專利名稱：胡蘿卜素羥化酶和制備葉黃素衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶活性的蛋白，涉及編碼這些蛋白的核酸，涉及含有這些核酸的核酸構(gòu)建體，涉及基因操作改造的生物，其中與野生型相比上述基因操作導(dǎo)致或提高了該核苷酸的基因表達(dá)，本發(fā)明還涉及制備葉黃素衍生物的方法。
葉黃素是動(dòng)物，植物或微生物來(lái)源的含氧的類胡蘿卜素。作為色素底物和維生素A的前體，葉黃素如黃體素(lutein)，玉米黃質(zhì)或蝦青素在人類和牲畜的膳食中是重要的添加物。此外，葉黃素(xanthophyll)具有重要的健康促進(jìn)作用，如增強(qiáng)免疫應(yīng)答和，由于它們的抗氧化特性，防癌作用，這使得它們成為感興趣的營(yíng)養(yǎng)藥。因此，制備葉黃素和葉黃素含量增高的食品的經(jīng)濟(jì)方法非常重要。特別是，制備葉黃素的經(jīng)濟(jì)方法為生物技術(shù)方法，它利用了源自產(chǎn)葉黃素生物的葉黃素生物合成的蛋白和生物合成基因。
催化β-胡蘿卜素通過(guò)β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)酶學(xué)轉(zhuǎn)化的原核β-胡蘿卜素羥化酶以及編碼這些蛋白的基因在細(xì)菌夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)Misawa et al.，J.of Bacteriology 1990，6704-6712；EP 393690 B1)，草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)(WO 9113078)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)sp.PC-1(EP 735 137A1)，產(chǎn)黃菌屬(Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes etal.，Gene 1997，185，35-41；EP 747483 A2)中和在藍(lán)藻(Cyanobacterium)，集胞藻屬(Synechocystis)sp.PCC6803(Masamoto et al.，Plant Cell Physiol.1998，39(5)，560-564)中是已知的。
還已知源自橙黃農(nóng)桿菌(Agrobacterium aurantiacum)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)的原核β-胡蘿卜素羥化酶還能將角黃素通過(guò)adonirubin轉(zhuǎn)化成蝦青素(Misawa et al.，J.of Bacteriology 1995，6575-6584；Fraseret al.，J.Biol.Chem.1997，272，6128-6135)。
在真核生物來(lái)源中，已知三種植物β-胡蘿卜素羥化酶能催化β-胡蘿卜素通過(guò)β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的酶學(xué)轉(zhuǎn)化。相應(yīng)的cDNA已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Cunningham et al，J.Biol.Chem.1996，271，24349-24352，WO 9736998)和從辣椒(Capsicum annuumL.)(Bouvier et al.，Biochimica et Biophysica Acta 1998，1391，320-328)中分離得到。
真核來(lái)源的基因比原核基因的優(yōu)越之處在于它們?cè)诟叩绒D(zhuǎn)基因生物，如植物，中的表達(dá)更好。然而，仍然有必要通過(guò)對(duì)生物整合真核核酸以改善或提高制備葉黃素衍生物或制備葉黃素含量增高的食品的經(jīng)濟(jì)方法的葉黃素產(chǎn)量。
此外，在現(xiàn)有技術(shù)中適宜的真核β-胡蘿卜素羥化酶的缺點(diǎn)在于它們的底物范圍很窄，以至于不能被羥化酶轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物增加，并且可能對(duì)上述羥化酶產(chǎn)生抑制效應(yīng)。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)為彌補(bǔ)上述的現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，并提供具有改良特性的β-胡蘿卜素羥化酶。
我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)可以通過(guò)一種蛋白達(dá)到，該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列具有至少50％同源性的序列。
在此后的胡蘿卜素羥化酶的意思為根據(jù)本發(fā)明的的一種蛋白，即，具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性的蛋白，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列在氨基酸水平上具有至少50％同源性的序列。
SEQ ID NO2中所描述的氨基酸序列是通過(guò)SEQ ID NO1中所描述的cDNA序列的翻譯得到的。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白能夠催化β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)40個(gè)C原子并含有β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如角黃素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉(zhuǎn)化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化。
對(duì)于源自β-胡蘿卜素的葉黃素的說(shuō)明可以參考Misawa et al.，J.Biotechnol.1998，59，174頁(yè)(top)中的生物合成圖解。黃體素(lutein)的生物合成從α-胡蘿卜素開(kāi)始通過(guò)α-隱黃質(zhì)而發(fā)生。含有通過(guò)氨基酸的替代，插入或缺失從SEQ ID NO.2衍生得到的氨基酸序列，并且在氨基酸水平上與序列SEQ ID NO.2具有至少50％的同源性的蛋白具有一種將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性，優(yōu)選地上述活性與含有序列SEQ ID NO.2的蛋白的活性可比。
替代的意思是一個(gè)或多個(gè)氨基酸被一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選的取代是那些所謂的保守取代，其中替代的氨基酸與原始氨基酸具有類似的性質(zhì)，例如Glu被Asp，Gln被Asn，Val被Ile，Leu被Ile，Ser被Thr替代。
缺失是用直接連接取代氨基酸。優(yōu)選的缺失位置是多肽末端和單個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域之間的連接位置。
插入是將氨基酸引入多肽鏈，形式上為用一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代直接連接。
蛋白之間的同源性指各個(gè)蛋白在全長(zhǎng)上的氨基酸同一性，是在計(jì)算機(jī)程序GAP的幫助下通過(guò)比較計(jì)算得到的(UWGCG，University ofWisconsin，Genetic Computer Group，Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.1970，48，443-453的程序算法)，設(shè)置以下參數(shù)縫隙加權(quán)(Gap Weight) 12長(zhǎng)度加權(quán)(Length Weight)4平均匹配(Average Match)2.912
平均錯(cuò)配(Average Mismatch) -2.003在氨基酸水平上與SEQ ID NO.2序列具有至少50％同源性的蛋白因此表示一種蛋白，利用上述程序算法和上面所設(shè)置的參數(shù)，該蛋白序列與序列SEQ ID No.2相比具有至少50％的同一性，優(yōu)選地60％，特別優(yōu)選地70％。
根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶與已知的原核β-胡蘿卜素羥化酶有29.9％(產(chǎn)黃菌屬)，36.8％(夏孢歐文氏菌)，38.5％(草生歐文氏菌)，35.0％(產(chǎn)堿桿菌)，和35.6％(橙黃農(nóng)桿菌)的同源性，以及與已知的源自Arabidopsis thaliana的真核β-胡蘿卜素羥化酶有41.2％的同源性。
優(yōu)選的蛋白具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)的酶學(xué)活性和將角黃素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性，并且含有氨基酸序列SEQ ID NO.2或一種蛋白，該蛋白是通過(guò)氨基酸的替換，插入或缺失從上述序列衍生得到的，并且在氨基酸水平上與序列SEQ ID NO.2具有至少50％的同源性。
上述優(yōu)選的蛋白能夠催化β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如角黃素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉(zhuǎn)化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化。
特別優(yōu)選的蛋白是源自綠藻Haematococcus pluvialis FlotowNIES-144的具有序列SEQ ID NO.2的真核胡蘿卜素羥化酶。上述特別優(yōu)選的蛋白能夠催化β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化，以及能夠催化4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如角黃素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉(zhuǎn)化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，或其它含有最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化。
如在下文所描述，可以通過(guò)表達(dá)編碼胡蘿卜素羥化酶的適當(dāng)?shù)暮怂?，從天然的或基因操作改造的生物中制備這些蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼上文所描述的根據(jù)本發(fā)明的蛋白的核酸，該核酸在下文中稱為胡蘿卜素羥化酶基因。可以根據(jù)遺傳密碼通過(guò)反翻譯多肽序列得到適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?。用于上述目的的?yōu)選的密碼子是那些根據(jù)生物特異的密碼子使用頻率頻繁使用的密碼子。通過(guò)對(duì)相關(guān)生物中其它已知基因的計(jì)算機(jī)分析可以容易地找到密碼子使用頻率。例如，如果在植物中表達(dá)蛋白，在反翻譯中使用上述植物的密碼子使用頻率經(jīng)常是有利的。
優(yōu)選的核酸含有序列SEQ ID NO.1。上述核酸是一種源自綠藻Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144的真核cDNA，它編碼序列SEQ ID NO.2的胡蘿卜素羥化酶。由于上述cDNA的閱讀框在5’末端是開(kāi)放的，SEQ ID NO.1可能不代表cDNA的完全序列。該cDNA的表達(dá)得到有功能的蛋白。通過(guò)分析源自Haematococcus pluvialisFlotow NIES-144的cDNA文庫(kù)的重疊cDNA片段，任何在5’末端缺失的部分序列可以以本來(lái)已知的方式得以彌補(bǔ)。
已知綠藻Haematococcus pluvialis在惡劣的環(huán)境條件下，如磷或氮缺乏或光強(qiáng)度過(guò)高，產(chǎn)生大量的蝦青素以保護(hù)其免受光氧化應(yīng)激(photooxidative streβ)(Kobayashi et al.，Appl.Environ.Microbiol.1993，59，867-873；Boussiba et al.，Methods Enzymol1992，213，386-391)。該過(guò)程通常伴隨著外形的改變，這種綠藻的營(yíng)養(yǎng)性細(xì)胞發(fā)展成胞囊細(xì)胞(Zyst Zell)。
添加醋酸鈉和FeSO4以及增加光強(qiáng)度在Haematococcuspluvialis Flotow NIES-144懸浮培養(yǎng)物中誘導(dǎo)蝦青素生物合成和胞囊細(xì)胞的形成。從該階段的Haematococcus pluvialis分離出RNA以構(gòu)建cDNA文庫(kù)。具有SEQ ID NO 1序列的cDNA是從該cDNA文庫(kù)分離得到的。
上述的所有胡蘿卜素羥化酶都可以通過(guò)化學(xué)合成以自身已知的方式從核苷酸結(jié)構(gòu)單元制備，例如，通過(guò)雙螺旋的重疊互補(bǔ)的各個(gè)核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合。寡聚核苷酸的化學(xué)合成是可能的，例如，通過(guò)一種已知的通過(guò)亞磷酰胺的方法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897頁(yè))。合成寡核苷酸的添加，利用DNA聚合酶的Klenow片段填補(bǔ)缺口，連接反應(yīng)，以及常規(guī)克隆方法在Sambrook et al.(1989)，Molecular cloningA Laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中有所描述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有上文所描述的根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的核酸構(gòu)建體，其中上述胡蘿卜素羥化酶基因與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)連接以提高基因的表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列為，例如，誘導(dǎo)劑或阻遏劑結(jié)合的并從而調(diào)節(jié)該核酸的表達(dá)的序列。除了這些新的調(diào)節(jié)序列外，或作為這些序列的替代，對(duì)這些序列的天然調(diào)節(jié)仍然可能存在于真正的結(jié)構(gòu)基因之前，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候被進(jìn)行基因改造，以便天然調(diào)節(jié)被關(guān)閉，并且上述基因的表達(dá)得以提高。
但是，上述核酸構(gòu)建體也可能具有更簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，這就是說(shuō)在上述的胡蘿卜素羥化酶基因之前并未插入另加的調(diào)節(jié)信號(hào)，同時(shí)天然啟動(dòng)子與其調(diào)節(jié)并未被缺失。替代地，天然調(diào)節(jié)序列被突變，以便調(diào)節(jié)不再發(fā)生，并且基因的表達(dá)提高了。這些改造的啟動(dòng)子也可以被置于天然基因的上游以提高其活性。上述核酸構(gòu)建體此外可以有利地含有一個(gè)或多個(gè)與啟動(dòng)子功能性連接的所謂的增強(qiáng)子序列，它可能提高上述核酸序列的表達(dá)。還可以在上述DNA序列的3’端插入另加的有利序列，例如進(jìn)一步的調(diào)節(jié)元件或終止子。上述胡蘿卜素羥化酶基因可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于該基因構(gòu)建體中。
對(duì)于下文描述的制備葉黃素的方法，對(duì)于下文描述的基因改造的生物而言，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的有利的調(diào)控序列存在于，例如，啟動(dòng)子如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或在λ-PL啟動(dòng)子中，這些啟動(dòng)子有利地用于革蘭氏陰性細(xì)菌中。
進(jìn)一步有利的調(diào)控序列存在于，例如，革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2中，酵母和真菌啟動(dòng)子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH或存在于植物啟動(dòng)子CaMV/35S[Franck et al.，Cell21(1980)285-294]，PRP1[Ward et al.，Plant.Mol.Biol.22(1993)]，SSU，OCS，leb4，usp，STLS1，B33，nos或存在于泛素啟動(dòng)子或菜豆球蛋白啟動(dòng)子中。
特別有利的啟動(dòng)子為那些能確保在某些組織或植物部分中特異性表達(dá)的植物啟動(dòng)子，其中在上述組織或植物部分中發(fā)生類胡蘿卜素或其前體的生物合成，或者上述產(chǎn)物有利地富集。
特別值得一提的的是在組成型表達(dá)的基礎(chǔ)上的整體植物啟動(dòng)子，例如，CaMV啟動(dòng)子，源自農(nóng)桿菌的OCS啟動(dòng)子(章魚肉堿合成酶)，源自農(nóng)桿菌的NOS啟動(dòng)子(胭脂堿合成酶)，泛素啟動(dòng)子，液泡ATP酶亞基的啟動(dòng)子或源自小麥的富含脯氨酸蛋白的啟動(dòng)子(WO9113991)，種子特異的啟動(dòng)子，例如，源自Vicia faba的菜豆球蛋白啟動(dòng)子和USP啟動(dòng)子，源自Vicia的豆球蛋白基因啟動(dòng)子(leb4)或者源自Brassica的Bce4基因啟動(dòng)子(WO 9113980)，綠色組織特異的啟動(dòng)子，例如，rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羥化-加氧酶)的SSU啟動(dòng)子(小亞基)或STLS1啟動(dòng)子(Solanumtuberosum(馬鈴薯)，源自馬鈴薯的捕光系統(tǒng)1)，葉肉特異的啟動(dòng)子，例如，源自馬鈴薯細(xì)胞質(zhì)FBPase的FBPase啟動(dòng)子(WO9705900)，塊莖，儲(chǔ)存根或根特異的啟動(dòng)子，例如，I類patatin啟動(dòng)子(B33)，源自馬鈴薯的組織蛋白酶D抑制劑啟動(dòng)子，淀粉合成酶的啟動(dòng)子(GBSS1)或sporamin啟動(dòng)子，果實(shí)特異的啟動(dòng)子，例如，源自西紅柿的果實(shí)特異的啟動(dòng)子(EP409625)，
果實(shí)成熟特異的啟動(dòng)子，例如，源自西紅柿的果實(shí)成熟特異的啟動(dòng)子(WO 9421794)，花朵特異的啟動(dòng)子，例如，八氫番茄紅素合成酶啟動(dòng)子(WO9216635)或P-rr基因的啟動(dòng)子(WO9822593)，特異的質(zhì)體或色質(zhì)體啟動(dòng)子，例如，RNA聚合酶啟動(dòng)子(WO9706250)或病原體或化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如，PRP1啟動(dòng)子，苯磺胺誘導(dǎo)的(EP 388186)，四環(huán)素誘導(dǎo)的(Gatz et al.，(1992)Plant J.2，397-404)，脫落酸誘導(dǎo)的(EP335528)或乙醇或環(huán)己酮誘導(dǎo)的(WO9321334)啟動(dòng)子。
使用源自Glycine max的磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子或EP249676中的另一種節(jié)點(diǎn)(Nodie)特異的啟動(dòng)子也是可能并有利的。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法，原則上可能象上文所述那樣使用所有的天然啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)序列。此外，使用合成的啟動(dòng)子也是可能并有利的。
上述核酸構(gòu)建體也可以含有待引入到上述生物的其它基因。這些基因可以處于單獨(dú)的調(diào)節(jié)之下，或與上述的胡蘿卜素羥化酶基因處于同一調(diào)節(jié)區(qū)域。這些基因的例子是使得合成的增加成為可能的類胡蘿卜素合成的其它生物合成基因。特別值得一提的是在生物化學(xué)上限制性的，類胡蘿卜素生物合成的其它基因，如編碼八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫氫酶，異戊基-焦磷酸異構(gòu)酶或β-環(huán)化酶的基因。
編碼異戊基-焦磷酸異構(gòu)酶的基因在，例如，生物Phaffiarhodozyma和Haematococcus pluvialis(EP 769 551)或擬南芥(Arabidospsis thaliana)和萬(wàn)壽菊(Tagetes)(Marigold)(WO9736998)中是已知的。
編碼八氫番茄紅素合成酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，西紅柿(9109128)，瓜(WO9602650)Flavobacterium(EP 747483)或煙草(US 5705624)中是已知的。
編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，煙草(US 5705624)或產(chǎn)黃菌(EP 747483)中是已知的。
編碼β-環(huán)化酶的基因在，例如生物夏孢歐文氏菌(EP 393690)，草生歐文氏菌(WO 9113078)，(9109128)，黃桿菌(EP 747483)，煙草和西紅柿(WO9628014)或Capsicum annuum中是已知的。
本發(fā)明進(jìn)而涉及制備下文所描述的基因改造的生物的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體被引入到初始生物的基因組中。初始生物的意思為進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的基因改造之前的生物。
原則上可以通過(guò)技術(shù)人員所知道的所有方法將根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體引入到下文所描述的初始生物中，從而對(duì)其進(jìn)行基因改造。
它們有利地通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，電穿孔，用所謂的顆粒槍(particlegun)或通過(guò)微量注射被引入到初始生物或它們的細(xì)胞。
在以下參考書中技術(shù)人員可以找到用于微生物的適當(dāng)方法bySambrook，J.et al.(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularcloningA laboratory manual)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，by F.M.Ausubel et al.(1994)Current protocols inmolecular biology，John Wiley and Sons，by D.M.Glover et al.，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISSN 019-963476-9)，by Kaiser et al.(1994)酵母遺傳學(xué)方法(Methods in YeastGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者by Guthrieet al.Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methodsin Enzymology，1994，Academic Press。
值得一提的有利方法的例子為那些，如，通過(guò)同源或異源重組引入DNA，例如利用ura-3基因，特別是利用源自Ashbya的ura-3基因，如德國(guó)申請(qǐng)DE 19801120.2中所描述，以及通過(guò)下文所所描述的REMI(＝“限制性酶介導(dǎo)的整合”)方法。
REMI技術(shù)是基于用同一種限制性核酸內(nèi)切酶水解線性DNA構(gòu)建體的兩端，然后將上述線性DNA構(gòu)建體與用于限制它的限制性核酸內(nèi)切酶一起共轉(zhuǎn)化入生物中。然后被引入DNA構(gòu)建體和限制性酶的生物的基因組DNA為限制性核酸內(nèi)切酶所水解。這導(dǎo)致細(xì)胞自身修補(bǔ)機(jī)制的激活。這些修補(bǔ)機(jī)制修補(bǔ)基因組DNA中由核酸內(nèi)切酶導(dǎo)致的鏈的間斷，并且在該過(guò)程中共轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體也以一定的頻率被整合入基因組中。通常，在上述過(guò)程中在DNA的兩端保留限制性水解位點(diǎn)。
Blker et al.(Mol Gen Genet，248，1995547-552)描述了上述技術(shù)用于真菌的插入突變。Von Schiestl and Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，19917585-7589)利用上述技術(shù)尋找在酵母中是否存在異源重組。Brown et al.(Mol.Gen.Genet. 251，199675-80)描述了將上述方法用于一種可誘導(dǎo)的報(bào)告基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和可調(diào)表達(dá)。
利用REMI方法在基因組中的轉(zhuǎn)錄活躍位點(diǎn)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的核酸片段或上述根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因進(jìn)行定位是可能的。
將上述核酸與至少一個(gè)報(bào)告基因一起克隆到DNA構(gòu)建體中是可能并有利的，該構(gòu)建體被引入基因組中。該報(bào)告基因必須是易于通過(guò)生長(zhǎng)，熒光，化學(xué)或生物發(fā)光檢測(cè)或通過(guò)光度計(jì)測(cè)定而檢測(cè)。
值得一提的報(bào)告基因的例子是抗生素抗性基因，水解酶基因，熒光蛋白基因，生物發(fā)光基因，葡萄糖苷酶基因，熒光素酶基因的過(guò)氧化酶基因，β-半乳糖苷酶基因，gfp基因，脂肪酶基因，酯酶基因，過(guò)氧化物酶基因，β-內(nèi)酰胺酶基因，乙?；?，磷酸基或腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因。上述基因使得轉(zhuǎn)錄活性的簡(jiǎn)易測(cè)量和定量，并從而使得基因表達(dá)的簡(jiǎn)易測(cè)量和定量成為可能。這意味著在基因組上鑒定產(chǎn)量差異高達(dá)2倍的位點(diǎn)成為可能。
如果打算將多個(gè)基因，如，例如，進(jìn)一步的類胡蘿卜素生物合成的crt基因，引入到生物時(shí)，它們可以在單一的載體中與一個(gè)報(bào)告基因被同時(shí)引入生物，或者每次單個(gè)基因在一個(gè)載體中與一個(gè)報(bào)告基因被引入生物，有可能在一次同時(shí)或相繼引入各個(gè)載體。還可能在REMI技術(shù)中插入編碼各個(gè)活性的基因片段。
所有原則上適于將根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構(gòu)建體整合到初始生物基因組的限制性內(nèi)切酶都是已知的限制性內(nèi)切酶。僅僅識(shí)別4個(gè)堿基對(duì)作為限制性水解位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶是較不優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨蚪M上或在待整合載體上的切割過(guò)于頻繁，優(yōu)選的酶識(shí)別6，7，8或更多個(gè)堿基對(duì)作為水解位點(diǎn)，如BamHI，EcoRI，BglII，SphI，SpeI，XbaI，XhoI，NcoI，SalI，ClaI，KpnI，HindIII，SacI，PstI，BpnI，NotI，SrfI或SfiI，僅提到可能的限制性內(nèi)切酶中的一小部分。如果上述酶在待引入的DNA上不再有水解位點(diǎn)將是優(yōu)選的；這提高了整合的效率。通常在REMI混合物中使用5到500 U，優(yōu)選地10到250 U，特別優(yōu)選地10到100U的酶。上述酶在一種水溶液中應(yīng)用是有利的，上述水溶液含有滲透壓穩(wěn)定物質(zhì)，如糖，如蔗糖，海藻糖或葡萄糖，多醇如甘油或聚乙二醇，含有一種緩沖劑，該緩沖劑在pH5到9，優(yōu)選地在6到8，特別優(yōu)選地在7到8之間起緩沖作用是有利的，如Tris，MOPS，HEPES，MES或PIPES，和/或含有穩(wěn)定核酸的物質(zhì)，如Mg，Cu，Co，F(xiàn)e，Mn或Mo的有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽。還可能在適當(dāng)?shù)那闆r下存在一些物質(zhì)，如EDTA，EDDA，DTT，β-巰基乙醇或核酸酶抑制劑。但是，也可能在不添加這些物質(zhì)的情況下執(zhí)行REMI技術(shù)。
執(zhí)行該方法的溫度在5到80℃，優(yōu)選地在10到60℃，特別優(yōu)選地在20到40℃之間。其它使細(xì)胞膜不穩(wěn)定的已知方法也適用于該方法，如，例如，電穿孔，與負(fù)載的脂質(zhì)體融合或或者用各種堿性金屬或堿性稀土金屬鹽進(jìn)行去穩(wěn)定，如鋰，銣或鈣鹽，鋰鹽是優(yōu)選的。
上述核酸可以在純化后或者在分離后直接用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)。
原則上可以通過(guò)技術(shù)人員所已知的所有方法將根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體引入到植物中。
將外源基因轉(zhuǎn)移到植物基因組中被稱為轉(zhuǎn)化。如果這樣的話，用所描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化并從植物組織或植物細(xì)胞重新生成植株，以進(jìn)行瞬時(shí)的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。
適當(dāng)?shù)姆椒橥ㄟ^(guò)聚乙二醇誘導(dǎo)DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，使用基因槍，電穿孔，將干的胚芽在含DNA的溶液中溫育，微量注射和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。上述的方法在，例如，B.Jenes et al.，Techniques for Gene Transfer，inTransgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，edited by S.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，和在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中有所描述。
待表達(dá)的構(gòu)建體優(yōu)選地被克隆到適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的載體中，例如pBin19(Bevan etal.，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化在，例如，Hofgen and Willmitzer in Nucl.Acids，Res.(1988)16，9877中有所描述。
用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可能被以已知的方式用于轉(zhuǎn)化植物，特別是萬(wàn)壽菊，向日葵，擬南芥，煙草，辣椒，大豆，西紅柿，茄子，辣椒，胡蘿卜，馬鈴薯，玉米，萵苣和蕓苔，燕麥，黑麥，小麥，黑小麥，粟，大米，紫花苜蓿，亞麻，十字花科植物如，例如，油菜或Canola，甜菜，甘蔗或木本植物如，例如，白楊或紅豆杉，例如通過(guò)將損傷的葉片或葉片的碎片浸泡于農(nóng)桿菌溶液然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。
基因改造過(guò)的植物細(xì)胞可以通過(guò)技術(shù)人員已知的所有方法再生。適當(dāng)?shù)姆椒梢栽谏鲜龅腟.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hofgen和Willmitzer的出版物中找到。
在細(xì)胞中增強(qiáng)胡蘿卜素羥化酶基因的酶學(xué)活性有很大的可能。
一種可能是修飾內(nèi)源的胡蘿卜素羥化酶基因，以便其編碼的酶的胡蘿卜素羥化酶活性比原始酶的活性高。另一種對(duì)酶活性的增強(qiáng)可以通過(guò)，例如，通過(guò)修飾催化位點(diǎn)以增加底物的轉(zhuǎn)化或通過(guò)中止酶抑制劑的作用而達(dá)到，即它們的比活增加或它們的活性不被抑制。在一個(gè)進(jìn)一步的有利實(shí)施方案中通過(guò)在細(xì)胞中增加酶的合成也可以增強(qiáng)酶活性，例如通過(guò)消除抑制酶合成的因子，或通過(guò)增強(qiáng)促進(jìn)合成增加的因子或調(diào)控元件的活性，或優(yōu)選地通過(guò)引入更多的基因拷貝。這個(gè)方法增強(qiáng)細(xì)胞中基因產(chǎn)物的整體活性而不改變比活。聯(lián)合利用上述方法也是可能的，即增強(qiáng)比活加上增強(qiáng)整體活性。原則上可以通過(guò)技術(shù)人員已知的所有方法將這些修飾引入基因、調(diào)控元件或其啟動(dòng)子的核酸序列。為此目的，可以將序列進(jìn)行，例如，突變，如D.M.Glover etal.，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963467-9)，第6章，193頁(yè)et seq所描述的定點(diǎn)突變。
Spee et al.(Nucleic acid Research，Vol.21，No.3，1993777-778)描述了利用dITP進(jìn)行隨機(jī)突變的PCR方法。
Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，199410747-10751)描述了體外重組技術(shù)在分子演化中的應(yīng)用。
Moore et al.(Nature Biotechnology Vol.14，1996458-467)描述了PCR和重組方法的結(jié)合。
改造后的核酸序列隨后通過(guò)載體回到生物中。
為了增強(qiáng)酶活性，可以將改造后的啟動(dòng)子區(qū)域置于天然基因之前以增強(qiáng)基因的表達(dá)，并從而最終提高活性。也可以在3’末端引入序列，例如，以增加mRNA的穩(wěn)定性，并從而使得翻譯的增加成為可能。這同樣也導(dǎo)致更高的酶活性。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了在下文所描述的一種生物中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構(gòu)建體被插入到載體例如，質(zhì)粒，噬菌體或其它使基因在原核或真核生物中的最佳表達(dá)成為可能的DNA中。上述載體可能含有用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的蛋白的ATG起始密碼子。
在E.coli中合適的質(zhì)粒的例子為pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11，pBdCI，pET載體系列(Novagen and Stratagene)，pMAL或pQE系列(Qiagen)，在真菌中pALS1，pII2或pBB116，在酵母中2μ，pAG-1，YEp6，YEp13或pEMBLYe23或在植物中pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004，pDH51，或上述質(zhì)粒的衍生物。
上述的質(zhì)粒代表可能質(zhì)粒的小部分選擇。更多的質(zhì)粒被技術(shù)人員所熟知并在，例如，在書本Cloning Vector(Eds.Pouwels P.H.etal.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444904018)中可以找到。合適的植物載體在“Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，第6/7章，71-119頁(yè)中特別描述。
如果核酸片段在3’和/或5’末端還含有另加的增強(qiáng)表達(dá)的調(diào)控序列，表達(dá)其它存在的基因是有利的，上述調(diào)控序列的選擇是為了所選擇的宿主生物和基因的最佳表達(dá)。
上述調(diào)控序列是用于使基因的特異表達(dá)和蛋白表達(dá)成為可能。這可能意味著，例如，根據(jù)宿主生物，只有在誘導(dǎo)之后基因才表達(dá)和/或過(guò)量表達(dá)，或基因立即表達(dá)和/或過(guò)量表達(dá)。
此外調(diào)控序列或因子可以優(yōu)選地對(duì)引入基因的表達(dá)具有有利的作用，并從而增強(qiáng)表達(dá)。因此在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，從而增強(qiáng)調(diào)控元件是有利地可能的。但是，還可能通過(guò)，例如，提高mRNA的穩(wěn)定性而增強(qiáng)翻譯。
在載體的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體也可以有利地以線性DNA形式被引入宿主生物中，并通過(guò)異源或同源重組被整合到宿主生物基因組中。這種線性DNA可以由線性化的質(zhì)?；騼H僅由作為載體的核酸片段組成。
也可以使用任何在細(xì)胞中自我復(fù)制的質(zhì)粒作為載體，但也可以，如上文所述，使用整合到宿主基因組中的線性DNA片段作為載體。上述整合可以通過(guò)異源或同源重組發(fā)生，但優(yōu)選地，如所述的那樣，通過(guò)同源重組(Steiner et al.，Genetics，Vol.140，1995973-987)。上述的胡蘿卜素羥化酶基因進(jìn)而可以在基因組各個(gè)位點(diǎn)或各個(gè)載體中單獨(dú)存在，或在基因組中或一個(gè)載體中一起存在。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因生產(chǎn)基因改造的生物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及相應(yīng)的基因改造的生物，與野生型相比，在初始生物含有根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的情況下，基因改造生物通過(guò)基因改造，其根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá)得以增強(qiáng)，或在初始生物不含根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的情況下，基因改造生物通過(guò)基因改造導(dǎo)致根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá)。
基因改造的生物是指一種生物，在該生物中，優(yōu)選地通過(guò)上文所描述的一種方法，被插入了根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構(gòu)建體。
基因改造的生物含有至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因或至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。根據(jù)初始生物，核酸可以存在于染色體內(nèi)或染色體外。
與野生型相比，基因改造生物中類胡蘿卜素代謝優(yōu)選地被改變。
合適的基因改造生物原則上都是能夠合成葉黃素的生物。
優(yōu)選的初始生物是那些天然能夠合成葉黃素的生物。但是，由于引入類胡蘿卜素生物合成基因而能夠合成葉黃素的初始生物也是合適的。初始生物是指原核或真核生物例如，微生物或植物。優(yōu)選的微生物是細(xì)菌，酵母，藻類或真菌。
可以使用的細(xì)菌既是由于引入產(chǎn)類胡蘿卜素生物的類胡蘿卜素生物合成基因而能夠合成葉黃素的細(xì)菌，例如，含有，例如，源自歐文氏菌屬的crt基因，的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，可以使用的細(xì)菌也是本身就能合成葉黃素的細(xì)菌，例如，歐文氏菌屬，農(nóng)桿菌屬，產(chǎn)黃菌屬，產(chǎn)堿桿菌屬的細(xì)菌或集胞藻屬的藍(lán)藻。優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿菌(Escherichia coli)，草生歐文氏菌，夏孢歐文氏菌，Agrobacterium aurantiacum，Alcaligenes sp.PC-1，產(chǎn)黃菌R1534菌株或Cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803。
優(yōu)選的酵母是假絲酵母(Candida)，酵母菌屬(Saccharomyces)，漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤氏酵母菌屬(Pichia)。
優(yōu)選的真菌是曲霉屬(Aspergillus)，木霉屬(Trichoderma)，Ashbya，脈孢菌(Neurospora)，鐮孢菌(Fusarium)或其它在IndianChem Engr.Section B.Vol 37，No.1，2(1995)第15頁(yè)，表6中所描述的真菌。
優(yōu)選的藻類是綠藻例如，紅球藻屬(Haematococcus)，Phaedactylum tricornatum，團(tuán)藻(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)。特別優(yōu)選的藻類是Haematococcus pluvialis或Dunaliella bardawil。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用植物作為初始生物，并因此也作為基因改造的生物。優(yōu)選植物的例子是萬(wàn)壽菊，向日葵，擬南芥(Arabidopsis)，煙草，辣椒，大豆，西紅柿，茄子，辣椒，胡蘿卜，馬鈴薯，玉米，萵苣和蕓苔，燕麥，黑麥，小麥，黑小麥，粟，大米，紫花苜蓿，亞麻，十字花科植物如，例如，油菜或Canola，甜菜，甘蔗或木本植物如，例如，白楊或紅豆杉。
特別優(yōu)選的是Arabidopsis thaliana，Tagetes erecta，油菜，canola，馬鈴薯，和含油種子以及通常的類胡蘿卜素生產(chǎn)者例如大豆，向日葵，辣椒，胡蘿卜，胡椒或玉米。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及葉黃素衍生物的制備方法，該方法包括在根據(jù)本發(fā)明的蛋白存在的情況下，將β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件和/或?qū)?-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件。
葉黃素衍生物是指葉黃素類，優(yōu)選的葉黃素含有至少一個(gè)羥基如，例如，玉米黃質(zhì)，β-隱黃質(zhì)，3’-羥基海膽酮，3-羥基海膽酮，adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))，蝦青素，phoenicoxanthin(adonirubin)，α-隱黃質(zhì)或黃體素或其最多可達(dá)到40個(gè)C原子并在分子中含有至少一個(gè)3-羥基-β-紫羅酮或至少一個(gè)3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件的衍生物，例如，3-羥基-6-乙烯基-β-紫羅酮，3-羥基-4-酮-6-乙烯基-β-紫羅酮，3-羥基視黃醇，3-羥基-4-酮視黃醇，3-羥基視黃醛，3-羥基-4-酮視黃醛，3-羥基視黃酸或3-羥基-4-酮視黃酸。
優(yōu)選的葉黃素衍生物是玉米黃質(zhì)，黃體素(Lutein)和蝦青素。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白存在的情況下，含有β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件向3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件的轉(zhuǎn)化，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化，或含有4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件向3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件的轉(zhuǎn)化，例如角黃素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉(zhuǎn)化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，或最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化。
在上述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)上述根據(jù)本發(fā)明的基因改造生物，收集后一種生物，并隨后從該生物中分離葉黃素衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的基因改造生物的培養(yǎng)是以本來(lái)已知的方式進(jìn)行的，例如培養(yǎng)合適的野生型，例如在微生物的情況下，在合適的培養(yǎng)基如，例如，在瓊脂培養(yǎng)板或懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或在植物的情況下，在土壤或合適的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)。在微生物的情況，收集意味著微生物的分離，在植物的情況，收集意味著切下植物或，在適當(dāng)?shù)那樾蜗?，含有葉黃素衍生物的特定的植物部位。葉黃素衍生物以本來(lái)已知的方式分離，例如通過(guò)生物細(xì)胞的破壞，葉黃素衍生物的提取以及隨后通過(guò)化學(xué)或物理分離方法例如萃取或?qū)游黾兓~黃素衍生物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶或根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因制備葉黃素衍生物。
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例說(shuō)明。
實(shí)施例1將胡蘿卜素羥化酶基因整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素的E.coli中，轉(zhuǎn)基因生物的發(fā)酵和葉黃素的分離常規(guī)方法類胡蘿卜素的分離為了分離類胡蘿卜素(胡蘿卜素和葉黃素)，通過(guò)離心收集E.coli細(xì)胞，并將得到的細(xì)胞物質(zhì)凍干24h。凍干的細(xì)胞在丙酮中懸浮并在55℃用丙酮15min萃取兩次?；旌蟽纱屋腿∥?，在分液漏斗中用二乙醚/石油醚(沸點(diǎn)35-80℃)混合物(1∶9，v/v)洗滌，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在氮?dú)猸h(huán)境下濃縮至干燥。
HPLC分析利用Nucleosil 100-5 C18柱子(Machery-Nagel)，以1.5ml/min的洗脫液流速分離萃取物。在實(shí)施例1中用于分離β-胡蘿卜素和羥基化的葉黃素的洗脫液是乙腈/甲醇/2-丙醇混合物(85∶10∶5，v/v/v；flow)。在實(shí)施例2中為了分離含有酮基的葉黃素，將乙腈/甲醇/H2O混合物(50∶44∶6，v/v/v)作為洗脫液1，洗22min，并將甲醇作為洗脫2使用。直接利用Waters 994diode array detector進(jìn)行檢測(cè)。用于HPLC分析的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)是從Sigma或Roth購(gòu)買的β-胡蘿卜素，蝦青素和玉米黃質(zhì)。
1.1產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli的生產(chǎn)使用的生物包括菌株JM101的E.coli細(xì)胞。質(zhì)粒pACCAR16DcrtX含有源自夏孢歐文氏菌的細(xì)菌類胡蘿卜素生物合成基因crtE，crtB，crtIhe crtY，并導(dǎo)致β-胡蘿卜素的生物合成(N.Misawa Res.Commun.209(1995)867-876)。
為了制備上述質(zhì)粒，將源自夏孢歐文氏菌(質(zhì)粒pCAR16delB)的類胡蘿卜素生物合成基因簇的一個(gè)6.0kb Asp718(KpnI)-EcoRI片段克隆到質(zhì)粒pACY184的EcoRI位點(diǎn)(R.E.Rose，Nucl.Acids Res.16(1998)355)。質(zhì)粒pCAR16delB在β-胡蘿卜素羥化酶ORF(開(kāi)放閱讀框)中含有一個(gè)移碼突變(Misawa et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.209(1995)867-876)。因此導(dǎo)致β-胡蘿卜素不能被羥化成玉米黃質(zhì)。將質(zhì)粒pACCAR16DcrtX插入到E.coli中并且制備和分離改造的E.coli細(xì)胞是以本來(lái)已知的方式進(jìn)行的，如在Sambrock et al.，Molecular cloninga Laboratory manul，2ndedn.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中有所描述。
1.2 Haematococcus pluvialis λcDNA表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和含有胡蘿卜素羥化酶基因的質(zhì)粒的分離Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144來(lái)源于NationalInstitute for Environmental Studies(國(guó)家環(huán)境研究所NIES)，Tsukuba，Japan。Haematococcus pluvialis生長(zhǎng)階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH 6.8)每升含有1.2g乙酸鈉，2.0g酵母提取物，0.4g L-天冬酰胺，0.2g MgCl2*6H2O，0.01g FeSO4*7H2O，和0.02gCaCl2*2H2O。Haematococcus pluvialis在20℃生長(zhǎng)4天，生長(zhǎng)時(shí)的黑暗/光照循環(huán)為12小時(shí)的光照(20μE/m2s)和12小時(shí)的黑暗。
為了誘導(dǎo)蝦青素生物合成和胞囊細(xì)胞形成，4天后加入乙酸鈉和FeSO4，其濃度分別達(dá)到45mM和450μM。之后，將光照條件改變?yōu)檫B續(xù)的光照(125μE/m2s)，如在Kajiwara et al.，Plant Mol.Biol.29(1995)343-352所描述。
在誘導(dǎo)胞囊細(xì)胞形成8小時(shí)后，分離Haematococcus pluvialis的RNA以便從胞囊細(xì)胞構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
利用寡聚(dT)-纖維素(Biolabs)純化多聚(A)RNA。cDNA的合成和λZAP表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建借助于cDNA Synthesis和ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning試劑盒(Stratagene)進(jìn)行。根據(jù)Stratagene的使用說(shuō)明書，利用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和含有XhoI限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的多聚(dT)引物合成cDNA的第1條鏈。相應(yīng)地利用DNA聚合酶I合成第2條鏈。通過(guò)用PfuDNA聚合酶填補(bǔ)產(chǎn)生DNA的平頭末端，并且在平頭末端連接上EcoRI適配序列。然后按照大小將得到的cDNA片段分離并隨后連接到Uni-ZAP載體的EcoRI-XhoI識(shí)別位點(diǎn)上。在分離和純化胡蘿卜素羥化酶陽(yáng)性斑塊后，根據(jù)Stratagene的使用說(shuō)明書，通過(guò)使用ExAssist輔助噬菌體和SOLR E.coli菌株，通過(guò)體內(nèi)切割而回收含有胡蘿卜素羥化酶cDNA的pBluescript噬菌粒。根據(jù)DNA序列分析，得到的質(zhì)粒除了在5’-(5’-AATTCGGCACGAG-3’)和3’(5’-TCGAG-3’)末端含有短適配序列之外，還含有與多克隆位點(diǎn)的EcoRI和XhoI限制位點(diǎn)連接的長(zhǎng)1608bp的cDNA片段。如1.1下面所描述，上述質(zhì)粒用來(lái)將胡蘿卜素羥化酶基因插入到產(chǎn)β-胡蘿卜素的E.coli細(xì)胞。
1.3將胡蘿卜素羥化酶基因整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)，以及葉黃素家族的玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的分離用1.3下面描述的含有胡蘿卜素羥化酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在1.1下面描述的含有質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞是以自身已知的方式進(jìn)行的，如J.Sambrook et al.，Molecularcloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞在添加有氨芐青霉素(50μg/ml；對(duì)于含有胡蘿卜素羥化酶基因的質(zhì)粒) 和氯霉素(30μg/ml；質(zhì)粒pACCAR16DcrtX)的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48小時(shí)。
類胡蘿卜素的分離如常規(guī)方法所描述。


圖1表示從以下提取的類胡蘿卜素的HPLC圖(A)含有源自1.1的質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的E.coli細(xì)胞(B)含有質(zhì)粒pACCAR16DcrtX和源自1.2的胡蘿卜素羥化酶基因的E.coli細(xì)胞
圖1中峰號(hào)(peak number)表示3玉米黃質(zhì)5β-隱黃質(zhì)6β-胡蘿卜素從
圖1明顯看出，由于整合了根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因，轉(zhuǎn)化后的E.coli細(xì)胞產(chǎn)生羥化的葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的E.coli只產(chǎn)生β-胡蘿卜素。因此根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶可以將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成β-隱黃質(zhì)，將β-隱黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)ⅵ?胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)。
實(shí)施例2將胡蘿卜素羥化酶基因和源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)和葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)的分離2.1含有源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質(zhì)粒的制備為了制備含有源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶基因的質(zhì)粒pRKbktl(Kajiwara et al.，Plant Mol.Biol.29(1995)343-352)，通過(guò)瓊脂凝膠電泳分離pUC19bkt質(zhì)粒的PvuII部分消化的1kb產(chǎn)物(Breitenbach et al.，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.140(1996)241-246)。上述DNA片段含有l(wèi)acZ啟動(dòng)子和酮酶的ORF(開(kāi)放閱讀框)并且被亞克隆到預(yù)先用HindIII消化并用Klenow酶處理的質(zhì)粒pRK404中。
得到的質(zhì)粒pRKbktl被一次單獨(dú)插入到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞中并且一次與1.2下面描述的胡蘿卜素羥化酶基因質(zhì)粒一起被插入到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞中。
2.2將質(zhì)粒pRKbktl整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)和葉黃素角黃素的分離用2.1下面描述的含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質(zhì)粒pRKbktl轉(zhuǎn)化1.1下面描述的含有質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞是以自身已知的方式進(jìn)行的，如J.Sambrook et al.，Molecular cloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞的培養(yǎng)與1.3下面的描述類似，但在添加有氯霉素(30μg/ml；質(zhì)粒pACCAR16DcrtX)，四環(huán)素(10μg/ml；質(zhì)粒pRKbktl)和異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.5mM)的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48小時(shí)。
類胡蘿卜素的分離如常規(guī)方法所描述。
圖2(A)表示從含有質(zhì)粒pACCAR16DcrtX和包含β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質(zhì)粒pRKbktl的E.coli細(xì)胞提取的類胡蘿卜素的HPLC圖。質(zhì)粒pRKbktl的整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞產(chǎn)生具有酮基的葉黃素，角黃素。
2.3將質(zhì)粒pRKbktl和胡蘿卜素羥化酶基因整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)和葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質(zhì)以及β-隱黃質(zhì)的分離用2.1下面描述的含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質(zhì)粒pRKbktl以及用2.3描述的含有胡蘿卜素羥化酶基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化1.1下面描述的含有質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的產(chǎn)β-胡蘿卜素E.coli細(xì)胞是以自身已知的方式進(jìn)行的，如J.Sambrook et al.，Molecularcloninga laboratory manul，2 nd edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述。
轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞的培養(yǎng)與1.3下面的描述類似，但在添加有氨芐青霉素(50μg/ml；含有胡蘿卜素羥化酶基因的質(zhì)粒)氯霉素(30μg/ml；質(zhì)粒pACCAR16DcrtX)，四環(huán)素(10μg/ml；質(zhì)粒pRKbktl)和異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.5mM)的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48小時(shí)。
類胡蘿卜素的分離如常規(guī)方法所描述。圖2表示從以下提取的類胡蘿卜素的HPLC圖(A)含有質(zhì)粒pRKbktl和源自1.1的質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的E.coli細(xì)胞。
(B)含有質(zhì)粒pRKbktl和胡蘿卜素羥化酶基因以及源自1.2的質(zhì)粒pACCAR16DcrtX的E.coli細(xì)胞。
圖2(C)表示與標(biāo)準(zhǔn)相比的蝦青素圖2中的峰號(hào)表示1蝦青素2adonixanthin
3玉米黃質(zhì)4角黃素5β-隱黃質(zhì)6β-胡蘿卜素從圖2可以看出，由于整合了根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因和含有β-胡蘿卜素酮酶基因(bkt)的質(zhì)粒pRKbktl，轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞產(chǎn)生羥化的和/或含有酮的葉黃素家族的蝦青素，角黃素，adonixanthin，玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)，而不含根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶基因的E.coli細(xì)胞只產(chǎn)生角黃素。
在關(guān)于源自Haematococcus pluvialis的β-胡蘿卜素酮酶的酶研究中表明上述酶主要將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成角黃素，而含有羥基的葉黃素例如玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)很少被轉(zhuǎn)化，并且只轉(zhuǎn)化成adonixanthin而不轉(zhuǎn)化成蝦青素(T.Lotan，J.Hisrschberg，F(xiàn)EBSLett.364(1995)125-128；J.Breitenbach，N.Misawa，S.Kajiwara，G.Sandmann，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.140(1996)241-246；P.D.Fraser，H.Shimada，N.Misawa，Eur.J.Biochem.252(1998)229-236)。
在實(shí)施例2.3中改造的E.coli細(xì)胞能產(chǎn)生蝦青素這一事實(shí)證明了根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶能將角黃素通過(guò)phoenicoxanthin(adonirubin)轉(zhuǎn)化成蝦青素。
因此根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素羥化酶能夠催化β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如β-胡蘿卜素向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-胡蘿卜素向β-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，β-隱黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，α-胡蘿卜素向α-隱黃質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或其它最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化，或能夠催化4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件，例如角黃素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，角黃素向phoenicoxanthin(adonirubin)的轉(zhuǎn)化，phoenicoxanthin(adonirubin)向蝦青素的轉(zhuǎn)化，海膽酮向3’-羥基海膽酮的轉(zhuǎn)化，3’-羥基海膽酮向adonixanthin(4-酮玉米黃質(zhì))的轉(zhuǎn)化，或其它最多可達(dá)到40個(gè)C原子并含有4-酮-β-紫羅酮環(huán)的化學(xué)化合物向相應(yīng)的3-羥基-4-酮-β-紫羅酮化合物的轉(zhuǎn)化。
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>胡羅卜素羥化酶和制備葉黃素衍生物的方法<130>OZ 0050/49896<140><141><160>2<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1607<212>DNA<213>Haematococcus pluvialis<220><221>CDS<222>(3)..(968)<400>1ct aca ttt cac aag ccc gtg agc ggt gca agc gct ctg ccc cac atc47Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile1 5 10 15ggc cca cct cct cat ctc cat cgg tca ttt gct gct acc acg atg ctg 95Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu20 25 30tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc 143Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala35 40 45cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg 191Arg Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser50 55 60tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga 239Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly65 70 75acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca 287Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala80 85 90 95ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa 335Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys100 105 110cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc 383Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly115 120 125gtg tca ggc att gcc atc ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cac 431Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His130 135 140atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc 479Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu145 150 155ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat 527Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr160 165 170 175gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac 575Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His180 185 190aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg 623Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu195 200 205ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc 671Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly210 215 220ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg 719Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu225 230 235ggc atc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg 767Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu240 245 250 255gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg 815Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met260 265 270aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt 863Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly275 280 285ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att 911Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile290 295 300cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp305 310 315tcc aag cgg tagggtgcgg aaccaggcac gctggtttca cacctcatgc 1008Ser Lys Arg320ctgtgataag gtgtggctag agcgatgcgt gtgagacggg tatgtcacgg tcgactggtc 1068tgatggccaa tggcatcggc catgtctggt catcacgggc tggttgcctg ggtgaaggtg 1128atgcacatca tcatgtgcgg ttggaggggc tggcacagtg tgggctgaac tggagcagtt 1188gtccaggctg gcgttgaatc agtgagggtt tgtgattggc ggttgtgaag caatgactcc 1248gcccatattc tatttgtggg agctgagatg atggcatgct tgggatgtgc atggatcatg 1308gtagtgcagc aaactatatt cacctagggc tgttggtagg atcaggtgag gccttgcaca 1368ttgcatgatg tactcgtcat ggtgtgttgg tgagaggatg gatgtggatg gatgtgtatt 1428ctcagacgta gaccttgact ggaggcttga tcgagagagt gggccgtatt ctttgagagg 1488ggaggctcgt gccagaaatg gtgagtggat gactgtgacg ctgtacattg caggcaggtg 1548agatgcactg tctcgattgt aaaatacatt cagatgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1608<210> 2<211> 322<212> PRT<213> Haematococcus pluvialis<400> 2Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile Gly1 5 10 15Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser20 25 30Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg35 40 45Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu50 55 60Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr65 70 75 80Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu
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權(quán)利要求
1.一種蛋白，該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性，該蛋白含有SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸的替代，插入或缺失從該序列衍生得到的，在氨基酸水平上和SEQ ID NO2的序列具有至少50％同源性的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種蛋白，其中該蛋白具有將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)的酶學(xué)活性和將角黃素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶學(xué)活性。
3.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其含有SEQ ID NO.1.中所描述的序列。
5.一種含有根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸的核酸構(gòu)建體，上述核酸與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)功能性地連接以增強(qiáng)基因表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體，其中根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸被插入到一種載體中，該載體適合該基因在原核或真核生物中表達(dá)。
7.一種基因操作的生物，其中基因的改變使得根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸的表達(dá)在初始生物含有根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸的情況下，與野生型相比得以增強(qiáng)，或在初始生物不含根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸的情況下，與野生型相比得以發(fā)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的基因操作的生物，其類胡蘿卜素代謝不同于野生型。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的基因操作的生物，其中所用的生物是真核生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的基因操作的生物，其中用所用的真核生物是植物。
11.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求7-10任何一項(xiàng)的基因改造生物的一種方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸或根據(jù)權(quán)利要求5或6的核酸構(gòu)建體引入初始生物的基因組中。
12.根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸在產(chǎn)生基因操作的生物中的應(yīng)用。
13.制備葉黃素衍生物的一種方法，該方法包括，在根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白存在的情況下，將β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件和/或?qū)?-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件轉(zhuǎn)化成3-羥基-4-酮-β-紫羅酮結(jié)構(gòu)元件。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的制備葉黃素衍生物的方法，其中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7-10中任何一項(xiàng)的生物，收集該生物，然后從該生物分離葉黃素衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白在制備葉黃素衍生物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸在制備葉黃素衍生物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有將β－胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)或?qū)⒔屈S素轉(zhuǎn)化成蝦青素的酶活性的蛋白,涉及編碼這些蛋白的核酸,涉及含有這些核酸的核酸構(gòu)建體,涉及基因操作改造的生物,其中與野生型相比上述基因操作導(dǎo)致或提高了該核苷酸的基因表達(dá),本發(fā)明還涉及制備葉黃素衍生物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1352689SQ00808149
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者H·林登, G·桑德曼 申請(qǐng)人:Basf公司