專利名稱：新型多肽及其dna的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及調節(jié)細胞分泌機能的新型蛋白及其DNA。
背景技術：
不論是原核細胞還是真核細胞，其細胞本身都具有分泌各種蛋白的功能。尤其是多細胞生物體(機體)其分泌蛋白在細胞間傳遞著各種信息以維持機體的分化、增殖及其個體的恒常性。然而這里起著重要作用的各種液體因子它們大多數(shù)都是分泌蛋白或具有一定功能的質體。如果從其結構、功能特征等可將其分為激素、神經遞質、細胞因子、增殖因子等。近年來，隨著重組DNA技術和細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，闡明編碼所述分泌蛋白的基因及其蛋白結構正在穩(wěn)步地發(fā)展。另一方面，這些因子的發(fā)現(xiàn)加速了對受體蛋白在細胞表面上表達的研究，并進一步能夠闡明各細胞之間信息傳遞的機制，同時給予其細胞生理機能之特征。本應保持其自身穩(wěn)定的某種液體因子，卻因其異常表達而導致人類多種疾病，或者在各種疾病動物模型上模擬病態(tài)原因，使之病情惡化，除此之外，例如，所謂腫瘤標記等在癌癥上認為是一種特異性表達的亢進，它可適用于診斷各種疾病，同時在研發(fā)新藥的基礎上可成為控制表達機制的一個重要的指標。
1994年Blesch等發(fā)表了一種抑制黑素瘤蛋白質MIA(melanomainhibitory activity)該蛋白屬于所述范疇的一種分泌蛋白。當時，如其名稱一樣，將抗黑素瘤細胞的增殖活性作為指標分離了黑素瘤細胞培養(yǎng)物上清液，并得到該基因[「癌癥研究」54，5695-5701，1994]。其后，在1996年Sabdell等將本蛋白質的相同基因再次鑒定為由牛軟骨細胞產生的視黃酸敏感蛋白質CD-RAP(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein)，該蛋白質在生理學上對關節(jié)的發(fā)育和維持起著一定的作用(生物化學雜志271，3311-3316，1996)。MIA-CD-RAP基因在人、小鼠、大鼠、牛的種間雖然在氨基酸水平上具有很高的乃至85％以上的同源性，但是迄今為止在已知的蛋白質中還沒有發(fā)現(xiàn)具有同源性的蛋白質。另外從牛、大鼠遺傳學上分析，認為與本基因相似的基因是不存在的(生物化學雜志271，3311-3316，1996)。
另一方面，現(xiàn)在，一個生物個體所具有的全部DNA，也就是說分析基因組的構造已經在細菌中完成了數(shù)個，人的基因構造分析預計還要幾年時間。所預計的人類基因數(shù)甚至超過10萬以上，的確迄今為止，編碼大量的分泌蛋白或分泌肽的基因雖然已被分離，但是從它的數(shù)量上來看，無法網羅整個基因組的全部。在個體水平上除了了解生命現(xiàn)象還要說明在生命現(xiàn)象當中可能引起的所有細胞之間的信息傳遞現(xiàn)象，然而，除了已知基因外，未知的液體機能分子有可能起著重要的生理功能，在這方面，極大地丞需發(fā)現(xiàn)這樣的物質。
本發(fā)明的目的就是提供一種調節(jié)細胞分泌機能的新型蛋白質(以下，稱為MLP蛋白質或MLP)、提供該蛋白質的部分肽或其鹽、編碼該蛋白質的DNA、重組載體、轉化體、生產該蛋白質的方法、含有該蛋白質或DNA的藥物、針對該蛋白質的抗體、篩選受體激動劑或拮抗劑的方法及其用于篩選的試劑盒、通過該篩選所得到的受體激動劑或拮抗劑及其藥物等。
分離調節(jié)細胞分泌機能的新型蛋白質不僅對細胞的分化、增殖、癌變等機制給與新的認識，而且可進一步推進個體發(fā)生、恒常性維持等生命現(xiàn)象的闡明，對于該蛋白質來說，可以抑制或促進其活性的發(fā)揮，并能在預防、診斷和治療各種疾病方面上開發(fā)新的藥物。
發(fā)明公開本發(fā)明人經過反復鉆研終于從人胎兒腦、鼠胎cDNA文庫中成功地完成了2種新型堿基序列cDNA的篩選。本發(fā)明人又發(fā)現(xiàn)被所得cDNA編碼的蛋白質為具有調節(jié)細胞機能活性的MIA/CD-RAP樣蛋白質MLP的前體蛋白，從MLP前體上由信號序列切割并生成的MLP為分泌蛋白?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進行了廣泛的研究，得出了結論，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，所述多肽含有與SEQ ID NO24所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；
(2)(1)中1所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，該多肽含有與SEQ ID NO6所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(3)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO26所示氨基酸序列；(4)(2)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ ID NO6所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO12所示氨基酸序列；(5)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO49所示氨基酸序列；(6)(2)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ ID NO6所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO47所示氨基酸序列；(7)一種DNA，其包含編碼(1)中所述多肽的堿基序列的DNA；(8)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO23所示的堿基序列；(9)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO4所示的堿基序列；(10)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO10所示的堿基序列；(11)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO25所示的堿基序列；(12)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO48所示的堿基序列；(13)(6)中所述的DNA，其中所述編碼(1)中多肽的堿基序列為SEQ IDNO46所示的堿基序列；(14)一種重組載體，其含有(6)所述的DNA；(15)一種轉化體，其用(14)所述重組載體轉化而成；(16)一種生產(1)所述的多肽、或其酰胺或其酯或其鹽的方法，其包含培養(yǎng)(15)所述轉化體，并從中產生多肽；(17)一種抗體，其針對(1)中所述多肽、其酰胺或其酯或其鹽；(18)一種篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽能夠促進或抑制(1)中所述多肽或其鹽的活性，該方法包括使用(1)中的多肽或其酰胺或其酯、或其鹽；
(19)一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽能夠促進或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性，該試劑盒包括(1)中所述多肽或其鹽；(20)一種能夠促進或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用(18)中所述篩選法或(19)中所述篩選試劑盒而獲得；(21)一種藥物，其包含能促進或抑制(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用(18)中所述篩選法或(19)中所述篩選試劑盒而獲得；(22)一種藥物，其含有(1)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽；(23)一種預防和/或治療骨疾病或關節(jié)疾病或者有病的血管新生藥物，所述藥物含有(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽；(24)一種診斷試劑，其含有權利要求17的抗體；本發(fā)明又進一步提供(25)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列是與SEQ ID NO24所示氨基酸序列至少具有約50％同源性的氨基酸序列(優(yōu)選同源性至少約60％，進一步優(yōu)選至少約70％，較優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％)；(26)(1)中所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列是①SEQ ID NO24所示氨基酸序列，其中有1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸)被缺失；②SEQ ID NO24所示氨基酸序列，其中有1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～40個氨基酸，更優(yōu)選1～30個氨基酸)被添加；③SEQ ID NO24所示氨基酸序列，其中有1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸)被其它氨基酸所取代；或者④上述氨基酸序列組合形成的序列。
又，本發(fā)明的DNA以及多肽、其酰胺、其酯、或其鹽等可用于基礎性研究如，分子量標記、組織標記、染色體作圖、遺傳病鑒定、引物和探針的設計等。
附圖簡述


圖1為人MLP前體(hMLP)、小鼠MLP前體(mMLP)、人MIA前體(hMIA)、小鼠MIA前體(mMIA)、大鼠MIA前體(rMIA)、以及牛MIA前體(bMIA)的氨基酸序列。
圖2為通過實施例6進行的蛋白質印跡分析結果。所用第一抗體為抗FLAG抗體。
圖中表示，在COS-7細胞中各自轉染了下列物質培養(yǎng)物上清液的電泳泳道，泳道1為轉染小鼠MLP(無FLAG標記)、泳道2為轉染小鼠MLP-FLAG、泳道3為轉染小鼠MIA(無FLAG標記)、泳道4為轉染小鼠MIA-FLAG、泳道5為轉染人MLP(無FLAG標記)、泳道6為轉染小鼠MLP-FLAG。
圖3為通過實施例6進行的蛋白質印跡分析結果。所用第一抗體為抗MLP抗血清。
圖中表示，在COS-7細胞中各自轉染了下列物質培養(yǎng)物上清液的電泳泳道，泳道1為轉染小鼠MLP(無FLAG標記)、泳道2為轉染小鼠MLP-FLAG、泳道3為轉染小鼠MIA(無FLAG標記)、泳道4為轉染小鼠MIA-FLAG、泳道5為轉染人MLP(無FLAG標記)、泳道6為轉染小鼠MLP-FLAG。
圖4為通過實施例6進行的免疫染色結果。左圖為對照實驗結果，免疫前采用了家兔血清，右圖為實驗結果，為采用了抗MLP抗血清。
本發(fā)明實施方案的最佳形式在本發(fā)明中，含有SEQ ID NO24所示氨基酸序列的多肽(下文通常稱為″人型多肽″)、SEQ ID NO26所示氨基酸序列的多肽(下文通常稱為″小鼠型多肽″)、SEQ ID NO49所示氨基酸序列的多肽(下文通常稱為″大鼠型多肽″)、以及含有基本與人型多肽相同的氨基酸序列的多肽(下文通常將″人型多肽及含有基本與人型多肽相同的氨基酸序列的多肽統(tǒng)稱為本發(fā)明多肽″)均可來自人或溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家雞、兔子、豬、綿羊、牛、猴子等)細胞中的多肽，還有重組多肽，或者合成多肽。所述細胞如肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠質細胞、胰腺β細胞、骨髓細胞、腎小球膜細胞、朗格罕氏細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例如，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞)、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、或間質細胞、或這些細胞的前體細胞、干細胞或癌細胞等；或含此類細胞的組織的多肽，所述組織例如腦、腦的任何部分(例如，嗅球、屏狀核、大腦基底神經節(jié)、海馬、丘腦、下丘腦、大腦皮質、延髓、小腦)、脊髓、垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾、唾液腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關節(jié)、骨骼肌等。
又，如果本發(fā)明多肽中含有信號多肽時，則可以使該多肽更有效地分泌到細胞外。
那么，所述與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列，可舉例為，具有與SEQ ID NO24所示氨基酸序列同源性至少約50％的氨基酸序列，優(yōu)選同源性至少約60％，較優(yōu)選至少約70％，進一步優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。更具體地說，可舉例為SEQ ID NO26所示氨基酸序列，或SEQ ID NO49所示氨基酸序列。
有時將含有SEQ ID NO24所示氨基酸序列的多肽稱為人MLP或人MLP蛋白，將含有SEQ ID NO26所示氨基酸序列的多肽稱為小鼠MLP或小鼠MLP蛋白，將含有SEQ ID NO49所示氨基酸序列的多肽稱為大鼠MLP或大鼠MLP蛋白，再將這些蛋白統(tǒng)稱為MLP。
那么，所述含有與SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽，其多肽可舉例為，如含有SEQ ID NO6所示氨基酸的序列或含有與該序列基本相同的氨基酸序列。
進一步，所述與SEQ ID NO6所示氨基酸序列基本相同的序列，可舉例為，具有與SEQ ID NO6所示氨基酸序列同源性至少約50％的氨基酸序列，優(yōu)選同源性至少約60％，較優(yōu)選至少約70％，進一步優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。更具體地說，可舉例為SEQ ID NO12所示氨基酸序列，或SEQ ID NO47所示氨基酸序列。
有時將含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽稱為人MLP前體或人MLP前體蛋白，將含有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的多肽稱為小鼠MLP前體或小鼠MLP前體蛋白，將含有SEQ ID NO47所示氨基酸序列的多肽稱為大鼠MLP前體或大鼠MLP前體蛋白，再將這些蛋白統(tǒng)稱為MLP前體。
所述含有與本發(fā)明中的SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽，優(yōu)選這樣一種多肽，例如具有與所述SEQ ID NO24所示氨基酸序列基本相同的序列，并且具有與該多肽性質基本相同。
又，所述含有與SEQ ID NO6所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽，優(yōu)選這樣一種多肽，例如具有與所述SEQ ID NO6所示氨基酸序列基本相同的序列，并且具有與該多肽性質基本相同。
所述性質基本相同的例子有，如由分泌而形成的具有液體因子功能。所謂性質基本相同是指，它們的性質在定性上相同。因此，優(yōu)選其分泌作用或溶解性等相同(例如，約0.1-100倍，優(yōu)選約0.5-10倍，更優(yōu)選0.5-2倍)。然而，這些性質的強弱或多肽分子量等其量化要素可以不盡相同。
本發(fā)明的多肽可以包括所謂的突變蛋白，如包含下述的多肽(i)SEQ IDNO24或6所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，更優(yōu)選1～10個氨基酸，最優(yōu)選1～5個氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO24或6所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～40個氨基酸，更優(yōu)選1～30個氨基酸，更優(yōu)選1～10個氨基酸，最優(yōu)選數(shù)個(1-5)氨基酸)被添加；(iii)SEQ ID NO24或6所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，更優(yōu)選1～10個氨基酸，最優(yōu)選數(shù)個(1-5)氨基酸)被插入；(iv)SEQ ID NO24或6所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，更優(yōu)選1～10個氨基酸，最優(yōu)選數(shù)個(1～5)氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(v)上述氨基酸序列的組合。
如上在氨基酸序列中插入、缺失或取代時，其插入、缺失或取代的位置不作特別限定。但下面的例子除外，與SEQ ID NO24、SEQ ID NO26及SEQ ID NO49所示氨基酸序列相同的位置，與SEQ ID NO6、SEQ IDNO12及SEQ ID NO47所示氨基酸序列相同的位置。
本說明書中的多肽可以用本領域已知的描述肽的方法來定義。即，左末端為N-末端(氨基端)，右末端為C-末端(羧基端)。本發(fā)明多肽中包括SEQID NO24所示的氨基酸序列，C-末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可為酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
R代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、或正丁基等；C3-8環(huán)烷基包括環(huán)戊基和環(huán)己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，還有通常用作口服給藥的酯的三甲基乙酰氧甲基。
當本發(fā)明多肽在C-末端以外的位置上包括一個羧基(或羧酸酯)時，它可以酰胺化或酯化，則這類酰胺或酯也可以包括在本發(fā)明所述多肽的范圍之內。所述酯基可以與上述C-末端的酯基相同。
另外，本發(fā)明多肽可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸殘基(如甲硫氨酸)的氨基用保護基(C1～6酰基，如甲?；⒁阴；菴1～6烷?；?保護；所述N末端在體內切割，形成的谷氨?；构劝彼峄?；所述多肽分子中氨基酸側鏈上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受適當基團(C1～6酰基，如甲酰基、乙?；菴1～6烷?；?保護，或結合多肽如通過糖鏈連接的糖多肽等。
作為本發(fā)明的多肽或其鹽，可以使用與生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機酸或有機酸)形成的鹽，尤其優(yōu)選生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
本發(fā)明多肽或它們的鹽既可用公知的從人或其它溫血動物細胞或組織中純化多肽(蛋白質)的方法來制備。又可以通過培養(yǎng)含有編碼多肽的DNA轉化體而制備(如下述)，也可用下述肽合成法來制備。
當從人或哺乳動物組織或細胞中制備多肽或它們的鹽時，首先將人或哺乳動物組織或細胞勻漿，然后用酸等抽提，通過反相層析、離子交換層析等多種層析技術的聯(lián)用來分離純化該抽提物。
為了合成本發(fā)明多肽、或其鹽或其酰胺物，可以使用可用于多肽(蛋白質)合成的商用樹脂。這類樹脂的實例包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基苯甲醇樹脂，4-甲基二苯甲基胺樹脂，PAM樹脂，4-羥甲基甲苯乙酰胺甲基樹脂，聚丙烯酰胺樹脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羥甲基)苯氧基樹脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂時，將那些α-氨基及側鏈上官能團受到相應保護的氨基酸，在樹脂上按目標多肽的序列順序，用本領域公知的各種縮合方法縮合。反應結束時，將多肽從樹脂上切除下來，同時除去保護基團。然后在高度稀釋的溶液中進行分子內二硫鍵的形成反應，以獲得目標多肽、或其酰胺物。
進行上述受保護氨基酸的縮合反應時，可使用多肽合成的多種活化試劑，但優(yōu)選使用碳二亞胺。所述碳二亞胺有DCC、N，N′-二異丙基碳二亞胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨?；?碳二亞胺。用這些試劑活化時，直接在樹脂上添加受保護的氨基酸及外消旋抑制劑(例如，HOBt，HOOBt)，或先將受保護的氨基酸活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到樹脂上。
適用于受保護氨基酸的活化反應或適用于與樹脂的縮合反應的溶劑選自已知可用于多肽(蛋白質)縮合反應的溶劑。這樣的溶劑有酰胺類如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；鹵化烴類如亞甲基鹽酸鹽和氯仿等；醇類如三氟乙醇等；亞砜類如二甲亞砜等；醚類如吡啶、二惡烷和四氫呋喃等；腈類如乙腈和丙腈等；酯類如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及這些溶劑的適當混合物。反應溫度從已知適用于多肽(蛋白質)成鍵反應的范圍中選取，通常選約-20℃-50℃?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ赃^量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反應檢驗所述縮合反應；當所述縮合不充分時，可通過不除去保護基團而重復縮合反應來完成。當即使重復反應后仍未充分縮合時，用乙酸酐或乙酰咪唑將未反應的氨基酸乙酰化，以消除對后續(xù)反應的可能負影響。
用于保護初始氨基的保護基團有Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧羰基、4-甲氧芐氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、鄰苯二甲?；?、甲?；?、2-硝基苯基亞硫?；?、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保護，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基和2-金剛烷基等的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化為芐酯、4-硝基芐酯、4-甲氧芐酯、4-氯芐酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化，芐氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
絲氨酸的羥基可以通過例如酯化作用或醚化作用來保護。適于酯化作用的基團有低級C1～6烷?；缫阴；?，芳?；绫郊柞；?，以及來自碳酸的基團如芐氧羰基和乙氧羰基。適于醚化的基團有苯甲基、四氫吡喃基和叔丁基等。
適于保護酪氨酸中酚羥基的基團有Bzl，Cl2-Bzl，2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基等。
適于保護組氨酸中咪唑基的基團有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺?；NP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相應的酸酐、疊氮化物、活化酯(帶有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、對硝基苯酚、HONB，N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)。將初始物質中待活化氨基酸的氨基活化時，可以使用其相應磷酰胺。
為了除去(脫離)保護基，在氫氣流下用Pd-黑或Pd-碳等催化劑進行催化還原；用氫氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或這些酸的混合液進行酸處理；用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等堿進行堿處理；以及用液態(tài)氨中的鈉還原。用上述酸處理除去所述保護基團的反應通常在約-20℃～40℃進行。在酸處理中，添加陽離子清除劑以使反應有效進行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、間甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚處理以除去已知可作為組氨酸中咪唑的保護基團的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保護基團的甲?；孟率龇椒ㄈコ?，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在時用上述酸進行處理，以及用氫氧化鈉稀溶液和稀氨水等堿進行處理。
與起始物質之反應無關的官能團的保護、保護基的選擇、該保護基的消除、以及與上述反應有關的官能團的活化，從公知的基團和公知的方法中適當選擇。
獲得酰胺化多肽的其它方法有，如先將羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保護；然后，將肽(多肽)鏈從氨基側延伸至預期長度。然后，制備只將其中N-末端α-氨基的保護基團除去的多肽以及只將其中C-末端羧基的保護基團除去的多肽。將這兩種多肽濃縮在上述溶劑的混合液中。濃縮反應的細節(jié)同上。對濃縮所得被保護多肽進行純化后，通過上述方法除去所有的保護基團，獲得所需粗制多肽。該粗制多肽可用各種已知的純化方法進行純化。凍干主要級分獲得所需多肽的酰胺物。
將羧基末端氨基酸的α-羧基與所選醇類縮合獲得氨基酸酯，然后用與上述制備酰胺化多肽方法類似的方法獲得所需酯化本發(fā)明多肽。
本發(fā)明多肽或它們的鹽可通過已知的肽合成方法而制備。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，將能構成本發(fā)明部分肽的部分肽或氨基酸與本發(fā)明多肽的其他部分縮合在一起。當產物中包含保護基團時，除去這些保護基團得到所需肽。用來縮合或除去保護基團的公知方法見下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，紐約(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，紐約(1965)3)泉屋信夫等多肽合成與實驗，丸善公司(1975)4)矢島治明和榊原俊平生物化學實驗教材1，蛋白質化學IV，205(1977)5)矢島治明主編藥物開發(fā)續(xù)篇，卷14，肽合成，廣川書店反應完成后，可將常規(guī)純化方法如溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析以及重結晶等進行組合以純化回收本發(fā)明多肽。當用上述方法獲得的多肽為游離形式時，可以用公知的方法或其改良方法將所述肽轉化為相應鹽；當所述多肽以鹽形式獲得時，可以用公知的方法或改良方法將其轉化為游離形式。
編碼本發(fā)明多肽的DNA可為任意DNA，只要其含有編碼本發(fā)明所述多肽的堿基序列。這類DNA也可以是基因組DNA、所述細胞或組織的cDNA、合成DNA。
用于上述文庫的載體可以為噬菌體、質粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一種。所述DNA可以用從上述細胞或組織中制備的總RNA或mRNA級分通過反轉錄聚合酶鏈反應(以下簡稱為RT-RCR)直接擴增。
編碼本發(fā)明多肽的DNA可以為任一種DNA，只要其具有，例如，SEQID NO23所示堿基序列，或其具有能在嚴謹條件下與SEQ ID NO23所示堿基序列雜交的堿基序列，而且其編碼多肽的活性基本與本發(fā)明多肽的活性(如，免疫原性)相同。
在嚴謹條件下與SEQ ID NO23所示堿基序列能雜交的DNA，分別為與SEQ ID NO23所示堿基序列至少具有約60％同源性的DNA，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。
又，在嚴謹條件下與SEQ ID NO23所示堿基序列能雜交的DNA，或其具有能在嚴謹條件下與SEQ ID NO25所示堿基序列雜交的堿基序列，而且其編碼多肽的活性基本與本發(fā)明多肽的活性(如，免疫原性)相同。
在嚴謹條件下與SEQ ID NO25所示堿基序列能雜交的DNA，分別使用與SEQ ID NO25所示堿基序列至少具有約60％同源性的DNA，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。更具體地說，使用含有SEQ ID NO10所示堿基序列的DNA等。
還有，在嚴謹條件下與SEQ ID NO23所示堿基序列能雜交的DNA或其具有能在嚴謹條件下與SEQ ID NO48所示堿基序列雜交的堿基序列，而且其編碼多肽的活性基本與本發(fā)明多肽的活性(如，免疫原性)相同。
在嚴謹條件下與SEQ ID NO48所示堿基序列能雜交的DNA，分別使用與SEQ ID NO48所示堿基序列至少具有約60％同源性的DNA，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。更具體地說，使用含有SEQ ID NO41或SEQ ID NO46所示堿基序列的DNA等。
可以用公知方法或其改良方法進行所述雜交反應，例如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，(1989)中所述方法。也可以按照所附說明書使用文庫商品。該雜交反應優(yōu)選在高度嚴謹?shù)臈l件下進行。
此處的高度嚴謹條件是，例如鈉離子的濃度約為19-40mM，優(yōu)選約19-20mM，而溫度約為50-70℃，優(yōu)選約60-65℃。
在本發(fā)明中，對于編碼含SEQ ID NO24所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含SEQ ID NO23所代表堿基序列的DNA，而對于編碼含SEQ ID NO6所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含SEQ ID NO4所代表堿基序列的DNA，對于編碼具有SEQ ID NO26所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用具有SEQ ID NO25所代表堿基序列的DNA，對于編碼具有SEQ ID NO12所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用具有SEQ ID NO10所代表堿基序列的DNA，對于編碼含有SEQ ID NO49所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含有SEQ ID NO48所代表堿基序列的DNA，對于編碼含有SEQ ID NO47所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含有SEQ ID NO46所代表堿基序列的DNA。
對完全編碼本發(fā)明多肽進行克隆時，可以用含有本發(fā)明多肽之部分堿基序列的合成型DNA引物按公知的PCR進行擴增，或通過與編碼本發(fā)明多肽之部分或完整區(qū)的標記的DNA片段或合成DNA片段雜交來篩選已插入合適載體中的DNA。雜交反應可以根據分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989)描述的方法進行。也可用商品化的文庫根據所附說明書進行雜交。
DNA堿基序列的轉換可根據眾所周知的方法如Gupped duplex法或Kunkel法或其改進方法，使用PCR或眾所周知的商品化試劑盒如MutanTM-G或MutanTM-K(均來自寶酒造株式會社)進行。
已經克隆的編碼本發(fā)明多肽的DNA，根據需要，或者單獨使用或者經限制酶消化后或連接一接頭之后使用。該DNA可能在其5′端包含ATG作為翻譯起始密碼子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始和終止密碼子也可用合適的合成型DNA接頭加上。
本發(fā)明多肽的表達載體可通過以下方法生產，例如，(a)從編碼本發(fā)明多肽的DNA上切下所需DNA片段，(b)將該DNA片段連接到一合適載體上的啟動子下游。
可以使用的載體包括來自大腸桿菌的質粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌體如λ噬菌體等、動物病毒如反轉錄病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
本發(fā)明所使用的啟動子可以是任意啟動子，只要它能同所用基因表達宿主匹配。在使用動物細胞作為宿主時，啟動子有SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV啟動子、HSV-TK啟動子、β-肌動蛋白等。
在這些啟動子中，優(yōu)選CMV(巨細胞病毒)啟動子或SRα啟動子。如果宿主為大腸桿菌屬的細菌，優(yōu)選的啟動子有trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、1pp啟動子、T7啟動子等。在使用枯草桿菌屬的細菌作宿主時，優(yōu)選的啟動子有SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子等。在用酵母作宿主時，優(yōu)選的啟動子有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子等。在用昆蟲細胞作宿主時，優(yōu)選的啟動子有多角體蛋白啟動子和P10啟動子等。
除了前述的實例，根據需要，表達載體還可使用包含增強子、剪接信號、polyA加尾信號、選擇標記、SV40復制起始子(下文通常簡寫為SV40ori)等。選擇標記的例子包括，二氫葉酸還原酶(下文通常縮寫為dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨芐青霉素抗性基因(下文通?？s寫為Ampr)、新霉素抗性基因(下文通?？s寫為Neor，Geneticin抗性)等。尤其是，當CHO(dhfr-)細胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作為選擇標記時，使用無胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基可以篩選充足的體細胞。
根據需要，可在本發(fā)明多肽的N-端加上同宿主匹配的信號序列。在用大腸桿菌屬細菌作宿主時，可以使用的信號序列為Pho A信號序列、OmpA信號序列等；當用枯草桿菌屬的細菌作宿主時，可以使用的信號序列為α-淀粉酶信號序列、枯草桿菌蛋白酶信號序列等；在用酵母作宿主時，可以使用的信號序列為MFα信號序列、SUC2信號序列等；在用動物細胞作宿主時，可以使用的信號序列為胰島素信號序列、α干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
使用含有如此構建的編碼本發(fā)明多肽的DNA序列的載體，可獲得轉化體。
可以使用的宿主的實例有，屬于大腸桿菌屬的細菌、屬于枯草桿菌屬的細菌、酵母、昆蟲細胞、昆蟲以及動物細胞等。
大腸桿菌屬的細菌有，大腸桿菌(Escherichia coli)K12 DH1(美國國家科學院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物學雜志，120，517(1978))、HB101(分子生物學雜志，41，459(1969))、C600(遺傳學，39，440(1954))等。
枯草桿菌屬的細菌有，枯草桿菌MI 114(基因，24，255(1983))、207-221(生物化學雜志，95，87(1984))等。
酵母有，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆蟲細胞而言，病毒為AcNPV時有草地夜蛾幼蟲(Spodopterafrugiperda，Sf)的細胞株、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中腸的MG1細胞、粉紋夜蛾卵的High FiveTM細胞、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)的細胞、Estigmenaacrea的細胞等；病毒為BmNPV時有家蠶(Bombyx mori)的N細胞(BmN細胞)等。可用的Sf細胞有Sf9細胞(ATCC CRL1711)和Sf21細胞(這兩種細胞均由Vaughn，J.L等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作為昆蟲的例子，可以使用家蠶的幼蟲(前田等，自然，315，592(1985))。
動物細胞包括猴COS-7細胞、Vero、中華倉鼠細胞CHO(以下簡稱CHO細胞)、dhfr基因缺陷的中華倉鼠細胞CHO(以下簡稱CHO(dhfr-)細胞)、小鼠L細胞、小鼠AtT-20細胞、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。
大腸桿菌屬的細菌可以根據美國國家科學院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法進行轉化。
枯草桿菌屬的細菌可以根據分子及普通遺傳學，168，111(1979)中描述的方法進行轉化。
酵母可以根據酶學方法，194，182-187(1991)或美國國家科學院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法進行轉化。
昆蟲細胞或昆蟲可以根據生物/技術，6，47-55(1988)中描述的方法進行轉化。
動物細胞的轉化可以根據《細胞工程學增訂版8，細胞工程學實驗最新方法》秀潤出版社，263-267(1995)或病毒學，52，456(1973)中描述的方法進行。
由此，可以獲得用含有本發(fā)明多肽之編碼DNA的表達載體轉化的轉化體。
當培養(yǎng)宿主為大腸桿菌或枯草桿菌的轉化體時，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有轉化體生長所必需的物質例如碳源、氮源、無機物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括無機或有機物質如銨鹽、硝酸鹽、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黃豆餅粉、馬鈴薯抽提物等。無機物又包括氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。此外，在培養(yǎng)基中也可加入酵母提取液、維生素、促生長因子等。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選約5-8。
用于培養(yǎng)大腸桿菌屬細菌的培養(yǎng)基優(yōu)選為，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培養(yǎng)基(Miller，分子遺傳學實驗雜志，431-433，冷泉港實驗室，紐約，1972)。必要時可以在培養(yǎng)基中加入試劑如3β-吲哚基丙烯酸，來有效激活啟動子。
當用大腸桿菌屬的細菌作為轉化宿主時，轉化體通常在大約15-43℃培養(yǎng)約3-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進行充氣或攪拌。
當用枯草桿菌屬的細菌作為轉化宿主時，轉化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)約6-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進行充氣或攪拌。
當用酵母作為宿主時，轉化體培養(yǎng)在，例如Burkholder氏基本培養(yǎng)基(Bostian，K.L.等，美國國家科學院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培養(yǎng)基(Bitter，G.A.等，美國國家科學院院刊，81，5330(1984))上。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調節(jié)到大約5-8。轉化體通常在大約20-35℃培養(yǎng)約24-72小時。根據需要，培養(yǎng)物可以進行充氣或攪拌。
當用昆蟲細胞或昆蟲作為宿主時，轉化體培養(yǎng)在，例如Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％牛血清等適當添加劑。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調節(jié)到大約6.2-6.4。轉化體通常在大約27℃培養(yǎng)大約3-5天。根據需要，培養(yǎng)物可以進行充氣或攪拌。
當用動物細胞作為宿主時，轉化體培養(yǎng)在，例如含有大約5-20％牛胎血清的MEM培養(yǎng)基(科學，122，501(1952))、DMEM培養(yǎng)基(病毒學，8，396(1959))、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國醫(yī)學會雜志，199，519(1967))、199培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調節(jié)到大約6-8。轉化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)大約15-60小時。根據需要，培養(yǎng)物可以進行充氣或攪拌。
如上所述，本發(fā)明的多肽可以產生在轉化體的細胞外或細胞內。
可以根據下述方法從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的多肽。
在培養(yǎng)后，用眾所周知的方法收集轉化體或細胞，懸浮在一合適的緩沖液中，從中抽提本發(fā)明的多肽。然后用眾所周知的方法破碎轉化體或細胞，如超聲處理、溶菌酶處理和/或反復凍融等，然后離心、過濾，獲得本發(fā)明多肽的粗提物。此過程的緩沖液可包含蛋白變性劑如尿素或鹽酸胍、或表面活性劑如Triton X-100TM等。當所述多肽分泌在培養(yǎng)液中時，在培養(yǎng)結束后，用眾所周知的方法從轉化體或細胞中經分離而收集上清。
上清或包含在所獲抽提物中的多肽可通過將已知的分離和純化方法適當組合來進行純化。這些眾所周知的分離純化方法包括，利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉淀等；主要利用分子量差異的方法如透析、超濾、凝膠過濾、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等；利用電荷差異的方法如離子交換層析等；利用特異性親和力差異的方法如親和層析等；利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜等；利用等電點差異的方法如等電聚焦電泳。
當如此獲得的多肽為游離形式時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉換為鹽。相反，當獲得的多肽為鹽時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉換為游離形式或另一種鹽形式。
重組產生的多肽，在純化前或純化后，可用相應蛋白修飾酶處理，從而使多肽經適當修飾，部分去除一段多肽。其中所述蛋白修飾酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
由此產生的本發(fā)明多肽或它們的鹽的存在，可通過利用特異性抗體的酶免疫分析法或蛋白質印跡法等進行測定。
針對本發(fā)明的多肽或其鹽的抗體，只要所述抗體能夠識別本發(fā)明多肽或其鹽，可為多克隆抗體或單克隆抗體。
針對本發(fā)明多肽或其鹽的抗體可使用本發(fā)明多肽作為抗原，根據本領域公知的抗體或抗血清的生產法制備。(a)產生單克隆抗體細胞的制備將本發(fā)明的多肽或其鹽，單獨或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內能產生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產量，可給予福氏完全或不完全佐劑。有效給藥通常約為每2-6周一次，一共2-10次。使用的溫血動物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、家雞，優(yōu)選小鼠和大鼠。
在制備產生單克隆抗體細胞時，從抗原免疫的溫血動物如小鼠中選擇抗體滴度比較明顯的動物，在最后一次免疫的2-5天后取脾臟或淋巴結，使其中產生抗體的細胞與同種或異種動物的骨髓瘤細胞融合，獲得產生單克隆抗體的雜交瘤細胞?？寡逯锌贵w滴度的測定可以通過使抗血清與標記的隨后所述的多肽反應，然后測定標記試劑同抗體的結合活性。可以根據Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法進行融合。融合加速劑的例子為聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，優(yōu)選PEG。
溫血動物骨髓瘤細胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，優(yōu)選P3U1。所用抗體產生細胞(脾臟細胞)同骨髓瘤細胞的比例優(yōu)選約為1∶1到20∶1，加入濃度約為10％-80％的PEG(優(yōu)選PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保溫。為了有效實施細胞融合，優(yōu)選30-37℃保溫約1-10分鐘。
可以用各種方法篩選產生單克隆抗體的雜交瘤。這些方法有將作為抗原的多肽直接或與載體一起吸附至一種固相(如微量反應板)，將雜交瘤上清加入到該固相中，然后加入標記的放射性物質或酶的抗免疫球蛋白抗體(如果用小鼠細胞作融合，則用抗小鼠的免疫球蛋白抗體)或蛋白A，檢測結合到固相上的單克隆抗體；另一方法為，將雜交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相中，加入標記的放射性物質或酶的多肽，檢測結合到固相上的單克隆抗體。
單克隆抗體的篩選可以根據眾所周知的方法或其改進方法進行。一般地，在含有HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的動物細胞培養(yǎng)基中進行篩選。可以使用任何篩選和生長培養(yǎng)基，只要雜交瘤可以在其中生長。例如，可以使用含有1％-20％，優(yōu)選10-20％牛胎血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)株式會社)、無血清的雜交瘤培養(yǎng)基(SFM-101，日水制藥株式會社)作為篩選或生長培養(yǎng)基。通常在含5％CO2的條件下于20-40℃(優(yōu)選37℃)培養(yǎng)約5天-3周(優(yōu)選1-2周)。雜交瘤培養(yǎng)上清液中抗體滴度的測定同上述抗血清中抗體滴度測定方法相同。
(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離和純化可根據公知方法，例如免疫球蛋白的分離和純化方法(如鹽析、乙醇沉淀、等電點沉淀、電泳、離子交換劑(如DEAE)吸附和去吸附、超離心、凝膠過濾、或一種特異性純化方法，其包括僅收集與結合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附劑相結合的抗體并使之分離以獲得該抗體)。本發(fā)明多克隆抗體的制備用眾所周知的方法或其改進方法進行。例如，用與上述生產單克隆抗體相似的方法生產免疫原(多肽抗原)或配制免疫原與載體蛋白形成的復合物并用其免疫溫血動物。從已免疫的動物收集產物，其中含有本發(fā)明多肽或其鹽的抗體，分離和純化該抗體。
在由免疫原和載體蛋白組成的用于免疫溫血動物的復合物中，對載體蛋白的類型和載體同半抗原的混合比率無限定，只要能針對與載體一起免疫的半抗原有效產生抗體。例如，牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或匙孔蟲戚血藍蛋白與半抗原以載體比半抗原重量比約0.1-20(優(yōu)選約1-5)的比率偶聯(lián)。
不同的縮合劑可用于偶聯(lián)載體和半抗原。戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺活化的酯和含有巰基或二硫代吡啶基的活化的酯試劑可用于偶聯(lián)。
將縮合產物單獨或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內能產生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產量，可給予福氏完全或不完全佐劑。大約每2-6周給藥一次，共3-10次。
多克隆抗體從用上述方法免疫的溫血動物的血液、腹水等(優(yōu)選血液)中收集。
抗血清中多克隆抗體滴度的測定同上述測定血清抗體滴度的方法相同?？梢愿鶕鲜鲇糜诜蛛x和純化單克隆抗體的免疫球蛋白分離純化方法來分離和純化多克隆抗體。
具有與編碼本發(fā)明多肽的DNA(下文，有時稱作本發(fā)明DNA)互補或基本互補的堿基序列的反義DNA可為任一種反義DNA，只要其含有與本發(fā)明DNA互補或基本互補的堿基序列，并能抑制該DNA的表達。
與本發(fā)明DNA基本互補的堿基序列，包括具有與互補于本發(fā)明DNA之堿基序列(即本發(fā)明DNA互補鏈)的全部或部分堿基序列至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％同源性的DNA。尤其是在本發(fā)明DNA互補鏈的全部堿基序列中，反義DNA具有與編碼本發(fā)明多肽上N-末端區(qū)的部分堿基序列(如起始密碼子附近的堿基序列等)的互補鏈至少約70％同源性，優(yōu)選至少約80％同源性，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。這些反義DNA可以使用公知的DNA合成裝置生產合成。
當本發(fā)明多肽包含信號肽時，它能有效地分泌到細胞外，并作為一種液體因子發(fā)揮著重要生物活性的作用，如信息傳遞或自我防御等。
下面闡述本發(fā)明多肽或其鹽(以下通常稱為本發(fā)明多肽)；編碼本發(fā)明多肽的DNA(以下通常稱為本發(fā)明DNA)；針對本發(fā)明多肽或其鹽的抗體(以下通常稱為本發(fā)明抗體)以及反義DNA的用途。
(1)由于本發(fā)明多肽在軟骨組織中能夠進行特異性表達，所以可將其用作組織標記。也就是說，它作為一種標記可來檢測組織的分化、病變、癌轉移等。也可用來提取相應的受體、配體、結合多肽等。另外，它作為本領域公知的用于高產量篩選的組群，可用來研究生物活性。它可進行染色體作圖，進而適用于遺傳病的研究。
(2)與本發(fā)明多肽相關的各種疾病的預防藥物與治療藥物因為本發(fā)明多肽它是以液體因子形式存在于生物體內(尤其是軟骨組織)并具有抑制軟骨分化的功能，所以當本發(fā)明多肽，或本發(fā)明DNA等發(fā)生異?；蛉毕?，或者當表達水平異常減少或亢進時，將導致各種疾病的發(fā)生。
當發(fā)明DNA等缺陷或其表達水平異常減少時，將導致各種疾病的發(fā)生。如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、大理石病等的骨疾病和/或關節(jié)疾病、有病的血管新生等。
因此，本發(fā)明多肽以及本發(fā)明DNA都可作為上述各種疾病的治療藥物或預防藥物使用。如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、大理石病等的骨疾病和/或關節(jié)疾病、有病的血管新生等。
例如，當生物體內本發(fā)明多肽很少或缺失時，當患者不能使其細胞內信息傳遞充分或正常地發(fā)揮作用時，本發(fā)明DNA可以通過以下3種方式充分地或正常地為該患者提供本發(fā)明多肽的作用(a)給予該患者本發(fā)明DNA，以便體內表達本發(fā)明多肽；(b)將本發(fā)明DNA插入細胞中，表達本發(fā)明多肽，或(c)直接將本發(fā)明多肽投藥于該患者體內。
當本發(fā)明DNA用作上述預防/治療藥物時，該DNA本身可單獨使用，或插入合適載體如反轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺伴隨病毒載體后按常規(guī)方法給藥于人或其它溫血動物。本發(fā)明DNA也可以以裸露DNA的形式給藥，或與生理學上承認的用于促進吸收的輔助劑等的載體一起制成藥劑并給藥以便于其被基因槍攝入或通過含有水凝膠的導管。
當本發(fā)明多肽用作所述治療或預防藥物時，優(yōu)選所用純度至少90％，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選98％以上，最優(yōu)選99％以上。
例如，本發(fā)明的多肽或受體蛋白可以以片劑(必要時加糖衣)、膠囊、酏劑、微膠囊等劑型口服，或以可注射型制劑如，與水或其它可藥用液體形成的無菌溶液或懸浮制劑經非胃腸道給藥。例如，將本發(fā)明的多肽與生理學上可接受的已知載體、調味劑、賦形劑、載色劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等制成符合制藥規(guī)定的要求的常用單位劑型。控制制劑中的活性成分使得在給定范圍內獲得合適劑量。
可與片劑、膠囊等混合的添加劑包括，粘和劑如明膠、玉米淀粉、西黃耆膠和金合歡膠；賦形劑如結晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖和糖精；加味劑如薄荷、akamonooil和櫻桃。當單位劑型為膠囊形式時，可進一步將液體載體如油和脂肪同上述添加劑一起使用?？筛鶕Ｒ?guī)制藥方法制備注射用無菌組合物，例如將活性成分與天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮在載體，如注射用的水中來制備藥物。
用于注射的液體介質的例子包括，生理鹽水、及包含葡萄糖和其它輔助制劑(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉等)的等滲溶液，并可以進一步同合適的助溶劑如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等結合使用。油性介質有芝麻油和大豆油，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結合使用。此外，上述的治療/預防制劑可進一步與緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液等)、鎮(zhèn)靜劑(例如苯扎氯胺和鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化劑等結合使用。由此制備的注射液體一般裝在合適的安瓿中。
本發(fā)明DNA所插入的載體用與上述類似的方法制成制劑，這類制劑通常經非胃腸道途徑給藥。
如此所獲制劑安全、低毒，因此可用于人或其它溫血動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。
本發(fā)明多肽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥方法等而異；例如口服給藥治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約1-1000mg/天，優(yōu)選大約10-500mg/天，更優(yōu)選10-200mg/天。當非胃腸道給藥時，該多肽一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時，成年人(體重60kg)優(yōu)選活性成分靜脈注射，劑量為大約1-1000mg/天，優(yōu)選大約1-200mg/天，更優(yōu)選大約1-100mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
(2)篩選可作為疾病治療藥物的候選化合物由于本發(fā)明多肽它是以液體的因子形式存在于生物體內(尤其是軟骨組織)并具有抑制軟骨分化的機能，因此能促進本發(fā)明多肽功能的化合物或其鹽可作為以下各種疾病的治療·預防藥物而使用例如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、大理石病等的骨疾病和/或關節(jié)疾病、有病的血管新生等。
另一方面，能夠抑制本發(fā)明多肽機能的化合物或其鹽可作為藥物用于以下疾病的治療，該疾病起因于本發(fā)明多肽的過量產生，例如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、骨發(fā)育不全、骨質粗松、骨折、大腿骨頭壞死、軟骨發(fā)育不全等的骨疾病和/或關節(jié)疾病、有病的血管新生等。
因此，本發(fā)明多肽可作為一種試劑，用于篩選能促進或抑制本發(fā)明多肽功能的化合物或其鹽。
即，本發(fā)明提供(1)一種篩選方法，其用于篩選能促進本發(fā)明多肽或其鹽的功能的化合物或其鹽(下文通常簡稱為促進劑)，或者其用于篩選能抑制本發(fā)明多肽或其鹽的功能的化合物(下文通常簡稱為抑制劑)，其特征為，該篩選法包括應用本發(fā)明多肽或其鹽。
本發(fā)明篩選用試劑盒包含本發(fā)明多肽或其鹽。
通過使用本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物或其鹽是從，例如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等中篩選出來的。它是一種具有促進或抑制本發(fā)明多肽的功能。
所述該化合物之鹽可以使用與所述本發(fā)明多肽的鹽相同。
當將通過使用本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物用作上述治療或預防藥物時，可以按照常規(guī)方法進行實施。例如，含有本發(fā)明多肽的藥物可以制成片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液劑型等。
如此所獲制劑安全、低毒，因此可對人或其它溫血動物(例如，大鼠、小鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)經胃腸道給藥或非胃腸道給藥。
本發(fā)明多肽或其鹽的劑量依賴于該化合物的作用、病癥、受試者和給藥方法等而異；例如口服給藥能夠抑制治療骨疾病和/或關節(jié)疾病的本發(fā)明多肽之機能時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。當非胃腸道給藥時，該化合物一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在給藥能夠促進治療骨疾病和/或關節(jié)疾病之機能時，成年人(體重60kg)優(yōu)選靜脈注射，劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
另一方面，當口服給藥能夠抑制本發(fā)明多肽之機能時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。當非胃腸道給藥時，該化合物一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在給藥能夠抑制本發(fā)明多肽機能時，成年人(體重60kg)優(yōu)選靜脈注射，劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
(3)本發(fā)明多肽或其鹽的定量針對本發(fā)明多肽的抗體(下文通常簡稱為本發(fā)明抗體)能特異性識別本發(fā)明的多肽，因此可用于定量測試樣品溶液中的本發(fā)明多肽，尤其是通過夾心免疫分析進行定量。因此，本發(fā)明提供了下述的定量方法(i)一種定量待測樣品液中本發(fā)明多肽的方法，其包括，使本發(fā)明的抗體與待測樣品液以及標記的本發(fā)明多肽進行競爭反應，測定與該抗體結合的本發(fā)明標記性多肽的比率；和，(ii)一種定量待測樣品液中本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白的方法，其包括，同時或先后使所述待測樣品液與固定在固相載體上的本發(fā)明抗體以及標記的本發(fā)明其它抗體反應，測定固相載體上標記試劑的活性。
在上述方法(ii)中，優(yōu)選一種抗體能識別本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白的N-末端區(qū)域，而另一抗體能識別本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白的C-末端區(qū)域。
針對本發(fā)明多肽的單克隆抗體(下文，通常稱作本發(fā)明單克隆抗體)可用于定量本發(fā)明多肽。此外，也可通過組織染色來檢測本發(fā)明多肽。為此，可用抗體本身或使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
對使用本發(fā)明多肽的抗體進行的定量方法沒有特別的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根據待測樣品液中相應抗原含量(例如多肽的量)，用化學或物理方法檢測抗體、抗原或抗體-抗原復合物的量，然后根據含已知量抗原的標準溶液制備的標準曲線來計算。優(yōu)選的方法為，例如比濁法、競爭法、免疫測定法和夾心法；就敏感性和特異性而言，特別優(yōu)選后面將要描述的夾心法。
用于分析方法的標記試劑的例子為放射性同位素、酶、熒光物質和化學發(fā)光物質等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。優(yōu)選酶的例子為穩(wěn)定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。熒光物質的例子包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等。化學發(fā)光物質的例子包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外，也可使用生物素-鏈霉素系統(tǒng)來對抗原或抗體標記。
在固定抗原或抗體時，可以使用物理吸附。作為替代方法，也使用傳統(tǒng)上來固定多肽或酶的化學結合。載體的例子包括，固相多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素；合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夾心法中，待測樣品溶液與本發(fā)明的固定化單克隆抗體反應(第一反應)，然后與本發(fā)明的標記的其它單克隆抗體反應(第二反應)，測定固相載體上的標記試劑活性，由此可以測定待測樣品中本發(fā)明多肽的量。第一和第二反應可以以相反次序進行，或同時或有間隔的先后進行。標記試劑的類型和固定的方法同上述的相同。在夾心法免疫分析中，用于標記的抗體和用于固相的抗體未必是一種類型或一個種類的抗體，也可使用兩種或多種抗體的混合物來改善測定的靈敏度等。
在根據本發(fā)明的夾心方法測定本發(fā)明多肽時，優(yōu)選用于第一和第二反應的單克隆抗體與本發(fā)明多肽的結合位點彼此不同。也就是說，在第一和第二反應用的抗體為，當?shù)诙磻目贵w識別本發(fā)明多肽的C端區(qū)域時，優(yōu)選在第一反應中使用能識別除C端區(qū)域以外的位點，如N端區(qū)域的抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體可用于除夾心法以外的其它分析方法，例如競爭法、免疫測定法和比濁法。
在競爭法中，待測溶液中的抗原和標記抗原競爭與抗體反應，然后將未反應的標記抗原(F)及結合于抗體的標記抗原(B)分離(即B/F分離)，測定B或F的標記量，從而可以測定待測溶液中的抗原量。在此類方法的反應中，有一種液相方法和一種固相方法，前者使用可溶性抗體，加入針對第一抗體的第二抗體后，用聚乙二醇來有效分離B/F；后者可用固定的抗體作為第一抗體，或用可溶性抗體作為第一抗體但第二抗體為固相抗體。
在免疫測定法中，待測溶液中的抗原和固相抗原競爭性地與一定量的標記抗體反應，然后使液相與固相分離；或待測溶液中的抗原與過量標記抗體反應，然后加入固相抗原，使未反應的標記抗體與該固相結合，然后使液相與固相分離。隨后，測定兩相的標記量，來測定待測溶液中的抗原量。
在比濁法中，測定抗原-抗體在凝膠或溶液中反應產生的固相沉淀的量。即使待測溶液中抗原量很少且僅獲得小量的沉淀，利用激光散射的激光比濁法也可以實施。
本發(fā)明應用這些免疫分析方法中任何一個進行分析時，不需要任何特殊條件和操作。除了每種方法的常規(guī)條件和操作外，本領域技術人員可構建測定本發(fā)明多肽的分析系統(tǒng)。所述常規(guī)技術的細節(jié)，參見如入江寬(編)“放射免疫分析”(1974，講談社，日本)；入江寬(編)“放射免疫分析，續(xù)編”(1979，講談社，日本)；石川榮治等(編)“酶免疫分析”(醫(yī)學書院，1978)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第二版”(醫(yī)學書院，1982)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第三版”(醫(yī)學書院，1987)；“酶學方法”卷70(免疫化學技術(A))；同上，卷73(免疫化學技術(B))；同上，卷74(免疫化學技術(C))；同上，卷84(免疫化學技術(D選擇性免疫分析))；同上，卷92(免疫化學技術(E單克隆抗體及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化學技術(I雜交瘤技術及單克隆抗體))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本發(fā)明的抗體可高度敏感地定量本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白。
此外，使用本發(fā)明的抗體可定量本發(fā)明多肽的濃度，(1)從而當檢出本發(fā)明多肽濃度的增加時，能夠診斷出如下各種疾病或者將來對這些疾病的高度易感性例如骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、骨發(fā)育不全、骨質粗松、骨折、大腿骨頭壞死、軟骨發(fā)育不全等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。還有，(2)從而當檢出本發(fā)明多肽濃度的減少時，能夠診斷出如下各種疾病或者將來對這些疾病的高度易感性例如骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、大理石病等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。
本發(fā)明抗體可用于檢出體液或者組織等待檢標本液中存在的本發(fā)明多肽。又可用于抗體柱的制作，該抗體柱可用于純化本發(fā)明多肽；檢出各純化組分中的本發(fā)明多肽；對被檢細胞內本發(fā)明多肽的行蹤進行分析等。
(4)基因診斷制劑例如，本發(fā)明的DNA作為一種探針可以檢出人或溫血動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)中編碼本發(fā)明多肽的DNA或mRNA的異常(基因異常)，因此，本發(fā)明的DNA可用作基因診斷制劑，用于診斷DNA或mRNA的損傷、突變，或其表達量的減少、和/或該DNA或mRNA的增加或DNA或mRNA的過表達。
上述基因診斷通過使用編碼本發(fā)明多肽的DNA，用眾所周知的Northem雜交分析或PCR-SSCP分析來完成(Genomics，5，874-879(1989)；美國科學院學報，86，2766-2770(1989))、DNA微列陣等。
例如，當用Northem雜交分析和DNA微列陣檢出表達量的減少時和PCR-SSCP分析和DNA微列陣檢出DNA突變時，能夠很大程度地診斷出如下各種疾病例如骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕、大理石病等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。
(5)含有反義DNA的藥物反義DNA能與本發(fā)明DNA互補地結合并抑制該DNA的表達，因此反義DNA能夠抑制生物體內中本發(fā)明多肽或本發(fā)明DNA，因此它可用作治療或預防以下各種疾病的藥物例如，骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)、慢性關節(jié)風濕、骨發(fā)育不良、骨質疏松、骨折、大腿骨頭壞死、軟骨發(fā)育不良等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。
當將所述反義DNA用作上述各種疾病的治療或預防藥物時，同前所述含有本發(fā)明DNA的各種疾病的治療或預防藥物一樣可以實施。
例如，當反義DNA用作上述預防/治療藥物時，反義DNA可單獨使用，或插入合適載體如反轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺伴隨病毒載體后按常規(guī)方法給藥。該反義DNA可以以裸露DNA的形式給藥，或與生理學上承認的用于促進吸收的輔助劑等的載體一起制成藥劑并給藥以便于其被基因槍攝入或通過含有水凝膠的導管。
該反義DNA也可用作用于診斷寡核苷酸探針，其目的是檢查組織或細胞中是否有本發(fā)明DNA的存在或者該DNA的表達。
(6)含有本發(fā)明抗體的藥物本發(fā)明抗體具有中和本發(fā)明多肽活性的作用，例如，如果下列疾病起因于本發(fā)明多肽的過量表達時，該抗體可用作治療或預防以下各種疾病的藥物例如，骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)、慢性關節(jié)風濕、骨發(fā)育不良、骨質疏松、骨折、大腿骨頭壞死、軟骨發(fā)育不良等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。
上述各種疾病的治療藥物或預防藥物含有本發(fā)明抗體，其可直接以原始液體制劑或以適當劑型的藥用組合物，對人或哺乳動物(例如，大鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)經過口服或非口服形式給藥。本發(fā)明抗體的劑量依賴于給藥受體、癥狀和給藥方法等而異；當用于治療或預防骨疾病和/或關節(jié)疾病患者時，靜脈注射的一次劑量為每天大約0.01-20mg/kg體重，優(yōu)選大約0.1-10mg/kg體重，更優(yōu)選0.1-5mg/kg體重，一天1-5次，優(yōu)選一天1-3次。其他非胃腸道給藥或經口給藥均依據此量。癥狀特別嚴重者根據其病癥可以增加使用量。
本發(fā)明的抗體可以直接給藥或者制成適當?shù)乃幱媒M合物給藥。所述藥用組合物包含上述抗體或它們的鹽和可藥用載體、稀釋劑或者賦形劑。這種組合物可以為適于經口或非胃腸道給藥的劑型。
即，適于經口給藥的組合物包括固體型制劑或液體型制劑，具體地有片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片劑)、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。這種組合物可以通過公知的方法生產，其制劑通常包括制藥領域常規(guī)使用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如用于片劑的載體或賦形劑有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
適于非胃腸道給藥的組合物有針劑、栓劑等，針劑包含的劑型有靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等。這類注射劑根據公知方法，例如將所述抗體或它們的鹽溶解、懸浮或者乳化于無菌水性溶液或無菌油性溶液而制備。注射用水溶液有生理鹽水、包含葡萄糖及其它輔助制劑的等滲溶液，并還可以進一步與合適的助溶劑如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氫的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等結合使用。油性溶液有芝麻油和大豆油，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結合使用。由此制備的注射液一般裝在合適的安瓿中。用于直腸給藥的栓劑通過將所述抗體或它們的鹽與一般的栓劑基質混合而制備。
上述口服或非口服的藥用組合物，最好制成適合于活性成分投藥劑量的用藥劑型。其投藥劑型包括，片劑、丸劑、膠囊、注射制劑(安瓿)、栓劑等，每個單位劑型通常含有上述抗體5-500mg，注射劑優(yōu)選含5-100mg，其他制劑優(yōu)選含有10-250mg。
此外，前面所述各種組合物也可含有其它活性成分，只要與上述抗體的結合不發(fā)生不利的相互作用。
(7)轉基因動物本發(fā)明提供一種非人哺乳動物，其具有編碼外源性本發(fā)明多肽的DNA(以下簡稱為本發(fā)明外源性DNA)或其DNA變體(通常簡稱為本發(fā)明外源性DNA變體)。
即，本發(fā)明提供(1)一種非人哺乳動物，其具有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體；(2)(1)中所述非人哺乳動物，其為嚙齒動物；(3)(2)中所述嚙齒動物，其為小鼠或大鼠；以及(4)一種重組載體，其含有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體，并能在哺乳動物中表達。
具有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體的非人哺乳動物(以下簡稱為本發(fā)明轉基因動物)可如下產生將所需DNA轉染至未受精卵、受精卵、精子以及含有相應原始細胞的胚細胞等，優(yōu)選它們處于非人哺乳動物發(fā)育過程中胚胎發(fā)生期(更優(yōu)選單細胞或受精卵細胞期，一般在8細胞期以前)，可用方法有磷酸鈣法、電脈沖法、脂轉染技術、凝集法、顯微注射法、粒子槍法、DEAE-葡聚糖法等?？筛鶕@些轉基因法將本發(fā)明外源DNA轉移至體細胞、活器官、組織細胞，對轉化體進行組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)?？梢赃M一步地根據公知細胞融合法使這些細胞與所述胚細胞或本領域公知的細胞融合法而產生本發(fā)明的轉基因動物。
非人哺乳動物的例子有牛、豬、綿羊、山羊、兔子、狗、貓、豚鼠、倉鼠、小鼠、大鼠等，就構建人類疾病的動物模型而言，優(yōu)選個體發(fā)育以及生命周期比較短，容易繁殖的嚙齒動物，主要是小鼠(例如，其純種系有C57B1/6系、DBA2系等；雜種系有B6C3F1系、BDF1系、B6D2F1系、BALB/c系、ICR系等)或大鼠(例如，Wistar，SD等)等。
能夠在哺乳動物中進行表達的重組載體中的[哺乳動物]除了所述非人哺乳動物外還有人等。
所說本發(fā)明外源性DNA不是非人哺乳動物本來具有的DNA，而是指從哺乳動物中分離并提取的本發(fā)明DNA。
所述本發(fā)明的DNA變體包括因本發(fā)明原始DNA的堿基序列發(fā)生變異(例如，突變等)產生的DNA，具體地說，包括堿基添加、缺失、用其它堿基置換產生的DNA，還有異常DNA。
該異常DNA是指能表達異常的本發(fā)明多肽的DNA，例如，所述DNA表達的多肽可抑制本發(fā)明多肽的正常功能。
本發(fā)明外源性DNA可以來自任一哺乳動物，不論是與靶動物同種還是異種均可。當把本發(fā)明DNA轉移至靶動物體中時，優(yōu)選使用DNA構建體，其中使該DNA連接在能于該靶動物中表達該DNA的啟動子下游。例如，轉移本發(fā)明的人源DNA時，以高水平表達本發(fā)明DNA的轉基因動物可如下制備選擇攜有與所述人源DNA高度同源的本發(fā)明DNA的非人哺乳靶動物，以及能在該靶動物中對來源于各種哺乳動物(如兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等)的DNA進行表達的各種啟動子，將所述本發(fā)明人源DNA連接于所述各種啟動子的下游形成DNA構建體(如載體等)，然后顯微注射至所述靶動物的受精卵中，如小鼠受精卵。
本發(fā)明多肽的表達載體有大腸桿菌質粒、枯草桿菌質粒、酵母質粒、噬菌體如λ噬菌體、反轉錄病毒如鼠白血病病毒、動物病毒如痘苗病毒或桿狀病毒。其中優(yōu)選使用大腸桿菌質粒、枯草桿菌質粒、或酵母質粒。
進行上述DNA表達調節(jié)的啟動子通常使用如下的啟動子①來自病毒(如，人類猿病毒、巨細胞病毒、鼠白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰質炎病毒等)DNA的啟動子；②來自各種哺乳動物(人、兔子、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等)的啟動子，例如下述蛋白啟動子白蛋白、胰島素II、尿空斑蛋白(uroplakin)II、彈性蛋白酶、促紅細胞生成素、內皮素、肌酸激酶、膠質原纖維酸性蛋白、谷光甘肽S-轉移酶、血小板衍生的生長因子β、角蛋白K1、K10以及K14、膠原蛋白I型及II型、cAMP依賴性蛋白激酶βI亞單位、肌營養(yǎng)不良蛋白、抗酒石酸堿性磷酸酶、心房利鈉激素、內皮受體-酪氨酸激酶(縮寫為Tie2)、Na/K-ATP酶、神經微絲輕鏈、金屬硫蛋白I及IIA、金屬蛋白酶1組織抑制劑、MHC I類抗原(H-2L)、H-ras、腎素、多巴胺β-羥化酶、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、多肽鏈延伸因子1α(EF-1α)、β-肌動蛋白、α及β-肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1及2、髓磷脂基質蛋白、甲狀腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H鏈可變區(qū)(VNP)、血清淀粉樣蛋白P成分、肌紅蛋白、肌鈣蛋白C、平滑肌、α-肌動蛋白、前腦啡肽原A、加壓素等。其中最好使用能在全身高效表達的巨細胞病毒啟動子、人多肽鏈延伸因子1α(EF-1α)啟動子、人及家雞β-肌動蛋白啟動子等。
優(yōu)選上述載體在轉基因動物中有終止目標mRNA轉錄的序列(一般稱為終止子)，例如，可以使用來自病毒以及各種哺乳動物的各種DNA的序列，優(yōu)選使用類人猿病毒的SV40終止子。
此外，為了更進一步提高外源目標DNA的表達，可根據不同目的將各種DNA的剪接信號、增強子區(qū)、真核DNA內含子的一部分連接在該啟動子區(qū)的5′上游、或啟動子區(qū)和翻譯區(qū)之間或翻譯區(qū)的3′下游。
該翻譯區(qū)可以通過常規(guī)基因工程方法構建成能在轉基因動物中進行表達的DNA構建體，其中將所述DNA連接至所述啟動子下游，必要時還同時位于轉錄終止位點的上游。
在受精卵細胞階段轉移本發(fā)明外源DNA必須保證靶動物的所有胚細胞及體細胞中都存在該外源DNA。在轉基因DNA之后產生的動物的胚細胞中所述本發(fā)明外源性DNA的存在表明該動物的所有后代均在其胚細胞及體細胞中含有本發(fā)明外源性DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在其所有胚細胞及體細胞中應攜有本發(fā)明外源性DNA。
已轉移有正常的本發(fā)明外源性DNA的非人哺乳動物通過雜交證實該外源DNA的穩(wěn)定維持后，可作為攜有該DNA的動物在一般飼養(yǎng)環(huán)境下傳代。
在本發(fā)明受精卵細胞階段中外源DNA的轉移必須保證靶動物的所有胚細胞及體細胞中都存在過量外源DNA。在轉移DNA之后產生的動物胚細胞中所述本發(fā)明外源性DNA的過量存在意味著產生的動物后代均在其所有胚細胞及體細胞中含有過量本發(fā)明外源性DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在所有胚細胞及體細胞中應保持有過量的本發(fā)明外源性DNA。
通過獲得一對同源染色體上都有導入的DNA的純合體動物，再通過它們的雌雄動物雜交其所有的后代就可以維持過量的該DNA。
在具有正常本發(fā)明DNA的非人哺乳動物體內正常的本發(fā)明DNA高效表達，通過促進內源性正常DNA的功能最終將導致本發(fā)明多肽發(fā)生功能亢進病，這時，該動物可以作為這種疾病的病理模型動物使用。例如，使用本發(fā)明的正常DNA轉基因動物，可以闡明本發(fā)明多肽發(fā)生功能亢進病癥以及與本發(fā)明多肽有關的疾病的病理機制，研究這些疾病的治療方法。
又，由于含有正常的本發(fā)明外來DNA的哺乳動物具有游離的本發(fā)明多肽增加癥狀，因此這種動物也可用于篩選與本發(fā)明多肽有關的疾病的治療藥物。
另一方面，具有異常的本發(fā)明外源性DNA的非人哺乳動物通過雜交確定外源性DNA的穩(wěn)定維持之后，可以在一般飼養(yǎng)環(huán)境下傳代?？赏ㄟ^將外源目標DNA重組到所述質粒中而將該DNA作為起始材料使用。帶有啟動子的DNA構建體可以通過一般DNA工程學方法制備而成。在受精卵細胞階段中本發(fā)明的異常DNA的轉基因必須保證靶動物的所有胚細胞及體細胞中都存在該異常DNA。在轉基因DNA之后產生的動物的胚細胞中所述本發(fā)明異常DNA的存在表明該動物的所有后代均在其胚細胞及體細胞中保持本發(fā)明異常DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在其所有胚細胞及體細胞中應攜有本發(fā)明異常DNA。通過獲得一對同源染色體上都有導入的DNA的純合體動物，再通過它們的雌雄動物雜交，其所有的后代就可以維持該DNA。
由于具有本發(fā)明異常DNA的非人哺乳動物可使該異常DNA高效表達，通過抑制內在的正常DNA功能，最終將導致該動物發(fā)生本發(fā)明多肽的功能失活型不適應病癥，因而該動物可作為相應疾病的模型動物使用。例如，使用本發(fā)明的異常DNA轉基因動物，可以闡明本發(fā)明多肽的功能失活型不適應病癥并研究這些疾病的治療方法。
又，本發(fā)明異常DNA高效表達的轉基因動物還可能用于闡明本發(fā)明多肽的功能失活型不適應病癥中本發(fā)明異常多肽對正常多肽的功能的抑制(顯性失活作用)作用。
由于攜有本發(fā)明之異常外源DNA的哺乳動物中游離形式的本發(fā)明多肽增加，因此這類動物也可用于篩選本發(fā)明多肽的功能失活型不適應癥的治療藥物。
上述2種轉基因動物的其它可能應用包括①作為組織培養(yǎng)的細胞來源；②通過直接分析本發(fā)明轉基因動物組織中的DNA或RNA，或者間接分析該DNA所表達的多肽組織，來闡述它們與被本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白特異性表達或活化的多肽的關連性；
③用標準組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)的含有所述DNA的組織細胞，研究難以培養(yǎng)的組織中細胞的功能；④用上述③中細胞篩選能夠提高該細胞功能的藥物；⑤分離純化本發(fā)明多肽的變體并制備其抗體。
用本發(fā)明的轉基因動物可以研究與本發(fā)明多肽有關的疾病的臨床癥狀，其中包括本發(fā)明多肽或本發(fā)明受體蛋白的功能失活型不適應癥，同時在與本發(fā)明多肽有關的疾病模型中還能得到各器官中更詳細的病理學發(fā)現(xiàn)，從而開發(fā)新治療方法，以及用于研究和治療與該疾病相關的繼發(fā)性疾病的方法。
從本發(fā)明轉基因動物中取出各種器官，切碎后，用胰蛋白酶等多肽酶(蛋白)分解可以得到游離的轉基因細胞，然后建立培養(yǎng)細胞系。本發(fā)明的轉基因動物還可用于鑒定能產生本發(fā)明多肽，研究這些細胞的特殊性、其與細胞凋亡、分化或增殖的關系，或者這些特性中的信號傳導機制，從而研究其中的任何異常性，因此本發(fā)明的轉基因動物可以為研究本發(fā)明多肽并闡明其作用提供有用的研究材料。
為了利用本發(fā)明轉DNA基因動物，開發(fā)與本發(fā)明多肽相關的疾病(包括本發(fā)明多肽的功能失活型不適應癥)的治療藥物，可利用上述檢查法以及定量法提供有效而快速的藥物篩選法。還可利用本發(fā)明轉基因動物或能表達本發(fā)明外源性DNA的載體，研究并開發(fā)與本發(fā)明多肽有關的疾病的基因治療方法。
(8)基因敲除實驗動物本發(fā)明提供攜有無活性的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞及在本發(fā)明DNA的表達中有缺陷的非人哺乳動物。
即，本發(fā)明提供(1)攜有無活性的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞；(2)第(1)所述胚胎干細胞，其中通過導入報道基因(例，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)使該DNA滅活；(3)第(1)所述胚胎干細胞，其為抗新霉素；(4)第(1)所述胚胎干細胞，其中所述非人哺乳動物為嚙齒動物；(5)第(4)所述胚胎干細胞，其中所述嚙齒動物為小鼠；
(6)對本發(fā)明DNA的表達有缺陷的非人哺乳動物，其中本發(fā)明DNA不具活性；(7)第(6)所述非人哺乳動物，通過導入報道基因(例，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)使該DNA滅活，該報道基因能在本發(fā)明DNA的啟動子控制下表達；(8)第(6)所述非人哺乳動物，其為嚙齒動物；(9)第(8)所述非人哺乳動物，其中所述嚙齒動物為小鼠，以及(10)一種對本發(fā)明DNA的啟動子活性具有促進或抑制作用的化合物或其鹽的篩選方法，包括給第(7)所述動物投與待測化合物，并檢測報道基因的表達。
所謂攜有無活性本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞是指，通過對本發(fā)明DNA進行人工突變而抑制該非人哺乳動物表達所述DNA，或通過使該DNA編碼的本發(fā)明多肽活性基本喪失，從而使該DNA基本上不具有表達本發(fā)明多肽的能力(下文有時稱本發(fā)明的基因敲除DNA)的胚胎干細胞(簡稱ES細胞)。
非人哺乳動物可以用與前述同樣的動物。
對本發(fā)明DNA進行人工突變的方法包括，該DNA序列的一部分或全部缺失，插入或用其它DNA置換。通過這些變異，可以利用諸如讀碼框的移動，或啟動子或外顯子功能的破壞來制備本發(fā)明的基因敲除DNA。
攜有無活性本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細胞(下文簡稱攜有無活性本發(fā)明DNA的ES細胞或本發(fā)明的基因敲除ES細胞)可如下獲得分離所選非人哺乳動物所具有的本發(fā)明DNA，在其外顯子部分插入抗藥基因如抗新霉素基因、抗潮霉素基因，或插入報道基因如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰轉移酶基因)以破壞外顯子的功能，或在外顯子之間的內含子上插入能夠終止基因轉錄的DNA序列(如，polyA加尾信號等)以抑制完整mRNA的合成，將如此構建的含有被破壞的上述DNA的序列(下文簡稱為靶載體)通過同源重組整合至該動物的染色體上。對如此獲得的ES細胞用本發(fā)明DNA上或其附近的DNA序列作為探針進行Southern雜交分析，或用上述靶載體上的DNA序列和另一種位于本發(fā)明DNA附近但不包括在上述靶載體中的DNA序列作為引物進行PCR，從而篩選本發(fā)明的基因敲除ES細胞。
通過同源重組使本發(fā)明DNA失活的親本ES細胞可以是上述已建立的細胞株，也可以是根據Evans及Kaufma方法的改良法建立的細胞株。例如，目前常用的小鼠ES細胞是129系ES細胞，但其免疫學背景不十分清楚，故優(yōu)選使用遺傳免疫學背景清晰的純系ES細胞等，例如，其中所述BDF1小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1代)是使C57BL/6通過與DBA/2雜交而改良其卵數(shù)少的特點。BDF1小鼠其優(yōu)點卵數(shù)多且卵飽滿，具有C57BL/6小鼠的背景，因此用其ES細胞產生病理模型小鼠時，通過再與C57BL/6小鼠進行回交可以使其遺傳背景恢復為C57BL/6小鼠的背景。
當建立ES細胞時，一般使用受精后第3.5天的胚泡，本發(fā)明優(yōu)選在8細胞胚期采集胚胎并培養(yǎng)至胚泡，通過使用此胚泡可以更有效地獲得大量的初期胚。
雖然可以利用的ES細胞無所謂性別，但是通常雄性ES細胞比較容易形成生殖細胞系的嵌合體。為了減少培養(yǎng)時的繁雜過程最好盡快判斷雌雄性。
ES細胞的雌雄判斷方法有，用PCR法擴增并檢測Y染色體上性決定區(qū)的基因。如果使用這種方法，只需一個菌落(約50個)的ES細胞就足以進行性別分析，而進行核型分析則需要約106個細胞；因此可在培養(yǎng)初期根據對性別的鑒定對ES細胞進行第一次篩選，及早選出雄性細胞，從而大大縮短培養(yǎng)初期的時間。
可用G帶法確定染色體數(shù)而完成第二次選擇。優(yōu)選所獲得的ES細胞染色體數(shù)為正常數(shù)的100％，但經物理操作建立細胞系很難獲得具有正常染色體數(shù)的細胞時，優(yōu)選對ES細胞的基因實施基因敲除后，再克隆成正常細胞(如，染色體數(shù)為2n＝40的小鼠體細胞)。
這樣所得的胚胎干細胞通常繁殖能力強，但個體發(fā)育能力低，因此必須傳代。例如，在適當飼養(yǎng)細胞如STO成纖維細胞上，在有LIF(1-10000U/ml)的情況下，在CO2培養(yǎng)箱(優(yōu)選約5％CO2和約95％空氣，或約5％CO2、約5％O2和90％空氣)內約37℃培養(yǎng)所述胚胎干細胞系，傳代時，可用胰酶/EDTA溶液(通常約0.001-0.5％胰酶/約0.1-5mM EDTA，優(yōu)選約0.1％胰酶/1mM EDTA)處理以獲得單細胞，然后接種至新鮮制備的飼養(yǎng)細胞。通常每1-3天傳代一次，并在傳代時觀察細胞，將形態(tài)異常的細胞除去。
ES細胞在適當條件下，在單層培養(yǎng)中長至高密度，或在懸浮培養(yǎng)中形成細胞集團后，它們可自發(fā)分化成各種類型的細胞，如頭頂肌細胞、內臟肌細胞、心肌細胞等[M.J.Evans及M.H.Kaufman，自然，292，154(1981)；G.R.Martin，美國國家科學院院刊，78，7634(1981)；T.C.Doetschman等，胚胎學和實驗形態(tài)學雜志87，27(1985)]，從本發(fā)明分化的ES細胞得到對本發(fā)明DNA的表達有缺陷的細胞，它們可用于體外進行本發(fā)明多肽的細胞生物學研究。
可用公知方法測定所選動物的mRNA量，并間接比較表達量，從而使本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物與正常動物有所區(qū)別。
非人哺乳動物的例子如前述。
對本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物而言，可將如上制備的靶載體導入小鼠胚胎干細胞或小鼠卵細胞，然后通過同源重組使小鼠胚胎干細胞或小鼠卵細胞染色體上的本發(fā)明DNA被靶載體上的已失活的本發(fā)明DNA序列所取代，從而完成對本發(fā)明DNA的基因敲除。
以位于本發(fā)明DNA內或附近的一段DNA序列作為探針通過DNA雜交分析，或以靶載體上的一段DNA序列以及不包含在該靶載體中的另一DNA序列為引物通過PCR分析，可以鑒定攜有本發(fā)明已破壞的DNA的基因敲除細胞。當使用非人哺乳動物胚胎干細胞時，對其中所含本發(fā)明DNA已失活的一個細胞系通過同源重組進行克??；在適當時期如8細胞期將所得已克隆的細胞注射至，例如非人哺乳動物胚胎或胚泡中。將所得嵌合體胚胎移植到非人哺乳動物的假妊娠子宮。所得動物是由具有正常的本發(fā)明DNA位點的細胞和具有人工突變的本發(fā)明DNA位點的細胞構成的嵌合體。
當該嵌合體動物的部分生殖細胞中本發(fā)明DNA位點發(fā)生突變后，可從這種嵌合動物與正常動物交配得到的子代群體中，通過毛色(coat color)鑒定等方法，篩選以下個體，其所有組織均由具有突變的本發(fā)明DNA位點的細胞組成。所得個體通常在本發(fā)明多肽的雜合子表達中有缺陷。通過這些雜合體的交配后代可獲得本發(fā)明多肽的純合子表達有缺陷的個體。
使用卵細胞時，可將DNA溶液顯微注射至細胞核內，獲得一種非人哺乳類轉基因動物，其中已將靶載體導入其染色體上。可根據同源重組從這些非人哺乳類轉基因動物中篩選本發(fā)明DNA位點上有變異的個體。
如上述，針對本發(fā)明DNA的基因敲除個體的雜交后代在證實了帶有此基因敲除后，可通過常規(guī)培養(yǎng)條件進行繁衍。
可按照常規(guī)方法獲得并維持繁殖系。即通過含有所述非活性DNA的雌雄動物交配，可以獲得兩條同源染色體上都具有該非活性DNA的純合體。對于母本動物來說，在1個正常個體、多個純合體的狀態(tài)下飼養(yǎng)，就能更有效地得到這種純合體動物。通過雌雄雜合體的雜交，可繁殖并傳代具有該非活性DNA的純合體以及雜合體動物。
本發(fā)明DNA已失活的非人哺乳動物胚胎干細胞在產生本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物方面十分有用。
由于本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物喪失了由本發(fā)明多肽衍生所得的各種生物活性，故可作為本發(fā)明多肽的生物活性失活的疾病模型，并因此有利于闡明這些疾病的原因及研究其治療方法。
(8a)對本發(fā)明DNA之缺失或損傷等所致疾病能進行有效預防/治療的化合物的篩選方法可用本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物篩選對本發(fā)明DNA之缺失或損傷所致疾病(骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)、慢性關節(jié)風濕、大理石病等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等)進行有效預防/治療的化合物。
即，本發(fā)明提供對本發(fā)明DNA之缺失或損傷等所致疾病能進行有效預防/治療的化合物的篩選方法，其特征為，對本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物施用一種待測化合物，觀察和測定該動物的變化。
可用于所述篩選方法的本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物實例如上述。
所述待測化合物如多肽、蛋白質、非多肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等，它們既可為新化合物也可為已知化合物。
具體地，用待測化合物處理本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物，與未處理的對照動物比較，以動物的各個器官、組織、疾病的癥狀變化為指標，可以評價此待測化合物的治療/預防效果。
所述用待測化合物處理對象動物的方法，可以口服給藥、靜脈注射，可以根據待測動物的癥狀和待測化合物的性質等適當?shù)剡M行選擇。另外，待測化合物的給藥量還可以根據投藥途徑、待測化合物的性質等進行適當選擇。
當篩選針對腫瘤血管新生具有治療/預防效應的化合物時，對本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物進行癌細胞移植，在移植前或移植后給予待測化合物，經常地測定該動物的腫瘤標記值以及腫瘤塊大小的變化等。
用該篩選法得到的化合物是從上述的待測化合物中選出的化合物，對因本發(fā)明多肽的缺陷、損傷引起的疾病(骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)、慢性關節(jié)風濕、大理石病等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等)具有治療和預防效應，所以這種化合物可以用作治療和預防這些疾病的藥物，既安全又毒性低。另外，如上述篩選的化合物所衍生的化合物也可以使用。
用上述篩選法得到的化合物可以與生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機酸或有機酸)形成鹽而使用，優(yōu)選為生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
含有用上述篩選法所得的化合物或其鹽的藥物，可以用類似于制備含上述本發(fā)明多肽的藥物的方法進行制備。
如此得到的制劑安全、低毒，因此可以對人或哺乳動物投藥，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴子等。
該化合物或其鹽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥方法等而異；例如經口投藥用于治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射該化合物用于治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時，成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
(8b)篩選能促進或抑制本發(fā)明DNA中啟動子之活性的化合物的方法本發(fā)明提供篩選能促進或抑制本發(fā)明DNA中啟動子之活性的化合物或其鹽的方法，其特征為，對本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物給予待測化合物，并檢測報道基因的表達。
在上述篩選方法中，本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物選自上述本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物，該動物中通過導入報道基因使本發(fā)明DNA失活，而該報道基因是在本發(fā)明DNA的啟動子控制下表達。
用于篩選的具體化合物實例同上。
報道基因實例同上，優(yōu)選β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因或熒光素酶基因等。
由于本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物之中，本發(fā)明DNA以報道基因取代，而報道基因又受本發(fā)明DNA啟動子的調控而出現(xiàn)，因此追蹤報道基因編碼物質的表達可以檢測啟動子活性。
例如，當用大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代編碼本發(fā)明多肽的DNA區(qū)的一部分時，原本表達本發(fā)明多肽的組織中，表達了β-半乳糖苷酶以代替本發(fā)明多肽。因此，用試劑β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)染色可以很容易地觀察到本發(fā)明多肽在動物體內的表達狀態(tài)。具體地，選取本發(fā)明多肽缺陷型小鼠或其經戊二醛等固定的組織切片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用含有X-gal的染色液在室溫或37℃左右反應約30分至1個小時，之后將組織標本用1mM EDTA/PBS溶液洗滌，觀察β-半乳糖苷酶產生的顏色?；蛘?，可按照常規(guī)法檢測編碼lacZ的mRNA。
用該篩選法得到的化合物或其鹽是從上述待測化合物中選出，具有促進或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物。
用上述篩選法得到的化合物可以形成鹽，所述鹽可以優(yōu)選使用與生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機酸或有機酸)形成鹽，尤其優(yōu)選為生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
由于具有促進本發(fā)明DNA啟動子的活性的化合物或其鹽，可促進本發(fā)明多肽的表達，或可促進本發(fā)明多肽的功能，因此它們可作為安全、低毒性藥物用于治療和預防骨疾病和/或關節(jié)疾病(如變形性關節(jié)、慢性關節(jié)風濕、大理石病等)、有病的血管新生(如腫瘤血管新生)等。
再者，由上述篩選得到的化合物進而衍生的化合物同樣可以使用。
含有用上述篩選法所得的化合物或其鹽的藥物，可以用類似于制備含上述本發(fā)明多肽或其鹽的藥物的方法進行制備。
如此得到的制劑安全、低毒，因此可以對人或哺乳動物投藥，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴子等。
該化合物或其鹽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥途徑等而異；例如經口投藥促進本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物用于治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射促進本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物用于治療骨疾病和/或關節(jié)疾病時成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
相反，經口服給予抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，一般成年人(體重60kg)正常劑量為大約0.1-100mg/天，優(yōu)選大約1.0-50mg/天，更優(yōu)選1.0-20mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
根據上述，本發(fā)明DNA表達缺陷型非人哺乳動物可有效用于篩選能促進或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物或其鹽，可以闡明本發(fā)明DNA表達缺陷的各種疾病的病因，和開發(fā)針對這些疾病的預防和治療藥物。
進一步地，編碼本發(fā)明多肽的基因由于在小鼠和人中尤其是在軟骨組織中能夠進行大量表達，因此該基因的啟動子序列最適合在非人溫血動物的軟骨組織中用于大量表達目標蛋白質(任意有用的基因產物等)。所述非人溫血動物例如，類似于上述所舉出的溫血動物之例等。
也就是說，本發(fā)明提供一種使目標蛋白質能在非人溫血動物的軟骨組織上進行最佳表達的方法，所述目標蛋白質是根據在編碼多肽基因的啟動子區(qū)的下游(3′末端區(qū))連接目標蛋白質(任意有用的基因產物等)并導入至非人動物中，所述多肽具有SEQ ID NO6、SEQ ID NO12或SEQ ID NO47所示氨基酸序列的特征。
該目標蛋白質(任意的有用基因產物等)為下面所述有用的基因產物等，如細胞因子(例如，白介素、干擾素、化學因子、造血因子)、增殖因子(例如，EGF(epidermal growth factor))或者是具有基本相同活性的物質(例如，EGF、ハレグリン(HER2配體)等)、胰島素或者是具有基本相同活性的物質(例如，胰島素、IGF(insulin-like growth factor)-1、IGF-2等)、FGF(fibroblastgrowth factor)或者是具有基本相同活性的物質(例如，aFGF、bFGF、KGF(Keratindcyte growth factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、FGF-10)、以及其他細胞增殖因子(例如，CSF(colony stimulating factor)、EPO(erythropoietin)、IL-2(interleukin-2)、NGF(nerve growth factor)、PDGF(platelet-derived growth factor)、TGFβ(transforming growth factorβ)等)、激素(促黃體激素釋放激素(LH-RH)、生長激素、生長素釋放激素(GH-RH)、催乳素、黑素細胞刺激激素、甲狀腺激素釋放激素、甲狀腺刺激激素、促黃體激素、黃體激素、卵泡刺激激素、胃液素、胃動素、生長抑素、胰泌素、高血糖素、PACAP、VIP等、消化酶(如，淀粉酶、胃蛋白酶原、脂肪酶等)、針對病原體的抗體(例如，針對病原性沙門氏菌等的病原性細菌的抗體、針對流感等病原性病毒的抗體、針對棘球滌蟲等的寄生蟲的抗體等)、抗菌多肽(例如，殺菌肽、ヒスタチン、白細胞內溶素、プロテグリン、防御素、溶菌酶等))。
在上述目標蛋白中，①通過在軟骨組織中特異性表達細胞因子，進而可以調節(jié)并加強非人溫血動物的免疫活性等；②通過在軟骨組織中特異性表達增殖因子，進而可以保護非人溫血動物的軟骨組織等。
下面就目標蛋白質能在非人溫血動物的軟骨組織中表達最佳的方法，將詳細地敘述。也就是說，所述目標蛋白質是根據在編碼多肽基因的啟動子區(qū)的下游(3′末端區(qū))連接編碼目標蛋白質(任意有用的基因產物等)的DNA或RNA并導入非人動物中，所述多肽具有SEQ ID NO6、SEQ ID NO12或SEQ ID NO47所示氨基酸序列的特征。
首先，編碼具有SEQ ID NO6、SEQ ID NO12或SEQ ID NO47所示氨基酸序列的特征的多肽基因啟動子可以通過菌落雜交、噬菌斑雜交和PCR等公知方法(根據《分子克隆》第二版(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989)獲得。還有，鑒定含有啟動子活性區(qū)域可以通過報道分析法等獲得(如，《分析生物化學》188，p245(1990)所述方法等)。
其次，為了將目標蛋白質(任意有用的基因產物等)連接于通過上述方法得到的引物下游(3′末端區(qū))，使用T4DNA連接酶根據本領域公知的方法(根據《分子克隆》第二版(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989)描述的方法)可以構建質粒而完成連接。
為了將上面所述的連接產物導入非人溫血動物之中，所述連接產物是在引物下游(3′末端區(qū))連接了編碼目標蛋白質(任意有用的基因產物等)DNA。所采用的導入方法有電穿孔法、基因槍法、轉錄病毒載體法(如，《血細胞》(Blood Cells)17，p407，(1991)描述的方法等)、腺病毒載體法(如，《病理學》(Pathology)30，p335，(1998)描述的方法等)。
在說明書和附圖中，堿基和氨基酸的代碼使用IUPAC-IUB生化命名委員會規(guī)定的或本領域通用的代碼，如下述例示。對于有光學異構體的氨基酸，除非特別說明，均指L形式。
DNA脫氧核糖核酸cDNA互補的脫氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鳥嘌呤C 胞嘧啶RNA 核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸鈉Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸
Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Cys半胱氨酸Met甲硫氨酸Glu谷氨酸Asp天冬氨酸Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺pGlu焦谷氨酸另外，在本說明書中，頻繁使用的取代基、保護基以及試劑用下列符號表示。
Me甲基Et基Bu丁基Ph苯基TC四氫噻唑-4(R)-氨甲酰Tos對甲苯磺?；鵆HO甲?；鵅zl芐基Cl2-Bzl2，6-二氯芐基Bom芐氧甲基
Z芐氧羰基Cl-Z2-氯芐氧羰基Br-Z2-溴芐氧羰基Boc叔丁氧基羰基DNP二硝基苯酚Trt三苯甲基Bum叔丁氧基甲基FmocN-9-芴基甲氧基羰基HOBt1-羥基苯并三唑HOOBt3，4-二羥基-3-羥基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪HONB1-羥基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亞胺DCCN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺本說明書序列表中的序列編號(SEQ ID NO)分別表示如下[SEQ ID NO1]表示實施例1中反義鏈引物的堿基序列。表示實施例1中有義鏈引物的堿基序列。表示編碼人MLP前體的DNA堿基序列，該前體含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列。表示在人MLP前體中所包含的氨基酸信號序列，該前體含有SEQ IDNO6所示氨基酸序列。表示人MLP前體的氨基酸序列。表示實施例2中反義鏈引物的堿基序列。表示實施例2中有義鏈引物的堿基序列。
表示編碼小鼠MLP前體的DNA堿基序列，該前體含有SEQ ID NO12所示氨基酸序列。表示在小鼠MLP前體中所包含的氨基酸信號序列，該前體含有SEQ IDNO12所示氨基酸序列。表示小鼠MLP前體的氨基酸序列。表示實施例3中G3PDH特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中G3PDH特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中Aggrecan特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中Aggrecan特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中II型膠原特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中II型膠原特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中X型膠原特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中X型膠原特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中小鼠MLP特異性寡DNA的堿基序列。表示實施例3中小鼠MLP特異性寡DNA的堿基序列。表示編碼人MLP的DNA堿基序列，該人MLP含有SEQ ID NO24所示氨基酸序列。
表示人MLP的氨基酸序列。表示編碼小鼠MLP的DNA堿基序列，該小鼠MLP含有SEQ ID NO26所示氨基酸序列。表示小鼠MLP的氨基酸序列。表示實施例4及實施例6中引物的堿基序列。表示實施例4中引物的堿基序列。表示實施例1中所得cDNA片段的堿基序列。表示實施例2中所得cDNA片段的堿基序列。表示實施例6中合成肽的氨基酸序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例6中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。
表示由實施例9所得DNA編碼的大鼠MLP前體的部分氨基酸序列。表示編碼實施例9所得部分大鼠MLP前體的DNA堿基序列。表示DNA堿基序列，其包含編碼實施例9所得部分大鼠MLP前體的DNA。表示實施例9中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例9中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例9中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示實施例9中用作PCR引物的寡DNA堿基序列。表示編碼大鼠MLP前體的DNA堿基序列，該前體含有SEQ ID NO47所示氨基酸序列。表示大鼠MLP前體的氨基酸序列。表示編碼大鼠MLP的DNA堿基序列，該大鼠MLP含有SEQ ID NO49所示氨基酸序列。表示大鼠MLP的氨基酸序列。表示在大鼠MLP前體中所包含的氨基酸信號序列，該前體含有SEQ IDNO47所示氨基酸序列。
隨后實施例1描述的大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pDRL128vH于1999年6月11日保藏位于日本國茨城縣茨城市東1-1-3的通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-6750，于1999年6月25日保藏位于日本國大阪府大阪市淀川區(qū)十三本町2-17-85的財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16292。
隨后實施例2描述的大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pDRL128vM于1999年6月9日保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-6747，于1999年6月25日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16293。
隨后實施例9描述的大腸桿菌轉化體(Escherichia coli) XL10-Gold/pDRL128vR于2000年5月19日保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7167，于2000年5月26日保藏于財團法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16439。
下面，用參考實施例詳述本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明的范圍。使用大腸桿菌(Escherichia coli))進行基因操作按“分子克隆”的方法進行。實施例1 克隆編碼人MLP前體蛋白質的cDNA通過使用人胎兒腦poly(A)+RNA按照以下要領實施5′RACE(RapidAmplification of cDNA End)和3′RACE對編碼人MLP前體蛋白質的cDNA進行克隆。取1μg人胎兒腦poly(A)+RNA(Clontech公司)用錨定引物(anchored primer)(該引物具有位于限制酶位點之后的poly(T))和SuperscriptII MMLV反轉錄酶(Gibco BRL公司)合成1st.strand cDNA，然后用RNA連接酶(寶酒造)將錨定引物(anchored primer)連接于1st.strand cDNA3′末端。其次，將SEQ ID NO1所示的寡DNA作為反義鏈引物進行5′RACE，同樣將SEQ ID NO2所示的寡DNA作為有義鏈引物進行3′RACE，從而得到在以各自引物為起點的5′上游區(qū)序列和3′下游區(qū)序列。當對所得的各自雙鏈DNA堿基序列進行測定時，由于在堿基序列上有相同重疊的序列，從而可知這兩條序列是來自于同一基因。故，用相同序列部分將通過所述5′RACE和3′RACE所得的各自cDNA片斷進行結合，最終獲得由SEQ IDNO29所示并包含poly(A)+的全長為923個堿基對(bp)的cDNA片斷。在這個cDNA片斷上編碼一種新的人MLP前體蛋白質，該蛋白質由SEQ IDNO6所示128個氨基酸所組成，并包含一個由SEQ ID NO5所示18個氨基酸殘基的典型信號序列。所述新的人MLP前體蛋白質與人MIA前體蛋白質具有最高的同源性，其4個半胱氨酸殘基的位置也一致(
圖1)。但是這兩者之間的同源性在氨基酸水平上只有23.4％。
將攜帶編碼本實施例所得人MLP前體蛋白質的DNA質粒pDRL128vH導入大腸桿菌(Escherichia coli)XL10-Gold，從而獲得大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pDRL128vH。實施例2克隆編碼小鼠MLP前體蛋白質的cDNA克隆編碼小鼠MLP前體蛋白質的cDNA與克隆編碼人MLP前體蛋白質的cDNA方法相同，使用17.5天的胎鼠poly(A)+RNA，通過實施5′RACE和3′RACE來進行。根據硫氰酸胍法從17.5天的胎鼠中分級分離總RNA，將該總RNA上樣于寡(dT)離心柱(Spun-column)(Pharmacia)，制備poly(A)+RNA。取同一17.5天1μg的胎鼠poly(A)+RNA，用錨定引物(anchoredprimer)(該引物具有位于限制酶位點之后的poly(T))和SuperscriptIIMMLV反轉錄酶(Gibco BRL公司)合成1st.strand cDNA，然后用RNA連接酶(寶酒造)將錨定引物(anchored primer)連接于合成的1st.strand cDNA3′末端。用于5′RACE和3′RACE的引物序列基于一種被認為是唯一的EST即AA222797序列制備而成的，其中包括編碼小鼠MLP前體蛋白質cDNA的3′區(qū)，并且假設一個在實施例1中得到的編碼人MLP前體蛋白質cDNA的堿基序列并在公知的EST(Expressed Sequence Tag)數(shù)據庫中求得。分別以SEQ IDNO7所表示的寡DNA為反義鏈引物，SEQ ID NO8所表示的寡DNA為有義鏈引物，進行5′RACE和3′RACE，從而獲得以它們各自引物為起點的5′上游序列和3′下游序列。當對所得各自雙鏈DNA堿基序列進行測定時，由于在堿基序列上存在相同重疊的序列，從而可知這兩條序列是來自于同一基因。故，用該相同序列部分將通過所述5′RACE和3′RACE得到的各自cDNA片斷進行結合，最終獲得包含poly(A)+的全長為947個堿基對(bp)的cDNA片斷(SEQ ID NO30)。在這個cDNA片斷上與人MLP前體蛋白質相同的方法，編碼一種新型蛋白質，該蛋白質由SEQ ID NO12所示128個氨基酸所組成，并包含一個由SEQ ID NO11所示18個氨基酸殘基的典型信號序列。所述新的小鼠MLP前體蛋白質其4個半胱氨酸殘基的位置與在人及小鼠MIA前體蛋白質，以及在人MLP前體蛋白質上的位置均一致(
圖1)。并且小鼠MLP前體蛋白質和人MLP前體蛋白質它們在氨基酸的水平上其同源性達到84.3％，而小鼠MIA前體蛋白質和小鼠MLP前體蛋白質之間的同源性僅停留在22.6％水平上。
將攜帶編碼本實施例所得小鼠MLP前體蛋白質的DNA質粒pDRL128vM導入大腸桿菌(Escherichia coli)XL10-Gold，從而獲得大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pDRL 128vM。實施例3 在體外軟骨分化模型中進行MLP的表達小鼠胚性腫瘤細胞株ATDC5可以用作體外軟骨分化模型(Cell Diff.Dev.，30109-116，1990，J.Cell Biol.，133457-468，1996，J.Bone Min.Res，10S234，1995)，其理由為，它能極好地保持前體軟骨細胞的性質，在胰島素存在的培養(yǎng)下，可以高效誘導軟骨的分化，其后在骨發(fā)育過程中可以模擬整個軟骨分化的過程。至此，按照以下要領根據RT-PCR法，研究每個分化過程中的各種基因的表達情況。首先，從在分化模型培養(yǎng)系的各階段ATDC5細胞中，通過將同一細胞溶解于含有苯酚和硫氰酸胍均一的液體ISOGEN(日本基因)中，加入氯仿離心分離收集含有RNA的水相級分，通過加入異丙醇攪拌離心沉淀以獲得純化的總RNA。其次，通過使用TAKARARNAPCRKit(AMV)Ver.2.1(寶酒造)中的AMV Reverse Transcriptase XL和Random 9mers，將每個待測總RNA進行反轉錄得到cDNA，再其次，以所得的cDNA為DNA模板，G3PDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)特異性寡DNA(SEQ ID NO13，SEQ ID NO14)為看家基因，或用軟骨分化標記基因特異性寡DNA(Aggrecan(SEQ ID NO15，SEQ ID NO16)、II型膠原(SEQ ID NO17，SEQ ID NO18)、X型膠原(SEQ ID NO19，SEQ ID NO20))作為DNA引物，在TaKaRa Ex TaqTM(寶酒造)的反應系中進行PCR反應。所得反應產物進行瓊脂凝膠電泳并分離，比較它們的形成量。每種基因都可如表1所示對應于各自軟骨細胞分化階段的表達類型進行檢測。對于cDNA相同樣品組來說，除了將對于編碼小鼠MLP前體蛋白質的cDNA具有特異性寡DNA(SEQ ID NO21，SEQ ID NO22)作為DNA引物外，其它PCR反應條件均相同，從第2階段到第4階段發(fā)現(xiàn)小鼠MLP前體mRNA的量產生顯著的亢進。故可表明，MLP前體的基因在軟骨分化的初期過程中其表達程度增加。
表1
(表中+的數(shù)目表示為在每個分化階段上它們各自基因表達水平的差異，其數(shù)目越多表示表達水平越高。)實施例4在COS7細胞中小鼠MLP-FLAG融合蛋白質的表達及其檢測為了證明MLP是否為分泌蛋白，以小鼠MLP為材料，按照以下要領在COS7細胞中對小鼠進行MLP-FLAG融合蛋白質的表達及其檢測。首先，依據實施例2得到的編碼小鼠MLP前體多肽cDNA堿基序列，對以下2種引物的DNA進行化學合成。一個引物是5′-CGAATTCCCACCATGGCAAGGATATTGATTCTTTTGCTTG-3′(SEQ ID NO27)，這是一個含有有義序列的寡DNA，該序列為+1～+28(翻譯起始位點為+1)并在5′末端具有包含限制酶EcoRI識別位點的錨定序列。另一個引物是5′-GTACAGTCGATTCACAGAAGAAGTCAATATCCGTGGTTG-3′(SEQ ID NO28)，這是一個寡DNA，在含有限制酶EcoRI識別位點的錨定序列3′側連接了+355～+378的反義序列。以實施例2的質粒pDRL128vM為模板，使用這2種引物DNA及TaKaRa LA TaqTM(寶酒造)，用熱循環(huán)儀GeneAmpTMPCR system9700(Perkin-Elmer)，最初在98℃靜止30秒后，再以98℃10秒、55℃20秒、72℃2分為一個反應周期，擴增25個周期循環(huán)，最后在72℃延長5分鐘。純化所得DNA片斷再用限制酶EcoRI和SalI進行末端消化并純化，插入并連接至用于動物細胞表達載體pCAN618FLAG的EcoRI、Sal I位點上。pCAN618FLAG源于質粒載體pCAN618并具有選擇標記抗新霉素基因，同時將編碼目標蛋白的DNA片斷插入該克隆部位的EcoRI、SalI位點上，不僅在巨細胞病毒極初期基因增強子及其下游的β-肌動蛋白啟動子的調控下可以使該蛋白質表達，而且還可通過編碼位于Sal I位點之后的8個氨基酸FLAG抗原表位序列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)的堿基序列和終止密碼匹配的讀碼框將所述目的蛋白表達為FLAG融合蛋白。用于表達小鼠MLP前體全長和FLAG抗原表位的融合蛋白質(其間插入1個殘基Val)，可將pCAN618FLAG插入到上述PCR克隆DNA片斷中，從而獲得表達載體質粒pMMLP-F。
其次，使用6孔平板將1.2×105的COS7細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(FBS)Dulbecco改良的必需極限培養(yǎng)基(DMEM)，培養(yǎng)24個小時。用脂質轉染胺試劑(リポフェクトァミン)(Gibco BRL)將所述的表達質粒pMMLP-F(每孔為0.4μg)導入該細胞中。轉染24小時之后，將培養(yǎng)基換成新鮮的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)5個小時，換成不含F(xiàn)BS的Opti-MEM(Gibco BRL)培養(yǎng)基，培養(yǎng)36個小時，獲得該培養(yǎng)物的上清液和細胞提取液。將細胞提取液用含有細胞的生理鹽水磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次，用Tris-SDS樣品緩沖液溶解抽提，而另一方的培養(yǎng)物上清液經適當超過濾(分子量3000開特)濃縮再與等體積的Tris-SDS樣品緩沖液混合。這些樣品經過熱處理之后，再進行15％-25％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進一步從該凝膠上轉移到PVDF(Amersham pharmacia biotech)膜上。然后，用封閉劑(雪印乳業(yè))封閉處理該PVDF膜1個小時，在含有0.05％Tween20的PBS(PBS-T)中與抗FLAG單克隆抗體(10μg/ml；Kodak)反應2小時。用PBS-T洗滌3次后，在PBS-T中與西洋辣根過氧化酶標記的抗小鼠IgG山羊抗體(Amersham pharmaciabiotech；稀釋5000倍)反應1個小時。用PBS-T洗滌5次后，用ECL plus顯色試劑盒(Amersham pharmacia biotech)及ECL film(Amersham pharmaciabiotech)檢測化學發(fā)光程度。其結果，在含有細胞提取液的培養(yǎng)物上清液中檢測出約14kDa基因產物，進而表明在COS7細胞中有分泌蛋白并表達小鼠MLP-FLAG融合蛋白。
以下分析了該小鼠MLP-FLAG融合蛋白質N-末端氨基酸的序列。首先基于上述方法將含有表達的小鼠MLP-FLAG的COS7細胞并從該細胞培養(yǎng)物上清液中通過使用Anti-FLAGTMM2-Agarose Affinity Gel(Sigma)親和性色譜法獲得酸性洗脫級分(用Glycine-HCl緩沖液(pH3.5)洗脫)。濃縮該級分后，進行與本實施例相同的方法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，CBB染色，此時，只觀察到一條帶它相當于目標蛋白質小鼠MLP-FLAG。用相同級分的濃縮材料同樣地進行電泳，將該蛋白質從凝膠上轉錄至PVDF膜上，然后在パルスリキッド氨基酸序列分析儀Procise CLC491(PE Bio systemes)上分析N-末端氨基酸的序列。從N-末端起依次檢測出氨基酸殘基1.組氨酸、2.甘氨酸、3.纈氨酸、4.苯丙氨酸，該末端與SEQ ID NO26所示小鼠MLP的N-末端序列相一致。從以上所得結果可知，小鼠MLP-FLAG蛋白質是其小鼠MLP-FLAG前體蛋白質的N-末端18個氨基酸殘基信號序列被切割以后從第19個組氨酸殘基開始以小鼠MLP-FLAG成熟蛋白質通過COS7細胞被分泌至培養(yǎng)基中的。實施例5建立能表達小鼠MLP-FLAG融合蛋白的CHO-K1細胞株按照以下要領建立能表達小鼠MLP-FLAG融合蛋白的CHO-K1細胞株。取3.3×104個CHO-K1細胞，于直徑為10cm的塑料平板上，用含有10％胎牛血清(FBS)的F-12培養(yǎng)基(Gibco BRL)培養(yǎng)24小時，通過磷酸鈣法(CellPhect Transfection Kit(Amersham Pharmacia Biotech))將實施例4中的表達質粒pMMLP-F(每個平板為1.5μg)導入至這些細胞中。轉染12個小時后，用不含F(xiàn)BS的F-12培養(yǎng)基洗滌細胞2次，用含有15％的甘油等滲溶液HEPES(pH7.5)3ml進行甘油刺激3分鐘。然后再用不含F(xiàn)BS的F-12培養(yǎng)基洗滌細胞2次，進一步用含有FBS的F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時，并換成含有500mg/L Geneticin(Gibco BRL)和10％FBS的F-12選擇培養(yǎng)基(以下為選擇培養(yǎng)基)。10天后，將平板中所形成的抗Geneticin菌落，分別移至24孔板中，再用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。將在新的選擇培養(yǎng)基中增殖的細胞移至6孔板中，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，再換成包含0.02％CHAPS、0.1mM p-ABSF(和光純藥工業(yè))的Opti-MEM(Gibco BRL)培養(yǎng)基1ml，培養(yǎng)48小時，回收該培養(yǎng)物的上清液。使用Geneticin YM-3超過濾膜(Amicon)濃縮所得培養(yǎng)物的上清液再與等容積的Tris-SDS樣品緩沖液混合。在95℃下熱處理5分鐘，然后用18％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠上的電泳蛋白質轉錄至尼龍膜上。用封閉劑(雪印乳業(yè))封閉該尼龍膜1小時，在含有0.05％Tween20的PBS(PBS-T)中與抗FLAG抗體(1/2000稀釋、SIGMA)反應1小時。用PBS-T洗滌5次后，在PBS-T中與HRP標記的抗小鼠IgG綿羊抗體(1/2000稀釋、Amersham Pharmacia Biotech)反應1個小時。用PBS-T洗滌5次后，使用ECL顯色試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)及HyperfilmECL(Amersham Pharmacia Biotech)檢測化學發(fā)光程度。其結果，在來自于CHO-K1/mMLP.FLAG#2-1株的細胞培養(yǎng)物上清液中約16 kDa目的基因產物被檢測得最多，因此該細胞株即可選作能表達小鼠MLP-FLAG融合蛋白的CHO-K1細胞株。實施例6制備抗MLP血清和使用該抗血清來檢測重組MLP蛋白質按照以下要領制備抗MLP抗血清。首先，通過公知方法在小鼠MLP前體蛋白質中，從第105位纈氨酸殘基至第124位天冬氨酸殘基之間與其氨基酸序列相對應的肽鏈在其C-末端上加上1個半胱氨酸進行化學合成使之為SEQ ID NO31所示的合成肽(Val-Lys-Glu-Gln-Arg-Val-Tyr-Gln-Glu-Ala-Thr-Lys-Glu-Ile-Pro-Thr-Asp-Ile-Asp-Cys)。合成鏈作為一種載體結合了KLH(Keyhole limpet hemocyanin)使其作為抗原，對日本白兔(SPF JapaneseWhite Rabbit)進行免疫。共計免疫7次，然后采血，根據公知方法制備血清級分，保存可加入疊氮鈉(最后濃度為0.1％)作為保存劑，該樣品即為抗MLP抗血清。
其次，對該抗血清的每種重組蛋白質進行蛋白質印跡反應分析。首先，除了實施例4所述的小鼠MLP-FLAG融合蛋白外，又構建了各種表達載體質粒小鼠MLP蛋白(無標記FLAG)、人MLP-FLAG融合蛋白、人MLP蛋白(無標記FLAG)、小鼠MIA-FLAG融合蛋白、小鼠MIA蛋白(無標記FLAG)。構建方法同實施例4相同。即在pCAN618FLAG克隆部位的EcoRI、SalI位點上插入已用PCR預克隆的目的DNA片斷。用于每個PCR反應的成套引物DNA的堿基序列它們分別為若小鼠MLP蛋白(無標記FLAG)則為SEQ ID NO27和32所表示的堿基序列；若人MLP-FLAG融合蛋白則為SEQ ID NO33和34所表示的堿基序列；若人MLP蛋白(無標記FLAG)則為SEQ ID NO33和35所表示的堿基序列；若小鼠MIA-FLAG融合蛋白則為SEQ ID NO36和37所表示的堿基序列；若小鼠MIA蛋白(無標記FLAG)則為SEQ ID NO36和38所表示的堿基序列。小鼠MLP蛋白(無標記FLAG)的模板DNA與實施例4一樣采用pDRL128vM，人MLP-FLAG融合蛋白和人MLP蛋白(無標記FLAG)以實施例1中的pDRL128vH為模板，而小鼠MIA-FLAG融合蛋白和小鼠MIA蛋白(無標記FLAG)采用的cDNA是通過小鼠黑素瘤細胞株B16制備而來。如此所得各種表達載體質粒向COS7細胞中轉染并依據實施例4的方法對收集得到各種培養(yǎng)物上清液使用抗FLAG抗體進行了蛋白質印跡分析。并且利用抗MLP抗血清進行蛋白質印跡分析以該抗血清(稀釋1000倍)作為第一抗體，第二抗體采用西洋辣根過氧化酶標記的抗家兔IgG抗體(Amersham Pharmacia Biotech；稀釋5000倍)，除此之外，均依據抗FLAG抗體蛋白質印跡法分析。
圖2顯示抗FLAG抗體蛋白質印跡法分析結果，圖3顯示抗MLP抗血清蛋白質印跡法分析結果?？筂LP抗血清對抗原肽來源的蛋白質即小鼠MLP和人MLP均顯示交叉性反應，其反應性幾乎不變。還有小鼠MLP-FLAG融合蛋白和人MLP-FLAG融合蛋白都參與了該抗血清反應，進而對標記FLAG的也沒有帶來影響。另一方面，關于小鼠MIA-FLAG融合蛋白和小鼠MIA蛋白(無標記FLAG)完全沒有檢測出信號序列，進而可知，該抗血清對原分子MLP是特異的。
進一步，用該抗血清依據公知方法對實施例5中的表達小鼠MLP-FLAG的CHO細胞株進行免疫染色其結果于圖4所示。以免疫前使用家兔血清作為對照組，在這個對照組中，細胞均未被染色，而使用該抗血清免疫時所有的細胞均被染色，進而表明該抗血清同時參與未變性的MLP蛋白質反應。實施例7 MLP蛋白質在軟骨組織中的表達利用實施例6中得到的抗MLP抗血清在軟骨組織中檢測到MLP蛋白質。所用檢測材料是將小鼠(BALB/c)大腿股骨頭軟骨用液氮冷凍破碎，再用TRIS SDSβME SAMPLE BUFFER(第一化學藥品)抽提離心除去殘渣而成。每個泳道相當于1只小鼠的材料，將這部分的量用SDS-PAGE(15-25％)電泳之后，方法同實施例6一樣，進行抗MLP抗血清蛋白質印跡分析。分析結果表明，MLP蛋白質同小鼠MLP重組蛋白質一樣幾乎在同一泳道位置上檢測出了信號，說明MLP蛋白質在軟骨組織中進行了表達。
為了研究人MLP的mRNA在包括軟骨組織的各種組織中進行表達，使用實施例1中的編碼人MLP前體蛋白質的DNA片斷[α-32P]dCTP(Amersham Pharmacia Biotech；6000Ci/mmol)根據Multiprime DNA labellingsystem(Amersham Pharmacia Biotech；RPN.1601Y)的方法制備探針，用該探針(比活性為1.3×1010cpm/μg)進行Human MTETMArray(CLONTECH#7775-1)雜交。所述雜交條件按照該陣列膜所附說明書的要求，最后一次洗滌采用55℃下，0.1×SSC、0.1％SDS，用BAS-2000(富士膠片)進行檢測。從檢測結果判斷，在該陣列上得到的信號是與對照組人染色體DNA(100ng，500ng)一起僅有的黑質，為胎兒腦斑點，每個信號檢測都處于界限附近，其表達水平在轉錄階段中極低。因此，它預示MLP蛋白質在軟骨組織中具有很強的特異性表達。實施例8添加MLP重組蛋白質對體外軟骨分化模型中的每個基因表達的影響效果在所用實施例3中ATDC5細胞體外軟骨分化模型中，評價了添加MLP重組蛋白質對每個基因表達影響的效果。所用MLP重組蛋白質是經下述方法純化濃縮的樣品，該方法與實施例4相同，用公知的方法從COS7細胞培養(yǎng)物上清液中通過使用抗FLAG抗體進行親和柱色譜分析，所述COS7細胞已表達了小鼠MLP-FLAG融合蛋白。從該模型體系中設定的第一天起每隔2天將該蛋白質加入ATDC5細胞，培養(yǎng)10天后回收細胞，根據實施例3所述的RT-PCR方法研究每個基因的表達情況。其結果確證，在添加該蛋白質細胞群中，隨著Aggrecan、II型膠原、X型膠原等的分化其表達水平增加，每個標記基因的表達受到抑制。另外，對軟骨分化起著抑制作用的PTH/PTHr受體表達來說，其變化沒有明顯的差異。由此可知，MLP蛋白質在使用了ATDC5本模型體系中對軟骨分化具有抑制作用。實施例9對編碼大鼠MLP前體蛋白質(rMLP)基因的分析首先，按照下述PCR法獲取編碼部分rMLP的DNA片斷。也就是說，制備一種20μl的混合液，該混合液不僅包含4pml的SEQ ID NO21所示的有義引物寡DNA和4pml的SEQ ID NO22所示的無義引物寡DNA，而且，它們還含有2μl的10×AdvantageTM2 PCR緩沖液(Clontech)、0.4μl的50×dNTP mix(Clontech)、0.4μl 的 50×Advantage 2 PolymeraseMix(Clontech)、以及2μl的來自SD(IGS)大鼠垂體cDNA溶液作為模板DNA，再使用熱循環(huán)儀(GeneAmpTMPCR system model 9700(Perkin-Elmer))循環(huán)35個周期，即先在95℃下進行1分鐘，然后在95℃10秒、54℃10秒、72℃1分鐘進行。進一步在72℃延長3分鐘反應，在這樣一種程序中進行PCR反應。用2.0％瓊脂糖凝膠使最后反應液電泳，然后用SYBRTMGreen I nucleicacid gel stain(モレキュラ-プロ-ブ)染色，觀察到一種染色帶其對應于通過PCR擴增形成的DNA其位置正好位于通過分子量標記換算之后的300bp附近。使用QIA quick Gel Extraction Kit(Qiagen)回收該DNA片斷，用pCRTM2.1-Topo(In Vitrogen)克隆TA，將該質粒導入大腸桿菌(Escherichiacoli) Epicurian Coli XL10-GoldTM株(ストラタジ-ン)的感受態(tài)細胞以測定堿基序列。在含有氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抗氨芐青霉素轉換體菌落中，選擇來自外源DNA片斷插入的質?？寺。購耐豢寺≈兄苽湓撡|粒DNA、pDRL128vR。以pDRL128vR為DNA模板，以市售的引物DNA(BcaBEST Primer RV-P，寶酒造)為序列引物，按照所附商品說明ABI PRISMTMBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)的條件在熱循環(huán)儀(GeneAmpTMPCR system model 9700(Perkin-Elmer))上測定插有DNA的堿基序列，然后用DNA測序儀ABI PRISMTM377(Perkin-Elmer)分析反應材料。
其結果，在pDRL128vR中不僅包含編碼新型大鼠MLP前體蛋白質的一部分的DNA片斷，該DNA片斷為SEQ ID NO40所示261個堿基對構成，其中所述一部分蛋白質由SEQ ID NO39所示的87個氨基酸組成；而且還包含由SEQ ID NO41所示307個堿基對的DNA片斷。
接著，關于編碼該蛋白質的基因，通過所述堿基序列進一步進行genomewalking以研究5′上游區(qū)和3′下游區(qū)的構造。用Rat Genome WalkerTMKit(Clontech)作為被檢材料，其操作方法遵循該試劑盒所附說明書，但是其中用于PCR反應的酶要使用TaKaRa Ex TaqTM(寶酒造)。首先分別進行genespecific primer的化學合成，它包括相當于SEQ ID NO40所示堿基序列一部分的2種寡DNA(rMLPGWF1(SEQ ID NO42)、rMLPGWF2(SEQ IDNO43))和與該序列一部分DNA互補的2種寡DNA(rMLPGWR1(SEQ IDNO44)、rMLPGWR2(SEQ ID NO45))。為了獲得3′下游區(qū)DNA，在1stPCR反應中先使用rMLPGWF1，然后在nested PCR反應中使用rMLPGWF2，同樣為了獲得5′上游區(qū)DNA，在1st PCR反應中先使用rMLPGWR1，然后在nested PCR反應中使用rMLPGWR 2。就這些反應所得各種擴增的DNA片斷來說，起點部位為所述引物序列，并在比較編碼人和小鼠MLP前體蛋白的cDNA堿基序列的同源性的同時分析各自的堿基序列。結果表明，從判斷的基因組一級構造上來看，大鼠MLP前體蛋白質為由SEQ ID NO47所示的128個氨基酸殘基組成的蛋白質，所述蛋白質是由SEQ ID NO46所示384個堿基DNA編碼的。大鼠MLP前體蛋白質與人MLP前體蛋白質以及小鼠MLP前體蛋白質它們在氨基酸水平上的同源性各自為84.3％、96.0％。然而大鼠MIA前體蛋白質與大鼠MLP前體蛋白質之間的同源性僅為26.5％。故此，大鼠MLP為由SEQ ID NO49所示的110個氨基酸殘基組成的蛋白質，其中所述蛋白質是由SEQ ID NO48所示330個堿基DNA編碼形成的，并且在大鼠MLP前體蛋白質中與SEQ IDNO50所示小鼠MLP相同并經過18個氨基酸殘基組成的信號肽而生成。
將具有編碼本實施例中的大鼠MLP前體蛋白質的一部分之DNA的質粒pDRL128vR導入大腸桿菌(Escherichia coli)XL10-Gold中，從而獲得大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pDRL128vR。
產業(yè)上的利用性本發(fā)明多肽以及編碼該多肽的DNA可用作治療、預防和診斷骨疾病或關節(jié)疾病以及有病的血管新生等。本發(fā)明多肽又可作為試劑有效篩選能夠促進或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物或其鹽。本發(fā)明多肽的抗體能進一步特異地識別本發(fā)明的多肽，因此它可用于檢測、定量和中和待測溶液中的本發(fā)明多肽等。
通過使用本發(fā)明啟動子還可在非人溫血動物軟骨組織中使蛋白質(任意有用基因產物等)處于最(優(yōu)選特異性)大量的表達，因此可為基因治療做出貢獻。
序列表<110>武田藥品工業(yè)株式會社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>新型多肽及其DNA<130>2622WOOP<150>1999-06-30<151>JP 11-186718<160>48<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1cgcagaagaa gtcaatatcc gtggtg 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2cagcgtgtgt accaggaagc taccaa 26<210>4<211>384<212>DNA<213>人<400>4atggcaagaa tattgttact tttcctcccg ggtcttgtgg ctgtatgtgc tgtgcatgga 60atatttatgg accgtctagc ttccaagaag ctctgtgcag atgatgagtg tgtctatact 120atttctctgg ctagtgctca agaagattat aatgccccgg actgtagatt cattaacgtt 180aaaaaagggc agcagatcta tgtgtactca aagctggtaa aagaaaatgg agctggagaa 240ttttgggctg gcagtgttta tggtgatggc caggacgaga tgggagtcgt gggttatttc 300cccaggaact tggtcaagga acagcgtgtg taccaggaag ctaccaagga agttcccacc 360acggatattg acttcttctg cgag384<210>5<211>18<212>PRT<213>人<400>5Met Ala Arg Ile Leu Leu Leu Phe Leu Pro Gly Leu Val Ala Val Cys1 5 10 15Ala Val18<210>6<211>128<212>PRT<213>人<400>6Met Ala Arg Ile Leu Leu Leu Phe Leu Pro Gly Leu Val Ala Val Cys1 5 10 15Ala Val His Gly Ile Phe Met Asp Arg Leu Ala Ser Lys Lys Leu Cys20 25 30Ala Asp Asp Glu Cys Val Tyr Thr Ile Ser Leu Ala Ser Ala Gln Glu35 40 45Asp Tyr Asn Ala Pro Asp Cys Arg Phe Ile Asn Val Lys Lys Gly Gln50 55 60Gln Ile Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Lys Glu Asn Gly Ala Gly Glu65 70 75 80Phe Trp Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp Gly Gln Asp Glu Met Gly Val85 90 95Val Gly Tyr Phe Pro Arg Asn Leu Val Lys Glu Gln Arg Val Tyr Gln100 105 110Glu Ala Thr Lys Glu Val Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu115 120 125 128<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>7cacacagcac gtagtcgcag ttgg 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8aacttggtga aggagcagcg tgta 24<210>10<211>384<212>DNA<213>小鼠<400>10atggcaagga tattgattct tttgcttggg ggccttgtgg ttctatgtgc cgggcatggt 60gtatttatgg ataaactttc ttctaagaag ttgtgtgcgg atgaggagtg tgtctatact 120atttctctgg caagagcaca ggaagattac aatgccccag actgtaggtt catcgatgtc 180aagaaagggc agcagatcta tgtttactcc aagctggtaa cagaaaacgg agctggagag 240ttttgggctg gcagtgttta tggtgaccac caggatgaga tgggaattgt aggttatttc 300cccagcaact tggtgaagga gcagcgtgta taccaggagg ccaccaagga gatcccaacc 360acggatattg acttcttctg tgaa384<210>11<211>18<212>PRT<213>小鼠<400>11Met Ala Arg Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly Gly Leu Val Val Leu Cys1 5 10 15Ala Gly18<210>12<211>128<212>PRT<213>小鼠<400>12Met Ala Arg Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly Gly Leu Val Val Leu Cys1 5 10 15Ala Gly His Gly Val Phe Met Asp Lys Leu Ser Ser Lys Lys Leu Cys20 25 30Ala Asp Glu Glu Cys Val Tyr Thr Ile Ser Leu Ala Arg Ala Gln Glu35 40 45Asp Tyr Asn Ala Pro Asp Cys Arg Phe Ile Asp Val Lys Lys Gly Gln50 55 60Gln Ile Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Thr Glu Asn Gly Ala Gly Glu65 70 75 80Phe Trp Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp His Gln Asp Glu Met Gly Ile85 90 95Val Gly Tyr Phe Pro Ser Asn Leu Val Lys Glu Gln Arg Val Tyr Gln100 105 110Glu Ala Thr Lys Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu115 120 125 128<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>13accacagtcc atgccatcac20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>14tccaccaccc 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300cccaccacgg atattgactt cttctgcgag 330<210>24<211>110<212>PRT<213>人<400>24His Gly Ile Phe Met Asp Arg Leu Ala Ser Lys Lys Leu Cys Ala Asp5 10 15Asp Glu Cys Val Tyr Thr Ile Ser Leu Ala Ser Ala Gln Glu Asp Tyr20 25 30Asn Ala Pro Asp Cys Arg Phe Ile Asn Val Lys Lys Gly Gln Gln Ile35 40 45Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Lys Glu Asn Gly Ala Gly Glu Phe Trp50 55 60Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp Gly Gln Asp Glu Met Gly Val Val Gly65 70 75 80Tyr Phe Pro Arg Asn Leu Val Lys Glu Gln Arg Val Tyr Gln Glu Ala85 90 95Thr Lys Glu Val Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu100 105 110<210>25<211>330<212>DNA<213>小鼠<400>25catggtgtat ttatggataa actttcttct aagaagttgt gtgcggatga ggagtgtgtc 60tatactattt ctctggcaag agcacaggaa gattacaatg ccccagactg taggttcatc 120gatgtcaaga aagggcagca gatctatgtt tactccaagc tggtaacaga aaacggagct 180ggagagtttt gggctggcag tgtttatggt gaccaccagg atgagatggg aattgtaggt 240tatttcccca gcaacttggt gaaggagcag cgtgtatacc aggaggccac caaggagatc 300ccaaccacgg atattgactt cttctgtgaa 330<210>26<211>110<212>PRT<213>小鼠<400>26His Gly Val Phe Met Asp Lys Leu Ser Ser Lys Lys Leu Cys Ala Asp5 10 15Glu Glu Cys Val Tyr Thr Ile Ser Leu Ala Arg Ala Gln Glu Asp Tyr20 25 30Asn Ala Pro Asp Cys Arg Phe Ile Asp Val Lys Lys Gly Gln Gln Ile35 40 45Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Thr Glu Asn Gly Ala Gly Glu Phe Trp50 55 60Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp His Gln Asp Glu Met Gly Ile Val Gly65 70 75 80Tyr Phe Pro Ser Asn Leu Val Lys Glu Gln Arg Val Tyr Gln Glu Ala85 90 95Thr Lys Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu100 105 110<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>27cgaattccca ccatggcaag gatattgatt cttttgcttg 40<210>28<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>28gtacagtcga cttcacagaa gaagtcaata tccgtggttg 40<210>29<211>923<212>DNA<213>人<400>29gtcagagttc aagttaaaac agaaaaaagg aagatggcaa gaatattgtt acttttcctc 60ccgggtcttg tggctgtatg tgctgtgcat ggaatattta tggaccgtct agcttccaag 120aagctctgtg cagatgatga gtgtgtctat actatttctc tggctagtgc tcaagaagat 180tataatgccc cggactgtag attcattaac 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Gly Ala Gly Ala Phe Trp Ala Gly Ser Val Tyr50 55 60Gly Asp His Gln Asp Glu Met Gly Ile Val Gly Tyr Phe Pro Ser Asn65 70 75 80Leu Val Arg Glu Gln Arg Val85<210>40<211>261<212>DNA<213>大鼠<400>40ggataaactt tcttctaaga agttgtgtgc agatgaggag tgtgtctata ccatttctct 60ggcaagagca caggaagact acaatgcccc ggactgtagg ttcatcaatg tcaagaaagg 120gcagcagatc tatgtttatt ccaagctggt aacagaaaat ggagctgggg cattctgggc 180tggcagtgtt tatggtgacc accaggatga gatgggaatt gtgggttatt tccccagcaa 240cttggttaga gagcaacgag t 261<210>41<211>307<212>DNA<213>大鼠<400>41gccgggcatg gtgtatttat ggataaactt tcttctaaga agttgtgtgc agatgaggag 60tgtgtctata ccatttctct ggcaagagca caggaagact acaatgcccc ggactgtagg 120ttcatcaatg tcaagaaagg gcagcagatc tatgtttatt ccaagctggt aacagaaaat 180ggagctgggg cattctgggc tggcagtgtt tatggtgacc accaggatga gatgggaatt 240gtgggttatt tccccagcaa cttggttaga gagcaacgag tataccagga gggccaccaa 300ggagatc 307<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>42caccaggatg agatgggaat 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Cys Arg Phe Ile Asn Val Lys Lys Gly Gln50 55 60Gln Ile Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Thr Glu Asn Gly Ala Gly Ala65 70 75 80Phe Trp Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp His Gln Asp Glu Met Gly Ile85 90 95Val Gly Tyr Phe Pro Ser Asn Leu Val Arg Glu Gln Arg Val Tyr Gln100 105 110Glu Ala Thr Lys Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu115 120 125<210>48<211>330<212>DNA<213>大鼠<400>48catggcatgt ttatggataa actttcttct aagaagttgt gtgcagatga ggagtgtgtc 60tataccattt ctctggcaag agcacaggaa gactacaatg ccccggactg taggttcatc 120aatgtcaaga aagggcagca gatctatgtt tattccaagc tggtaacaga aaatggagct 180ggggcattct gggctggcag tgtttatggt gaccaccagg atgagatggg aattgtgggt 240tatttcccca gcaacttggt tagagagcaa cgagtgtacc aggaggccac caaggagatt 300ccaaccacgg atattgactt cttctgtgaa 330<210>49<211>110<212>PRT<213>大鼠<400>49His Gly Met Phe Met Asp Lys Leu Ser Ser Lys Lys Leu Cys Ala Asp5 10 15Glu Glu Cys Val Tyr Thr Ile Ser Leu Ala Arg Ala Gln Glu Asp Tyr20 25 30Asn Ala Pro Asp Cys Arg Phe Ile Asn Val Lys Lys Gly Gln Gln Ile35 40 45Tyr Val Tyr Ser Lys Leu Val Thr Glu Asn Gly Ala Gly Ala Phe Trp50 55 60Ala Gly Ser Val Tyr Gly Asp His Gln Asp Glu Met Gly Ile Val Gly65 70 75 80Tyr Phe Pro Ser Asn Leu Val Arg Glu Gln Arg Val Tyr Gln Glu Ala85 90 95Thr Lys Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile Asp Phe Phe Cys Glu100 105 110<210>50<211>18<212>PRT<213>大鼠<400>50Met Ala Arg Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly Gly Leu Val Ala Leu Cys5 10 15Ala Gly18
權利要求
1.一種多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，所述多肽含有與SEQ ID NO24所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
2.權利要求1所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽含有與SEQ ID NO6所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
3.權利要求1所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ IDNO24所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO26所示氨基酸序列。4.權利要求2所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ IDNO6所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO12所示氨基酸序列。
5.權利要求1所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ IDNO24所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO49所示氨基酸序列。
6.權利要求2所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽，其中所述與SEQ IDNO6所示氨基酸序列基本相同的序列為SEQ ID NO47所示氨基酸序列。
7.一種DNA，其包含編碼權利要求1所述多肽的堿基序列的DNA。
8.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO23所示的堿基序列。
9.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO4所示的堿基序列。
10.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO25所示的堿基序列。
11.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO10所示的堿基序列。
12.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO48所示的堿基序列。
13.權利要求6所述的DNA，其中所述編碼權利要求1多肽的堿基序列為SEQ ID NO46所示的堿基序列。
14.一種重組載體，其含有權利要求6所述的DNA。
15.一種轉化體，其用權利要求14所述重組載體轉化而成。
16.一種生產權利要求1所述多肽、其酰胺、其酯、或其鹽的方法，其包含培養(yǎng)權利要求15的轉化體，并從中生成該多肽。
17.一種抗體，其針對權利要求1所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽，
18.一種篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽能夠促進或抑制權利要求1所述多肽或其鹽的活性，該方法包括使用權利要求1的多肽或其酰胺或其酯、或其鹽。
19.一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽能夠促進或抑制權利要求1所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性，其中所述試劑盒包括權利要求1的多肽或其鹽。
20.一種能夠促進或抑制權利要求1的多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用權利要求18的篩選法或權利要求19的篩選試劑盒而獲得。
21.一種藥物，其包含能促進或抑制權利要求1所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用權利要求18的篩選法或權利要求19的篩選試劑盒而獲得。
22.一種藥物，其含有權利要求1所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽。
23.一種預防和治療骨疾病或關節(jié)疾病或者有病的血管新生之藥物，所述藥物含有權利要求1的多肽、其酰胺、其酯、或其鹽。
24.一種診斷試劑，其含有權利要求17的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型多肽;編碼該多肽的DNA;含有該多肽或DNA的藥物;篩選能夠促進或抑制該多肽活性的化合物或其鹽的方法和/或試劑盒;通過該篩選法可獲得的化合物或其鹽;含有該化合物或其鹽的藥物。本發(fā)明的多肽和編碼該多肽的DNA可用作治療、預防和診斷骨疾病或關節(jié)疾病、以及有病的血管新生等。本發(fā)明的多肽又可作為一種試劑,其用于篩選能夠促進或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物或其鹽。
文檔編號C12N15/12GK1359421SQ00809843
公開日2002年7月17日 申請日期2000年6月29日 優(yōu)先權日1999年6月30日
發(fā)明者伊藤康明, 西一紀, 大儀和宏, 大久保尚一, 茂木伸一, 野口優(yōu)子, 吉村浩二, 田中秀幸 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社