專利名稱：組合式奈瑟球菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物，這些組合物含有來自奈瑟球菌，尤其是腦膜炎奈瑟球菌(N meningitidis)和淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)地生物分子的組合。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)是不能動的、對人有致病性的革蘭氏陰性雙球菌。
根據(jù)該菌的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是亞撒哈拉-非洲地區(qū)流行病中最常見的病原體。B型和C型血清型菌是導致美國以及大多數(shù)發(fā)達國家內(nèi)大多數(shù)病例的原因。W135和Y型血清型菌是導致美國和發(fā)達國家的其余病例的原因。
目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135組成的四價多糖疫苗。然而，腦膜炎球菌B(menB)仍是一個問題。不能采用多糖方法，因為menB莢膜多糖是一種α(2-8)-相連的N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚合物，它也存在于哺乳動物組織中。一種menB疫苗方法是采用外膜蛋白(OMP)的混合物。為了克服抗原性變異，已經(jīng)構(gòu)建了含有高達9種不同膜孔蛋白的多價疫苗(例如，Poolman JT(1992)“腦膜炎球菌疫苗的發(fā)展”Infect.Agents Dis.413-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是這些方法均不能克服抗原性變異(例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)″腦膜炎球菌運鐵蛋白結(jié)合蛋白1和2均是外露的，并能產(chǎn)生殺傷同源和異源菌株的殺菌性抗體″Vaccine 14(1)49-53)。
考慮到在非流行期間的腦膜炎球菌疾病是由多個菌株或變異菌株所造成的傾向(Russel等人(1998)11屆國際致病奈瑟球菌大會摘要，第281頁)，以及在一群落中優(yōu)勢菌株經(jīng)常發(fā)生暫時變動，看來通用的腦膜炎球菌B疫苗將需要一種以上的抗原種類。發(fā)明描述奈瑟球菌蛋白和核苷酸序列公開于下列文件中·WO 99/24578·WO 99/36544·WO 99/57280·WO 97/28273·WO 96/29412·WO 95/03413·Tettelin等人(2000)科學(Science)2871809-1815為了方便起見，在這些文件中所公開的序列在本申請中根據(jù)下表進行引用。
本發(fā)明提供了含有來自奈瑟球菌細菌的第一生物分子以及來自奈瑟球菌細菌的第二生物分子的組合物。術(shù)語“生物分子”包括蛋白質(zhì)和核酸。
該組合物還可含有進一步的生物分子，較佳地也來自奈瑟球菌。換言之，該組合物可含有2種或多種(如3、4、5、6、7、8等)生物分子，其中至少2種來自奈瑟球菌細菌(如3、4、5、6、7、8等)。這樣的組合物包括那些含有下列物質(zhì)的組合物(i)兩種或多種不同的奈瑟球菌蛋白，(ii)兩種或多種不同的奈瑟球菌核酸，或(iii)一種或多種奈瑟球菌蛋白以及一種或多種奈瑟球菌核酸的混合物。
在一優(yōu)選例中，第一和第二生物分子來自不同的奈瑟球菌物種(例如一種來自腦膜炎奈瑟球菌，一種來自淋病奈瑟球菌)，但是它們也可來自同一物種。組合物中的生物分子可以來自同一物種的不同的血清型或菌株。
第一生物分子宜選自由SEQ ID 1-8376構(gòu)成的組。更佳地，選自由SEQ ID1-4002和/或SEQ ID 4057-8376構(gòu)成的組。優(yōu)選地，它是純化的或分離的生物分子。
第二生物分子宜選自由SEQ ID 1-8376構(gòu)成的組。更佳地，選自由SEQ ID1-4002和/或SEQ ID 4057-8376構(gòu)成的組。優(yōu)選地，它是純化的或分離的生物分子。
第一和第二生物分子中的一者或兩者可以是在本文中沒有具體公開的，以及在本專利申請?zhí)峤恢斑€沒有被鑒定、發(fā)現(xiàn)、為公眾所知或純化的奈瑟球菌生物分子。
具體地，本發(fā)明提供了一種組合物，它含有一種或多種下列的第一和第二生物分子的配對(以SEQ ID列出)
因此，本發(fā)明包括了SEQ ID 1-8376的35074500種可能的配對形式(1&2，1&3，1&4，1&5，……1&8375，1&8376，2&3，2&4，2&5，……2&8375，2&8376，3&4…1000&1001，1000&1002，…1000&8376，…8374&8375，8374&8376，8375&8376)。盡管出于空間原因，并沒有全部在此列出。
有關(guān)如何產(chǎn)生和使用構(gòu)成SEQ ID 1-4056的分子的細節(jié)，可以在相關(guān)的國際申請中找到。這些細節(jié)沒有必要在此重復。類似的原則適用于SEQ ID 4057-8376。
在本發(fā)明組合物中的SEQ ID 1-8376，可以用具有與SEQ ID 1-8376同源(即具有序列相同性)的序列的分子加以補充或替換。根據(jù)具體的序列，相同性的程度宜大于50％(例如65％、80％、90％或更高)，并且包括突變體和等位基因變體。蛋白質(zhì)之間的序列相同性宜用Smith-Watemen同源性搜索算法來確定，如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中采用仿射缺口搜尋，其中參數(shù)“缺口開口罰分(gap open penalty)”為12，“缺口延伸罰分(gap extension penalty)”為1。
在本發(fā)明組合物中的SEQ ID 1-8376，可以用包含SEQ ID 1-8376片段的分子加以補充或替換。這些片段應包含諸分子中至少n個連續(xù)的單體，并且根據(jù)具體的序列，(i)對于蛋白質(zhì)分子，n宜為7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)，從而使片段宜包含該序列的表位，或者(ii)對于核酸分子，n為10或更高(如12、14、15、18、20、25、30、35、40或更高)。
當組合物含有以不同新生形式或成熟形式存在的蛋白時，優(yōu)選使用成熟形式的蛋白質(zhì)。例如，可以使用沒有信號肽的成熟形式的NspA蛋白(SEQ ID 4008-4033；WO96/29412；圖29)。
在蛋白質(zhì)分子情況下，本發(fā)明組合物中的SEQ ID 1-8376，可以用結(jié)合于所述蛋白的抗體加以補充或替換。這種抗體可以是單克隆的或多克隆的。
在核酸分子情況下，本發(fā)明組合物中的SEQ ID 1-8376，可以用雜交于奈瑟球菌核酸(較佳地在“高度嚴緊”條件下雜交(如65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液中))的核酸加以補充或替換。
應理解，該組合物中的任何核酸可以是各種不同形式的(例如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。此外，術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA，以及它們的類似物，如含有修飾骨架的那些類似物，還包括肽核酸(PNA)等。
在某些例子中，組合物含有來自不同奈瑟球菌物種的分子，例如一種或多種腦膜炎奈瑟球菌分子和一種或多種淋病奈瑟球菌分子。在某些例子中，組合物可含有來自相同物種的不同血清型和/或菌株(例如腦膜炎奈瑟球菌A菌株和B菌株)的分子。進一步的例子還包括，來自不同菌株的一種或多種腦膜炎奈瑟球菌分子和一種或多種淋病奈瑟球菌分子的混合物。
許多蛋白質(zhì)在腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的不同物種、血清型和菌株之間是相對保守的(例如SEQ ID 52、54、58)。PCT/IB00/00642包含了對這些蛋白中保守區(qū)域的更詳細的實驗分析。為了確保最大的菌株間交叉識別性和反應性，可以在本發(fā)明組合物中使用不同奈瑟球菌物種、血清型和菌株之間保守的蛋白質(zhì)區(qū)域。因此，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)含有在大多數(shù)奈瑟球菌(尤其是腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)中共有的氨基酸序列區(qū)段。較佳地，所述組合物含有一蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有奈瑟球菌蛋白(宜為SEQ ID 1-8376中的蛋白，或更佳地為SEQ ID 1-4002中的蛋白)的片段，其中，所述片段包含n個連續(xù)的保守氨基酸。根據(jù)具體的蛋白質(zhì)，n為7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。所述片段宜包含奈瑟球菌蛋白的抗原性或免疫原性區(qū)域?！氨Ｊ氐摹卑被崾窃谥辽賦％奈瑟球菌中，更佳地在至少x％腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中的特定奈瑟球菌蛋白中存在的氨基酸。x的值可以是50％或更高，例如66％、75％、80％、90％、95％或甚至100％(即該氨基酸存在于所有奈瑟球菌的有關(guān)蛋白質(zhì)中)。為了確定一個氨基酸在特定奈瑟球菌蛋白中是否是“保守的”，需要比較在多種不同奈瑟球菌(“參照群”)的有關(guān)蛋白序列中的該氨基酸殘基。“參照群”的合適定義可以在PCT/IB00/00642中找到。不同奈瑟球菌的氨基酸序列可以用計算機輕易地進行比較。這通常涉及用算法，例如CLUSTAL[Thompson等人(1994)核酸研究(Nucl.Acids Res.)224673-4680；Trends Biochem Sci(1998)23403-405]或PILEUP算法[GCG Wisconsin軟件包的組成部分，優(yōu)選9.0版]，將多個序列進行比對。保守氨基酸在多序列比對中是很明顯的，在有關(guān)的氨基酸位置處，大多數(shù)被比對的序列會含有特定的氨基酸。還可以通過使用程序，例如BOXSHADE[可從例如NIH在線獲得]、PRETTYBOX[GCG Wisconsin，版本10]或JALVIEW[可從EBI在線獲得]，可更清楚地看出保守氨基酸。
因此，本發(fā)明具體的組合物包括那些含有以下物質(zhì)的組合物
■兩種或多種選自SEQ ID 1-4002的生物分子；
■一種或多種選自SEQ ID 1-4002的生物分子，以及一種或多種選自SEQ
ID 4003-8376的生物分子；
■一種或多種選自SEQ ID 1-4002的生物分子，以及NspA蛋白(如
WO96/29412中所公開還可參見本申請的圖29)(優(yōu)選成熟形式)；
■一種或多種選自SEQ ID 1-8376(優(yōu)選SEQ ID 1-4002)的生物分子，以及
運鐵蛋白結(jié)合蛋白A(TbpA)和/或B(TbpB)，例如在WO 00/25811中公開
的TbpA和TbpB(或其免疫原性片段)；
■一種或多種選自SEQ ID SEQ ID 1-4002的蛋白質(zhì)的片段，且該片段優(yōu)選
含有保守的氨基酸區(qū)段；
■不同蛋白質(zhì)的組合，其中該組合整體上含有被參照群中每種菌株所識別
的一種或多種蛋白質(zhì)，盡管在組合中的每個單獨蛋白質(zhì)本身并不被參照
群中每種菌株所識別，即參照群中每個成員識別該組合中的至少一個蛋
白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了用作藥劑(例如作為免疫原性組合物或疫苗)，或作為診斷性試劑的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明組合物在生產(chǎn)下列物質(zhì)中的應用(i)用于治療或預防奈瑟球菌屬細菌感染的藥劑；(ii)用于檢測奈瑟球菌或檢測抗奈瑟球菌抗體是否存在的診斷性試劑；和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細菌的抗體的試劑。
本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明組合物的方法，它包括步驟將一種或多種SEQ ID 1-8376中與另外的一種或多種SEQ ID 1-8376混合。
附圖簡述


圖1顯示了ORF 6、7、13、65-1、72、73-1、105-1、137-1、143-1、和147-1表達的SDS-PAGE結(jié)果。左側(cè)泳道顯示了分子量標記(M1組)。
圖2顯示了ORF9的(A)SDS-PAGE結(jié)果；(B)在針對腦膜炎奈瑟球菌外膜小泡制備物的Western印跡中腦膜炎奈瑟球菌免疫反應條帶的位置；(C)FACS分析。
圖3顯示了ORF2-1、5-1、22-1、132-1和4表達的SDS-PAGE結(jié)果。左側(cè)泳道顯示了分子量標記(M1組)。
圖4-28顯示了ORF2、5、6、7、9、13a、15、22、23、27、28、32、65、72、73、76、79、89、105、106-1、132、137、138、143和147的親水性圖(上)、抗原性指數(shù)(中)和兩親性區(qū)域(AMPHI)(下)。
圖29顯示了腦膜炎球菌B不同菌株的NspA的序列變異性。這些序列可用作WO 96/29412(SEQ ID 4008-4033)的替代物。
圖30顯示了用間接熒光流式細胞術(shù)確定的多克隆抗-rNspA與有莢膜和無莢膜的menB菌株的結(jié)合情況。
圖31顯示了對有莢膜的菌株8047、CU385和M986(31A)以及無莢膜的菌株BZ232、MC58、NG3/88和NGB165(31B)的類似結(jié)果。
圖32顯示了NspA的二級結(jié)構(gòu)模型。
圖33顯示了用四價混合物對無莢膜菌株M7(37A)和乙醇處理過(破壞莢膜)的菌株2996、N44776、MC58、1000、BZ232、BZ133、NG6/88、BZ198、NG3/88、297-0、BZ147和BZ169(37B)的FACS分析。
圖34顯示了用五價混合物的1∶400(34A)、1∶200(34B)和1∶100(34C)稀釋液，對M7菌株的FACS分析。
實施例
實施例1表達和純化實驗
將在WO 99/24578中公開的ORF6、7、13、65-1、72、73-1、105-1、137-1、143-1、和147-1，如下表所示在大腸桿菌中表達并純化。
注ORF73-1以片段形式表達(氨基酸41-161)。
用于表達這10個ORF的方案與WO99/24578中所描述的基本相同，其中使用pGEX和pET載體。用于擴增ORF的PCR引物列于下表
這10個表達的ORF的SDS-PAGE結(jié)果示于
圖1。
用ORF7-His融合蛋白免疫小鼠?；旧习碬O 99/24578中所述，將血清用于ELISA分析，并獲得了陽性結(jié)果。
下列蛋白也被表達和純化(結(jié)果未示出)
下列PCR引物用于擴增這些ORF。
這些ORF中的每一個都可與一種或多種SEQ ID 1-8376相混合。
實施例2 ORF9表達與純化
將在WO99/24578中公開的ORF9克隆入pET載體并在大腸桿菌中表達。純化的ORF-His融合蛋白用SDS-PAGE分析，如圖2A所示。用純化的ORF9-His免疫小鼠，將血清用于Western印跡分析(圖2B)、FACS分析(圖2C)和ELISA分析。所用方案與WO99/24578中所給出的方案基本相同。
結(jié)果證實，ORF9是一個暴露于表面的蛋白。ORF9適合用于與SEQ ID 1-8376中的其他一種或多種進行混合。
實施例3進一步的表達實驗
按下表所示，對于WO99/24578中公開的ORF2-1、5-1、22-1和132-1在大腸桿菌中進行進一步的表達和純化實驗。
用于表達這4個ORF的方案與WO99/24578中所描述的基本相同，其中使用pGEX和pET載體。用于擴增ORF的PCR引物列于下表
這4個表達的ORF的SDS-PAGE結(jié)果示于圖3。
這些ORF中的每一個都可與一種或多種SEQ ID 1-8376相混合。
實施例4 ORF4脂蛋白的表達和純化
作為一個含有脂肽信號信號序列(LPSS)的ORF4公開于WO99/24578。用下列PCR引物擴增全長的ORF orf4-L正向CGCGGATCCCATATGAAAACCTTCTTCAAAAC orf4-L反向CCCGCTCGAGTTATTTGGCTGCGCCTTC
將擴增的DNA片段克隆入載體pET21b+，以便以C末端帶His尾標記的融合蛋白形式表達。對含pET21b+orf4-LPSS的大腸桿菌的對數(shù)期培養(yǎng)物，在30℃用1.0mM IPTG誘導3小時，通過8000g離心10分鐘而收集，并重新懸浮于PBS中。懸浮液在冰上進行超聲波處理，加入Triton X-114至終濃度為0.6％(v/v)。材料在冰上保溫20分鐘，然后升溫至37℃，直至相分離發(fā)生(以高度渾濁為標志)。在20℃，10000g離心10分鐘后，棄去上層水相，并在不影響細菌沉淀的情況下收集下層去污劑相。向去污劑相中加入13倍體積的20mM組氨酸、2mMEDTA、30mM NaCl(pH 5.8)。在4℃離心10分鐘，將上清液分批與Q SepharoseFast Flow樹脂(Pharmacia)在4℃混合30分鐘?；旌衔锉浑x心、保留上清液，用20mM組氨酸、2mM EDTA、30mM NaCl(pH 5.8)、Tritron X-1000.3％(v/v)洗滌樹脂，并用相同緩沖液配的1M氯化鈉進行洗脫。大部分Orf4脂蛋白在結(jié)合后獲得的上清液中發(fā)現(xiàn)。最后的純化是在Hi-TrapTMQ柱(Pharmacia)上，通過色譜法完成。通過加入0.1M HCl使結(jié)合上清液的pH調(diào)至7.0，然后上樣于用50mMTris-HCl(pH 7.0)，2mM EDTA，0.3％Triton X-100，10mM NaCl平衡過的Hi-TrapTMQ柱。用5.0毫升平衡緩沖液洗滌柱，使用10mM至1M的氯化鈉梯度。洗脫出了兩種電泳上截然不同的蛋白形式。一種在洗滌液中，一種在150-300mM氯化鈉之間的氯化鈉梯度中。在洗滌液中獲得的蛋白被用于免疫小鼠。這種形式的蛋白可能代表了完全加工的脂化分子。
在圖3中可看見該純化的31kDa脂蛋白。ORF4適合與SEQ ID 1-8376中其他的一種或多種混合。
實施例5計算機預測
對ORF 2、5、6a、7、9、13a、15、22、23、27、28、32、65、72、73、76、79、89、105、106-1、132、137、138、143和147(如WO 99/24578中所公開)進行了計算機分析。圖4-28顯示了這些ORF中每一種ORF的親水性圖(上)、抗原性指數(shù)圖(中)和兩親性區(qū)域(AMPHI)分析(下)。使用AMPHI程序來預測T細胞表位(Gao等人1989，J.Immunol 1433007；Roberts等人.1996，AIDS Res HumanRetroviruses 12593；Quakyi等人.1992，Scand JImmunol Suppl 119)，該測序可在DNASTAR Inc.公司(1228 South Park Street，Madison，Wisconsn 53715，USA)的Protean軟件包中獲得。
這些ORF中的每一種都可與SEQ ID 1-8376中其他的一種或多種混合。
實施例6四價混合物
制備蛋白質(zhì)919(WO99/57280)、225(WO99/57280)、ORF4(WO99/24578，實施例26)和ORF40(WO 99/36555，實施例1)的混合物，并用ELISA和FACS進行分析。針對13種測試菌株的ELISA效價如下
FACS結(jié)果示于圖33。很明顯，無論使用何種特定menB菌株，該四價混合物都給出了優(yōu)異結(jié)果。此外，產(chǎn)生的針對混合物的抗血清在菌株2996中，在高達1∶2048倍的稀釋度下是殺菌性的。
實施例7-五價混合物
制備蛋白質(zhì)ORF4-L(脂化蛋白，見上面的實施例4)、ORF37(WO99/24578，實施例1)、ORF40(WO99/36544，實施例1)、502(WO99/57280，第687-690頁)和8(WO99/57280，第165-167頁)。針對13種測試菌株的ELISA效價如下
FACS結(jié)果示于圖34。很明顯，無論使用何種特定menB菌株，五價混合物都給出了優(yōu)異結(jié)果。此外，產(chǎn)生的針對混合物的抗血清在菌株2996中是殺菌性的。
實施例8-三價混合物
混合蛋白質(zhì)ORF1(例如WO99/24578，實施例77；還可見WO99/55873)、287(例如WO99/57280，圖21；還可參見本文SEQ ID 3103-3108)和919(例如WO99/57280，圖23和本文的SEQ ID 3069-3074)，并與Al(OH)3佐劑混合。這些蛋白質(zhì)來自MenB的2996菌株。
該混合物還與MenC多糖偶聯(lián)抗原[如Costantino等人(1992)Vacine10691-698]組合。OMV被用作對照。
該混合物還被用于針對同源菌株以及異源MenB菌株的殺菌性分析。效價如下實施例9蛋白質(zhì)287、919和953蛋白質(zhì)287、919和953公開于WO9957280。這些來自腦膜炎奈瑟球菌B血清型菌株2996的蛋白被表達，并在針對菌株2996的殺菌性分析中單獨地和組合地進行測試。來自2996的OMV被用作陽性對照。
圖35顯示了對于單個抗原以及4種組合的FACS數(shù)據(jù)。
顯然，抗原混合物比分離的抗原更有效，而且尤其是919+953組合給出了出乎意料的好結(jié)果。
還針對不同的血清型A、B和C菌株(即異源性侵襲)，測試了2996的各抗原及其組合。殺菌性效價如下所示
很明顯，抗原混合物可用于提供菌株間交叉反應性。
在第二組實驗中，各抗原的效價如下
用于該實驗的3種蛋白質(zhì)是以如下方式表達和使用的
(1)蛋白質(zhì)287在大腸桿菌中以GST融合蛋白表達；
(2)蛋白質(zhì)919在大腸桿菌中表達，沒有前導肽、沒有其成熟的N末端半胱氨酸、并且沒有任何融合配對物(919-未標記型)(919-untag)；和
(3)蛋白質(zhì)953使用組氨酸尾標記進行表達。
3種免疫接種都加Freund氏佐劑，第一次包括CFA，最后二次包括IFA。
實施例10-進一步的多價組合
在CD1小鼠中測試了進一步的組合
*″his″表示以組氨酸尾標志蛋白形式表達和免疫；
“ORF4-L”是脂化形式的ORF4；
“GST”表示用GST融合蛋白形式表達和免疫；
“919-untag”如實施例9中所定義；
“MenC糖偶聯(lián)物”是實施例8中所述的MenC糖偶聯(lián)物。
在豚鼠中測試了進一步的抗原組合
明顯地，這些組合給出了優(yōu)異的免疫學結(jié)果。
實施例11 NspA組合
NspA蛋白公開于WO 96/29412，在本文中以SEQ ID 4008-4033表示。該蛋白質(zhì)的學術(shù)文獻公開內(nèi)容(Martin等人(1997)J.Exp.Med.1851173-1183)，報道了該蛋白質(zhì)在奈瑟球菌菌株中是高度保守的(抗NspA抗體與250種腦膜炎球菌A、B和C菌株有99％交叉反應性)，而且可有效保護免受活細菌的致命侵襲。還有報道稱，吸附在明礬上的NspA可在兔和猴中引發(fā)血清的腦膜炎球菌殺菌性抗體應答[Martin等人(1998)11屆國際致病奈瑟球菌大會摘要，第198頁]?；谶@些資料，rNspA(重組的NspA)正在被開發(fā)作為預防所有血清型造成的腦膜炎球菌疾病疫苗。
盡管序列保守，然而已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，rNspA細胞表面表位僅在下面測試的65％血清型B菌株中檢測到，而且對抗NspA殺菌活性的易感性也小于Martin等人的報道。這些結(jié)果與Martin等人的結(jié)果相反，并且暗示基于rNspA的腦膜炎球菌B疫苗需要補充額外的抗原以便成為有效的疫苗。
在該實施例中測試的腦膜炎奈瑟球菌是從在超過30年的期間內(nèi)，在不同國家居住的病人中分離出的(見第72頁的表格)。選定這些菌株作為用多基因座同工酶分型法[Seiler等人(1996)Mol.Microbiol.19841-856]和/或多基因座序列分型法[Maiden等人(1998)PNAS USA 953140-45]所確定的廣泛不同的“克隆”組的代表。菌株M7衍生自菌株NMB，它含有一個能阻斷莢膜多糖生物合成的轉(zhuǎn)座子插入(Stephens等人(1991)Infect.Immun.594097-4102)。但所有其他菌株是莢膜化的。
根據(jù)Martin等人(1997)中的核苷酸序列，設(shè)計PCR引物并從菌株8047中擴增出NspA基因。含有啟動子區(qū)域的該序列被克隆入pSK+質(zhì)粒(rNspA)。還使用質(zhì)粒pTrc.NspA.1，該質(zhì)粒編碼一種蛋白質(zhì)，其中一部分信號序列被多聚氨酸尾標志所替換。兩種質(zhì)粒都在大腸桿菌BL21(BE3)菌株中表達，并純化蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中，rNspA是分泌的，而不是與外膜相結(jié)合。通過用55％(w/v)硫酸銨沉淀，從培養(yǎng)基中部分純化該蛋白質(zhì)，Western印跡證實其表觀分子量為18.6kDa。
兩種形式的NspA(rNspA和變性的帶His尾的NspA)被注入6周大的雌性CD-1小鼠中，以產(chǎn)生抗血清。用間接熒光分析的流式細胞術(shù)檢測(Granoff等人(1998)J.Immunol.1605028-36)，測定它們與腦膜炎奈瑟球菌B菌株表面的結(jié)合能力。對于菌株NMB和M7(一種NMB的無莢膜的突變株)的結(jié)果示于圖30。如預期的那樣，抗B型多糖的單克隆抗體SEAM-3(Granoff等人)僅結(jié)合于莢膜化菌株，而陽性抗-P1.2(PorA)對照單克隆抗體結(jié)合于兩種菌株。產(chǎn)生的抗rNspA抗血清能夠結(jié)合于兩種菌株。然而，抗帶His尾NspA的抗血清給出了陰性結(jié)果。這些抗血清對于菌株8047、CU385和M986(圖31A)也是陰性的，但用Western印跡時這些抗血清給出了陽性結(jié)果。
這些數(shù)據(jù)提示，用帶His尾的NspA制備的抗體，識別存在于變性NspA上但不存在于體內(nèi)細胞表面上天然NspA的表位。與之相反，制備的抗rNspA的抗體似乎可識別有構(gòu)象的NspA表位。
對第72頁表格中所示的菌株進行流式細胞術(shù)分析。圖31A顯示了針對rNspA產(chǎn)生的鼠抗體結(jié)合于菌株8047(NspA基因是從該菌株克隆出的)和菌株CU385的表面，但不結(jié)合于M986。圖31B顯示了對菌株BZ232、MC58、NG3/88和NGP165的類似的陰性結(jié)果。然而，在所有這些陰性情況下，抗莢膜的單克隆抗體對照是陽性的。
在第72頁上的表格總結(jié)了流式細胞術(shù)的結(jié)果。盡管據(jù)報道NspA在所有測試的完整的腦膜炎奈瑟球菌菌株表面是可達到的(Martin等人(1997)J.Exp.Med185 1173-1183；Plante等人(1999)Infect.Immun.672855-61)，但在17種測試菌株中僅11種(65％)與抗rNspA的血清反應。在給定菌株中細胞表面的表達與分類(通過血清型、亞型或電泳型進行的分類)之間、或分離的年代和國家之間，沒有明顯的關(guān)系。
為了解釋與抗rNspA血清的反應性的差異，測序了6種陰性菌株中5種菌株(BX232、NG3/88、NGP165、M136和M986)以及3種陽性菌株(8047、CU385和NG6/88)的NspA基因。第6種陰性菌株(MC58)的序列早已可從完整的基因組序列中獲得。
所有10種菌株的NspA序列是高度保守的，變化最多不過與Martin等人的原型序列有5個核苷酸的差異。變化最大的蛋白質(zhì)僅有3個氨基酸差異(見圖29)。除了一個例外之外，所有的氨基酸變異蛋白都涉及到該蛋白質(zhì)各區(qū)段中相同的各個殘基。這些包括信號肽(它并不存在于成熟蛋白)和C端50個殘基中的兩個短區(qū)段。這些差異不能解釋抗血清的結(jié)果，因為它們代表了那些陽性菌株和那些陰性菌株中相同變異序列(比較M136和8047；NGP165和NG6/88；MC58和CU385)。
因為無法用基因缺失或多態(tài)性來解釋抗血清結(jié)果，所以測試了在5種菌株(8047、CU385和NG6/88，都是抗rNspA陽性菌株；M986和M136，都是陰性菌株)外膜中的NspA蛋白的數(shù)量。用月桂基肌氨酸酯抽提細菌的細胞沉淀物，并分析不溶性外膜組份。在全部5種菌株中都看見18.6kDa條帶，且該條帶在Western印跡中與抗-His尾NspA的抗體起交叉反應。因此，NspA表達的菌株差異也不能解釋結(jié)果。
抗rNspA抗體結(jié)合于細菌細胞表面的能力可能受到莢膜上多糖數(shù)量的影響。因此，用抑制性ELISA法，分析了17種測試菌株所產(chǎn)生的莢膜多糖數(shù)量。
根據(jù)Corn等人(J.Infect.Dis.(1993)167356-364)所述的方法，制備莢膜多糖的提取物。各個細菌克隆在7毫升Mueller-Hinton肉湯中生長至OD620為0.5-0.7。通過5000g離心15分鐘而收集細菌，在0.6毫升10mM Hepes(pH 8.0)中洗滌，然后再懸浮于含10mM EDTA的相同緩沖液中并在37℃孵育1小時。細胞在10000g離心1分鐘而沉淀，然后，按Azmi等人(Infect.Immun.(1995)631906-13)所述的方法，用抑制性ELISA法測定釋放入上清液中的腦膜炎球菌B多糖抗原的相對數(shù)量。在ELISA中的固相抗原是吸附在親和素包被的微量滴定板上的腦膜炎球菌B多糖-ADH-生物素(Granoff等人)。將腦膜炎球菌B多糖反應性人副蛋白LIP(Azmi等人)用作第一抗體(0.2微克/毫升)。在沒有抑制劑時，這種濃度的抗體與底物一起在30分鐘孵育后足以產(chǎn)生約0.7-1.0的OD值(Azmi等人)。通過確定可導致50％抗體結(jié)合受抑制的上清液稀釋度，而測定釋放入上清液的多糖效價。在該分析中的對照是從菌株M7中制備的EDTA提取物(該菌株不產(chǎn)生任何莢膜多糖)和純化的腦膜炎球菌B多糖。為了確保所有的莢膜多糖均通過EDTA處理而被釋放，用懸浮在與莢膜提取物相同的緩沖液和體積中的細胞沉淀，進行相同的抑制性ELISA。可觀測的細胞沉淀的抑制活性，是莢膜提取物中觀測值的0-10％，后者較高的百分比值來自產(chǎn)生最大數(shù)量莢膜的菌株細胞沉淀。
每一種菌株的結(jié)果示于第72頁的表中。平均地，6種陰性抗-rNspA菌株比11種陽性菌株產(chǎn)生多3倍的莢膜多糖(各自的幾何平均稀釋度倒數(shù)為676對224，p＜0.05)。這可以解釋用抗血清所獲得的結(jié)果可以理解，存在更多數(shù)量的莢膜會干擾抗rNspA抗體結(jié)合于NspA表位的能力，而在具有較少數(shù)量莢膜的菌株中NspA表位是可達到的。
用與Mandrell等人(J.Infect.Dis.(1995)1721279-89)所述方法相類似的分析法，測試了抗rNspA的抗血清的補體依賴性殺菌活性。補體源是來自健康成人的人血清，其中沒有可檢測的針對B型多糖的抗莢膜抗體也沒有針對測試菌株的內(nèi)在殺菌活性。血清的殺菌效價定義為與在時間0時的對照CFU/毫升相比，在反應混合物中細菌孵育60分鐘后，導致CFU/毫升下降50％的血清稀釋度。
典型地，在60分鐘孵育期間，與陰性對照抗體孵育的細菌會表現(xiàn)出CFU/毫升上升150-200％。陽性對照抗體[抗莢膜IgG2a單克隆抗體SEAM12，Granoff等人]對全部17種菌株都表現(xiàn)出補體介導的殺菌活性。與之相反，在流式分析中對抗rNspA抗血清結(jié)合呈陰性的6種菌株是抗性的，表現(xiàn)出沒有殺菌或抑菌效果。其他11種陽性菌株中的10種或者被補體和抗血清殺死(SWZ107、J351、CU385、NG6/88、BZ198、H44/76、NMB和8047)，或者被抑制(H355和S3446)；然而，菌株1000不受影響。
用Saukkonen(J.Infect.Dis.(1988)158209-212)的方法，在幼大鼠中測試了抗rNspA抗血清提供抗腦膜炎球菌B菌血癥的被動保護的能力。簡而言之，將6-7日齡的大鼠隨機分配給哺乳母鼠。每組5-6只動物的各組，通過腹膜內(nèi)注射用100微升約5000CFU的腦膜炎奈瑟球菌B型細菌進行侵襲。測試了一種NspA表位的陰性菌株(M986)和一種陽性菌株(8047)，每種菌株都已經(jīng)在幼大鼠中傳代3次。就在施用之前，將細菌懸浮液與不同稀釋度的測試或?qū)φ湛贵w(陽性對照抗莢膜單克隆抗體；陰性對照抗-大腸桿菌)混合。在侵襲后18小時，從心臟獲得血液樣本。將各等份血樣平板接種于巧克力瓊脂，在37℃5％二氧化碳中孵育過夜后，測定CFU/毫升。
各種一起施用的抗體的保護活性如下ap＞0.5，與對照大鼠的幾何平均CFU/毫升相比。bp＜0.001，與對照大鼠的幾何平均CFU/毫升相比。
可見，2微克/大鼠的陽性抗莢膜對照(抗體)可提供抗兩種菌株的保護?？?rNspA抗血清的1∶5或1∶25稀釋液保護免患菌株8047造成的菌血癥。然而，兩種稀釋都不能有效預防M986菌血癥。
因此，盡管有Martin等人的正面結(jié)論，NspA似乎并不能有效地預防腦膜炎球菌B感染。約有1/3菌株的NspA表位的細胞表面表達是下降的，它們在體外生長時可耐受抗-NspA誘導型補體介導的溶菌作用，并且可耐受被動的抗血清免疫。這些菌株產(chǎn)生大量的莢膜多糖，并因此預期具有最高的毒性。因此，僅含有NspA的莢膜能夠提供廣泛的抗腦膜炎球菌B的保護性免疫力，這一點是必須受到懷疑的。
因此，含有NspA(SEQ ID 4008-4033；圖29)的組合物應有利地含有其他的抗原。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選方面是NspA蛋白與一種或多種其他奈瑟球菌抗原的組合。
實施例12NspA片段
NspA的二級結(jié)構(gòu)模型示于圖32，它含有8個跨膜β-鏈和4個暴露于表面的連接環(huán)。這符合NspA中疏水和親水氨基酸交替的模式，是許多β-桶的孔蛋白特有的[Weiss等人，(1990)FEBS Letts 267268-272]。
在模型中的灰色陰影區(qū)表示與來自腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、N.flavius、干燥奈瑟球菌(N.sicca)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)的，編碼的渾濁度蛋白(Opa)的氨基酸序列相比，用非冗余GenBankCDS的BLAST檢索時有＞40％相同性和＞70％相似性的區(qū)段。交替的序列是預測的兩親性β-鏈；垂直區(qū)段對應于跨膜區(qū)段；圖的上方對應于表面暴露的區(qū)段，標記為環(huán)1-4。
根據(jù)Martin等人，在NspA的推定氨基酸序列與其他蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間僅有的顯著同源性，是與奈瑟球菌渾濁度蛋白(Opa)家族，在靠近蛋白質(zhì)C末端的2個小區(qū)段(約20個氨基酸)有弱同源性。然而，將NspA的N端和C端單獨地與GenBank進行的比較揭示，在NspA和腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、N.flavius、干燥奈瑟球菌(N.sicca)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)的Opa蛋白之間有高度同源性(＞40％相同性和＞70％相似性)。Opa蛋白被認為是整合性膜蛋白，它有8個跨膜區(qū)段和在膜中的β-桶結(jié)構(gòu)，這與孔蛋白相似(Merker等人(1997)Mol.Microbiol.23281-293)。在去污劑不溶性膜制備物中存在NspA表明了NspA位于外膜，這與模型中所示的Opa樣膜拓撲結(jié)構(gòu)是一致的。此外，與Opa蛋白質(zhì)的區(qū)段最同源的NspA區(qū)段，是圖32中陰影區(qū)域所示的假設(shè)跨膜區(qū)段。
在某些情況下，奈瑟球菌的渾濁度蛋白可引發(fā)保護性抗體。然而，抗體達到莢膜菌的渾濁度蛋白受限制，在暴露的環(huán)區(qū)段存在氨基酸序列變異性，以及在臨床感染期蛋白質(zhì)表達的階段差異等問題，限制了Opa始終如一地誘導保護性抗體的能力(Malorny等人(1998)J.Infect.Dis.1721721279-89)。相反，在圖32中rNspA的表面暴露的環(huán)中似乎很少或沒有序列變異性。然而，最近已報道，一組與所有測試的腦膜炎球菌菌株反應的抗腦膜炎奈瑟球菌NspA單克隆抗體，僅與有限數(shù)目的淋病奈瑟球菌菌株反應，盡管在這2個物種之間各氨基酸序列是92％相同的。當比較腦膜炎球菌和淋病球菌菌株各自的NspA序列時(圖29)，所有各個氨基酸差異都造成疏水性或電荷的改變，并且位于推定的暴露于表面的連接環(huán)中(圖32)。該發(fā)現(xiàn)暗示，在腦膜炎奈瑟球菌中高度保守的NspA中的這些連接環(huán)，可能是結(jié)合于天然NspA的抗體的重要表位。因此，該分子的這些區(qū)段，對于與保護性抗體的相互作用而言似乎是最令人感興趣的。然而，NspA的推定的表面環(huán)較小(10-14個氨基酸)。例如與PorA和Ope的高度免疫原性的外環(huán)(24-45個氨基酸)相比。更短長度的環(huán)，可能會限制與血清抗體發(fā)生結(jié)合相互作用時所需的NspA表面表位的可接近性，尤其是在存在豐富的莢膜多糖時。
因此，本發(fā)明提供了圖32中暴露于細胞表面的NspA區(qū)段，即SSSLGSAKG、NYKAPSTDFKLY、NRASVDLGGSDSFSQT、和NYIGKVNTVKNVRSG，還提供了來自NspA的等位基因變異體的對應片段。此外，本發(fā)明提供了這些片段的亞序列，它們含有這些片段的7個或更多個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了含有這些片段的蛋白質(zhì)。還提供了編碼這些片段和蛋白質(zhì)的核酸。
這些NspA片段、含有這些片段的蛋白質(zhì)、以及核酸，可以用于本發(fā)明的組合物，尤其是作為全長NspA的替代物。另一方面，這些片段、蛋白質(zhì)和核酸可以以分離中的產(chǎn)品形式使用，換言之，在與其他生物分子聯(lián)用時沒有必要排他性地使用。
應理解，本發(fā)明是僅通過實施例進行描述的，在不違背本發(fā)明精神和范圍的情況下可以進行改動。抗rNspA多克隆抗血清與腦膜炎奈瑟球菌B的有莢膜活菌表面暴露的天然NspA的反應性，與溶菌易感性和莢膜產(chǎn)生有關(guān)a表示已經(jīng)進一步地用多基因座序列分型法[Maiden，1998]進行定性的菌株。b表示菌株獲自Frasch Collection，USA FDA。8047獲自W.zollinger，Walter Reed Army Institute of Research，Washington，D.C。MC58是通過基因組測序法用TIGR選出的菌株。J351獲自M.Sarvas，National Public Health Institute，Helsinki，F(xiàn)inland。其余菌株來自Seiler等人[Seiler，1996]所述的集合。ET數(shù)據(jù)來自Caugnant等人[J.Infect.Dis.(1990)162867-874]和Seiler等人。c用抗rNspA抗血清通過間接熒光流式細胞術(shù)測得。d與在時間0時相比，與細菌細胞和20％人補體一起孵育60分鐘后，導致CFU/毫升下降≥50％的抗rNspA抗血清的稀釋度。e效價定義為在ELISA反應中，使抗體結(jié)合于腦膜炎球菌B多糖抗原受到50％抑制時的莢膜提取物的稀釋度。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于，含有來自奈瑟球菌細菌的第一生物分子以及來自奈瑟球菌細菌的第二生物分子。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的第一生物分子選自由SEQ ID 1-8376構(gòu)成的組。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述的第一生物分子選自由SEQ ID 1-4002構(gòu)成的組。
4.如上述任一權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述的第二生物分子選自由SEQ ID 1-8376構(gòu)成的組。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述的第二生物分子選自由SEQ ID 1-4002構(gòu)成的組。
6.如權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于，含有兩種或多種選自SEQ ID 1-4002的生物分子。
7.如權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于，含有一種或多種選自SEQ ID 1-4002的生物分子以及一種或多種選自SEQ ID 4003-8376的生物分子。
8.如權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于，含有一種或多種選自SEQ ID 1-4002和4057-8376的生物分子以及在WO96/29412中公開的NspA蛋白，NspA蛋白宜為成熟形式。
9.如權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于，含有一種或多種選自SEQ ID 1-8376的生物分子以及953蛋白。
10.如上述權(quán)利要求任一項所述的組合物的用途，其特征在于，用作藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了從包括奈瑟球菌的基因組序列獲得免疫原性蛋白質(zhì)的方法,包括腦膜炎奈瑟球菌B的氨基酸序列和對應的核苷酸序列、以及基因組序列。這些獲得的蛋白質(zhì)可用作疫苗、免疫原性組合物和/或診斷用抗原。
文檔編號C12N15/09GK1362992SQ00810600
公開日2002年8月7日 申請日期2000年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月19日
發(fā)明者M·M·朱利亞尼, M·皮扎, R·拉普奧利 申請人:啟龍股份公司