專利名稱：轉(zhuǎn)錄激活抑制蛋白的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，其具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的，本發(fā)明還涉及編碼該蛋白質(zhì)的DNA，識別該蛋白質(zhì)的抗體，含有所述蛋白質(zhì)或DNA的治療劑，和含有所述抗體的診斷試劑。
背景技術(shù)：
本文使用下列縮寫AD轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域ADH醇脫氫酶APC結(jié)腸腺癌(adenomatous poliposis coli)BDDNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域β-連環(huán)蛋白/TCF-4β-連環(huán)蛋白和TCF-4的復合物DCC結(jié)直腸癌中的缺失dhfr二氫葉酸還原酶DLGDrosophila Discs LargeDMSO二甲亞砜EDTA乙二胺四乙酸ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗EST表達序列標簽FAP家族性結(jié)腸腺癌FCS胎牛血清FITC異硫氰酸熒光素GST谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST/ICATGST和ICAT的融合蛋白GSK-3β糖原合酶激酶-3βICATβ-連環(huán)蛋白和TCF的抑制劑
IPTG異丙基硫代半乳糖苷KLH匙孔血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)Lef淋巴細胞增強子-結(jié)合因子LTR長末端重復序列MBS間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺MEM極限必需培養(yǎng)基PCR聚合酶鏈反應PEG聚乙二醇RITC異硫氰酸羅丹明SDS十二烷基硫酸鈉SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳TCFT細胞因子Tris三(羥甲基)氨基甲烷X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷已分離到作為FAP致病基因的APC基因(Kinzler和Vogelstein，細胞，87，159(1996))。然而，據(jù)報道，不僅可在FAP中觀察到APC基因異常，也可在70至80％的偶發(fā)性結(jié)腸癌病例中觀察到APC基因異常。據(jù)認為，結(jié)腸癌的發(fā)生是由很多基因的連續(xù)突變引起的，所述基因包括K-ras，p53，DCC等，也包括APC。與其它基因相比，APC基因中的突變發(fā)生得最早，因此，據(jù)信APC基因的異常是結(jié)腸癌發(fā)生的主要事件。
為了闡明與APC基因異常相關的癌癥發(fā)生機制，必須測定基因產(chǎn)物APC蛋白的功能。據(jù)報道，大小約為300kDa的APC蛋白與細胞中的β-連環(huán)蛋白，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)以及DLG結(jié)合(Rubinfeld等，科學，262，1731(1993)；Su等，科學，262，1734(1993)；Rubinfeld等，科學，272，1023(1996)；Matsumine等，科學，272，1020(1996))。關于APC蛋白的功能，據(jù)報道，當在具有APC基因突變的結(jié)腸癌細胞系SW480中表達野生型APC蛋白時，β-連環(huán)蛋白的水平快速降低(Munemitsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，3046(1995))。含有7個重復結(jié)構(gòu)的中心區(qū)域是APC蛋白的功能所必需的，該區(qū)域與很多結(jié)腸癌病例中存在有突變的區(qū)域一致。另外，據(jù)報道在這些結(jié)腸癌細胞中，β-連環(huán)蛋白水平升高(Munemitsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，3046(1995)；Rubinfeld等，癌癥研究，57，4624(1997))。
另外，還已知β-連環(huán)蛋白是細胞粘著分子鈣粘著蛋白的膜-骨架蛋白，據(jù)報道，它還參與下述Wnt蛋白的信號轉(zhuǎn)導(Cadigan & Nusse，Genes Dev.，11，3286(1997))。Wnt基因是一個大基因家族，其成員在動物早期胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生過程中具有多種功能；在小鼠中，該家族由約20種基因組成，這些基因在多種動物中是保守的，所述動物包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)，果蠅(Drosophila melanogaster)和線蟲(Caenorhabditis elegans)。當Wnt蛋白結(jié)合受體Frizzled時，通過細胞內(nèi)信號分子Dishvelled(Dsh)抑制糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性。由于GSK-3β介導的β-連環(huán)蛋白磷酸化導致β-連環(huán)蛋白降解，因此，抑制GSK-3β活性可導致細胞中積累β-連環(huán)蛋白。β-連環(huán)蛋白結(jié)合屬于轉(zhuǎn)錄因子Lef/TCF家族的蛋白以形成復合物，從而將屬于Lef/TCF家族的蛋白激活為轉(zhuǎn)錄因子。因此，β-連環(huán)蛋白的積累導致β-連環(huán)蛋白/TCF復合物的形成，所述復合物轉(zhuǎn)運至核中，從而刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄。在屬于Lef/TCF家族的蛋白中，TCf-4在結(jié)腸上皮細胞中特異性表達，因此，據(jù)信在結(jié)腸癌中，β-連環(huán)蛋白主要與TCf-4形成復合物(Korinek等，科學，275，1784(1997))。另外，據(jù)報道在有些結(jié)腸癌細胞和黑素瘤細胞中，APC基因為野生型，但β-連環(huán)蛋白基因具有突變，且不受GSK-3β調(diào)節(jié)(Morin等，科學，275，1787(1997)；Rubinfeld等，科學，275，1790(1997))。據(jù)估計，在這些細胞中，β-連環(huán)蛋白不斷積累，導致由β-連環(huán)蛋白/TCF復合物引起的轉(zhuǎn)錄激活。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)蛋白在結(jié)腸癌的發(fā)生中起著舉足輕重的作用。因此，可將能通過與β-連環(huán)蛋白結(jié)合而抑制其功能的物質(zhì)與結(jié)腸癌的發(fā)生相聯(lián)系，這預示著該物質(zhì)可用于治療，診斷結(jié)腸癌。最近發(fā)現(xiàn)能結(jié)合β-連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)分子是Axin，Axin能負調(diào)節(jié)Wnt的信號轉(zhuǎn)導(Zeng等，細胞，90，181(1997))。Axin與GSK-3β結(jié)合，從而刺激β-連環(huán)蛋白的磷酸化(Ikeda等，EMBO J.，17，1371(1998))。另外，據(jù)報道，Axin也結(jié)合APC和β-連環(huán)蛋白以刺激β-連環(huán)蛋白的降解，進而降低細胞中的β-連環(huán)蛋白水平(Kishida等，生物化學雜志，273，10823(1998)；Rubinfeld等，當代生物學，8，573(1998)；Nakamura等，Genes to Cells，3，395(1998))。然而，目前已知的蛋白質(zhì)無一能與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，并直接影響β-連環(huán)蛋白/TCF復合物作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能通過結(jié)合β-連環(huán)蛋白來調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白/TCF復合物所致轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的DNA，識別該蛋白質(zhì)的抗體，含有所述蛋白質(zhì)或DNA的治療劑，和含有所述抗體的診斷試劑，它們都可用于治療和診斷癌癥。
本發(fā)明涉及下列主題(1)至(21)(1)一種蛋白質(zhì)，其具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的；(2)(1)所述的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列；(3)一種蛋白質(zhì)，其含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸被添加，缺失或取代，所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的；通過按核酸研究，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)；基因，34，315(1985)；核酸研究，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，488(1985)等所述，經(jīng)定點誘變在編碼含有SEQ ID NO2或4之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA中導入定點突變，即可實現(xiàn)上述氨基酸缺失，取代或添加。
(4)編碼(1)至(3)中任一項所述蛋白質(zhì)的DNA；(5)一種DNA，其含有選自SEQ ID NO1，3，5和6的核苷酸序列；(6)一種DNA，其在嚴緊條件下能與(4)或(5)的DNA雜交，并且能編碼一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的。
上述的“在嚴緊條件下能與(4)或(5)的DNA雜交，并且能編碼一種蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導)的DNA”指的是將具有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的DNA用作探針，經(jīng)菌落雜交，噬斑雜交，Southern印跡雜交等方法可以獲得的DNA。具體地說，所述DNA包括可通過下列方法鑒定的DNA，所述方法為在65℃，0.7至1.0mol/LNaCl的存在下，使用其上固定有得自菌落或噬斑的DNA的濾膜進行雜交，然后在65℃的條件下，用0.1x至2xSSC(檸檬酸鈉鹽水)溶液[1xSSC溶液(150mmol/LNaCl，15mmol/L檸檬酸鈉)；nX指的是n倍于此溶液濃度]洗滌濾膜?？筛鶕?jù)任何實驗手冊中所述的方法進行雜交，所述實驗手冊如J.Sambrook等，“分子克隆，實驗室手冊，第2版”，冷泉港實驗室出版社(1989)；F.M.Frederick等，“最新分子生物學方法，附錄1-38”，JohnWiley & Sons(1987-1997)；D.M.Glover和B.D.Hames“DNA克隆1核心技術(shù)，操作方法，第2版”，牛津大學出版社(1995)。
能雜交的DNA的具體例子包括與SEQ ID NO1或3的核苷酸序列具有至少80％或更高同源性的DNA，優(yōu)選為具有95％或更高同源性的DNA，此時，同源性是通過BLAST(分子生物學雜志，215，403(1990))，F(xiàn)ASTA(酶學方法，183，63(1990))或類似方法計算出的。
(7)重組DNA，所述DNA是通過將(4)至(6)中任一項所述DNA插入載體而得到的；(8)含有(7)所述重組DNA的轉(zhuǎn)化子；(9)生產(chǎn)(1)至(3)中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(8)所述的轉(zhuǎn)化子，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累(1)至(3)中任一項所述的蛋白質(zhì)，從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)；(10)癌癥治療劑，其中治療劑含有(1)至(3)中任一項所述的蛋白質(zhì)作為有效成分；(11)癌癥治療劑，其中治療劑含有(4)至(6)中任一項所述的DNA作為有效成分；(12)用于癌癥基因治療的載體，其中載體含有(4)至(6)中任一項所述的DNA；(13)含有由(4)至(6)中任一項所述DNA之核苷酸序列中的連續(xù)5至60個殘基組成的核苷酸序列的寡核苷酸，含有與該寡核苷酸序列互補之序列的寡核苷酸，或這些寡核苷酸的衍生物；(14)癌癥診斷試劑，其中診斷試劑含有(13)所述的寡核苷酸作為有效成分；(15)能識別(1)至(3)中任一項所述蛋白質(zhì)的抗體；
(16)免疫檢測(1)至(3)中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法利用了(15)所述的抗體；(17)免疫定量(1)至(3)中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法利用了(15)所述的抗體；(18)癌癥診斷試劑，其中診斷試劑含有(15)所述的抗體作為有效成分；(19)(10)或(11)所述的治療劑，其中癌癥是結(jié)腸癌；(20)(12)所述的載體，其中癌癥是結(jié)腸癌；和(21)(18)所述的診斷試劑，其中癌癥是結(jié)腸癌。
以下將詳細描述本發(fā)明。在下列描述中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)被稱為“β-連環(huán)蛋白和TCF的抑制劑(以下簡稱為ICAT)”，所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的。另外，將編碼ICAT的DNA簡稱為ICAT DNA。
I.制備ICAT DNA可通過酵母雙-雜種體系(S.Fields等，自然，340，245(1989))，由編碼ICAT的cDNA獲得ICAT DNA。換句話說，ICAT cDNA一般含有非翻譯區(qū)域，但本發(fā)明的ICAT DNA僅含有其編碼區(qū)?？赏ㄟ^分析ICAT cDNA的核苷酸序列將編碼區(qū)測定為開放閱讀框(ORF)區(qū)域(覆蓋框內(nèi)起始密碼子至終止密碼子的區(qū)域)。
酵母雙-雜種體系是檢測目的蛋白質(zhì)X(在此方法中一般稱其為“誘餌”)和蛋白質(zhì)Y之間的結(jié)合的方法，其中利用酵母轉(zhuǎn)錄因子Z，例如在蛋白質(zhì)分開的區(qū)域內(nèi)具有DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)的GAL4完成檢測。第一步制備的是用于在宿主酵母細胞中表達X和轉(zhuǎn)錄因子Z的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(以下稱之為BD-X)的質(zhì)粒(誘餌質(zhì)粒)，和另一種用于在宿主酵母細胞中表達Y和轉(zhuǎn)錄因子Z的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(以下稱之為AD-Y)的質(zhì)粒。將這兩種質(zhì)粒導入宿主酵母細胞中以共表達BD-X和AD-Y。所用宿主酵母是可在啟動子的調(diào)節(jié)下表達報道基因的酵母，其中通過轉(zhuǎn)錄因子Z與啟動子的結(jié)合來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活。當?shù)鞍踪|(zhì)Y能與蛋白質(zhì)X結(jié)合時，BD-X則能與AD-Y結(jié)合。由于所得復合物具有衍生自轉(zhuǎn)錄因子Z的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)，復合物與轉(zhuǎn)錄因子Z一樣，可導致報道基因的表達。因此，通過使用報道基因的表達作為標記即可檢測蛋白質(zhì)X和Y之間的結(jié)合。當在這種情況下，使用其中的每種cDNA(而不僅僅是Y)都能被表達成與Z的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的cDNA文庫來替代AD-Y表達質(zhì)粒，則可通過基于報道基因的表達篩選轉(zhuǎn)化子來分離含有cDNA的轉(zhuǎn)化子，所述cDNA編碼能與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y。此外，通過從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒，可以克隆到所需的cDNA。
下文將描述通過使用上述方法克隆ICAT cDNA的方案，其中誘餌X是小鼠β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域(下文簡稱為mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū))，而轉(zhuǎn)錄因子Z是酵母GAL4。
(1)制備誘餌質(zhì)粒在本發(fā)明中，將mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)(對應于小鼠β-連環(huán)蛋白的氨基酸序列141至664)用作誘餌。為了制備誘餌質(zhì)粒，必須得到編碼用作誘餌的mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的DNA(下文簡稱為mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA)。由于本領域技術(shù)人員已知小鼠β-連環(huán)蛋白DNA的完整核苷酸序列和其中的小鼠β-連環(huán)蛋白編碼區(qū)(GenBank登錄號M90364；科學，257，1142(1992))，因此，可以容易地識別對應于mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA的核苷酸序列。因此，可通過下文所述的RT-PCR法(M.J.McPherson等，“PCR，操作方法”，牛津大學出版社(1991))擴增和分離mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA。
具體地說，從表達β-連環(huán)蛋白的小鼠組織或細胞中分離RNA；由RNA合成cDNA；使用cDNA為模板，并使用對應于mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA核苷酸序列5’末端的有義引物，和含有與核苷酸序列3’末端互補的核苷酸序列的反義引物進行PCR。當將每種引物的5’末端設計成具有克隆載體的限制性酶識別位點序列以用于下文所述的誘餌質(zhì)粒時，即可通過利用限制性酶位點，將擴增片斷有效插入克隆載體以用于下文所述的誘餌質(zhì)粒。如果想使引物具有可用于克隆的限制性酶識別序列，可設計引物，使得轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的密碼子插入克隆載體時可與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的相應密碼子位于同一讀碼框內(nèi)。
載體(優(yōu)選在其中插入通過上述方法制備的mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA)包括能在釀酒酵母中復制的載體，其具有轉(zhuǎn)化所用的適當標記基因，例如氨基酸生物合成基因，如TRP1和LEU2，并可在酵母表達用啟動子，如醇脫氫酶(ADH)啟動子的調(diào)節(jié)下表達GAL4的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(下文簡稱為GAL4 BD)。在這種情況下，優(yōu)選使用具有下列特征的載體，所述載體在GAL4 BD的C末端部分具有可插入mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA的適當限制性酶位點，并且能在大腸桿菌(因其便于操作，例如便于純化載體DNA)中復制，另外還具有轉(zhuǎn)化大腸桿菌所用的可測標記，例如氨芐青霉素-抗性基因。這類載體包括pGBT9(Clontech)，pAS1(T.Durfee等，基因&發(fā)育，7，555(1993))，pAS2-1(Clontech)等。
分離上文所制備的mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)DNA，然后在密碼子框內(nèi)將其插入載體中GAL4 BD C-末端的限制性酶位點。
(2)制備cDNA文庫以表達與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白為了制備cDNA文庫以表達與GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，可優(yōu)選在釀酒酵母中復制所用載體，所述載體具有轉(zhuǎn)化所用的適當標記基因，例如酵母氨基酸生物合成基因，如TRP1和LEU2，并可在酵母表達用啟動子，如醇脫氫酶(ADH)啟動子的調(diào)節(jié)下表達GAL4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(下文簡稱為GAL4AD)。在這種情況下，優(yōu)選使用具有下列特征的載體，所述載體在GAL4 AD的C末端部分具有適當限制性酶位點，并且能在大腸桿菌(因其便于操作，例如便于純化載體DNA)中復制，另外還具有轉(zhuǎn)化大腸桿菌所用的可測標記，例如氨芐青霉素-抗性基因。這類載體包括pGAD(C.T.Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，9578(1991))，pGAD424(Clontech)，pACT(T.Durfee等，基因&發(fā)育，7，555(1993))，pACT2-1(Clontech)等。
據(jù)推測，能與細胞中的β-連環(huán)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)能在表達β-連環(huán)蛋白的細胞和組織中表達。因此，可以通過以下方法制備cDNA文庫，即由據(jù)推測可表達β-連環(huán)蛋白的小鼠組織和細胞制備cDNA，并將其插入用于表達融合蛋白的上述載體中的GAL4 AD C末端限制性酶位點。在這種情況下，當cDNA和GAL4AD的方向彼此相同，并且位于同一讀碼框中時，即可表達GAL4AD與cDNA所編碼蛋白質(zhì)的融合蛋白?；蛘撸梢允褂媚茉诮湍鸽p-雜種體系中使用的商用文庫，例如MATCHMAKER cDNA文庫(Clontech)。
(3)通過酵母雙-雜種體系篩選cDNA用于導入(1)中制備的誘餌質(zhì)粒和(2)中制備的cDNA文庫的酵母包括屬于釀酒酵母的酵母，其中導入了上述誘餌質(zhì)粒和cDNA文庫，另外，它還需要(a)導入的質(zhì)粒中用于轉(zhuǎn)化的標記基因和宿主中對應于雙-雜種體系所用轉(zhuǎn)錄因子GAL4基因的基因由于缺失或突變而不能被表達；和(b)已將與GAL4 BD結(jié)合的核苷酸序列插入適當報道基因的啟動子區(qū)域。在此情況下，優(yōu)選使用一種報道基因，當通過與誘餌結(jié)合來啟動所述基因的轉(zhuǎn)錄時，易于檢測到這種轉(zhuǎn)錄，所述基因如氨基酸生物合成的基因，如HIS3等(在此情況下，基因應該不同于用作轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒所用標記的基因)，可在酵母中檢測的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因lacZ等。例如，宿主酵母包括釀酒酵母CG1945菌株(Clontech)，Y153菌株(基因&發(fā)育，7，555(1993))，CGY1∷171菌株(細胞，51，121(1987))，HF7C菌株(Clontech)等。
可將(1)中制備的誘餌質(zhì)粒和(2)中制備的cDNA文庫導入該宿主酵母，以通過使用報道基因的表達作為標記選擇含有cDNA的轉(zhuǎn)化子，所述cDNA編碼能與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)結(jié)合的蛋白質(zhì)。例如，當將用于組氨酸生物合成的HIS3基因用作報道基因時，可選擇在不含組氨酸的基礎培養(yǎng)基上生長的菌落，或者，當將大腸桿菌lacZ基因用作報道基因時，可選擇在X-gal的存在下表現(xiàn)為藍色的菌落。
由于所選擇的轉(zhuǎn)化子菌落含有兩種類型的質(zhì)粒，即誘餌質(zhì)粒和cDNA文庫，根據(jù)參考文獻(“DNA克隆2，表達系統(tǒng)，操作方法，第2版”，牛津大學出版社(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.，88，9578(1991))所述的方法僅分離cDNA文庫質(zhì)粒。具體地說，從菌落中分離質(zhì)粒，然后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。此時，所用宿主大腸桿菌是不表達cDNA文庫中所含標記基因，因而在經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株中可檢測到基因表達的菌株。從轉(zhuǎn)化子中選擇表達cDNA文庫中所含標記基因的一些轉(zhuǎn)化子，從選擇的轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA以獲得cDNA克隆。
(4)分析cDNA克隆的核苷酸序列通過使用完整的cDNA克隆，或者在用適當限制性酶切下cDNA組成成分的片斷，并將其亞克隆至適當克隆載體，如pUC118之后，用常用的分析核苷酸序列的方法，例如Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977))的雙脫氧-測序法或Perkin Elmer等提供的DNA測序儀，即可測定(3)中所得cDNA克隆的核苷酸序列。
通過在使用同源性檢索程序，如BLAST檢索核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，如GenBank，EMBL和DDBJ時證實cDNA序列未與數(shù)據(jù)庫中存儲的已知基因的核苷酸序列表現(xiàn)出顯著的同源性，可以認為所得cDNA的核苷酸序列是新的。
如果核苷酸序列是新的，那么，如(2)中所述，(3)中所得的cDNA克隆應該編碼融合蛋白，其中ICAT與GAL4AD的C-末端在框內(nèi)相連。因此，通過在與GAL4 AD的翻譯讀碼框相同的框內(nèi)，在終止密碼子的下游將所揭示的cDNA的核苷酸序列翻譯成相應的氨基酸序列，即可推導出由cDNA編碼的ICAT氨基酸序列。
另外，通過用同源性檢索程序，例如BLAST，F(xiàn)ASTA和FrameSearch在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，例如Genpept，PIR和Swiss-Prot中對該氨基酸序列進行檢索，可以選擇出與cDNA所編碼的蛋白質(zhì)具有同源性的已知基因。
然而，所得cDNA可僅含有全長ICAT cDNA的起始密碼子的下游部分，因為如下文實施例11所述，甚至當ICATN-末端的12個氨基酸缺失時，ICAT也可與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)結(jié)合。在這種情況下，在通過用下文(5)中所述的方法獲得全長ICAT cDNA之后，通過使用與所得ICAT的氨基酸相同的讀碼框測定出ORF區(qū)域，從而揭示出完整的ICAT氨基酸序列；可將ORF區(qū)域用作ICAT DNA。另外，只要它們能編碼ICAT的完整氨基酸序列，ICATDNA中的各個密碼子的核苷酸序列并不局限于與cDNA中的密碼子相同，它可以使用任何編碼相同氨基酸的密碼子的核苷酸序列。
按上述所得的新cDNA包括例如編碼含有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的cDNA。
(5)克隆全長cDNA當根據(jù)(4)中的核苷酸序列分析，以及按下文所述用Northern印跡雜交得到的mRNA的長度信息推測出(3)中所得ICAT cDNA的長度不是全長時，可通過下列方法制備全長ICAT cDNA。
(5-1)篩選cDNA文庫將(3)中所得的完整cDNA或其部分用作探針，通過菌落雜交或噬斑雜交篩選出(2)中制備的，表達融合蛋白的cDNA文庫，或者由表達β-連環(huán)蛋白，據(jù)信還同時表達ICAT的組織或細胞制備的cDNA文庫，或者按下文所述用Northern印跡可檢測到β-連環(huán)蛋白mRNA的細胞制備的cDNA文庫，然后在陽性克隆中選擇據(jù)信為全長的cDNA克隆。通過J.Sambrook等，“分子克隆，實驗室手冊，第2版”，冷泉港實驗室出版社(1989)所述的方法或其它方法可進行cDNA文庫的制備和雜交?；蛘?，可以使用來自Clontech或其它公司的商用cDNA文庫。通過按照與(4)中所述相同的方法測定所得cDNA克隆的核苷酸序列，可以揭示出小鼠ICAT cDNA的完整核苷酸序列，并且揭示出小鼠ICAT的完整氨基酸序列。
(5-2)RACE由據(jù)推測可表達ICAT的組織或細胞制備互補DNA，然后在cDNA的兩個末端添加銜接子寡核苷酸。通過5’-RACE或3’-RACE(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998(1988))可得到互補的DNA片斷，該片斷含有(3)中所得cDNA的延伸至5’或3’方向的部分，其中使用來自所述銜接子的核苷酸序列的引物，和根據(jù)(3)中所得cDNA克隆的核苷酸序列設計的引物進行PCR。
也可以按照與(4)相同的方法，通過測定所得cDNA的核苷酸序列，然后基于所測定的核苷酸序列，將所得cDNA和(3)中所得cDNA克隆彼此相連，籍此提供全長ICAT cDNA。
(5-3)使用EST核苷酸序列當通過在公共核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中檢索同源性來分析(4)中測定的ICAT cDNA的核苷酸序列時，即使在已知基因中沒有相同的核苷酸序列，在隨機cDNA克隆的部分序列EST中仍可發(fā)現(xiàn)與所述cDNA序列相同的序列。此時，將這些EST和其它含有與該EST相同的核苷酸序列的EST，以及得自同一克隆的EST全部集中到一起，作為得自同一基因的EST。有時，通過裝配這些據(jù)信得自ICAT cDNA的EST的核苷酸序列，可以發(fā)現(xiàn)與(3)中所得的cDNA相比在5’或3’方向延伸得更長的核苷酸序列。在這種情況下，通過RT-PCR即可獲得位于(4)中所得cDNA核苷酸序列5’或3’方向的cDNA延伸部分，所述PCR使用了具有得自經(jīng)裝配EST的核苷酸序列的5’末端核苷酸序列的有義引物，或具有與所述EST 3’末端的核苷酸序列互補的核苷酸序列的反義引物。在RT-PCR中，可將互補DNA或得自據(jù)推測可表達ICAT的小鼠組織或細胞的cDNA文庫用作模板。按照與(4)中所述相同的方法測定所得cDNA的核苷酸序列。當在公共核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中得到很多據(jù)信得自小鼠ICAT cDNA的EST時，無需使用RT-PCR，通過裝配收集的EST核苷酸序列即可揭示出小鼠ICAT的全長cDNA核苷酸序列。
另外，一旦按上述揭示出ICAT cDNA的全長核苷酸序列，可按照與(3)中所述相同的方法，將制備自據(jù)推測可表達ICAT的小鼠組織或細胞的cDNA或cDNA文庫用作模板，并使用根據(jù)cDNA的核苷酸序列設計的引物進行PCR，從而獲得ICAT cDNA。已于1999年4月14日將含有所得小鼠ICAT cDNA克隆pmICAT的轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH5α/pmICAT保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣茨城市1-1-3，郵編305-8566)，保藏號為FERM BP-6701。
另外，可以根據(jù)按上述測定的ICAT cDNA的核苷酸序列，在DNA合成儀中化學合成ICAT DNA。所述DNA合成儀包括購自Perkin Elmer的，利用亞磷酰胺法的392型DNA合成儀等。
(6)分離編碼人ICAT的DNA為了分析人結(jié)腸癌發(fā)生的機理以及為了治療和診斷癌癥，更重要的是獲得人ICAT或編碼DNA(下文簡稱為人ICAT DNA)，而不是小鼠ICAT。一般說來，得自不同物種，但具有相同功能的蛋白質(zhì)經(jīng)常具有不同的氨基酸序列，但這些序列之間表現(xiàn)出同源性。因此，據(jù)信編碼蛋白質(zhì)的DNA之間也會表現(xiàn)出同源性。另外，在生物進化過程中，突變在基因中積累，因此，可以設想物種的系統(tǒng)發(fā)育譜系越近，同源性就會越高。因此，通過根據(jù)下文所述的方法，利用(3)中所得的小鼠ICAT DNA的核苷酸序列，即可從其它哺乳動物，例如人ICATDNA中獲得ICATDNA。無需獲得小鼠ICATDNA，也可按照與(1)至(5)所述相同的方法直接獲得人ICAT DNA，所述方法為具有誘餌質(zhì)粒和人cDNA文庫的酵母雙-雜種體系，其中人β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域(細胞生物學雜志，127，2601(1994))被用作誘餌。
(6-1)篩選cDNA文庫由于人ICAT被設想為與小鼠ICAT具有相同的功能，據(jù)推測，人ICAT與小鼠ICAT在相同的組織和細胞中表達。因此，可以根據(jù)與(5-1)所述相同的方法，通過使用經(jīng)放射性同位素，地高辛配基等標記的小鼠ICAT DNA為探針，進行菌落雜交或噬斑雜交，從cDNA文庫，例如制備自等同于表達小鼠ICAT的小鼠組織的人組織，或制備自得自這種人組織的細胞的cDNA文庫，或者從可商購的，得自所述人組織或細胞的人cDNA文庫中獲得人ICAT的cDNA克隆。
(6-2)使用EST使用同源性檢索程序檢索公共核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，如GenBank，以尋找與(4)中所得小鼠ICAT DNA的核苷酸序列表現(xiàn)出同源性的人EST。據(jù)認為，這種與小鼠ICAT DNA表現(xiàn)出同源性的EST得自人ICAT cDNA，因此，通過裝配EST的核苷酸序列，至少可獲得人ICAT cDNA的部分核苷酸序列。在用于測定EST核苷酸序列的克隆中，得自基因組表達聚生體的整合分子分析(I.M.A.G.E.Consortium)以及基因組研究所(TIGR)的克隆來自ATCC。通過裝配根據(jù)EST的核苷酸序列，被認為含有人ICAT cDNA的5’末端，3’末端或中間部分的所得cDNA克隆，也可獲得覆蓋整個人ICAT cDNA的cDNA克隆。已于1999年4月14日將含有所得全長人ICAT cDNA克隆phICAT的轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH5α/phICAT保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣茨城市1-1-3，郵編305-8566)，保藏號為FERMBP-6700。
通過按照與(3)中所述相同的方法進行RT-PCR擴增，也可以獲得人ICAT cDNA，所述PCR使用了對應于人ICAT cDNA核苷酸序列的3’末端和5，末端的引物，并且使用了制備自據(jù)推測可表達ICAT的人組織或細胞的RNA作為模板。
將人ICAT DNA測定為根據(jù)上述方法獲得的全長人ICAT cDNA的ORF區(qū)域。即使存在很多ORF，仍可將與小鼠ICAT cDNA中的確定ORF具有同源性的ORF選擇為人ICAT DNA，原因是小鼠ICAT和人ICAT具有氨基酸序列同源性?？蓪⑷薎CAT的氨基酸序列測定為由ORF編碼的氨基酸序列。
(7)制備ICAT寡核苷酸可在(5)中所述的DNA合成儀中制備寡核苷酸，所述寡核苷酸含有本發(fā)明ICAT DNA的部分序列，或具有與該序列互補的核苷酸序列(下文簡稱為ICAT寡核苷酸)。
具體地說，ICAT寡核苷酸包括具有與SEQ ID NO1或3的核苷酸序列中的連續(xù)5至60個核苷酸相同之序列的DNA，或具有與所述DNA互補之序列的DNA。當用作有義引物或反義引物時，優(yōu)選這些DNA是解鏈溫度和核苷酸數(shù)目相差不大的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸包括寡核苷酸的任何衍生物(下文也稱寡核苷酸衍生物)。寡核苷酸衍生物的例子有寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯鍵已被轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼姿狨ユI；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯鍵已被轉(zhuǎn)變?yōu)镹3’-P5’氨基磷酸酯鍵；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中位于核糖和磷酸之間的磷酸二酯鍵已被轉(zhuǎn)變?yōu)殡?核酸鍵；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶已被C-5丙炔基尿嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶已被C-5噻唑尿嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶已被C-5丙炔基胞嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶已被經(jīng)吩惡嗪-修飾的胞嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖已被2’-O-丙基核糖所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖已被2’-甲氧基乙氧基核糖所取代(細胞技術(shù)，16，1463(1997))。
2.產(chǎn)生ICAT通過根據(jù)“分子克隆，實驗室手冊，第2版”(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社(1989))，“DNA克隆1核心技術(shù)，操作方法，第2版”(D.M.Glover和B.D.Hames，牛津大學出版社(1995))等所述的方法，在宿主細胞中表達按照第1節(jié)的內(nèi)容制備的ICAT DNA，即可產(chǎn)生本發(fā)明的ICAT。
具體地說，通過制備重組載體(其中已將ICAT DNA插入適當表達載體的啟動子下游)，將該載體導入宿主細胞以得到表達ICAT的轉(zhuǎn)化子，然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，即可生產(chǎn)本發(fā)明的ICAT。
所用表達載體是能自我復制，或整合至宿主細胞染色體中，并含有能在宿主細胞中介導ICAT DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的啟動子的載體。
可以使用任何宿主細胞，包括原核細胞，酵母細胞，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞等，只要細胞可表達所需基因即可。也可以使用動物個體和植物體。
當將原核細胞，例如細菌用作宿主細胞時，所用ICAT表達載體應能在宿主原核細胞中自我復制，其中已將ICAT DNA置于含有核糖體-結(jié)合序列的啟動子的下游。優(yōu)選已適當調(diào)節(jié)核糖體-結(jié)合序列與起始密碼子之間的距離(例如，對大腸桿菌宿主而言為6至18個核苷酸)。優(yōu)選將轉(zhuǎn)錄終止序列置于緊接ICAT DNA下游的位置，但在本發(fā)明中這并不是必需的。另外，載體應該被設計成含有表達標記基因，如藥物抗性基因所需的序列以便于選擇轉(zhuǎn)化子。
可使用任何啟動子，只要它能介導宿主細胞中的表達即可。例如，當宿主為大腸桿菌時，啟動子包括得自大腸桿菌和噬菌體的啟動子，例如trp啟動子(Ptrp)，lac啟動子(Plac)，PL啟動子，T7啟動子，PR啟動子等。也可以使用人工設計的或經(jīng)修飾的啟動子，例如兩個Ptrp彼此串聯(lián)的啟動子，tac啟動子，T7-lac啟動子，let I啟動子等。當宿主為枯草芽孢桿菌時，啟動子包括得自枯草芽孢桿菌噬菌體SPO1和SPO2的啟動子以及PenP啟動子。
表達載體的例子有pSE280(Invitrogen)，pGEMEX-1(Promega)，pQE-8(QIAGEN)，pKYP200(農(nóng)業(yè)生物化學，48，669(1984))，pLSA1(農(nóng)業(yè)生物化學，53，277(1989))，pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))，pBluescript II SK(-)(Stratagene)，pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)，pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)和pET14(Novagen)。
宿主細胞可以是屬于埃希氏菌屬，沙雷氏菌屬，芽孢桿菌屬，短桿菌屬，棒狀桿菌屬，微桿菌屬，假單胞菌屬的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue，大腸桿菌XL2-Blue，大腸桿菌DH1，大腸桿菌MC1000，大腸桿菌KY3276，大腸桿菌W1485，大腸桿菌JM109，大腸桿菌HB101，大腸桿菌No.49，大腸桿菌W3110，大腸桿菌NY49，無花果沙雷氏菌，居泉沙雷氏菌，液化沙雷氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，產(chǎn)氨短桿菌，Brevibacterium immariophilum ATCC14068，解糖短桿菌ATCC 14066，谷氨酸棒桿菌ATCC13032，谷氨酸棒桿菌ATCC14067，谷氨酸棒桿菌ATCC13869，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，嗜氨微桿菌ATCC15354，假單胞菌菌株D-0110。
可以使用任何導入重組載體的方法，只要這種方法能將DNA導入上述宿主細胞即可。所述方法包括例如電穿孔(核酸研究，16，6127(1988))，使用鈣離子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))，原生質(zhì)體法(日本公開未審專利申請248394/88)或基因，17，107(1982)或分子&普通遺傳學，168，111(1979)中所述的其它方法。
當酵母被用作宿主細胞時，所用表達載體包括含有以下組成元件的載體即含有能介導宿主酵母中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，ICAT DNA，轉(zhuǎn)錄終止序列和能在酵母中表達轉(zhuǎn)化用標記基因(例如藥物抗性基因和氨基酸生物合成基因，如TRP1，HIS3和LEU2)的序列。另外，優(yōu)選使用能自我復制并能表達藥物抗性基因的表達載體，所述藥物抗性基因可用作轉(zhuǎn)化大腸桿菌的標記，以便于制備和維持載體。
可使用任何啟動子，只要它能介導酵母中的轉(zhuǎn)錄即可。所述啟動子包括例如醇脫氫酶基因ADH1和參與半乳糖代謝的基因，如GAL1，GAL10等的啟動子，酸性磷酸酶基因PHO5的啟動子，磷酸甘油酸激酶基因PGK的啟動子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAP的啟動子，熱激蛋白基因的啟動子，α-交配因子基因MFα1的啟動子，和得自釀酒酵母的銅-金屬硫蛋白基因CUP1的啟動子以及得自巴斯德畢赤氏酵母的醇氧化酶基因AOX1的啟動子。
宿主細胞包括屬于糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬等的酵母菌株，具體包括釀酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母，產(chǎn)朊假絲酵母等。
可以使用任何導入重組載體的方法，只要所述方法能將DNA導入酵母即可。所述方法包括例如電穿孔(酶學方法，194，182(1990))，原生質(zhì)球方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4889(1984))，醋酸鋰法(細菌學雜志，153，163(1983))等。
當將動物細胞用作宿主時，所用表達載體包括含有以下組成元件的載體即含有能介導宿主動物細胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，ICAT DNA，用于轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化的信號序列。另外，優(yōu)選使用能自我復制并能表達藥物抗性基因的表達載體，所述藥物抗性基因可用作轉(zhuǎn)化大腸桿菌的標記，以便于制備和維持載體?？墒褂萌魏螁幼?，只要它能介導動物細胞中的轉(zhuǎn)錄即可。所述啟動子包括得自病毒的序列，例如SV40早期啟動子，人巨細胞病毒IE(即早期)基因的啟動子和增強子元件，源自逆轉(zhuǎn)錄病毒，如Rous肉瘤病毒，人T細胞白血病病毒I，Moloney鼠白血病病毒等的LTR；或得自動物細胞的基因的啟動子，所述基因如金屬硫蛋白基因，β-肌動蛋白基因，延伸因子-1等。另外，還可以使用將如上所述的多個啟動子元件連接在一起而形成的人工啟動子，例如通過將SV40早期啟動子和人T細胞白血病病毒I的LTR相互連接而形成的SRα啟動子。
通過將ICAT表達載體導入宿主細胞，其中所述載體含有用于表達抗藥物(如G418或潮霉素)的藥物抗性基因的序列，并在藥物的存在下培養(yǎng)細胞，即可選擇出其中ICAT DNA已整合至宿主染色體DNA，并且能組成型表達ICAT的細胞。另外，為了增加宿主細胞中所產(chǎn)生的ICAT的量，可將組成型表達ICAT的載體導入宿主細胞，所述載體含有能表達二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的序列，培養(yǎng)細胞，同時連續(xù)增加作為dhfr抑制劑的氨甲碟呤的濃度；因此，可以成功地擴增ICAT DNA以及dhfr基因的拷貝數(shù)。利用dhfr基因已達到基因擴增目的的宿主細胞可以是含無功能的dhfr基因的細胞，例如CHO/dhfr-(ATCCCRL-9096)等。
用于制備上述ICAT表達載體的載體具體包括例如pAGE107(日本公開未審專利申請22979/91；細胞技術(shù)，3，133(1990))，pAS3-3(227075/90)，pCDM8(自然，329，840(1987))，pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，pREP4(Invitrogen)，pBK-RSV(Stratagene)，pSVK3(Amersham Pharmacia Biotech)，pcDNA1.1/Amp(Invitrogen)，pAMo(生物化學雜志，268，22782(1993))等。
宿主細胞包括細胞系，例如得自人的細胞，HeLa和Namalwa以及人腎細胞系293(ATCCCRL-1573)；非洲綠猴腎細胞COS-1和COS-7；倉鼠CHO和BHK細胞；小鼠骨髓瘤的SP2/0和NS0細胞，大鼠骨髓瘤細胞YB2/0。
可使用任何導入重組載體的方法，只要所述方法能將DNA導入動物細胞即可。所述方法包括例如電穿孔(細胞技術(shù)，3，133(1990))，磷酸鈣法(日本公開未審專利227075/90)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))等。
當將昆蟲細胞用作宿主細胞時，可利用桿狀病毒表達系統(tǒng)(桿狀病毒表達載體，實驗室手冊，W.H.Freeman和Company，紐約(1992)，生物技術(shù)，6，47(1988))。具體地說，將ICAT DNA插入被稱為轉(zhuǎn)移載體的載體之后，同時將載體和桿狀病毒導入昆蟲細胞；所得同源重組提供了重組桿狀病毒，其中ICAT DNA已插入多角體基因啟動子的下游，所述啟動子是高效啟動子；然后將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染至昆蟲細胞，從而獲得ICAT表達。
所用桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，家蠶核型多角體病毒等。所用昆蟲細胞可以是得自草地夜蛾的細胞Sf9和Sf21(桿狀病毒表達載體，實驗室手冊，紐約(1992))，得自粉蚊夜蛾的細胞High5(Invitrogen)等。或者，也可以使用幼蠶本身。轉(zhuǎn)移載體含有多角體蛋白啟動子和得自桿狀病毒，用于介導同源重組的序列，以及用于維持和復制載體及插入外源基因的序列(能在大腸桿菌中自我復制的序列和藥物抗性基因的序列)，和便于在大腸桿菌中進行基因操作的序列。具體地說，所述載體包括pVL1392，pVL1393，pBluebac4(皆得自Invitrogen)等。
通過使用動物個體可產(chǎn)生ICAT。例如，可在已根據(jù)已知方法(美國臨床營養(yǎng)雜志，63，639S(1996)；美國臨床營養(yǎng)雜志，63，627S(1996)；生物技術(shù)，9，830(1991))導入ICAT DNA的動物體中生產(chǎn)ICAT。
可使用任何啟動子，只要該啟動子能介導動物中的表達即可。例如，可優(yōu)選使用乳腺細胞特異性的啟動子，如α-酪蛋白啟動子，β-酪蛋白啟動子，β-乳球蛋白啟動子，乳清酸性蛋白啟動子等。
當將植物細胞或植物體用作宿主時，可根據(jù)已知方法(組織培養(yǎng)，20(1994)；組織培養(yǎng)，21(1995)；生物技術(shù)趨勢，15，45(1997))生產(chǎn)ICAT。
可使用任何能表達ICAT DNA的啟動子，只要該啟動子能介導植物細胞中的基因表達即可。所述啟動子包括例如花椰菜花葉病毒35S啟動子，水稻肌動蛋白-1啟動子等。另外，可將玉米醇脫氫酶基因的內(nèi)含子1插入啟動子和待表達的ICAT DNA之間以增加ICAT DNA的表達效力。
宿主細胞可以是得自馬鈴薯，煙草，玉米，水稻，油菜，大豆，番茄，小麥，大麥，黑麥，苜蓿，亞麻等的植物細胞。
可以使用任何能導入重組載體的方法，只要所述方法能將DNA導入植物細胞即可。所述方法包括例如，使用農(nóng)桿菌，電穿孔(細胞技術(shù)，3，133(1990))的方法，使用微粒槍(基因槍)的方法等。
可使用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)其中已導入ICAT DNA的植物細胞或器官。也可以再生含有導入基因的植物細胞，以產(chǎn)生其中已導入ICAT DNA的植物體(轉(zhuǎn)基因植物)。
可根據(jù)一般的培養(yǎng)方法培養(yǎng)含有重組載體的微生物，動物細胞或得自植物細胞的轉(zhuǎn)化體，所述重組載體含有本發(fā)明的ICAT DNA作為插入物，ICAT可以在這些細胞中積累，從培養(yǎng)物中回收ICAT以生產(chǎn)ICAT。
用于培養(yǎng)通過使用動物細胞作為宿主而獲得的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基包括常用的RPMI1640培養(yǎng)基(美國醫(yī)學協(xié)會雜志，199，519(1967))，Eagle MEM(科學，122，501(1952))，DMEM(病毒學，8，396(1959))，199培養(yǎng)基(生物藥物學會會議匯編，73，1(1950))，和含有胎牛血清的這些培養(yǎng)基等。必要時，可在培養(yǎng)基中加入抗生素，例如青霉素或鏈霉素。通常，可在例如5％CO2的存在下，于30至40℃，pH6至8的條件下培養(yǎng)1至7天。
用于培養(yǎng)通過使用昆蟲細胞作為宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基包括常用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen)，Sf-900 II SFM培養(yǎng)基(Life-Technologies)，ExCell400，ExCell405(皆得自JRH Biosciences)，Grace昆蟲培養(yǎng)基(自然，195，788(1962))。在優(yōu)選的培養(yǎng)條件下，pH是6至7；培養(yǎng)溫度是25至30℃，培養(yǎng)一般持續(xù)1至5天。另外，必要時，可在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基中加入抗生素，如慶大霉素。
當轉(zhuǎn)化子是動物個體或植物體時，可以根據(jù)一般方法，通過飼養(yǎng)或培育轉(zhuǎn)化子，使ICAT在其中積累并從動物個體或植物體中回收ICAT來生產(chǎn)ICAT。
具體地說，對動物個體而言，例如，可以通過飼養(yǎng)含有ICAT DNA的非-人轉(zhuǎn)基因動物，在動物體中產(chǎn)生并積累由重組DNA編碼的ICAT，并從動物中回收ICAT來生產(chǎn)ICAT。動物中生產(chǎn)和積累ICAT的位點包括例如動物的乳汁或卵。
對植物體而言，例如，可以通過培育含有ICAT DNA的轉(zhuǎn)基因植物，在植物中產(chǎn)生并積累由重組DNA編碼的ICAT，并從植物中回收ICAT來生產(chǎn)ICAT。
任何天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基都可用于培養(yǎng)以諸如大腸桿菌的原核生物或諸如酵母的真核生物為宿主而獲得的轉(zhuǎn)化子，只要所述培養(yǎng)基含有碳源，氮源，無機鹽等生物可同化的物質(zhì)，轉(zhuǎn)化子可在其中有效培養(yǎng)即可。
可以使用任何生物可同化的碳源，包括葡萄糖，果糖，蔗糖和含有它們的糖蜜；諸如淀粉和淀粉水解物的碳水化合物；諸如乙酸和丙酸的有機酸；諸如乙醇和丙醇的醇類。
可以利用的氮源包括氨，無機酸的銨鹽，如氯化銨，硫酸銨，醋酸銨，磷酸銨或有機酸的銨鹽，其它含氮化合物，以及蛋白胨，肉提取物，酵母提取物，玉米浸膏，酪蛋白水解物，豆餅和豆餅水解物，多種發(fā)酵微生物及其消化物。
所述無機物質(zhì)包括磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉，硫酸鐵，硫酸錳，硫酸銅，碳酸鈣等。
一般在需氧條件下進行培養(yǎng)，例如通過振蕩培養(yǎng)或深度-需氧攪拌培養(yǎng)。優(yōu)選在15至40℃進行培養(yǎng)，一般培養(yǎng)16至96小時。在培養(yǎng)過程中應將pH維持在3.0至9.0。通過使用無機或有機酸，堿溶液，尿素，碳酸鈣，氨等進行pH的調(diào)節(jié)。必要時，可在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中加入抗生素，如氨芐青霉素或四環(huán)素。
在培養(yǎng)被使用誘導型啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，必要時，可在培養(yǎng)基中加入誘導物。例如，當培養(yǎng)被使用lac啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可在培養(yǎng)基中加入IPTG等；當培養(yǎng)被使用trp啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可在培養(yǎng)基中加入吲哚乙酸等。
可使用下列分離和純化蛋白質(zhì)的一般方法分離和純化上述轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中積累的ICAT。
當細胞分泌ICAT時，培養(yǎng)基中積累了ICAT。因此，在培養(yǎng)完成之后，可通過諸如離心分離的技術(shù)僅回收已除去細胞的培養(yǎng)基。通過單獨或聯(lián)合使用分離和純化蛋白質(zhì)的一般方法，可從培養(yǎng)基中獲得純化的樣品；具體地說，可使用溶劑提取，使用硫酸銨等進行鹽析，脫鹽，有機-溶劑沉淀，使用諸如DEAE Sepharose，DIAION HPA-75(三菱化成)，Mono-Q(AmershamPharmacia Biotech)等樹脂的陰離子交換層析，使用諸如SPSepharose(Amersham Pharmacia Biotech)等樹脂的陽離子交換層析，使用諸如丁基-Sepharose，苯基-Sepharose的樹脂的疏水層析，使用分子篩的凝膠過濾，親和層析，層析聚集，諸如等電聚焦等的電泳技術(shù)。
當ICAT在轉(zhuǎn)化子細胞中積累時，在培養(yǎng)完成之后，通過離心等技術(shù)從培養(yǎng)物中回收轉(zhuǎn)化子細胞，隨后懸浮于緩沖液中，然后使用超聲發(fā)生器，弗氏細胞壓碎器等破碎細胞，產(chǎn)生無-細胞提取物。當ICAT可溶于細胞時，可按照與從上述培養(yǎng)基中純化和分離蛋白質(zhì)所用方法相同的方法，在離心無細胞提取物之后，從上清液中獲得純化的樣品?；蛘?，當ICAT以包涵體的形式存在于細胞中時，可以通過離心來處理無細胞提取物，然后回收作為沉淀組分的ICAT包涵體。用蛋白質(zhì)變性劑溶解所述ICAT包涵體，然后透析所得溶液，使其不含蛋白質(zhì)變性劑，或者進行透析或稀釋，以使如此低水平的蛋白質(zhì)變性劑不能變性蛋白質(zhì)，從而恢復ICAT的天然三級結(jié)構(gòu)。隨后，通過按照與上述相同的分離和純化方法獲得純化的樣品。
另外，根據(jù)已知方法(生物分子NMR雜志，6，129-134，科學，242，1162-1164，生物化學雜志，110，166-168(1991))，通過體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)ICAT。具體地說，將ICAT DNA連接至啟動子(如SP6，T7或T3)的下游，使特異于每個啟動子的RNA聚合酶與所述啟動子反應，以在體外合成大量ICAT RNA，然后通過無細胞反應系統(tǒng)，如利用兔網(wǎng)織紅細胞裂解物或小麥胚芽提取物的翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)ICAT。
可通過蛋白質(zhì)化學中常用的方法，例如“基因克隆的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析”(平野久著，東京化學同人發(fā)行，1993)中所述的方法進行純化ICAT的結(jié)構(gòu)分析。
通過在第1節(jié)所述酵母雙-雜種體系中使用融合蛋白表達載體(所述融合蛋白為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與所述DNA編碼的每種蛋白的融合蛋白)，以及通過使用β-連環(huán)蛋白的誘餌質(zhì)粒，可評價是否檢測到了報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而測定由ICAT或ICAT衍生物(有氨基酸序列的取代，缺失或添加)與β-連環(huán)蛋白和TCF/Lef家族的蛋白的復合物的是否進行了結(jié)合?；蛘?，在體外直接將ICAT或其衍生物與β-連環(huán)蛋白混合，讓它們相互結(jié)合，或者在細胞中表達ICAT或其衍生物并使它們在細胞中結(jié)合，然后通過使用抗β-連環(huán)蛋白的抗體對反應溶液或細胞提取物進行免疫沉淀；再通過Western印跡等評價沉淀物中ICAT或其衍生物的存在，從而測定結(jié)合的存在。或者，不使用抗體，而制備融合蛋白，所述融合蛋白由ICAT或其衍生物和諸如GST的蛋白質(zhì)或肽組成以便于純化，使融合蛋白與經(jīng)標記(如經(jīng)35S標記)的β-連環(huán)蛋白結(jié)合；純化ICAT融合蛋白之后，檢測純化物中經(jīng)標記β-連環(huán)蛋白的存在以測定結(jié)合的存在。
另外，通過使用質(zhì)?？梢詼y定是否不僅僅有ICAT或其衍生物能結(jié)合β-連環(huán)蛋白和屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)的復合物，并且也能抑制轉(zhuǎn)錄激活復合物的活性，所述質(zhì)粒中的報道基因，如螢光素酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或β-半乳糖苷酶基因被置于啟動子的下游，所述啟動子含有TCF結(jié)合序列，使得轉(zhuǎn)錄能被β-連環(huán)蛋白和屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)的復合物激活，所述質(zhì)粒如pTOPFLASH和pTOPCAT(科學，275，1784(1997))。將上述具有報道基因的表達質(zhì)粒與突變β-連環(huán)蛋白的表達質(zhì)粒一起導入動物細胞，所述突變β-連環(huán)蛋白總能與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)結(jié)合，因此可以激活轉(zhuǎn)錄，例如其中的絲氨酸殘基33已被酪氨酸取代的突變β-連環(huán)蛋白；進一步加入或不加ICAT或其衍生物的表達質(zhì)粒，然后分析報道基因的表達水平，并比較這兩種情況，從而測定ICAT或其衍生物是否能抑制轉(zhuǎn)錄激活。
3.制備識別ICAT的抗體(1)制備多克隆抗體可將通過上文第2節(jié)所述方法獲得的全長ICAT或蛋白質(zhì)的部分片段用作抗原，并施用于動物以制備多克隆抗體。
可用于免疫接種的動物包括兔，山羊，大鼠，小鼠，倉鼠等。優(yōu)選以50至100μg/每只動物的接種劑量使用抗原。
當使用肽進行免疫接種時，優(yōu)選與諸如KLH或牛甲狀腺球蛋白的載體蛋白共價相連之后，再將肽用作抗原。
在第一次接種之后，以1至2周的間隔施用抗原3至10次。每次接種后3至7天，從眼底靜脈叢采集血液。然后通過使用酶免疫測定法(“酶免疫測定法(ELISA)”醫(yī)學書院，1976；“抗體實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版社(1988))等來檢測血清與免疫用抗原的反應性。
從非-人哺乳動物中收集血清，所述哺乳動物的血清中表現(xiàn)出足夠高的抗免疫用抗原的抗體滴度，分離并純化血清，即可獲得多克隆抗體。
用于分離和純化的方法包括離心分離，用40至50％飽和的硫酸銨鹽析，用辛酸沉淀(“抗體實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版社(1988))，和單獨或聯(lián)合使用層析方法進行處理的方法，例如，使用DEAE-Sepharose柱，陰離子交換柱，A蛋白或G蛋白柱，凝膠過濾柱等。
(2)制備單克隆抗體(2-1)制備抗體生成細胞將血清中表現(xiàn)出針對(1)中所述免疫所用抗原的足夠高抗體滴度的大鼠被用作抗體生成細胞的來源。
給已表現(xiàn)出上述抗體滴度的大鼠最后一次施用抗原物質(zhì)之后3至7天，取出大鼠的脾臟。
將脾臟切成小塊，置于MEM中，用鑷子將脾臟壓碎。以1200rpm離心5分鐘，然后棄去上清液。
用Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65)處理所得的脾細胞沉淀組分1至2分鐘以除去紅血細胞，然后用MEM將脾細胞洗3次。將所制備的脾細胞用作抗體生成細胞。
(2-2)制備骨髓瘤細胞所用骨髓瘤細胞是由小鼠或大鼠建立的細胞系。例如，可以使用的8-氮鳥嘌呤抗性小鼠(由BALB/c衍生得到)骨髓瘤細胞系包括P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(微生物學和免疫學最新觀點，81，1(1978)；歐洲免疫學雜志，6，511(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(自然，276，269(1978))，P3-X63-8653(653)(免疫學雜志，123，1548(1979))，P3-X63-Ag(X63)(自然，256，495(1975))等。在8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基[含有1.5mmol/L谷氨酰胺，5×10-5mol/L2-巰基甲醇，10μg/ml慶大霉素和10％胎牛血清(CSL)的RPMI1640培養(yǎng)基(下文稱之為普通培養(yǎng)基)+15μg/ml 8-氮鳥嘌呤]中傳代這些細胞系的細胞，但在細胞融合之前的3至4天，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。將2×107或更多的細胞用于融合。
(2-3)制備雜交瘤用MEM或PBS(1.83g磷酸氫二鈉，0.21g磷酸二氫鉀，7.65g氯化鈉，1L蒸餾水；pH7.2)充分洗滌按(2-1)所述制備的抗體生成細胞和(2-2)中的骨髓瘤細胞，以抗體生成細胞數(shù)目骨髓瘤細胞數(shù)目＝5至10∶1的比例將細胞相互混合。以1200rpm離心混合物5分鐘，棄去上清液。
充分分散制備自沉淀組分的混合細胞。于37℃攪拌細胞，同時在細胞混合物中加入0.2至1ml(每108個抗體生成細胞)由2g PEG-1000，2ml MEM和0.7ml DMSO組成的溶液；然后以1至2分鐘的間隔，在其中幾次加入1至2ml MEM。
加入之后，進一步加入MEM以制備細胞直至總體積為50ml。
以900rpm離心所制備的懸浮液5分鐘，然后棄去上清液。
小心分散所得沉淀組分中的細胞，然后用測量用的移液管小心吸取，將細胞懸浮于100ml HAT培養(yǎng)基(在普通培養(yǎng)基中加入10-4mol/L次黃嘌呤，1.5×10-5mol/L胸腺嘧啶和4×10-7mol/L氨基碟呤的培養(yǎng)基)。
將100μl懸浮液的等分試樣分散于96孔培養(yǎng)板的每個孔中。然后在含5％CO2的37℃溫箱中將細胞培養(yǎng)7至14天。
培養(yǎng)完成之后，根據(jù)“抗體-實驗室手冊”(冷泉港實驗室出版社，第14章(1988))中所述的酶免疫測定法，取培養(yǎng)物上清液的等分試樣來選擇與免疫所用抗原特異性反應的雜交瘤，以獲得上述抗體生成細胞。
酶免疫測定法的具體例子如下用作為免疫用抗原的本發(fā)明全長蛋白質(zhì)或其部分片段的純化樣品包被適當?shù)呐囵B(yǎng)板。在培養(yǎng)板中，將雜交瘤培養(yǎng)物上清液或按照下文(2-4)所述得到的純化抗體作為第一抗體進行反應，再將經(jīng)生物素，酶，化學發(fā)光物質(zhì)，放射性化合物等標記的抗-大鼠免疫球蛋白抗體作為第二抗體進行反應。隨后，根據(jù)標記物進行反應，將表現(xiàn)出與本發(fā)明蛋白質(zhì)的特異反應性的細胞選定為能生產(chǎn)抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤。
通過有限稀釋法將雜交瘤克隆兩次[第一次克隆用HT培養(yǎng)基(不含氨基碟呤的HAT培養(yǎng)基)，第二次克隆用普通培養(yǎng)基]。將穩(wěn)定表現(xiàn)出高抗體滴度的細胞選定為能生產(chǎn)抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
(2-4)制備單克隆抗體將(2-3)中所得的能生產(chǎn)抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤細胞腹膜內(nèi)注射(5至20×106個細胞/每只小鼠)至8-10周齡的小鼠或裸鼠，在此之前，已給所述小鼠或裸鼠腹膜內(nèi)注射過0.5ml降植烷(2，6，10，14-四甲基五癸烷)并飼喂了2周。在10至21天后，雜交瘤形成腹水瘤。
從具有腹水瘤的每只小鼠體內(nèi)收集腹水，然后以3000rpm離心5分鐘以除去固體物。
通過與制備多克隆抗體相同的方法，從所得上清液中純化和制備單克隆抗體。
使用小鼠或大鼠單克隆抗體分型試劑盒進行抗體亞型的分型。根據(jù)Lowry法或通過使用280nm處的光吸收值即可計算出蛋白質(zhì)的量。
4.使用ICAT DNA，ICAT蛋白質(zhì)和識別ICAT的抗體(1)可將本發(fā)明的ICAT DNA用作探針，通過使用提取自組織和細胞的RNA進行Northern印跡雜交(J.Sambrook等，“分子克隆，實驗室手冊，第2版”，冷泉港實驗室出版社(1989))，籍此檢測或定量組織或細胞中ICAT基因的mRNA。通過比較多個組織中mRNA的表達水平，可以揭示出ICAT表達的組織分布。
另外，可將具有與本發(fā)明ICAT DNA的核苷酸序列或其部分核苷酸序列相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸用作特異于ICAT DNA的引物，以通過使用提取自組織或細胞的RNA進行RT-PCR來檢測或定量組織或細胞中的mRNA。
可將具有與本發(fā)明ICAT DNA的核苷酸序列或其部分核苷酸序列相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸用作探針以進行組織切片的原位雜交，給出與表達分布相關的更詳細的信息，例如鑒定出組織中表達ICAT的細胞。
通過這些方法提供的，有關何種組織或細胞表達ICAT的信息或有關何種細胞刺激物能改變細胞表達水平的信息可用于研究ICAT，例如涉及ICAT的，由β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的信號傳導機制。因此，這些DNA可用作研究ICAT的試劑。
另外，具有突變的癌癥細胞因ICAT基因的突變而降低了ICAT表達水平，并且不再能抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4的活性，因此，這些DNA可用作診斷試劑以分析所述癌癥中的ICAT基因表達。
(2)通過使用具有與ICAT DNA或其部分核苷酸序列相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸，可以檢測異常，例如ICAT基因的缺失，拷貝數(shù)的變化，染色體易位，和基因核苷酸序列中的突變，如取代，缺失，添加等。
檢測諸如ICAT基因的缺失，拷貝數(shù)變化和染色體易位之類的異常的方法包括Southern雜交。具體地說，可將ICAT DNA用作探針，通過Southern雜交研究經(jīng)適當限制性酶消化的染色體DNA，以測定異常，例如ICAT基因的缺失，拷貝數(shù)變化和染色體易位。
檢測ICAT基因核苷酸序列中的取代，缺失和添加突變的方法包括Southern雜交，PCR和SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766(1989))。
當如取代，缺失和添加的突變位于基因的限制性酶位點時，可通過Southern雜交檢測ICAT基因核苷酸序列中的突變。
可通過PCR檢測ICAT基因核苷酸序列中的突變，在所述PCR中，通過ICAT寡核苷酸擴增染色體ICAT基因以測定擴增片段的核苷酸序列。
根據(jù)因核苷酸序列改變而引起的電泳遷移率差異，可通過SSCP檢測單個核苷酸的差異，其中在非-變性的聚丙烯酰胺凝膠中電泳得自PCR擴增片段的單鏈DNA。
當存在一般出現(xiàn)于癌癥細胞的突變時，可使用能與突變位點雜交的寡核苷酸探針，通過Southern雜交分析染色體DNA以診斷這種癌癥。
(3)可通過輻射-雜合體法(科學，250，245(1990))或原位雜交(人類遺傳學年刊，45，135(1981)，細胞，52，51(1988))測定ICAT DNA的染色體位置。
輻射-雜合體法是指定精確染色體位置的方法，其中進行PCR以將ICAT基因特異性地擴增為很多組含有人染色體片段(通過使用染色體標記已鑒定出實驗組片段的染色體位置)的DNA，例如Gene-Bridge 4，并分析擴增結(jié)果。
在原位雜交中，首先，使用作探針的人ICAT DNA與人染色體樣品雜交，然后檢測信號，將信號作圖于樣品上。這樣就可以鑒定出ICAT基因在染色體上的物理位置以及相應的染色體編號。探針已被放射性同位素3H或生物素標記。當使用3H標記時，可通過放射自顯影檢測信號；或者，當使用生物素標記時，可用經(jīng)熒光染料FITC標記的抗生物素蛋白檢測信號。
另外，當用另一種方法替代上述直接檢測ICAT基因染色體位置的方法時，通過在STS數(shù)據(jù)庫中檢索與ICAT DNA核苷酸序列的同源性，發(fā)現(xiàn)STS(序列-標記位點其具有與衍生自多種EST的核苷酸序列的引物，使用引物擴增的染色體DNA片段，以及片段的染色體位置相關的信息)含有與ICAT DNA的一部分相同的核苷酸序列，該STS可對應于染色體上的ICAT基因，因此，可以認為STS的染色體位置對應于ICAT基因的染色體位置。
與所獲得的經(jīng)鑒定的ICAT基因染色體位置相關的信息可用于研究疾病和ICAT基因之間的關系。例如，LOH(雜合性缺失在成對基因之一中發(fā)現(xiàn)的染色體缺失)的熱點區(qū)域，作為很可能存在腫瘤抑制基因的癌癥相關染色體區(qū)域，已在其中鑒定出癌癥(一個腫瘤抑制基因已通過另一染色體上對應于該LOH區(qū)中腫瘤抑制基因的等位基因的額外突變而滅活，這導致癌癥的發(fā)生)；當所述區(qū)域與ICAT基因的染色體位置恰好重合時，ICAT就可能參與在該區(qū)域具有LOH的癌癥的發(fā)生。此時，當通過分析ICAT基因的突變和表達水平，證實ICAT參與癌癥發(fā)生時，可以使用ICAT DNA和ICAT或ICAT抗體來診斷和治療這種類型的癌癥。
(4)通過第2節(jié)中所述的方法，使用ICAT DNA可產(chǎn)生和獲得ICAT。
(5)在APC基因，β-連環(huán)蛋白基因或ICAT基因已突變的癌癥細胞，如結(jié)腸癌中，據(jù)認為不能抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4所致的轉(zhuǎn)錄激活與癌癥的發(fā)生有關。由于通過施用ICAT，ICAT可抑制由β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的轉(zhuǎn)錄激活，因此可將ICAT用作這些癌癥的治療劑，在所述癌癥中，對β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的轉(zhuǎn)錄激活的抑制作用已經(jīng)受損。
對于含有上述ICAT的治療劑而言，蛋白質(zhì)可單獨作為治療劑被施用，但一般優(yōu)選先將蛋白質(zhì)與一種或多種可藥用的載體混合，再以通過制藥學技術(shù)領域中任何眾所周知的方法制備的藥物制品形式提供蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用無菌溶液，其中蛋白質(zhì)已溶解于水或含水載體，如氯化鈉，甘氨酸，葡萄糖，人白蛋白等的水溶液中。另外，可以添加可藥用的添加劑，如盡可能與制品溶液的生理條件接近的緩沖試劑和等滲試劑，例如，醋酸鈉，氯化鈉，乳酸鈉，氯化鉀，檸檬酸鈉等。或者，可以凍干保存，使用時將其溶解于適當溶劑中，然后再用。優(yōu)選使用能最有效地進行治療的給藥途徑，通常，這種有效的給藥途徑是非腸道途徑，例如皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，支氣管內(nèi)途徑等。
(6)除了按照(5)所述，從外部施用ICAT外，可替代地，還可通過給患者施用已插入ICAT DNA的基因治療載體，并使ICAT DNA在靶細胞中表達來治療癌癥。
(7)可通過第3節(jié)中所述的方法，使用ICAT作為抗原，生成能識別ICAT的抗體。
(8)通過使用識別ICAT的抗體可檢測ICAT。具體地說，該方法包括以下檢測方法如使用微滴板的ELISA，熒光抗體法，Western印跡或免疫組織染色。
(9)通過使用識別ICAT的抗體可定量ICAT。具體地說，該方法包括夾心ELISA，所述ELISA使用了兩類能與液相中的ICAT反應，并具有不同表位的單克隆抗體；放射-免疫測定法，該方法使用了經(jīng)放射性同位素，如125I標記的ICAT和識別ICAT的抗體等。
附圖簡述
圖1A顯示了小鼠ICAT cDNA和人ICAT cDNA中的ORF位置。
圖1B顯示了小鼠ICAT和人ICAT之間的氨基酸序列比較。
圖2顯示了小鼠組織中ICAT mRNA的Northern印跡結(jié)果。從左開始為睪丸，腎臟，骨骼肌，肝臟，肺，脾臟，腦，心臟；和第7天，第11天，第15天，第17天胎兒。右邊顯示的數(shù)字對應于鏈長標記的位置。
圖3顯示了用抗-ICAT抗體免疫沉淀之后進行的Western印跡結(jié)果。左邊的兩個泳道含有小鼠腦提取物；右邊的兩個泳道含有COS-7細胞樣品，所述細胞中已導入了ICAT表達載體。Ag+意味著泳道含有樣品，其中在用抗原肽處理之后使用了抗-ICAT抗體。
圖4顯示了經(jīng)35S-標記的蛋白質(zhì)與GST/ICAT或GST的結(jié)合。自左邊起，各個蛋白質(zhì)是β-連環(huán)蛋白，β-連環(huán)蛋白的N末端部分(殘基1至140的氨基酸序列)，β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域(殘基141至664的氨基酸序列)，β-連環(huán)蛋白的C末端部分(殘基665至782的氨基酸序列)，DVL-1，GSK-3β，APC，Axin和TCF-4。最上方的一組實驗顯示了對體外翻譯中所得產(chǎn)物進行SDS-PAGE后的放射自顯影模式；箭頭表示目的蛋白質(zhì)的位置。中間的一組實驗顯示了對與GST/ICAT結(jié)合的組分進行SDS-PAGE后的放射自顯影模式；最下方的一組實驗顯示了對與GST結(jié)合的組分進行SDS-PAGE后的放射自顯影模式。右邊的數(shù)字表示以kDa計的分子量標記的位置。
圖5表示用抗-ICAT抗體或抗-β-連環(huán)蛋白抗體免疫沉淀之后的Western印跡結(jié)果。最上方和最下方實驗組的樣品是小鼠腦提取物，中間一組實驗使用的樣品是COS-7細胞，其中已導入了ICAT表達載體。左邊兩個泳道含有與抗-ICAT抗體的免疫沉淀物；右邊兩個泳道含有與抗-β-連環(huán)蛋白抗體的免疫沉淀物。在上方，中間或下方實驗組中，分別將抗-β-連環(huán)蛋白抗體，抗-ICAT抗體或抗-TCF-4抗體用作第一抗體，這些實驗組中顯示出Western印跡。
圖6顯示了在293細胞中使用螢光素酶報道質(zhì)粒pTOPtkLuciferase檢測β-連環(huán)蛋白/TCF-4-介導的轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)果。上方4個泳道中不使用S33Y突變β-連環(huán)蛋白；其余4個泳道表達了S33Y突變β-連環(huán)蛋白。泳道1和5僅含有對照載體；泳道2和6含有導入的ICAT表達載體；泳道3和7含有導入的ICAT(13-81)表達載體；泳道4和8含有導入的ICAT(E37-39A)表達載體。
圖7顯示了在DLD-1細胞(上方的一組實驗)和HCT116細胞(下方的一組實驗)中使用螢光素酶報道質(zhì)粒pTOPtkLuciferase檢測與β-連環(huán)蛋白/TCF-4-相關的轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)果。左邊一組顯示了ICAT表達載體的實驗結(jié)果；中間一組顯示了ICAT(13-81)表達載體的實驗結(jié)果；右邊一組顯示了ICAT(E37-39A)表達載體的實驗結(jié)果。從上往下，是使用0，0.1，0.25，0.5或1μg各種ICAT或突變ICAT的表達載體所獲得的結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳模式以下將參照實施例詳細描述本發(fā)明。
實施例1克隆ICAT cDNA
通過酵母雙-雜種體系克隆編碼能結(jié)合小鼠mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的蛋白質(zhì)的基因。
(1)制備mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的誘餌質(zhì)粒小鼠β-連環(huán)蛋白cDNA的核苷酸序列和由該cDNA編碼的小鼠β-連環(huán)蛋白的氨基酸序列是公知的(GenBank登錄號為M90364，科學，257，1142(1992))。小鼠β-連環(huán)蛋白在其氨基酸序列的殘基141至664區(qū)域含有被稱為犰狳結(jié)構(gòu)域的重復序列(mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū))。通過使用小鼠細胞的cDNA為模板進行PCR，擴增并分離編碼該mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)部分的小鼠β-連環(huán)蛋白DNA片段。根據(jù)編碼上述mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的cDNA部分的核苷酸序列設計PCR引物。測序經(jīng)擴增的DNA片段，以證實其編碼mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)，然后將該片段插入載體pGBT9(Clontech)的BamHI/SalI位點之間，以制備表達GAL4-β-連環(huán)蛋白融合蛋白的質(zhì)粒，其中β-連環(huán)蛋白與GAL4BD融合。
(2)使用雙-雜種體系進行篩選用MATCHMAKER小鼠胚胎(Swiss Webster/NIH小鼠；17天齡的胚胎)cDNA文庫進行篩選，所述文庫是用于雙-雜種體系的文庫，是由Clontech提供的。該cDNA文庫含有具有cDNA插入物的載體pGAD10(Clontech)，所述載體含有參與酵母亮氨酸生物合成的基因LEU2作為選擇標記，通過利用ADH1啟動子，所述載體可表達GAL4AD和cDNA-編碼蛋白質(zhì)的融合蛋白。根據(jù)購自Clontech的文庫中所附手冊所用的具體篩選方法如下具體地說，將雙-雜種體系所用的小鼠胎cDNA文庫和(1)中制備的質(zhì)粒GAL4-β-連環(huán)蛋白導入釀酒酵母HF7C菌株(Clontech)。HF7C菌株是色氨酸-，亮氨酸-和組氨酸-營養(yǎng)缺陷型的酵母菌株，在其染色體上，具有參與組氨酸生物合成的基因HIS3作為報道基因，所述基因已被連接至可結(jié)合GAL4 BD的GAL1啟動子的下游，還具有得自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ，該基因已被連接至可結(jié)合GAL4 BD的核苷酸序列的下游(基因，212，197(1998))。含有質(zhì)粒GAL4-β-連環(huán)蛋白和能結(jié)合mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的蛋白質(zhì)的cDNA克隆，并能表達各個融合蛋白的轉(zhuǎn)化子為非組氨酸營養(yǎng)缺陷型，并且為β-半乳糖苷酶活性陽性，這是因為mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)和結(jié)合蛋白質(zhì)之間的結(jié)合使得GAL4 BD被置于與GAL4 AD相鄰的位置，位于可結(jié)合GAL4 BD的核苷酸序列下游的HIS3基因和lacZ基因的轉(zhuǎn)錄因而被激活。最后從2.3×107個在不含任何亮氨酸，組氨酸和色氨酸的培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子中選擇4個β-半乳糖苷酶活性陽性克隆。
從這些克隆中回收質(zhì)粒DNA，測定插入cDNA的核苷酸序列。這4個克隆享有相同的cDNA序列。在核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中檢索與該核苷酸序列的同源性。盡管有一些小鼠EST的核苷酸序列與該序列相同，但未發(fā)現(xiàn)有已知的基因與該核苷酸序列相同。因此，可以證實通過雙-雜種體系分離的上述cDNA是得自新基因的cDNA。由該新基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為ICAT。
在所發(fā)現(xiàn)的EST核苷酸序列中，一部分序列與通過雙-雜種體系獲得的cDNA相比，在5’側(cè)延長。因此，根據(jù)其中一個EST(GenBank登錄號為AA017805)的5’末端的核苷酸序列制備PCR有義引物，再根據(jù)小鼠EST(GenBank登錄號為AA253623)的核苷酸序列制備反義引物，所述小鼠EST具有與上述ICAT cDNA相同的核苷酸序列。使用這些引物，并使用小鼠胎cDNA文庫(Clontech)為模板，經(jīng)PCR擴增含有在5’側(cè)延長的核苷酸序列的cDNA片段，然后測序。通過連接經(jīng)雙-雜種體系制備的cDNA克隆的核苷酸序列和經(jīng)PCR揭示的cDNA核苷酸序列，得到SEQ ID NO3所示的小鼠ICAT cDNA的完整核苷酸序列。在該核苷酸序列中有多個開放閱讀框(ORF)。含有50或更多個氨基酸的這種ORF是殘基1至273(91個氨基酸；其中不含起始密碼子)；殘基167至409(81個氨基酸)；殘基447至647(67個氨基酸)；殘基1122至1304(61個氨基酸)和殘基1711至2373(221個氨基酸)(
圖1A)，但僅根據(jù)核苷酸序列，仍不清楚哪一個是真正編碼ICAT的ORF。最靠近5’-端起始密碼子的81個氨基酸的ORF(SEQ ID NO6；對應于SEQ ID NO1核苷酸序列中的殘基167至409)被假設為編碼ICAT的部分。SEQ ID NO4中將該ORF的氨基酸序列顯示為小鼠ICAT的氨基酸序列。在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中檢索該氨基酸序列的同源性，但未找到具有高同源性的氨基酸序列。(3)克隆人ICAT cDNA在GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中檢索與(2)中所得小鼠ICAT cDNA的核苷酸序列具有同源性的人核苷酸序列，結(jié)果表明一些EST表現(xiàn)出高同源性。另外，通過檢測與這些EST或得自同一克隆的EST(在單個cDNA克隆中，一般有兩個EST，即5’末端序列和3’末端序列的EST)共享序列的EST，來收集據(jù)認為得自人ICAT cDNA的EST，根據(jù)核苷酸序列分析所得EST以測定每個EST對應于人ICAT cDNA的哪一部分。另外，通過測定這些EST的核苷酸序列是否位于測定核苷酸序列所用cDNA克隆的5’方向或3’方向，可以估計出cDNA克隆含有全長人ICAT cDNA的哪一部分。根據(jù)分析結(jié)果，在這些EST中選擇GenBank登錄號為AA478738，W73346和AA428913的EST，然后從I.M.A.G.E.consortium獲得用于測定這些EST核苷酸序列的親代cDNA克隆，即克隆IMAGE75366(5’方向EST是AA478738；假設該cDNA克隆含有人ICAT cDNA的5’末端)，IMAGE344405(3’方向EST是W73346；假設該cDNA克隆含有人ICAT cDNA的中間部分)和IMAGE759649(5’方向EST是AA428913；假設該cDNA克隆含有人ICATcDNA的3’末端)。通過按下述方法裝配這些cDNA克隆中所包含的cDNA，可制備出幾乎覆蓋了全長人ICAT cDNA的cDNA克隆phICAT。
首先進行PCR，所述PCR使用IMAGE75366為模板，并使用(a)有義引物，其中在與cDNA部分的5’末端相鄰的核苷酸序列(具體地說，是與AA478738的5’末端相鄰的核苷酸序列，并對應于SEQ ID NO1的第9個核苷酸后面的序列)的5’方向添加了一個EcoRI位點，和(b)反義引物，其含有位于SEQ ID NO1第742位的PstI位點及其下游核苷酸序列；用EcoRI和PstI消化約為760bp的擴增DNA片段以分離該片段。然后用PstI和EcoRI消化IMAGE 759649，分離含有載體pT7T3D-Pac和人ICAT cDNA 3’部分(在位于SEQ ID NO1第980位殘基的PstI之后的部分)的DNA片段。用PstI消化通過連接這兩個部分而制備的質(zhì)粒(在該質(zhì)粒的cDNA中缺失了SEQID NO1的殘基747至979的序列)，然后通過用堿性磷酸酶處理，除去消化所產(chǎn)生的末端磷酸基團以防止自身連接。將該DNA與用PstI消化IMAGE344405之后分離的約240bp的DNA片段連接。通過測定PstI位點附近的核苷酸序列，將在所需方向上已插入PstI片段的質(zhì)?？寺∵x定為幾乎含有全長人ICAT cDNA的cDNA克隆，然后將所得克隆稱為phICAT。測定phICAT中cDNA的完整核苷酸序列以確定人ICAT cDNA的核苷酸序列。在該核苷酸序列中，在制備phICAT的過程中，已除去phICAT cDNA核苷酸序列5’末端的8個核苷酸(對應于AA478738核苷酸序列中的殘基1至8)，因此，其中已添加了該段核苷酸序列的一個核苷酸序列在SEQ IDNO1中被表示為全長人ICAT cDNA的核苷酸序列。如
圖1A所示，在這一人ICAT cDNA的核苷酸序列中，有幾個編碼50或更多個氨基酸的ORF(殘基2至210(70個氨基酸；不含起始密碼子)；殘基274至516(81個氨基酸)；殘基545至709(55個氨基酸)；殘基1206至1388(61個氨基酸)，殘基1822至2025(68個氨基酸)；和殘基2547至2864(106個氨基酸))。然而，當比較得自人和小鼠的每個ICAT cDNA中ORF所處的位置及其由ORF編碼的氨基酸序列時，只有編碼對應于人ICAT cDNA的核苷酸殘基274至516的81個氨基酸的ORF表現(xiàn)出與小鼠ICAT氨基酸序列的同源性，該ORF與小鼠cDNA中的ORF位于相似的位置。該ORF對應于(2)中假設的編碼小鼠ICAT的推定ORF，并與后者具有同源性。因此揭示出編碼ICAT的區(qū)域正如所假設的那樣，是SEQ ID NO3所示小鼠ICAT cDNA的殘基167至409(SEQ IDNO6)區(qū)域，或SEQ ID NO1所示人ICAT cDNA的殘基274至516(SEQ IDNO5)區(qū)域。人ICAT DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO5，人ICAT的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。人ICAT和小鼠ICAT氨基酸序列之間的序列比較示于
圖1B。人和小鼠ICAT之間唯一的差別是81個氨基酸中的2個氨基酸。
實施例2通過Northern印跡分析ICAT基因的表達使用經(jīng)隨機引物標記法標記的，實施例1中所得小鼠ICAT cDNA為探針，對MTN BLOT(Clontech)進行Northern印跡，MTN BLOT是印跡有得自多個成年小鼠器官(心臟，腦，脾臟，肺，肝臟，骨骼肌，腎臟和睪丸)和小鼠胎(第7，11，15，17天)的poly(A)+RNA的濾膜。
結(jié)果示于圖2。檢測到2.6kb的ICAT mRNA片斷。在成年小鼠器官中，mRNA在心臟，腦，肝臟和骨骼肌中以高水平表達，而在腎臟，睪丸，脾臟和肺中的表達水平較低。在整個胎兒階段，mRNA以相同的水平表達。
實施例3制備抗-ICAT抗體通過肽合成儀合成肽(氨基酸序列Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu AspArg Arg Gln)，所述肽對應于小鼠和人ICAT氨基酸序列C末端的第70至81位殘基。通過使用MBS為間隔將肽與KLH偶聯(lián)，然后將其用作抗原來免疫兔。免疫方法如下第一次免疫時皮下注射1mg抗原，第二次免疫之后，以10天為間隔皮下注射0.5mg抗原。自第三次免疫起，從兔體內(nèi)收集血清，通過ELISA檢測該血清與上述肽的反應性，從而測定皮下注射后的抗體滴度。當?shù)味茸銐蚋邥r，從兔中收集全血清，以得到抗-ICAT的抗血清。對抗-ICAT血清進行硫酸銨沉淀處理，然后透析。通過利用親和柱從透析液中純化并得到抗-ICAT多克隆抗體，在所述親和柱中，用作抗原的肽已被固定在EAH-Sepharose(Amersham-Pharmacia Biotech)載體上。下文將純化的抗-ICAT多克隆抗體稱為抗-ICAT抗體。下文實施例4至7中表明該抗體對小鼠ICAT具有特定的反應性。
實施例4在大腸桿菌中表達重組ICAT并進行檢測(1)在大腸桿菌中表達ICAT將小鼠ICAT cDNA亞克隆至大腸桿菌谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達質(zhì)粒載體pGEX5X-1(Amersham-Pharmacia Biotech)的EcoRI/SalI位點之間，以制備融合蛋白表達質(zhì)粒，其中ICAT在GST的C末端融合(下文簡稱為GST/ICAT)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后進行培養(yǎng)。為了進行對照，同時還培養(yǎng)用pGEX5X-1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(該大腸桿菌僅表達GST)。
(2)通過免疫沉淀和Western印跡檢測ICAT回收(1)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，然后在其中加入含有1％Triton X-100的緩沖液A(裂解緩沖液A；緩沖液A的組成10mM Tris-HCl(pH8.0)，140mmol/LNaCl，1mmol/L EGTA，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽)以裂解細菌。于4℃，使細胞裂解物與實施例3中所得的抗-ICAT抗體反應1小時，以在GST/ICAT和抗體之間形成復合物，然后在反應溶液中加入具有結(jié)合IgG之特性的G蛋白-Sepharose 4B(Amersham-Pharmacia Biotech)以吸附免疫復合物。用裂解緩沖液A充分洗滌G蛋白-Sepharose 4B之后，加入SDS-PAGE樣品緩沖液以洗脫免疫復合物。將洗脫液用作SDS-PAGE的樣品，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Immobilon P；Millipore)。通過使用抗-ICAT抗體作為第一抗體，并使用與堿性磷酸酶綴合的抗-兔IgG抗體(山羊)作為第二抗體，用上述膜檢測ICAT。
結(jié)果表明在表達GST/ICAT的大腸桿菌中，GST/ICAT和抗-ICAT抗體之間發(fā)生反應，結(jié)果可檢測到一條帶，而在表達GST的對照大腸桿菌中未檢測到條帶。由此揭示出實施例3中所得的抗-ICAT抗體可能就是能與ICAT特異性反應的抗體，正因為它是這樣一種抗體，因而才能在免疫沉淀和Western印跡中都能檢測到ICAT。
實施例5在動物細胞中表達和檢測重組ICAT將實施例1中所得的小鼠ICAT cDNA亞克隆至動物細胞表達質(zhì)粒載體pMKITneo(Nakamura等，Genes to Cells，3，395(1998))的EcoRI/SalI位點之間，以制備動物細胞中的ICAT表達質(zhì)粒。用Lipofect-AMINE(LifeTechnologies)將質(zhì)粒DNA導入猴腎細胞系COS-7(ATCCCRL-1651)。48小時之后，回收細胞，按照與實施例4中相同的方法制備細胞裂解物，然后在用抗-ICAT抗體免疫沉淀之后，通過Western印跡進行檢測。如圖3所示，結(jié)果顯示出檢測到9-kDa的蛋白質(zhì)帶。9kDa的分子量類似于由ICAT的氨基酸序列估計出的分子量。另外，當預先使抗-ICAT抗體與免疫所用的ICAT部分肽反應，然后再進行免疫沉淀反應時，就檢測不到ICAT帶，因此抗體和ICAT之間的反應受到抑制。
實施例6通過體外翻譯系統(tǒng)合成ICAT并用抗體進行檢測在體外，通過使用TNT-網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)(Promega)，由小鼠ICATmRNA翻譯并合成ICAT。在按照與實施例4所述相同的方法，使用抗-ICAT抗體進行免疫沉淀之后，對合成的ICAT進行Western印跡，檢測到ICAT帶。因此，由體外翻譯系統(tǒng)合成的ICAT也能與抗-ICAT抗體結(jié)合，并與之形成免疫復合物。
實施例7使用抗體檢測小鼠腦中的ICAT在裂解緩沖液A中，使用Dounce勻漿儀破碎49天齡小鼠的大腦以制備裂解物。在按照與實施例4所述相同的檢測方法，使用抗-ICAT抗體進行免疫沉淀之后，對裂解物進行Western印跡。如圖3所示，結(jié)果表明檢測到9-kDa的蛋白質(zhì)帶。由于實施例5中也檢測到9-kDa的蛋白質(zhì)，因此大腦中的ICAT基因產(chǎn)物被認為是9-kDa的蛋白質(zhì)。另外，由此揭示出實施例3中所得的抗-ICAT抗體是能與組織中的ICAT反應的抗體，正因為它是這樣一種抗體，因而才能在免疫沉淀和Western印跡中都能檢測到ICAT。
實施例8分析ICAT和β-連環(huán)蛋白之間的結(jié)合(1)體外檢測直接結(jié)合按下述證實ICAT和β-連環(huán)蛋白的直接結(jié)合。
在體外，通過使用35S-標記的甲硫氨酸TNT-網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)(Promega)，由小鼠β-連環(huán)蛋白mRNA翻譯并合成35S-標記的β-連環(huán)蛋白。培養(yǎng)實施例3中制備的表達GST/ICAT的大腸桿菌以及表達GST的對照大腸桿菌，得到各自的細菌裂解物。在這些細菌裂解物中加入谷胱甘肽-Sepharose 4B(Amersham-Pharmacia Biotech)，GST/ICAT或GST吸附于其上，對其進行分離，于4℃，在含有0.1％Triton X-100的緩沖液A中，使吸附有GST/ICAT或GST的谷胱甘肽-Sepharose 4B與上述經(jīng)35S-標記的β-連環(huán)蛋白反應2小時。用緩沖液A充分洗滌谷胱甘肽-Sepharose 4B，然后在其中加入SDS-PAGE樣品緩沖液以將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫至樣品緩沖液中。將洗脫液用作凝膠濃度為15％的SDS-PAGE的樣品，然后通過放射自顯影肉眼觀察凝膠。結(jié)果表明在表達GST/ICAT的大腸桿菌中，檢測到經(jīng)35S-標記的β-連環(huán)蛋白帶，而在表達GST的大腸桿菌中未檢測到該帶。由此證實GST/ICAT在體外與β-連環(huán)蛋白直接結(jié)合，負責結(jié)合β-連環(huán)蛋白的位點位于GST/ICAT的ICAT組成成分內(nèi)。
(2)負責與ICAT結(jié)合的β-連環(huán)蛋白區(qū)域按下述測定負責與ICAT結(jié)合的β-連環(huán)蛋白區(qū)域。通過PCR擴增編碼小鼠β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列中的殘基141至664)，N末端部分(氨基酸序列中的殘基1至140)和C末端部分(氨基酸序列中的殘基665至782)區(qū)域的DNA片斷。通過使用DNA，合成mRNA，并在經(jīng)35S-標記的甲硫氨酸的存在下，通過TNT-網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)(Promega)體外翻譯所述mRNA，以合成對應于各個區(qū)域的經(jīng)35S-標記的部分β-連環(huán)蛋白。通過按照與上述相同的方法進行免疫沉淀，檢測各個經(jīng)35S-標記的部分β-連環(huán)蛋白與GST/ICAT的體外結(jié)合情況。如圖4所示，用犰狳結(jié)構(gòu)域部分觀察到與GST/ICAT的結(jié)合，但用N末端或C末端部分未檢測到結(jié)合。由此證實ICAT可直接結(jié)合β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域。這一事實與實施例1中小鼠ICATcDNA作為編碼能與小鼠β-連環(huán)蛋白的犰狳結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的DNA被獲得的事實相符。
(3)ICAT與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合特異性按下述方法證實ICAT特異性結(jié)合β-連環(huán)蛋白。
按照與(1)中相同的方法，在經(jīng)35S-標記的甲硫氨酸的存在下，通過體外翻譯系統(tǒng)合成除β-連環(huán)蛋白外的蛋白質(zhì)APC，DVL-1，GSK-3β，Axin和TCF-4(對APC而言，僅合成APC氨基酸序列的殘基453至767)。按照與上述相同的方法，檢測各個經(jīng)35S-標記的蛋白質(zhì)與GST/ICAT的體外結(jié)合情況。結(jié)果示于圖4。GST/ICAT不能結(jié)合除β-連環(huán)蛋白外的這些蛋白質(zhì)。因此，可以證明ICAT與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合具有特異性。
據(jù)報道，TCF-4和β-連環(huán)蛋白相互結(jié)合形成復合物。當將通過體外翻譯系統(tǒng)合成的經(jīng)35S-標記的β-連環(huán)蛋白和經(jīng)35S-標記的TCF-4加入上述系統(tǒng)，并與GST/ICAT反應時，能同時檢測到β-連環(huán)蛋白，TCF-4和GST/ICAT。由此證明ICAT可直接結(jié)合β-連環(huán)蛋白/TCF-4復合物(下文稱之為β-連環(huán)蛋白/TCF-4)。
(4)細胞中ICAT和β-連環(huán)蛋白之間的結(jié)合在使用實施例5制備的，表達小鼠ICAT的COS-7細胞進行免疫沉淀和Western印跡以檢測ICAT的實驗中，用抗-β-連環(huán)蛋白單克隆抗體(Transduction Laboratory；用于免疫的動物是小鼠)替代抗-ICAT抗體進行免疫沉淀，用抗-ICAT抗體作為第一抗體進行Western印跡以進行檢測。結(jié)果示于圖5的中間一組圖。檢測到ICAT條帶，由此證實在細胞中ICAT能與β-連環(huán)蛋白結(jié)合。然而，在此實驗中，在免疫沉淀中使用了預先已與GST/β-連環(huán)蛋白反應的抗-β-連環(huán)蛋白抗體，由于對免疫沉淀的抑制作用，因而檢測不到ICAT條帶。
在使用實施例6中的小鼠腦裂解物進行免疫沉淀和Western印跡以檢測ICAT的實驗中，用抗-ICAT抗體進行免疫沉淀，然后用抗-β-連環(huán)蛋白單克隆抗體(Transduction Laboratory；用于免疫的動物是小鼠)作為第一抗體進行Western印跡以進行檢測。結(jié)果示于圖5上方的一組圖，檢測到β-連環(huán)蛋白條帶，由此證實在小鼠活體中ICAT也能與β-連環(huán)蛋白結(jié)合。然而，在此實驗中，在免疫沉淀中使用了預先已與GST/ICAT反應的抗-ICAT抗體，由于對免疫沉淀的抑制作用，因而檢測不到β-連環(huán)蛋白條帶。
另外，當在相同的實驗中，使用抗-TCF-4抗體(通過按照與制備抗-ICAT抗體相同的方法，用含有對應于TCF-4 C末端20個氨基酸的氨基酸序列的部分肽免疫兔，然后測定滴度而制備的純化抗體)作為第一抗體進行Western印跡時，可檢測到TCF-4條帶(圖5下方的一組圖)。由于已揭示出如(3)中所示，ICAT不能直接結(jié)合TCF-4，據(jù)認為，在小鼠活體中，ICAT經(jīng)由β-連環(huán)蛋白與β-連環(huán)蛋白/TCF-4結(jié)合。
實施例9 ICAT的亞細胞定位通過雙重熒光抗體法檢測人結(jié)腸癌細胞系SW480中的ICAT和β-連環(huán)蛋白。具體地說，使細胞與抗-ICAT抗體和抗-β-連環(huán)蛋白抗體反應，然后，與作為第二抗體的經(jīng)FITC-標記的抗-兔IgG抗體(Cappel；能與抗-ICAT抗體結(jié)合)和經(jīng)RITC-標記的抗-小鼠IgG抗體(Cappel；能與抗-β-連環(huán)蛋白抗體結(jié)合)反應；在熒光顯微鏡(奧林巴斯；AH2-FL)中分別檢測細胞中的ICAT和β-連環(huán)蛋白。結(jié)果表明ICAT和β-連環(huán)蛋白都位于核中。
實施例10由ICAT介導的對β-連環(huán)蛋白和TCF所致轉(zhuǎn)錄激活的抑制作用如實施例8所示，已闡明ICAT能與β-連環(huán)蛋白/TCF-4結(jié)合。β-連環(huán)蛋白/TCF-4具有經(jīng)由與靶基因結(jié)合而激活靶基因轉(zhuǎn)錄的活性(下文將該活性稱為轉(zhuǎn)錄激活活性)。因此，研究了ICAT對β-連環(huán)蛋白/TCF-4所介導的轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。具體按下述進行研究。
β-連環(huán)蛋白可被GSK-3β磷酸化。在一些結(jié)腸癌細胞系和黑素瘤細胞系中，在β-連環(huán)蛋白基因內(nèi)的位點發(fā)現(xiàn)了突變，所述位點對應于被磷酸化的位點。據(jù)報道，這些細胞系中的β-連環(huán)蛋白很難被降解，因此，β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性升高。當通過利用下述報道基因在細胞中表達無磷酸化的突變β-連環(huán)蛋白時，可構(gòu)建一個系統(tǒng)來檢測β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性，然后再研究ICAT對此系統(tǒng)的作用。
首先，制備質(zhì)粒以表達突變的β-連環(huán)蛋白S33Y(下文簡稱為S33Y)，其中被GSK-3β磷酸化的第33位殘基絲氨酸已被酪氨酸取代。然后，將0.5μg質(zhì)粒pTOPtkLuciferase，1.0μg S33Y表達質(zhì)粒，2.0μg載體MKITneo，0.05μg質(zhì)粒pRL-TK(Promega)共轉(zhuǎn)染至6×105個人腎細胞系293(ATCCCRL-1573)的細胞，然后在培養(yǎng)皿(直徑為60mm)中培養(yǎng)細胞，其中通過pTOPtkLuciferase，可在啟動子(此啟動子所致的轉(zhuǎn)錄激活受β-連環(huán)蛋白/TCF-4的影響)的調(diào)節(jié)下表達作為報道基因的螢光素酶基因，在所述啟動子中，3個TCF-結(jié)合位點(核苷酸序列為CCTTTGATC)被插入胸苷激酶基本啟動子的上游，在所述基本啟動子中，除了啟動子外不含調(diào)節(jié)位點，質(zhì)粒pRL-TK被用作對照，作為基因?qū)胄实闹笜?。使用由Promega提供的螢光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒導入40小時后，通過檢測報道基因產(chǎn)物，即螢光素酶的活性，測定由啟動子介導的轉(zhuǎn)錄水平。另外，通過使用3.0μg MKITneo替代S33Y表達質(zhì)粒，同時對對照進行相同的螢光素酶活性測定以比較轉(zhuǎn)錄水平。在此比較中，pRL-TK的表達水平被用作基因?qū)氲男室允刮灩馑孛富钚詷藴驶．攲隨33Y表達質(zhì)粒時，與對照相比，螢光素酶活性，即轉(zhuǎn)錄水平有所提高。由此表明突變型β-連環(huán)蛋白S33Y具有組成型激活轉(zhuǎn)錄的特性(圖6)。使用質(zhì)粒pFOPtkLuciferase而不是pTOPtkLuciferase作為陰性對照，進行相同的螢光素酶活性檢測，在pFOPtkLuciferase中，上述pTOPtkLuciferase中所含的TCF結(jié)合位點已轉(zhuǎn)變?yōu)門CF不能結(jié)合的核苷酸序列(CCTTTGGCC)。在此條件下，盡管導入了S33Y表達質(zhì)粒，也未提高轉(zhuǎn)錄水平，因此，可以證實轉(zhuǎn)錄水平是通過TCF結(jié)合位點提高的。
在上述β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測系統(tǒng)中，以連續(xù)增加的量，即0，0.1，0.25，0.5或1μg同時導入ICAT表達質(zhì)粒。導入的ICAT表達質(zhì)粒DNA量的增加導致對轉(zhuǎn)錄水平升高的抑制作用，最終，轉(zhuǎn)錄水平降低至與僅導入載體MKITneo時相同。
制備使用小鼠乳腺癌細胞系C57MG而不是293細胞作為宿主的檢測系統(tǒng)，以測定β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性。與在293細胞中的情形相同，在此系統(tǒng)中導入S33Y表達質(zhì)粒也會使報道基因的轉(zhuǎn)錄水平提高。在上述系統(tǒng)中，所用TCF-4是細胞內(nèi)源性TCF-4。然而，當在此系統(tǒng)中再導入TCF-4表達質(zhì)粒時，能進一步提高轉(zhuǎn)錄水平。當在此檢測系統(tǒng)中導入ICAT表達質(zhì)粒以表達ICAT時，與在293細胞中的情形一樣，轉(zhuǎn)錄水平的增加受到抑制。由此說明ICAT抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的轉(zhuǎn)錄激活的作用不依賴于細胞類型。
在因基因突變致使APC功能受損的結(jié)腸癌細胞系中，據(jù)認為由于β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化，組成型出現(xiàn)β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的轉(zhuǎn)錄激活。因此，在缺乏S33Y表達質(zhì)粒時，使用人結(jié)腸癌細胞系SW480(ATCCCCL-228)，DLD-1(ATCCCCL-221)，SW48(ATCCCCL-231)或HCT116，而不是293細胞作為宿主細胞(因為利用了組成型激活的內(nèi)源性β-連環(huán)蛋白/TCF-4)，來構(gòu)建上述β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中導入ICAT表達質(zhì)粒以表達ICAT，與上述情況相同，觀察到對轉(zhuǎn)錄水平增加的抑制作用。DLD-1和HCT116的結(jié)果示于圖7。如圖7所示，發(fā)現(xiàn)ICAT也具有抑制轉(zhuǎn)錄的活性，所述轉(zhuǎn)錄是由因APC突變的存在而被組成型激活的β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，認為ICAT可經(jīng)由與細胞中的β-連環(huán)蛋白/TCF-4結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細胞中與β-連環(huán)蛋白/TCF-4相關的信號傳導。另外，關于上述檢測系統(tǒng)，在因APC或β-連環(huán)蛋白發(fā)生突變而由β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導組成型轉(zhuǎn)錄激活的系統(tǒng)中，強行表達ICAT導致對轉(zhuǎn)錄的抑制作用。因此，可以認為當癌細胞具有APC或β-連環(huán)蛋白突變，細胞中由β-連環(huán)蛋白/TCF-4介導的轉(zhuǎn)錄激活為組成型時，通過施用ICAT或通過在細胞中強行表達ICAT，以調(diào)節(jié)癌細胞中的轉(zhuǎn)錄即可治療癌癥。
實施例11制備ICAT突變體并評價它與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合特性(1)與同β-連環(huán)蛋白的結(jié)合相關的區(qū)域按下述通過雙-雜種體系測定ICAT缺失突變體和β-連環(huán)蛋白之間的結(jié)合，從而估計出參與結(jié)合β-連環(huán)蛋白的ICAT區(qū)域。
通過將經(jīng)PCR擴增的，編碼各個小鼠ICAT突變體的部分DNA片段插入載體pGAD424(Clontech)，制備可被雙-雜種體系利用的，用于表達下述ICAT缺失突變體的質(zhì)粒，所述突變體被表達成GAL4 AD融合蛋白。
(a)ICAT(1-61)；(b)ICAT(1-41)；(c)ICAT(13-81)；(d)ICAT(21-81)；(e)ICAT(42-81)；(f)ICAT(42-61)；(g)ICAT(21-61)；(h)ICAT(13-41)和(i)ICAT(13-61)括號中的數(shù)字對應于在ICAT序列中被表達的區(qū)域的氨基酸編號；例如，ICAT(1-61)表示含有序列的第1至61位氨基酸殘基的ICAT衍生物。
另外，由于負責與β-連環(huán)蛋白結(jié)合的所有區(qū)域富含其它能與β-連環(huán)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，如鈣粘著蛋白，APC和TCF-4中的酸性氨基酸，通過PCR擴增編碼ICAT突變體((j)ICAT(E37-39A))的DNA，其中，位于第37，38和39位殘基的谷氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，在所述PCR利用的引物中，對應于第37，38和39位殘基的谷氨酸殘基原始密碼子(GAG或GAA)中第2位的腺嘌呤核苷酸被轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏ず塑账?轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼岬拿艽a子GCG或GCA)。將此DNA插入載體pGAD424(Clontech)，以制備GAL4 AD與ICAT(E37-39A)的融合蛋白的表達質(zhì)粒，所述質(zhì)?？捎糜陔p-雜種體系。
按照與實施例1相同的方法，將這些GAL4 AD-ICAT突變體融合蛋白表達質(zhì)粒中的每一個與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的誘餌質(zhì)粒GAL4-β-連環(huán)蛋白一起導入酵母HF7C菌株，然后根據(jù)轉(zhuǎn)化子中β-半乳糖苷酶活性的存在來評價每種ICAT突變體與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合。結(jié)果表明(a)ICAT(1-61)，(c)ICAT(13-81)和(i)ICAT(13-61)與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，但其余的缺失突變體不與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)結(jié)合。因此說明N末端的12個氨基酸和C末端的20個氨基酸都不參與結(jié)合，具體地說，氨基酸序列中的殘基13至61區(qū)域?qū)τ谂cβ-連環(huán)蛋白的結(jié)合而言是至關重要的。另外，(j)ICAT(E37-39A)不與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)結(jié)合。因此說明連續(xù)的谷氨酸殘基37至39對于與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合而言是至關重要的。
另外，按照與實施例8相同的方法，在大腸桿菌中將ICAT(E37-39A)表達為GST融合蛋白，以評價與β-連環(huán)蛋白的體外結(jié)合，結(jié)果表明它不與β-連環(huán)蛋白結(jié)合。另外，按照與實施例5相同的方法制備動物細胞表達質(zhì)粒，在所述質(zhì)粒中，編碼ICAT(E37-39A)的DNA被亞克隆至載體pMKITneo，然后在COS-7細胞中表達該質(zhì)粒。按照與實施例8相同的方法評價與β-連環(huán)蛋白的體內(nèi)結(jié)合，結(jié)果表明未檢測到結(jié)合。此外，當在按實施例10所述制備的β-連環(huán)蛋白/TCF-4轉(zhuǎn)錄激活活性檢測系統(tǒng)中，使用ICAT(E37-39A)突變體替代ICAT時，ICAT(E37-39A)也不能抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性(圖7)。
(2)ICAT(13-81)突變體對β-連環(huán)蛋白/TCF-4-介導的轉(zhuǎn)錄激活的作用在按實施例10所述制備的β-連環(huán)蛋白/TCF-4轉(zhuǎn)錄激活活性檢測系統(tǒng)中，表達ICAT(13-81)突變體以替代ICAT。盡管如(1)中所示，該ICAT(13-81)突變體能結(jié)合β-連環(huán)蛋白，但該突變體不能抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性(圖7)。該結(jié)果表明N末端的12個氨基酸對于ICAT對β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性的抑制作用是至關重要的，與β-連環(huán)蛋白的結(jié)合不足以抑制β-連環(huán)蛋白/TCF-4的轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，ICAT(13-81)突變體與β-連環(huán)蛋白結(jié)合，但與ICAT不同，它不具有抑制由β-連環(huán)蛋白介導的轉(zhuǎn)錄激活的作用；因此，可認為當存在于細胞中時，該突變體作為與ICAT拮抗的，抑制ICAT作用的拮抗劑起作用。
實施例12β-連環(huán)蛋白中與同ICAT的結(jié)合相關的位點實施例8中證實了mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)和ICAT之間的結(jié)合。按下述測定mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)(由12個犰狳單位組成的重復序列；下文將每個重復單位用R1至R12表示)的哪個區(qū)域與同ICAT的結(jié)合相關。
首先，通過PCR制備編碼下述mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)缺失突變體(6種含有mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)的一部分的缺失突變體；(a)R1至R9，(b)R6至R12，(c)R10至R12，(d)R10的后一半至R12，(e)R10，(f)R11至R12)的DNA，然后將每種DNA插入載體pGβT9以提供缺失突變體的誘餌質(zhì)粒。將該突變體與雙雜種體系中的小鼠正常ICAT表達質(zhì)粒一起導入酵母HF7C菌株。根據(jù)轉(zhuǎn)化子中β-半乳糖苷酶活性的存在來評價ICAT與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)缺失突變體之間的結(jié)合。結(jié)果表明當表達了(b)R6至R12，(c)R10至R12，或(d)R10的后一半至R12的各個β-連環(huán)蛋白區(qū)域時，發(fā)現(xiàn)了與ICAT的結(jié)合，這說明ICAT與mβ-連環(huán)蛋白臂區(qū)中R10的后一半至R12區(qū)域結(jié)合，而R1至R9不參與結(jié)合。
實施例13人ICAT基因的染色體位置根據(jù)實施例1所得的人ICAT cDNA的核苷酸序列檢索STS數(shù)據(jù)庫，揭示出編號為WI-9616，WI-16661和SHGC-30730的STS具有與ICAT相同的序列。另外，在Unigene數(shù)據(jù)庫中檢索EST，揭示出stSG22813和stSG2532是該區(qū)域的STS。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的描述，通過一些諸如輻射-雜合體法的方法，證實這5個STS的所有染色體位置對應于人染色體1上的標記D1S214和D1S244之間的區(qū)域。該標記的位置對應于1p36.1。因此，可認為人ICAT基因位于人染色體1p36.1。在成神經(jīng)細胞瘤，黑素瘤，嗜鉻細胞瘤，肺癌，肝癌，結(jié)腸癌等中，在1p35-36上有一些染色體缺失，因此，這是據(jù)認為存在腫瘤抑制基因的染色體區(qū)域(基因染色體&癌癥16，211(1996))。當考慮到ICAT能抑制由β-連環(huán)蛋白/Tcf-4介導的轉(zhuǎn)錄刺激活性這一事實時，可以認為ICAT作為腫瘤抑制基因起作用，因此可用于癌癥的診斷和基因治療。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，其具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的，本發(fā)明還涉及編碼該蛋白質(zhì)的DNA，識別該蛋白質(zhì)的抗體，含有所述蛋白質(zhì)或DNA的治療劑，和含有所述抗體的診斷試劑。
序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社(KYOWA HAKK0 KOGYO CO.，LTD)<120>轉(zhuǎn)錄激活抑制蛋白<130>11207WO1<140><141><150>JP 99/120266<151>1999-4-27<160>6<170>PatentIn 2.0<210>1<211>2997<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(274)..(516)<400>1ggccgctcct gctgctgcta ctgccgccgc cgcagcggct gctcgggctg agcacgcccc 60ggaacaggcc gccgcgcgct gcgcgccgga cccgctgccc ctgccggccc ggccgggtcg 120ggcggcccag ggaccgacag acttgacaac ggtgacagca ctggggcggc accttcctac 180ttctgcccag ccacagccct cccctcacag ttgagcacct gtttgcctga agttaatttc 240cagaagcagg agtccccaga gccaggcagg ggg atg aac cgc gag gga gct ccc 294Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro1 5ggg aag agt ccg gag gag atg tac att cag cag aag gtc cga gtg ctg 342Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile Gln Gln Lys Val Arg Val Leu10 15 20ctc atg ctg cgg aag atg gga tca aac ctg aca gcc agc gag gag gag 390Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu25 30 35ttc ctg cgc acc tat gca ggg gtg gtc aac agc cag ctc agc cag ctg 438Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val Asn Ser Gln Leu Ser Gln Leu40 45 50 55cct ccg cac tcc atc gac cag ggt gca gag gac gtg gtg atg gcg ttt 486Pro Pro His Ser Ile Asp Gln Gly Ala Glu Asp Val Val Met Ala Phe60 65 70tcc agg tcg gag acg gaa gac cgg agg cag tagctgcaaa gcccttggaa 536Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg Gln75 80caccctggat gctgttgaag ggccaagaga tctgtgtggc tcctgggccg gctgaatggc 596agcagccccc cttgccccac ctcccccttc cctacccaac cctgccctgc cccaccccac 656ctcacagcta ctcagtgggg ctggcatcaa gggagacacc agtggtgcgt ttataattgg 716cttaaaggga tggacttgtg attggctgca ggaagaaact tttttatttt ttaaatcttg 776accaacagaa accttttatt tttatttctg actcttattt tttaaaaaat ttgcgcctcg 836gtatctggct tccctggaag ctctccgagc tctggtgctt tagttaggtc atttttttag 896aaatgtgaag aggtctgatt ggctgcttaa actggaaagg gactgtgatt ggctggttaa 956tgggaaacgg tttttttctt tggctgcagg tgttctgctg atatcaacag cttccctatt 1016ttgaatgcag aaaacagggt ctgggacatt agtcgttata tttgacttga aaagaaagaa 1076accaagtgcg ctttgcaata tttattacac aaagaacttg ctgctgcctt cacatttggg 1136gtttgtgttt gattggcttt cgatgcgtgt gtttggtttc ccattggttc acctgtgact 1196cctgttgcca tggattcacc cccctctgct gccggctctg ggcctgaggg tccacctgga 1256gagtacattt gctttaatga gtgcacctgc ctccaccagc aaggggaccc cgagaaccct 1316gagcagggtc cacagctgga aagttgggcc cctgaggagc tttgtgtcgt cttgaacgag 1376cagcccaggg cctagaggta accgttaggc gggatttatg tgcactgcct gcatgagctg 1436gcaaccagcc agcgtccctt ggtgagaaag ggattgctga ggcaccgtcc aggccccacc 1496ggccaggccg cgcccagcag aggcgtacta cccagctctg tcctcttggc catccttctg 1556tgtaccactt cctgaggcct cattttgggg gtcatcttgg aaaggggagg agcttctccc 1616agtgtgagac cccaaagact ctggaggtca tctggcggag gtctctggga gcccagaacc 1676cacataaaag ccccagcttg gctcacaagg cccaggagac ctccagctaa acaccaaccc 1736ctgacctacc ccagccaggc tcctacctgt ctgctgccag cacagtaggt cccggccagc 1796tctggagttc tctcatcgga ggcccatgcc ctccactcca ctgcctttgg aagggtctct 1856ctccaggtca gcctggaagg gacagtatcg tttgtttatg aaatgccact gggacagctg 1916gctgggcctt caccaagcaa gtcccttcag actggccctt aagccaaact caggcccaga 1976attgcagttc agaatggcag tcctggaggc agggggtgag gggcaggtct agtgttcctg 2036caccaaacct aagtccttcc acctgccacc cccttccctg ggagggaggt ggtcctccta 2096tctccctggc tcactggcag gtgtgggatc tggggagagc ggctggagaa agatgcagtc 2156ctcaggaagg gggccgccac cctcccctat gctggtagat gctgaggccc ctaggtgccc 2216agggccagtg ggaccctctc agaaccaaat ctttcccctt tctcggggct tggggctcgg 2276gccgtagggg ctcctgagtg tcatgaagtg cacaggagcc aaatgaccga gccctggaga 2336gccccatggt gggtaggtgg ttcgtgctgt gctctggcac catcagcctg ttccagaagg 2396aggattcgag catcaggcta agaccctgtg tcctccacca tgcactcacc cctagccctg 2456gttagctgac agtcagctgt ggggaacaca gctacaaccc taccctggca gggacctgag 2516agcatctcag gaggggcagc gcatgtgtgc atgtgctgtg tgagtgagca cacccgtgtg 2576cacactcata cacatgtgca cacacacgca ctctccccgc tcaggggcct ggaggtctgg 2636ctgagcccct ggggaaaggt gagttctttc atctccctcc tccaggtcgg agtgcctgga 2696gtcaggtgtc gaggccacat tgctggctgc cccctctttg tagctcctat aaagggccca 2756cacctggtgg atacctggtt gagcgtgtgg tctctgcccc agcctgtcct tgtcacgatc 2816acaggccttg cttttgtaac aatgatgacc ccggcctgtc tcatcttctg aagaggaaaa 2876gtcaaagtgt tgctgtggct ccatatttca actaaaaata tatctgttgg agaaagaaat 2936taacaataaa gaattttcat aggttaaaaa aaaaaaanaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa 2996a 2997<210>2<211>81<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1 5 10 15Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn20 25 30Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val35 40 45Asn Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Pro His Ser Ile Asp Gln Gly Ala50 55 60Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65 70 75 80Gln<210>3<211>2606<212>DNA<213>小鼠(Mouse musculus)<220><221>CDS<222>(167)..(409)<400>3caggccgccg cgctccggac ccgcagcccc cggcgccgcg cgttcgggcg gcccagggcg 60gcaccttgct atttcttctc aggcgcggtc ctccccttag agttgagcat ctgtttgcct 120gaagtgaatt tccagaagca ggtgtcccca gaactgggcc aggggg atg aac cgc175Met Asn Arg1gag gga gca ccc ggg aag agt ccg gag gag atg tac att caa cag aag 223Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile Gln Gln Lys5 10 15gtc cgc gtg ctg ctc atg ctg agg aag atg ggg tca aac ctg acc gcc 271Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn Leu Thr Ala20 25 30 35agt gag gag gaa ttt ctg cgc acc tat gct ggg gtc gtc agc agc cag 319Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val Ser Ser Gln40 45 50ctc agc cag ctg cca cag cac tcc atc gac cag ggt gca gag gac gtg 367Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala Glu Asp Val55 60 65gtg atg gcg ttt tcc aga tcg gag acg gaa gac cgg agg cag 409Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg Gln70 75 80tagctggaag cccctcggaa ctccctggaa gctgcagatg gccaagagat ctgtgtggct 469cctctgccgg ttgagtggta gcaaaccacc gtcttcttac cctttgcacc ccttacccca 529tccgaccctc cccacccagc cgccactcag cagggctggc atcaaggtgg tttgtgattg 589gcttaaaggg atggacttga gattggctgc aggaagaaac ctttttattt ttaaatcttg 649actaacggaa accttttatt tttatttctg actctttatt tttttaaaca tttgcgcctc 709ggtatctggc ttccccggaa gctctccgag ctctggtgct ttatttaggt catttttagg 769aatgtgaaga ggcctgattg gttgcttaaa ctggaaaagg gttatgattg gctggctagt 829gggacgtggt cttttctttg attggctata ggtgttctgt tcacatcacc gacttcctct 889gttctgaaag cagaaaacgg ggtttgggat attgttatat ttgacttgaa aaaaaaaaaa 949aaagaaagaa atgaagtgag ctttgcaata tttattacac aaagagctgg ctgctgcctt 1009cacgtagtgg gtttgtgttt ggatttgatt ggcagtaaga tgcgggtttg gtttcccatt 1069ggctcacccc tgactcccgt tgctatggtc tttcttccac tctgctggtt acatgaggcc 1129tgagggtaca cctggagaat gcacgtgctt taatgaccac acctgcctcc accagcgaag 1189ggaccccagg gacgcgagcg cgagcggggt ccacagctgg agaacaggcc cccaaggggc 1249tttgtgttct cctgagccag cagcccagag ctcaggggtg accgggaggc aggattgatg 1309tactcagttc taagagctgg cagccagcca gtttcctgga gcgaatggat tgtgcagagc 1369tcttcaggcc tttctggcca gcccatgcta agtacaggag tgttgaccgg cagctccagc 1429ctctctgctg ccccctgtgt ctcacttccc caggtcttgg catccccaga tcctgaaggt 1489tatgaggggt ctttactgga gccttgaacc caagcagata ccccagtttc acttctagaa 1549ccccagaggt ttcaaacttg gctccaagca caacctagcc aggcttccca gggtccattg 1609ccagtggctg tagttcccgg atagcagatg tgttctacct gagcccaggc ccccattaca 1669ccgtgtatca ccctgtgtgt cagcatagaa gggggagtag catggcttat ttattaggaa 1729gcacccactt ggaagaccag ctagactttc acacagtagg ccccacaggc tactcagatc 1789cagcccaagg gtcacatttt agagcagcga ctgagaagaa agatatgggt ggtcgtccca 1849tgcccaccat gccttccctg ggagtgagag aaacggtgac ggccctttct ggtcctgggc 1909accatgatcc ggaaaacact ggagcatctt ttcccttctt ggggcttcgg cctcccgtgt 1969ggcagggagt gtgcaggatg ccagtgccag caggtcttga gttcaagccc tggggcacct 2029ccctgttggt ggacggttca agcttcccag acatgtccca ggaggagaat gtgaacatct 2089ggtccctcag cacatcggcc ctgttagctg acagtaacat gctcgctttg gccattgagc 2149tccagggagc aaggacagtg gagaatcagc tccgccaacc ccagcctgac cagcaagagc 2209ctgagaggag agcgtcattg ctggggagga gcagcgtgtg tgagcaggca cggtatgagc 2269tcacactgac tgacagacgc gtgcttgttc tgctggcgca gtgtggcctg gagatgtggc 2329tgggcccgtg ggcagagatg gggtcattca gtcttcctcc cctgtgagat tgtatctaaa 2389gtccggtgtt gccagcttca gttggttcct gtgactgcct cgaggccaag ccctggtgat 2449ggtgtgtgct ctgtcttagc agtggttctc ggctcagcct ctgagggaaa aagatgcaag 2509tatcgatgtg gcttcttatt ctaactgaaa gtctatctaa tggagaaaaa aaataacaat 2569aaagattttt cacagctaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2606<210>4<211>81<212>PRT<213>小鼠(Mouse musculus)<400>4Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1 5 10 15Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn20 25 30Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val35 40 45Ser Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala50 55 60Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65 70 75 80Gln<210>5<211>243<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(243)<400>5atg aac cgc gag gga gct ccc ggg aag agt ccg gag gag atg tac att 48Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1 5 10 15cag cag aag gtc cga gtg ctg ctc atg ctg cgg aag atg gga tca aac 96Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn20 25 30ctg aca gcc agc gag gag gag ttc ctg cgc acc tat gca ggg gtg gtc 144Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val35 40 45aac agc cag ctc agc cag ctg cct ccg cac tcc atc gac cag ggt gca 192Asn Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Pro His Ser Ile Asp Gln Gly Ala50 55 60gag gac gtg gtg atg gcg ttt tcc agg tcg gag acg gaa gac cgg agg 240Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65 70 75 80cag 243Gln<210>6<211>243<212>DNA<213>小鼠(Mouse musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(243)<400>6atg aac cgc gag gga gca ccc ggg aag agt ccg gag gag atg tac att 48Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1 5 10 15caa cag aag gtc cgc gtg ctg ctc atg ctg agg aag atg ggg tca aac 96Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn20 25 30ctg acc gcc agt gag gag gaa ttt ctg cgc acc tat gct ggg gtc gtc 144Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val35 40 45agc agc cag ctc agc cag ctg cca cag cac tcc atc gac cag ggt gca 192Ser Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala50 55 60gag gac gtg gtg atg gcg ttt tcc aga tcg gag acg gaa gac cgg agg 240Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65 70 75 80cag 243Gln
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列。
3.一種蛋白質(zhì)，其含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列且其中一個或多個氨基酸被添加，缺失或取代，所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的。
4.編碼權(quán)利要求1至3中任一項所述蛋白質(zhì)的DNA。
5.一種DNA，其含有選自根據(jù)SEQ ID NO1，3，5和6的核苷酸序列的核苷酸序列。
6.一種DNA，其在嚴緊條件下能與權(quán)利要求4或5的DNA雜交，并且能編碼一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄激活的活性，所述轉(zhuǎn)錄激活是由β-連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的。
7.重組DNA，所述DNA可通過將權(quán)利要求4至6中任一項所述DNA插入載體而得到。
8.含有權(quán)利要求7所述重組DNA的轉(zhuǎn)化子。
9.生產(chǎn)權(quán)利要求1至3中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子，在培養(yǎng)中產(chǎn)生并積累權(quán)利要求1至3中任一項所述的蛋白質(zhì)，從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)。
10.癌癥治療劑，其中所述治療劑含有權(quán)利要求1至3中任一項所述的蛋白質(zhì)作為有效成分。
11.癌癥治療劑，其中所述治療劑含有權(quán)利要求4至6中任一項所述的DNA作為有效成分。
12.用于癌癥基因治療的載體，其中所述載體含有權(quán)利要求4至6中任一項所述的DNA。
13.含有權(quán)利要求4至6中任一項所述DNA的核苷酸序列中連續(xù)5至60個殘基組成的核苷酸序列的寡核苷酸，含有該寡核苷酸序列的互補序列的寡核苷酸，或這些寡核苷酸的衍生物。
14.癌癥診斷試劑，其中所述診斷試劑含有權(quán)利要求13所述的寡核苷酸作為有效成分。
15.能識別權(quán)利要求1至3中任一項所述蛋白質(zhì)的抗體。
16.免疫檢測權(quán)利要求1至3中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法利用了權(quán)利要求15所述的抗體。
17.免疫定量權(quán)利要求1至3中任一項所述蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法利用了權(quán)利要求15所述的抗體。
18.癌癥診斷試劑，其中所述診斷試劑含有權(quán)利要求15所述的抗體作為有效成分。
19.權(quán)利要求10或11所述的治療劑，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。
20.權(quán)利要求12所述的載體，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。
21.權(quán)利要求18所述的診斷試劑，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì),其能與β－連環(huán)蛋白結(jié)合,因而能抑制轉(zhuǎn)錄激活,所述轉(zhuǎn)錄激活是由β－連環(huán)蛋白與屬于TCF/Lef家族的蛋白質(zhì)形成復合物而誘導的,本發(fā)明還涉及編碼該蛋白質(zhì)的DNA,識別該蛋白質(zhì)的抗體,含有所述蛋白質(zhì)或DNA的治療劑,和含有所述抗體的診斷試劑。
文檔編號C12N15/12GK1364172SQ00809228
公開日2002年8月14日 申請日期2000年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月27日
發(fā)明者秋山徹, 中村勉, 多胡賢一 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社