K.，I.and Hirabayashi，Y.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 4638-4643.63.Jacobs，J.W.and Fodor S.P.A.(1994)TIBTECH 12 19-26.64.Janda，K.D.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 10779-10785.65.Joziasse，D.H.，Shaper，J.H.，Van den Eijnden，D.H.，Van Tunen，A.J.and Shaper N.L.(1989)JBC 264 14290-14297.66.Kahne，D.(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1 130-135.67.Kanie，O.，Barresi，F(xiàn).，Ding，Y.，Labbe，J.，Otter A.，F(xiàn)oesberg L.S.，Ernst，B.and Hindsgaul，O.(1995)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34 2720-2722.68.Kaushal，G.P.and Elbein，A.D.(1986)Arch.Biochem.Biophys.25038-47.69.Kaushal，G.P.and Elbein，A.D.(1987)Biochemistry 26 7953-7960.70.Kawashima，H.，Yamamoto，K.，Osawa，T.and Irimura T.(1993)JBC268 27118-27126.71.Kenan，D.J.，Tsai，D.E.and Keene，J.D.(1994)TIBS 19 57-64.72.Kitagawa，H.and Paulson，J.C.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.194 375-382.73.Kitagawa H.，Tone Y.，Tamura J.，Neumann K.W.，Ogawa T.，Oka S.，Kawasaki T.，Sugahara K.(1998)J.Biol.Chem.273 6615-661874.Kobata，A.(1998)Glycoconjug.J.15 323-331.75.Konishi，Y.and Misaki，A.(1976)Abstr.Paper of Jap.Agric.Chem.Soc.76.Kornfeld，R.and Kornfeld，S.(1985)Ann. Rev Biochem.54 631-664.77.Kuchner，O.and Arnold，F(xiàn).，H.(1997)TIBTECH 15 523-530.78.Kudo，T.，Ikehara，Y.，Togayachi，A.，Kaneko，M.，Hiraga，T.，Sasaki，K.and Narimatsu H.(1998)JBC 273 26729-26738.79.Kurosawa，N.，Hamamoto，T.，Inoue，M.and Tsuji S.(1995)Biochim.Biophys.Acta 1244 216-222.80.Laine，R.A.(1994)Glycobiology 4 759-767.81.Larsen，R.D.，Ernst，L. K.，Nair，R.P.and Lowe J.B.(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6674-6678.82.Larsen，R.D.，Rajan，V.P.，Ruff，M.M.，Kukowska-Latallo，J.，Cummings，R.D.，Lowe，J.B.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86 8227-8231.83.Leloir，L.F.(1971)Science 172 1299-1303.84.Leong，P.and Schachter，H.(1995)Eur.J.Biochem.231 317-328.85.Liang，R.，Loebach，J.，Horan，N.，Ge，M.，Thompson，C.，Yan，L.andKahne，D.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 10554-10559.86.Liang，R.，Yan，L.，Loebach，J.，Ge，M.，Uozumi，Y.，Sekanina，K.，Horan，N.，Gildersleeve，J.，Thompson，C.Smith，A.，Biswas，K.，StillW.C.and Kahne，D.(1996)Science 274 1520-1522.87. Lockney，M.W.and Sweely，C.S.(1982)Biochim.Biophys.Acta 712234-241.88. Mackenzie，P.I.，Owens，I.S.，Burchell，B.，Bock，K.W.，Bairoch，A.，Belanger，A.，F(xiàn)ourneI-Gigleux，S.，Green，M.，Hum，D.W.，Iyanagi，T.，Lancet，D.，Louisot，P.，Magdalou，J.，Chowdhury，J.R.，Ritter，J.K，Schachter，H.，Tephly，T.R.，Tipton，K.F.and Nebert，D.W.(1997)Pharmacogenetics 7 255-69.89. Martensson，S.，Due，C.，Pahlsson，P.，Nilsson，B.，Eriksson，H.，Zopf，D.，Olsson，L.and Lundblad，A.(1988)Cancer Res.48 2125-2131.90. Masibay，A.S.and Qasba，P.K.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 5733-5737.91. Matulewich，M.C.and Cerezo，A.S.(1978)Carbohydrate Pol.7 121-132.92. Matuzaki，K.，Sato，T.，Enomoto，K.，Yamamoto，I.，Oshima，R.，Hatanaka，K.，Uryu，T.，Kahu，H.，Sone，Y.and Misaki，A.(1986)Carbohydr.Res.157 171-183.93. McDevitt，J.P.and Lansbury Jr，P.T.(1996)JACS 118 3818-3828.94. Meldal，M.，Auzanneau，F(xiàn).I.，Hindsgaul，O.and Palcic，M.，M.(1994)J.Chem.Soc.Commun.1849-1850.95. Mendicino，J.，Sivakami，S.，Davila，M.and Chandrasekaran，E.V.
(1982)JBC 257 3987-3994.96. Mengling，B.J.and Turco S.J.(1998)Current opinion in structuralbiology 8 572-577.97. Merrifield，R.B.J.(1963)JACS 85 2149-2154.98. Meurer，J.A.，Naylor，J.M.，Baker，C.A.，Thomsen，D.R.，Homa，F(xiàn).L.andElhammer，A.P.(1995)J.Biochem.118 568-574.99. Michels，P.C.，Khmelnitsky，Y.L.，Dordick，J.S.ans Clark，D.S.(1998)TIBTECH 16 210-215.100.Minamida，S.，Aoki，K.，Natsuka，S.，Omichi，K.，F(xiàn)ukase，K.，Kusumoto，S.and Hase S.(1996)J.Biochem.120 1002-1006.101.Minowa，M.T.，Oguri，S.，Yoshida，A.，Hara，T.，Iwamatsu，A.，Ikenagaand H.，Takeuchi，M.(1998)JBC 273 11556-11562.102.Misaki，A.，Kakuta，M.，Sasaki，T.and Miyaji，H.(1980)Carbohydr.
Res.92 115-129.103.Misaki，A.，Johnson，J.，Kirkwood，S.，Scaletti，J.V.ans Smith F.(1968)Carbohydr.Res.6 150-164.104.Mizuochi，T.，Nishimura，R.，Derappe，C.，Taniguchi，T.，Hamamoto，T.，Mochizuki，M.and Kobata，A.(1983)JBC 258 14126-14129.105.Moore，J.C.and Arnold，F(xiàn).H.(1996)Nat.Biotechnol.14 458-467.106.Nagata Y，Yarnashiro S，Yodoi J，Lloyd KO，Shiku H，F(xiàn)urukawa K(1992)JBC 267 12082-12089.107.Nara K.，Watanabe Y.，Maruyama K.，Kasahara K.，Nagaiy Y.，Sanai Y.
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.91 7952-7956108.Nicholls，A.，Sharp，K.and Honig，B.(1991)Proteins Struct.Funct.
Genet.11 281-296.109.Nicolaou，K.C.，F(xiàn)lorke，H.，Egan，M.G.，Barth，T.and Estevez，V.A.
(1995)Tetrahedron Lett.36 1775-1778.110.Nigou，J.，Gilleron，M.，Cahuzac，B.，Bounery，J.-D.，Herold，M.，Thurnher，M.and Puzo，G.(1997)JBC 272 23094-23103.111.Nilsson，K.G.L.(1988)TIBTECH 6 256-264.112.Nilsson，K.G.L.(1996)in Modern Methods in Carbohydrate Synthesis，eds.Khan，S.H.and O’Neill R.A.p.518-546.113.Nishikar A.，Ihara Y.，Hatakeyama M.，Kangawa K.，Taniguchi N.(1992)JBC 267 18199-18204.114.Nishino，T.，Yokoyama，G.，Dobashi，K.，F(xiàn)ujihara，M.and Nagumo，T.
(1989)Carbohydr.Res.186 119-129.115.Omichi，K.，Aoki，K.，Minamida，S. and Hase，S. (1997)Eur.J.
Biochem.245 143-146.116.Orlean，P.，Albright，C.and Robbins，P.，W.(1988)JBC 263 17499-17507117.Orntoft，T.F.and Bech，E.(1995)Glycoconjug.J.12 200-205.118.Otbs，P.J.，Hayer，R.M.and Floss，H.G.(1990)Carbohydr.Res.19891-99.119.Palcic，M.M.(1994)Methods in enzymology 230 300-316.120.Palcic，M.M.，Heerze，L.D.，Pierce，M.and Hinsgaul，O.(1988)Glycocon.J.5 49-63.121.Palcic，M.，Venot，A.P.，Ratcliffe，R.M.and Hinsganl，O.(1989)Carbohydr.Res.190 1-11.122.Pease，A.，Solas，D.，Sullivan，EJ.，Cornin，M.T.，Holmes，C.P.andFodor，S.P.A.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 5022-5026.123.Prieto，P.A.，Mukerji，P.，Kelder，B.，Erney，R.，Gonzales，D.，Yun，J.S.，Smith，D.F.，Moremen，K.W.，Nardelli，C.，Pierce，M.，Li，Y.，Chen，X.，Wagner，T.E，Cummings，R.D.and Kopchick，J.J.(1995)JBC 270295115-29519.124.Rademann，J.and Schmidt，R.R.(1996)Tetrahedron Lett.37 3989-3990.125.Ramsay，G.(1998)Nat. Biotechnol.16 40-44.126.Rees，D.A.(1965)Ann.Rep.Chem.Soc.(London)469-477.127.Robinson，J.A.，Robinson，H.C.(1985)Biochem.J.227 805-814128.Rodebaugh，R.，Joshi，S.，F(xiàn)raser-Reid，B.and Geysen，H.M.(1997)J.
Org.Chem.62 5660-5661.129.Romero，P.A.，Lussier，M.，Sdicu，A.M.，Bussey，H.and Herscovics，A.
(1997)Biochem.J.321 289-295.130.Ronin，C.(1998)Clin.Chem.Lab.Med.36 373-378.131.Saito，H.，Gu，J.，Nishikawa，A.，Ihara，Y.，F(xiàn)ujii，J.，Kohgo，Y.andTaniguchi，N.(1995)Eur.J.Biochem.233 18-26.132.Sanson，C.(1997)Nat.Biotechnol.15 1253-1256.133.Sasaki，T.，Abikd，N.，Nitta，K.，Takatsuka，N.and Sugino，Y (1978)CancerRes.38 379-383.134.Schachter，H.，Brockhausen，I.and Hull，E.(1989)Methods Enzymol.
179 351-397.135.Schachter，H.(1994)in Molecular Glycobiology，F(xiàn)ukuda，M.andHindsagul，O.(eds)Oxford University Press，NY pp.88-149.136.Schaeper，R.J.，Das，K.K.，Zhixiong，L.and Basu，S.(1992)Carbohydr.
Res.236 227-244.137.Schawrtz，N.(1976)JBC 251 285-291.138.Schenkman，S.，Jiang，M.-S.，Hart，G.W.and Nussenzweing，A.(1991)Cell 65 1117-1125.139.Schullek，J.R.，Butler，J.H.，Ni，Z.-J.，Chen，D.and Yuan，Z.(1997)Ana.
Biochem.246 20-29.140.Schulte，S.and Stoffel W.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010265-10269.141.Schuster，M.，Wang P.，Paulson C.and Wong C.，H.(1994)JACS 1161135.142.Schwartz，N.B.and Rodn，L.(1975)JBC 250 5200-5207.143.Seitz，O.and Wong，C.-H.(1997)JACS 119 8766-8776.144.Shah，K.，Liu，Y.，Deirmengian，C.and Shkat，K.M.(1997)Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.94 3565-3570.145.Shoreibah，M.，Pemg，G.S.，Adler，B.，Weinstein，J.，Basu，R.，Cupples，R.，Wen，D.，Browne，J.K.，Buckhaults，P.and Fregien，N.(1993)JBC268 15381-15385.146.Simon，P.M.(1996)Drug Discovery Today 1 552-528.147.Sittampalam，G.S.，Kahl，S.D.and Janzen，W.P.(1997)Curr. Opin.
Chem.Biol.1 384-391.148.Smith，T.K.，Cottaz，S.，Brimacombe，J.S.and Ferguson(1996)JBC271 6476.149.Sosnowski，R.G.，Tu，G.，Butler，W.F.，and Heller，M.J.(1997)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 94 1119-1123.150.Spaller，M.R.，Burger，M.T.，F(xiàn)ardis，M.and Bartlett，P.A.(1997)Curr.
Opin.Chem.Biol.1 47-53.151.Stinson，S.C.(1998)C&EN 16 42-46.152.Strahan，K.M.，Gu，F(xiàn).，Preece，A.F.，Gustavsson，I.，Andersson，L.andGustafsson K.(1995)Immunogenetics 41 101-105.153.Stults，C.L.M.and Macher，B.A.，(1990)Arch. Biochem.Biophys.28020-26.154.Tan，J.，D1Agostaro，A.F.，Bendiak，B. Reck，F(xiàn).，Sarkar，M.，Squire，J.A.，Leong，P.and Schachter，H.(1995)Eur.J.Biochem.231 317-328.155.Toki D.，Sarkar M，Yip B.，Reck F.，Joziasse D.，F(xiàn)ukuda M.，SchachterH.，Brockhausen I.(1997)Biochem.J.325 63-69156.Toone，E.J.，Simon，M.D.，Bednarski，G.M.and Whitesides，G.M.
(1989)Tetrahedron 45 5365-5422.157.Unverzagt，C.(1996)Anew Chem Int Ed.35 2350-2352.158.Uozumi，N.，Yanagidani，S.，Miyoshi，E.，Ihara，Y.，Sakuma，T.，Gao，C.X.，Teshima，T.，F(xiàn)ujii，S.，Shiba，T.and Taniguchi，N.(1996)JBC 27127810-27817.159.Van den Eijnden，D.H.，Koenderman，A.H.L.and Schiphorst，W.E.C.M.
(1988)JBC 263 12461-12471.160.Voynow，J.A.，Kaiser，R.S.，Scanlin，T.F.and Glick，M.，C.(1991)JBC266 21572-21577.161.Watt，G.M.，Lowdsen，P.AS.and Filtsch，S.L.(1997)Curr. Opin.
Struc.Biol.1 652-660.162.Wen，D.X.，Livingston，B.D.，Medzihradszky，K.F.，Kelm，S.，Burlingame，A.L.and Paulson，J.C.(1992)JBC 267 21011-21019.163.Witczak，Z.J.and Nieforth，K.A.(1997)inCarbohydrates in drugdesign(eds.)Marcel Dekker，N.Y.164.Wong，C.-H.(1996)in Modern Methods in Carbohydrate Synthesis，eds.
Khan，S.H.and O’Neill R.A.pp.467-491.165.Wong，C.H.，Ye，X.S.and Zhang，Z.(1998)JACS 120 7137-7138166.Yamamoto，F(xiàn).，Marken，J.，Tsuji，T.，White，T.，Clausen，H.andHakomori，S.(1990)JBC 265 1146-1151.167.Yan，L.Y.，Smith，D.F.and Cummings，R.D.，(1994)Anal.Biochem.
223 111-118.168.Yanagidani，S.，Uozumi，N.，Ihara，Y.，Miyoshi，E.，Yamaguchi，N.andTaniguchi N.(1997)J. Biochem.121 626-632.169.Yip，C.L.，Welch，S.K.，Klebl，F(xiàn).，Gilbert，T.，Seide，I.P.，Grant，F(xiàn).J.，Ohara，P.J.and MacKay，V.L.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912723-2727.170.Zehavi，U.and Herchman，M.(1984)Carbohydr.Res.128 160.171.Zehavi，U.，Sadeh，S.and Herchman，M.(1983)Carbohydr.Res.12423.172.Zeng，Y.，Bannon，G.，Thomas，V.H.，Rice，K.，Drake，R.and Elbein，A.
(1997)JBC 272 31340-31347.173.Zhang，J.H，，Dawes，G.and Stemmer，W.P.C.(1997))Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.94 4504-4509.
權(quán)利要求
1.組合復(fù)合糖庫，其中包含許多可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中每一個(gè)所述可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)都連接到固體載體上。
3.權(quán)利要求2的組合復(fù)合糖庫，其中每一個(gè)所述可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與固體載體的結(jié)合通過連接體完成的。
4.權(quán)利要求3的組合復(fù)合糖庫，其中所述連接體包括至少兩個(gè)鄰近的共價(jià)鍵。
5.權(quán)利要求3的組合復(fù)合糖庫，其中所述連接體選自氨基酸，肽，非糖基化的蛋白，類脂，神經(jīng)酰胺，磷酸多帖醇，環(huán)糊精，寡糖，單糖，烷基鏈和核酸。
6.權(quán)利要求3的組合復(fù)合糖庫，其中所述連接體的長(zhǎng)度至少20埃。
7.權(quán)利要求2的組合復(fù)合糖庫，其中所述固體載體選自可編址的微粒，可編址的珠，可編址的多嵌段(muiti-block)和平臺(tái)。
8.權(quán)利要求7的組合復(fù)合糖庫，其中所述平臺(tái)選自微量滴定板，膜和小片。
9.權(quán)利要求8的組合復(fù)合糖庫，其中所述微量滴定板是可編址的封閉反應(yīng)室的微裝配陣列，封閉反應(yīng)室附加有微流系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求9的組合復(fù)合糖庫，其中所述封閉反應(yīng)室的排列密度為每平方厘米4-25個(gè)。
11.權(quán)利要求9的組合復(fù)合糖庫，其中所述每個(gè)封閉反應(yīng)室的體積為50-1000納升。
12.權(quán)利要求2的組合復(fù)合糖庫，其中所述固體載體是小片，而且所述大量的可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的不同復(fù)合糖結(jié)構(gòu)相互之間的排列間隔從中心到中心的距離不大于2.25mm。
13.權(quán)利要求2的組合復(fù)合糖庫，其中所述固體載體選自用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯，聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，硅石，玻璃，石英，塑料和纖維素。
14.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少兩個(gè)鄰近的單一種類的糖單元。
15.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)支鏈。
16.權(quán)利要求15的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的至少一個(gè)支鏈由相同的核心和支鏈糖單元構(gòu)成。
17.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少4個(gè)糖單元。
18.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少5個(gè)糖單元。
19.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少6個(gè)糖單元。
20.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中至少一種所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少7個(gè)糖單元。
21.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是包括非天然復(fù)合糖的代表。
22.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中所述的大量可編址的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是包括天然復(fù)合糖代表。
23.權(quán)利要求22的組合復(fù)合糖庫，其中所述天然復(fù)合糖來自于人類來源。
24.權(quán)利要求23的組合復(fù)合糖庫，其中所述人類來源選自組織，細(xì)胞和體液。
25.權(quán)利要求1的組合復(fù)合糖庫，其中所述的大量可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是至少一種天然復(fù)合糖域的代表。
26.權(quán)利要求25的組合復(fù)合糖庫，其中所述至少一種天然復(fù)合糖來自于人類來源。
27.制備可編址的組合復(fù)合糖庫的方法，該方法包括下列步驟(a)提供一個(gè)具有大量位置的固體載體；和(b)酶催化合成大量的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，每個(gè)所述大量的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與至少一個(gè)所述大量位置的編址位置相結(jié)合，從而產(chǎn)生可編址的組合復(fù)合糖庫。
28.權(quán)利要求27的方法，其中每一個(gè)所述大量的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與所述固體載體的結(jié)合通過連接體實(shí)現(xiàn)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述連接體包括至少兩個(gè)鄰近的共價(jià)鍵。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述連接體選自氨基酸，肽，非糖基化的蛋白，類脂，神經(jīng)酰胺，磷酸多帖醇，環(huán)糊精，寡糖，單糖，烷基鏈和核酸。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述連接體的長(zhǎng)度至少為20埃。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述固體載體選自可編址的微粒，可編址的珠和平臺(tái)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述平臺(tái)選自微量滴定板，膜和小片。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述固體載體是小片，而且所述大量位置的鄰近位置彼此之間的距離不大于2.25mm。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述微量滴定板是可編址的封閉反應(yīng)室的微裝配陣列，封閉反應(yīng)室附加有微流系統(tǒng)。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述封閉反應(yīng)室的排列密度為每平方厘米4-25個(gè)。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述每個(gè)封閉反應(yīng)室的體積為50-1000納升。
38.權(quán)利要求27的方法，其中所述固體載體選自用二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯，聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，硅石，玻璃，石英，塑料和纖維素。
39.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少兩個(gè)鄰近的單一種類的糖單元。
40.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)支鏈。
41.權(quán)利要求40的方法，其中至少一種所述至少一個(gè)支鏈由相同的核心和支鏈糖單元構(gòu)成。
42.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少4個(gè)糖單元。
43.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少5個(gè)糖單元。
44.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少6個(gè)糖單元。
45.權(quán)利要求27的方法，其中至少一種所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)包括至少7個(gè)糖單元。
46.權(quán)利要求27的方法，其中所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是包括非天然復(fù)合糖的代表。
47.權(quán)利要求27的方法，其中所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是包括天然復(fù)合糖的代表。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述天然復(fù)合糖類與選自下列的疾病有關(guān)腫瘤發(fā)生，轉(zhuǎn)移，妊娠，血管疾病，心臟病，神經(jīng)變性疾病，自身免疫疾病，不育癥，變應(yīng)性，胚胎發(fā)生，細(xì)胞編程性死亡，神經(jīng)變性疾病和器官移植。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述天然復(fù)合糖來自于人類來源。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述人類來源選自組織，細(xì)胞和體液。
51.權(quán)利要求27的方法，其中所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)是至少一種天然復(fù)合糖域的代表。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述至少一種天然復(fù)合糖來自于人類來源。
53.鑒定能夠結(jié)合實(shí)體的復(fù)合糖的方法，該方法包括下列步驟(a)通過以下步驟制備可編址的組合復(fù)合糖庫(i)提供具有大量位置的固體載體；和(ii)酶催化合成大量的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，每個(gè)所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與至少一個(gè)所述大量位置的編址的位置相結(jié)合，從而產(chǎn)生可編址組合復(fù)合糖庫；和(b)使用用于鑒定能夠結(jié)合實(shí)體的復(fù)合糖的實(shí)體篩選所述可編址的組合復(fù)合糖庫。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述實(shí)體選自由EST庫編碼的蛋白，和天然提取的蛋白。
55.權(quán)利要求53的方法，其中實(shí)體是生物活性物質(zhì)的候選物，該方法用于鑒定為所述生物活性物質(zhì)的候選物的靶的復(fù)合糖。
56.權(quán)利要求53的方法，其中實(shí)體是已知能結(jié)合特定的天然復(fù)合糖的配體，而且其中所述可編址的組合復(fù)合糖庫是所述特異天然復(fù)合糖域的代表，該方法用于鑒定結(jié)合所述配體的所述域的特異性域。
57.用自身或非自身復(fù)合糖結(jié)構(gòu)診斷疾病和誘發(fā)所抗的抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)通過以下步驟制備代表自身或非自身復(fù)合糖結(jié)構(gòu)的可編址的組合復(fù)合糖庫(i)提供一個(gè)具有大量位置的固體載體；和(ii)酶催化合成大量的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)，每個(gè)所述的大量復(fù)合糖結(jié)構(gòu)與至少一個(gè)所述大量位置的編址的位置相結(jié)合，從而產(chǎn)生可編址組合復(fù)合糖庫；和(b)所述可編址的組合復(fù)合糖庫與來自于疑有疾病的患者的抗體反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述抗體與所述位置結(jié)合的模式，將該模式與表征健康個(gè)體的已知模式進(jìn)行比較，可得到所述疾病的診斷結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供組合的復(fù)合糖庫并且包括大量可編址復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1357108SQ00806346
公開日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月17日
發(fā)明者A·杜克勒, N·多坦 申請(qǐng)人:格里科麥德斯有限公司