專利名稱：新的類似微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(mite)的轉(zhuǎn)座元件和轉(zhuǎn)錄活化元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明相關(guān)于新型植物來(lái)源的轉(zhuǎn)座元件，更具體的，相關(guān)于一個(gè)MITE(微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件)類似序列。更具體的，本發(fā)明相關(guān)于分離自胡蘿卜(Daucus cartota)的新型轉(zhuǎn)座元件。
本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于包含轉(zhuǎn)座元件的新型轉(zhuǎn)錄活化元件。更具體的，當(dāng)與本發(fā)明相關(guān)的轉(zhuǎn)錄元件被插入到一個(gè)基因中時(shí)，能夠促進(jìn)周圍或其插入位點(diǎn)附近的基因的轉(zhuǎn)錄，或者抑制所述基因轉(zhuǎn)錄的被滅活。本發(fā)明更進(jìn)一步相關(guān)于包含所述轉(zhuǎn)錄活化元件的轉(zhuǎn)基因植物。
轉(zhuǎn)座元件被粗略的分為三類DNA型(轉(zhuǎn)座子和插入序列)，RNA型(逆轉(zhuǎn)座子)(Berg et al.(ed.)，Mobile DNA(1989))，和不屬于上述兩種的微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)(Wessler et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))。
對(duì)于其中的DNA型和RNA型轉(zhuǎn)座元件，它們?cè)诨蚪M中的實(shí)際轉(zhuǎn)座反應(yīng)已經(jīng)確定，而對(duì)于MITE，盡管它們與DNA型轉(zhuǎn)座元件非常相似，但還沒(méi)有報(bào)道作為它們?cè)诨蚪M中轉(zhuǎn)座的證明。
大多數(shù)MITE都是通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索，從正在進(jìn)行的基因組計(jì)劃所闡明的不同生物體基因組基因的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)是由Bureau et al.(Bureau et al.，Plant Cell41283-1294(1992))于1992年發(fā)現(xiàn)的Tourist家族。從此，在不同的植物和昆蟲以及動(dòng)物基因組中都發(fā)現(xiàn)不同的MITE。
通常，MITE被定義為具有如下特征(1)在其5′-和3′-末端具有完全或者非完全反向倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(這一點(diǎn)與DNA型轉(zhuǎn)座元件相似)，(2)在反向重復(fù)序列的兩個(gè)末端出現(xiàn)類似目標(biāo)復(fù)制序列，一段包含兩個(gè)或更多核苷酸的序列，類似于DNA型轉(zhuǎn)座元件插入到基因組DNA中所形成的，以及(3)它們通常大小為小于2kb(Wessleret al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))。
至于那些如同DNA型轉(zhuǎn)座元件一樣，在其末端反向重復(fù)序列之間具有編碼轉(zhuǎn)座酶的開放閱讀框的MITE，已知只有在真菌和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的IS630-Tcl/Mariner家族(Kachroo et al.，Mol.Gen.Genet.245339-348(1994)；Smit et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931443-1448(1996))。但是，對(duì)于植物來(lái)源的MITE，還未發(fā)現(xiàn)有這種編碼轉(zhuǎn)座酶的開放閱讀框。所以，關(guān)于植物MITE的轉(zhuǎn)座機(jī)制和其作用還有很多點(diǎn)尚不清楚。
附帶的，在高等生物體的基因操縱中進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)多數(shù)為核基因組插入類型。這是因?yàn)樵诟叩壬矬w中沒(méi)有類似于原核生物中質(zhì)粒的物質(zhì)。
對(duì)于這種插入到核基因組中的基因轉(zhuǎn)移，可以使用物理方法包括基因槍，脂質(zhì)體或電穿孔技術(shù)將偶聯(lián)用于插入到高等生物體核基因組中的目的基因的載體轉(zhuǎn)入，以及使用生物方法包括將如前所述的包含基因的載體轉(zhuǎn)入到病毒或微生物體中，利用所述病毒或微生物體所具有的DNA轉(zhuǎn)移/插入系統(tǒng)將基因轉(zhuǎn)入到高等生物體的核基因組中。
但是，這些物理和生物方法都存在問(wèn)題，因?yàn)椴迦氲礁叩壬矬w中的基因的表達(dá)活性在不同的個(gè)體中是不同的，因此并不穩(wěn)定。在許多例子中，這是由位置效應(yīng)所引起的基因沉默所造成的(Peach et al.，Plant Mol.Biol.1746-60(1991))。這種位置效應(yīng)是在酵母以及其它許多真核生物中都能夠發(fā)現(xiàn)的一種現(xiàn)象，而且已知在插入的基因本身的核苷酸序列沒(méi)有變化，表達(dá)活性的變化主要依賴于所述基因在染色體上插入位點(diǎn)的變化，在某些例子中，基因的表達(dá)被完全滅活(基因沉默)(Molecular Biology of the Cell，3rd edition，434-435(1995))。
假定造成基因沉默這種現(xiàn)象是由于所有在真核生物體中的基因都不是均一轉(zhuǎn)錄的，并且在核基因組中基因被轉(zhuǎn)錄的活性位點(diǎn)和基因沉默的隱藏位點(diǎn)是相互交織的。已經(jīng)知到由于對(duì)于轉(zhuǎn)錄所必需的蛋白不能接觸到基因，或者由于該位點(diǎn)基因組DNA的甲基化所造成的核小體結(jié)構(gòu)變化或異染色質(zhì)化，插入到隱藏位點(diǎn)的基因根本不能被轉(zhuǎn)錄，結(jié)果發(fā)生基因表達(dá)的滅活(基因沉默)(Ng et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.，9158-163(1999)；Matzke et al.，Curr.Opin.Plant Biol.1142-148(1999))。
進(jìn)一步了解到，即使在同一生物體中，如同哺乳動(dòng)物的X染色體可見(jiàn)一樣，基因沉默還依賴于細(xì)胞分化的時(shí)期。而且，已知由當(dāng)前尚未知的機(jī)制造成的基因沉默一旦發(fā)生，能夠通過(guò)交配由其后代繼承(Molecular Biology of the Cell，3rd edition，434-453(1995))。
同時(shí)，在基因操作中，目的基因(外源基因)通過(guò)物理或生物方法(除了用于基因敲除的同源重組方法)被轉(zhuǎn)入到高等生物體中，基因在細(xì)胞核基因組中的插入位點(diǎn)在不同細(xì)胞中是不同的而且?guī)缀醪豢赡苋藶榭刂啤Ｒ虼?，外源基因轉(zhuǎn)入到高等生物中以不確定的方式導(dǎo)致包含外源基因在活性位點(diǎn)的細(xì)胞或包含外源基因在隱藏位點(diǎn)的細(xì)胞的形成。
在植物中，已知當(dāng)外源基因被轉(zhuǎn)入到隱藏位點(diǎn)，會(huì)受到隱藏位點(diǎn)的影響，導(dǎo)致外源基因的表達(dá)顯著減小或者接近于零；而且也知道即使外源基因被插入到活性位點(diǎn)，外源基因的表達(dá)也會(huì)隨著重復(fù)的細(xì)胞分裂造成的生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生的基因沉默而變得不穩(wěn)定并減小(Peach et al.，Plant Mol.Biol.1746-60(1991))。
所假定的外源基因表達(dá)滅活的一個(gè)主要原因是染色體上核DNA結(jié)構(gòu)。參與核DNA結(jié)構(gòu)的一個(gè)元件為MAR(基質(zhì)結(jié)合區(qū))，也被稱為SAR(腳手架結(jié)合區(qū))序列。其被發(fā)現(xiàn)為一種將核基因組DNA錨定于核基質(zhì)的序列。在動(dòng)物中，已經(jīng)表明在基因轉(zhuǎn)移后，當(dāng)包含MAR的雞A元件被連接到外源基因上時(shí)，插入的基因的表達(dá)上升(Stief et al.，Nature 341；343-345(1989))。但是，后續(xù)的研究表明MAR對(duì)基因表達(dá)的增加有效，但是其單獨(dú)使用并不能抵消位置效應(yīng)(Bonifer et al.，Nculeic Acids Res.224202-4210(1994)；Poljak et al.，Nucleic Acids Res.224386-4394(1994))。在植物中，用轉(zhuǎn)化株研究MAR的效應(yīng)。但是，至今還未得到任何可重復(fù)的結(jié)果?，F(xiàn)在認(rèn)為單獨(dú)用MAR不能抵消位置效應(yīng)(MeshiShokubutsu no Genome Science(Genome Science ofPlants)，153-160(1996)，published by Shujunsha)。
目前，遺傳修飾的植物已經(jīng)被用作遺傳修飾的食品。但是，在發(fā)展基因食品中待解決的最重要的問(wèn)題是上述的會(huì)導(dǎo)致外源基因表達(dá)滅活的基因沉默現(xiàn)象。為避免基因沉默現(xiàn)象，從大量其外源基因插入位點(diǎn)盡可能的少的發(fā)生基因沉默的植物個(gè)體中以及即使經(jīng)過(guò)很多年的傳代也不會(huì)發(fā)生基因沉默的植物個(gè)體中進(jìn)行選擇對(duì)于發(fā)展基因修飾的植物是必需的。對(duì)于這種選擇，必須培養(yǎng)大量的植物個(gè)體并且要重復(fù)很多代，因此不但需要大量的人力和時(shí)間還需要大量的土地，也即會(huì)發(fā)生土壤面積問(wèn)題。
因此，找到另一種避免基因沉默的策略在植物的基因工程中是一個(gè)迫切并非常重要的問(wèn)題，要發(fā)展一種抑制由基因沉默造成的位置效應(yīng)或者活化插入的外源基因轉(zhuǎn)錄的方法，更具體的為發(fā)展具有這種效應(yīng)的“轉(zhuǎn)錄活化元件”。
因此，從闡明還未經(jīng)充分研究的基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)關(guān)系的科研角度來(lái)說(shuō)，MITE是非常令人感興趣的轉(zhuǎn)座元件(插入元件)。考慮到MITE的可能性，當(dāng)在基因組基因間進(jìn)行轉(zhuǎn)座后整合到基因組結(jié)構(gòu)中時(shí)，能夠改變基因組結(jié)構(gòu)并且控制基因表達(dá)，可以預(yù)期它們能夠在外源基因插入情況中作為穩(wěn)定或阻止基因表達(dá)活性滅活的因子。
因此，一方面本發(fā)明的目的是提供新型植物來(lái)源的MITE類似元件，以及如上所述的科研和工業(yè)用途。
具體的，本發(fā)明首先相關(guān)于如下1到5所述的新型MITE類似的元件(下文中為方便起見(jiàn)這種MITE類似元件有時(shí)被稱為“IS2元件”)1.一種能夠?qū)е掳行蛄兄貜?fù)的MITE類似元件(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]；2.如上述1所定義的MITE類似元件，在其5′和3′末端各有完全或不完全末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列；3.如上述1或2所定義的MITE類似元件，其包括核苷酸序列中至少一個(gè)具有一種以上的副本，如下述公式所代表(1)XttgcaaY(其中X代表g或t，Y代表a或c)，或公式(2)Zatgcaa(其中Z代表t或a)；4.如上述1到3中任一所定義的MITE類似元件，其末端反向重復(fù)序列包括如SEQ ID NO1所出示的核酸序列為其5′末端，以及如SEQ ID NO2所出示的核酸序列為其3′末端；5.包括如SEQ ID NO3所示核酸序列的MITE類似元件；本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于如下6和7所述新型MITE類似元件(下文中，為方便起見(jiàn)這種MITE類似元件被稱為“IS1元件”)6.MITE類似元件的末端反向重復(fù)序列包括如SEQ ID NO4所出示的核酸序列為其5′末端，以及如SEQ ID NO5所出示的核酸序列為其3′末端，并且其能夠?qū)е掳行蛄蠺A的重復(fù)；7.包括如SEQ ID NO6所示核酸序列的MITE類似元件第二方面，本發(fā)明的目的是提供“轉(zhuǎn)錄活化因子”，其能夠抑制由位置效應(yīng)引起的被稱為基因沉默的基因活化現(xiàn)象，或者能夠激活其附近或邊緣區(qū)的基因轉(zhuǎn)錄。
具體的。本發(fā)明相關(guān)于如下8到12中所述的轉(zhuǎn)錄活化因子8.包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)錄活化因子；9.如8中所定義的轉(zhuǎn)錄活化因子，其中的轉(zhuǎn)座元件為MITE類似元件；10.如9中所定義的轉(zhuǎn)錄活化因子，其中的轉(zhuǎn)座元件包括的MITE類似元件包含如下的DNA(a)或DNA(b)(a)具有如SEQ ID NO1所示核酸序列的DNA；(b)能夠與上面核酸序列(a)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點(diǎn)的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]重復(fù)的MITE類似元件；和/或包含如下面DNA(c)或(d)的MITE類似元件(c)具有如SEQ ID NO2所示核酸序列的DNA；(d)能夠與上面核酸序列(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點(diǎn)的TA重復(fù)的MITE類似元件。
11.如9中所定義的的轉(zhuǎn)錄活化元件，其中的轉(zhuǎn)座元件為串聯(lián)偶聯(lián)產(chǎn)物，其來(lái)自于包含如下DNA(a)或(b)的MITE類似元件(a)具有如SEQ ID NO1所示核酸序列的DNA；(b)能夠與上面核酸序列(a)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點(diǎn)的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]重復(fù)的MITE類似元件；和/或包含如下面DNA(c)或(d)的MITE類似元件(c)具有如SEQ ID NO2所示核酸序列的DNA；(d)能夠與上面核酸序列(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，并編碼能夠造成插入位點(diǎn)的TA重復(fù)的MITE類似元件。
12.轉(zhuǎn)錄活化元件包括具有如SEQ ID NO3所示核酸序列的DNA；本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于被引入的外源基因表達(dá)盒，其包括如上所述的轉(zhuǎn)錄活化元件。具體的，如下面13到15所述的表達(dá)盒13.用于植物中的基因表達(dá)盒包括如上面8到12中任一條所定義的轉(zhuǎn)錄活化元件，和一段DNA序列可操縱地連接到所述的因子上；14.如上面13中所定義的被插入的基因表達(dá)盒，其中的DNA序列被可操縱地連接到包含啟動(dòng)子和/或中止子的轉(zhuǎn)錄活化元件；15.如上面14中所定義的被插入的基因表達(dá)盒，其中進(jìn)一步包括DNA序列可操縱地連接到轉(zhuǎn)錄活化元件上，插入的目的基因序列得到表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于包含上述轉(zhuǎn)錄活化元件的質(zhì)粒(例如作為插入的外源基因表達(dá)盒)以及包含利用所述質(zhì)粒引入轉(zhuǎn)錄活化元件的轉(zhuǎn)基因植物。
圖2表示相應(yīng)于本發(fā)明中MITE類似元件的IS1元件的結(jié)構(gòu)，以及其末端反向重復(fù)序列和其被插入的重復(fù)序列(劃線的部分中的TA)。
圖3為構(gòu)建gDCPAL3-pro/SK方法的示意圖。
圖4為胡蘿卜PAL基因gDCPAL3和gDCPAL4的比較示意圖。
圖5為本發(fā)明中的MITE類似元件(IS1元件)的核酸序列和已知為Stowaway家族(Bureau and Wessler，Plant Cell，6907-917(1994))的比較示意圖。黑色背景中白色字母所指示的序列為表現(xiàn)出同源性的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。
圖6作為本發(fā)明中MITE類似元件的IS2元件末端所發(fā)現(xiàn)的不完全重復(fù)序列和靶重復(fù)序列(劃線的部分中的AAAAGAAAA)。
圖7為構(gòu)建IS1-35S/SK方法的示意圖。
圖8為構(gòu)建IS2-35S/SK方法的示意圖。
圖9為構(gòu)建IS12-35S/SK方法的示意圖。


圖10為構(gòu)建MU3-35S/SK方法的示意圖。
圖11為構(gòu)建pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S方法的示意圖。
圖12表示了實(shí)施例3(1)的結(jié)果，在包含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化有pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)和pAB35S(35S)(對(duì)照)煙草BY-2細(xì)胞中，對(duì)新生的愈傷組織的數(shù)目進(jìn)行了比較。圖中上面和下面的圖分別表示了用包含100μg/ml和300μg/ml卡那霉素的選擇培養(yǎng)基獲得的結(jié)果。
圖13表示實(shí)施例3(2)的結(jié)果，對(duì)引入pAB35S(35S)形成的煙草愈傷組織(對(duì)照)(左圖)和引入pIS12-35S/AB35S(IS12)形成的煙草愈傷組織(右圖)的GUS活性進(jìn)行了比較。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式I.新型MITE類似元件已發(fā)現(xiàn)的MITE不只包括如上所述的Tourist和Stowaway家族，還包括Castaway，Crackle，Emigrant，Explorer，Ditto，Gaijin，Krispie，Pop，Snap，Wanderer，Wujin，Wukong，Wuneng和Xbr家族。當(dāng)MITE在其末端區(qū)具有完全或非完全反向重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特征時(shí)，反向重復(fù)序列在MITE的核酸序列和長(zhǎng)度上有很大的不同。而且，在MITE中靶重復(fù)序列為對(duì)于Tourist為TAA，對(duì)于Stowaway為TA，對(duì)于Castaway為TAA，對(duì)于Crackle為GTTGATAT，對(duì)于Ditto為TTA，對(duì)于Emigrant為TA，對(duì)于Gaijin為ATT或TAG或TGA或GGT或GTT或GAA，對(duì)于Krispie為TTGAAC，對(duì)于Pop為AAAACAAA或AAAAAAAA，對(duì)于Snap為TTTTTTT，對(duì)于Wanderer為TTA或TAA，對(duì)于Wujin為TA或CATA，對(duì)于Wukong為TATA或TACA，對(duì)于Wuneng為TTAA或TTAT，對(duì)于Xbr為TTAA，(任何明確的靶重復(fù)序列都未在Explorer中發(fā)現(xiàn))(Bureau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938524-8529(1996)；Casacuberta et al.，Plant J.，1679-85(1998)；Song et al.，Mol.Gen.Genet.，258449-456(1998)；Tu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，947475-7480(1997)；Unsal and Morgan，J.Mol.Biol.，248812-823(1995))。
另一方面，IS2元件作為上述本發(fā)明中的新型MITE類似元件的一個(gè)具體體現(xiàn)，其具有(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]作為其靶重復(fù)序列，這在已知的任何MITE中(插入元件)都未曾發(fā)現(xiàn)。從這個(gè)角度，IS2元件可以被稱為不同于任何已知家族的屬于新家族的插入元件。
關(guān)于IS1元件，其作為本發(fā)明中的新型MITE類似元件的一個(gè)具體體現(xiàn)，具有TA作為靶重復(fù)序列，因此可以被稱為屬于已知Stowaway家族的新型MITE類似元件(Bureau，T.E.and Wessler，S.R.，Stowawaya new family of inverted repeat elements associated with the genes of bothmonocotyledonous and dicotyledonous plants.Plant Cell，6907-16(1994))。
下文中，描述了這些IS2和IS1元件。
1.IS2元件IS2元件的特征為能夠在插入位點(diǎn)的基因組基因中造成(A)nG(A)n的靶重復(fù)。數(shù)字n為不小于1的整數(shù)。當(dāng)沒(méi)有特別限制時(shí)，其具體的為如2到6，優(yōu)選的為3到5，更加優(yōu)選的為4。
更具體的，本發(fā)明中的MITE類似元件為一類大小不超過(guò)2kb的DNA，優(yōu)選的為0.2到2kb，在其5′和3′末端區(qū)域具有相互方向相反的重復(fù)序列(末端反向重復(fù)序列)。
從這個(gè)觀點(diǎn)，本發(fā)明中的IS2元件符合上述的MITE的三點(diǎn)特征的要求(Wessler et al.Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))，也即(1)在5′和3′末端具有完全或不完全反向重復(fù)序列；(2)在基因插入位點(diǎn)兩端的反向重復(fù)序列的相同方向中發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列包括兩個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)作為靶重復(fù)序列；(3)它們的大小不超過(guò)2kb；因此能夠被證實(shí)為具有MITE類似序列的轉(zhuǎn)座元件(插入元件，MITE類似元件)。
本發(fā)明的IS2元件結(jié)構(gòu)特征為在其核酸序列中包含至少一個(gè)如下述公式所表示的核酸序列(1)XttgcaaY(其中X代表g或t，Y代表a或c)(SEQ ID NO7 to 10)或公式(2)Zatgcaa(其中Z代表t或a)(SEQID NO11 to 12)，都是以連續(xù)或不連續(xù)重復(fù)方式。
這種重復(fù)序列的位置和數(shù)目沒(méi)有特別的限制，而且它們可以包含在出現(xiàn)在IS2元件兩個(gè)末端的末端反向重復(fù)序列中，或者在所述的末端反向重復(fù)序列之間的中間區(qū)域中。
本發(fā)明中的IS2元件具體的包括在末端重復(fù)序列之間的中間序列中的如上述公式(1)和(2)所代表的復(fù)數(shù)形式重復(fù)序列，以及在末端反向重復(fù)序列中如公式(1)所代表的復(fù)數(shù)形式重復(fù)序列，如
圖1所示。
本發(fā)明中的IS2元件的末端反向重復(fù)序列并不需要嚴(yán)格互補(bǔ)，但唯一的要求是5′和3′末端區(qū)能夠在嚴(yán)格的條件下相互雜交，結(jié)果，IS2元件具有如
圖1所示的莖干結(jié)構(gòu)。從這一角度，本發(fā)明的IS2元件不僅包括那些完全反向重復(fù)序列作為其末端反向重復(fù)序列，還包括那些不完全反向重復(fù)序列作為其末端反向重復(fù)序列。
作為相應(yīng)于本發(fā)明IS2元件的具體例子，其包含的末端反向重復(fù)序列為如SEQ ID NO1所示的核酸序列在其5′末端區(qū)域，如SEQ IDNO2所示的核酸序列在其3′末端區(qū)域。作為IS2元件的一個(gè)更具體的例子，其具有如SEQ ID NO3所示的核酸序列。IS2可以具有一個(gè)或更多個(gè)替換，增加或缺失的核苷酸在其末端反向重復(fù)序列或出現(xiàn)在所述的重復(fù)序列之間的序列中，只要所產(chǎn)生的變體保持的功能等價(jià)物具有與IS2元件基本相同的功能或活性。本發(fā)明的MITE類似元件也包括這種功能等價(jià)物。
作為優(yōu)選的功能等價(jià)物，其具有和IS2元件基本相同的功能和活性，該IS2元件具有如SEQ ID NO3所示的核酸序列，并能造成插入位點(diǎn)的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]靶重復(fù)，等價(jià)物能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與IS2元件雜交。關(guān)于“嚴(yán)謹(jǐn)條件”，所述的條件為1×SSC加0.1％(w/w)SDS在50℃或更高溫度處理超過(guò)1小時(shí)的時(shí)間。關(guān)于功能等價(jià)物，更具體所述的其核酸序列與如SEQ ID NO3所示的IS2具有不低于70％，優(yōu)選的不低于85％，更優(yōu)選的不低于90％，進(jìn)一步優(yōu)選的不低于95％的同源性。
2.IS1元件本發(fā)明的IS1元件使得基因組基因插入位點(diǎn)TA靶重復(fù)，以及特征性的具有末端反向重復(fù)序列，如SEQ ID NO4所示的核酸序列在5′端區(qū)域，如SEQ ID NO5所示的核酸序列在3′端區(qū)域。本發(fā)明的IS1元件具體的為具有不超過(guò)1kb大小的DNA，優(yōu)選的為100bp到500bp。根據(jù)這些事實(shí)，本發(fā)明的IS1元件可以被定義為MITE類似元件，如上述IS2元件。
關(guān)于本發(fā)明中的IS1元件，所具體提及的具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。更具體的，所提及的具有如SEQ ID NO6示的核酸序列。具有這種核酸序列的MITE類似元件可以有一個(gè)或更多個(gè)核苷酸發(fā)生替代，增加或缺失在其末端反向重復(fù)序列或者出現(xiàn)在5′和3′的這些重復(fù)序列之間的序列，只要所產(chǎn)生的變體保持的功能等價(jià)物具有與IS2元件基本相同的功能或活性。本發(fā)明的MITE類似元件也包括這種功能等價(jià)物。
優(yōu)選作為功能等價(jià)物為那些基本具有如SEQ ID NO6所示核酸序列的MITE類似元件(IS1元件)的功能或活性，其核酸序列與所述的IS1具有不低于70％，優(yōu)選為不低于85％，更優(yōu)選為不低于90％，進(jìn)一步優(yōu)選為不低于95％的同源性。
上文所述的MITE類似元件(IS2和IS1元件)都發(fā)現(xiàn)自胡蘿卜基因組，更具體的來(lái)自于胡蘿卜苯基丙氨酸氨裂解酶基因，如后文所述，能夠如后面實(shí)施例部分所述的被分離得到。只要具有如上文所述的結(jié)構(gòu)和特征，本發(fā)明的MITE類似元件的起源沒(méi)有限制。
應(yīng)指出轉(zhuǎn)座元件通常作為植物基因組自身進(jìn)行自我修飾的機(jī)制，對(duì)其生物體的進(jìn)化以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)可能具有顯著作用。
關(guān)于本發(fā)明中的MITE類似元件，其相關(guān)于植物基因組自我修飾機(jī)制的功能的機(jī)制還不清楚。但是，和逆轉(zhuǎn)座子的例子不同(McDonald，BioScience 40183-191(1990))，其具有增強(qiáng)子元件并且基因啟動(dòng)子由所述元件發(fā)生轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的所述增強(qiáng)子元件的插入導(dǎo)致的活化的事實(shí)還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的MITE類似元件可以被認(rèn)為具有很高的可能性導(dǎo)致插入的植物基因組的基因結(jié)構(gòu)的變化，并且造成基因組結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，例如基因組DNA或者核小體結(jié)構(gòu)的不可卷繞性的變化，通過(guò)和那些已知的增強(qiáng)子元件非常不同的機(jī)制。
用本發(fā)明的MITE類似元件，利用上述特性，通過(guò)與已知技術(shù)不同的技術(shù)使控制位于所述元件附近的基因的表達(dá)變得可能。一般認(rèn)為當(dāng)外源基因被插入到基因組DNA的隱藏位點(diǎn)時(shí)，其表達(dá)被抑制或滅活。因此，利用本發(fā)明的MITE類似元件并基于上述特性去激活或活化通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)被引入的外源基因的被降低或抑制的表達(dá)能力被認(rèn)為是可能的。相應(yīng)的，本發(fā)明的MITE類似元件對(duì)于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒和包含所述的表達(dá)盒的質(zhì)粒來(lái)穩(wěn)定的產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程處理的植物是有用的，并且對(duì)利用所述表達(dá)盒和質(zhì)粒穩(wěn)定的產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程處理的植物也是有用的。II.轉(zhuǎn)錄活化元件本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于一種轉(zhuǎn)錄活化元件。
此處所指轉(zhuǎn)錄活化元件包括能夠促進(jìn)在所述元件附近或邊緣的一組基因轉(zhuǎn)錄的元件，或能夠阻止被轉(zhuǎn)入基因組DNA的目的外源基因的抑制或抑制因位置效應(yīng)產(chǎn)生基因沉默使其失活的元件。每一種已知負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄活化的元件(因子)能夠活化特定基因的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)作為增強(qiáng)子出現(xiàn)在所述基因啟動(dòng)子的附近并且對(duì)所述啟動(dòng)子直接順式作用。相反的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件能夠促進(jìn)位于其附近或邊緣的單一基因或一組復(fù)數(shù)形式基因的轉(zhuǎn)錄，而不論相對(duì)于啟動(dòng)子的位置；而且包括那些能夠主要通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄滅活的遺傳現(xiàn)象來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件，因此與已有的轉(zhuǎn)錄活化元件的概念相比在概念上包括更廣范圍的因子。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件的特征為包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)座元件。
在此所指的轉(zhuǎn)座元件包括所有上述DNA型和RNA型以及MITE。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件包括前述種類中至少一種作為轉(zhuǎn)座元件，而不論其來(lái)源于同一物種或不同物種。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄活化元件包含MITE作為轉(zhuǎn)座元件。
MITE按照前面所述定義為具有如下特征的元件(1)在其5′和3′末端區(qū)域具有完全或不完全反向重復(fù)序列(相似于DNA型轉(zhuǎn)座元件)；(2)在反向重復(fù)序列的兩端具有靶重復(fù)序列，其包含按照相同方向排列的重復(fù)序列和包含兩個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)，類似于DNA型轉(zhuǎn)座元件插入到基因組DNA中所形成；(3)大小通常小于2kb(Wessler et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.5914-821(1995))；任何屬于如上所定義的種類的MITE都能夠作用實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)座元件。其中作為特別適合的MITE為前面所提到的本發(fā)明中的新型MITE類似元件，即“IS2元件”，“IS1元件”以及功能類似物。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件優(yōu)選的包含至少一種核酸序列，其選自所述IS2元件，IS1元件和功能類似物。
更具體的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件包括(1)具有IS1元件或其功能類似物的核酸序列；(2)具有IS2元件或其功能類似物的核酸序列；(3)具有IS1元件或其功能類似物的核酸序列和IS2元件或其功能類似物的核酸序列串聯(lián)所產(chǎn)生的核酸序列(IS1元件和IS2元件的順序是任意的)；以及(4)具有IS1元件(或IS2元件)或其功能類似物通過(guò)任意核酸序列與IS2元件(或IS1元件)或其功能類似物相連接產(chǎn)生的核酸序列。轉(zhuǎn)錄活化因子的優(yōu)選實(shí)施例包括(i)IS2元件或其功能類似物和(ii)IS1元件(或IS2元件)或其功能類似物和IS2元件(或IS1元件)或其功能類似物前后連接的產(chǎn)物。作為后面(ii)的一個(gè)具體實(shí)施例，所提到的元件具有如SEQ ID NO3所示的核酸序列。
關(guān)于上述(4)中所提到的轉(zhuǎn)錄活化元件，在IS1元件和IS2元件之間(順序是任意的)的核酸序列并沒(méi)有特別的限制，只要不會(huì)阻礙發(fā)明所產(chǎn)生的效果，可以為任意的核酸序列。作為具體的，但并非限制性的例子，此處所提及的為來(lái)源于胡蘿卜PAL啟動(dòng)子序列。通常，這種核酸序列具有5到1,000bp的大小，優(yōu)選的為300到500bp。作為這種轉(zhuǎn)錄活化元件模型的具體體現(xiàn)，此處具體的提到了具有如SEQ IDNO14所示的核酸序列的一種。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件能夠可操縱地連接到轉(zhuǎn)入植物體中的目的基因序列(轉(zhuǎn)基因序列(包括外源基因序列))，以及進(jìn)一步的，連接于所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄活化元件能夠可操縱地連接到功能DNA序列或如植物中作為啟動(dòng)子功能和/或植物中作為增強(qiáng)子功能的序列上。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”是指轉(zhuǎn)錄活化元件所處的位置能夠有效的接近于上述轉(zhuǎn)基因序列或各種功能DNA序列來(lái)發(fā)揮它對(duì)這些序列的影響，而不論插入位點(diǎn)和方向。
實(shí)際應(yīng)用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因包括那些需要在植物中表達(dá)的DNA，而不論其對(duì)于所述植物是同源性或異源性。這些轉(zhuǎn)基因包括，但不限于，編碼β-葡萄糖苷酸酶的基因；抗生素抗性基因；編碼殺蟲劑和殺菌劑蛋白毒素基因；抗病原復(fù)合物基因；合成高敏感性復(fù)合物基因，如過(guò)氧化物酶，葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶和植物抗毒素；農(nóng)用化學(xué)品，除草劑和殺蟲劑抗性基因；合成植物酶的基因(如與蛋白，淀粉，糖和脂肪含量和質(zhì)量相關(guān)的酶)以及編碼其調(diào)控因子的基因；相關(guān)于植物酶抑制劑的基因，如蛋白酶和淀粉酶抑制劑；涉及植物激素合成的基因；涉及昆蟲激素和信息素合成的基因；涉及藥用和營(yíng)養(yǎng)的復(fù)合物，如β-胡蘿卜素和維生素；以及干擾出現(xiàn)在植物中核酸序列的反義序列(Transgenic Plant，vol.1，Academic Press，1993)。
本發(fā)明進(jìn)一步相關(guān)于適合應(yīng)用于植物中的基因表達(dá)盒，其包括上述轉(zhuǎn)錄活化元件和可操縱地連接于其上的DNA序列。此處所指的“基因表達(dá)盒”是指能夠被轉(zhuǎn)入到植物中的質(zhì)粒或其亞片段。
作為可操縱地連接到轉(zhuǎn)錄活化元件上的DNA序列，包括功能性DNA序列例如啟動(dòng)子和終止子。所述的DNA序列包括上面所述的任一種轉(zhuǎn)基因序列。
此處所指的啟動(dòng)子表示一段DNA序列，當(dāng)產(chǎn)生目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因被連接到所述啟動(dòng)子的下游時(shí)，啟動(dòng)子能夠通過(guò)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和隨后的翻譯調(diào)控所述蛋白的表達(dá)，其還包括在植物中有功能的和用于植物轉(zhuǎn)化的相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的所有啟動(dòng)子。大量的啟動(dòng)子已經(jīng)應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化，包括如從根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離的啟動(dòng)子，即羧乙基精氨酸合成酶(ocs)啟動(dòng)子(L.Comai et al.，1985；C.Waldron et al.，1985)，甘露氨酸合成酶(mas)啟動(dòng)子和胭脂氨酸(nos)啟動(dòng)子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動(dòng)子，其通常用于轉(zhuǎn)化，也能夠充分的用于本發(fā)明。35S啟動(dòng)子的修飾形式，例如兩個(gè)并聯(lián)的35S啟動(dòng)子(R.Kay et al.，1987)和mas-35S啟動(dòng)子(L.Comai et al.，1990)也能夠被使用。而且，花椰菜花葉病毒19S啟動(dòng)子(J.Paszkowski et al.，1984)和玄參花葉病毒來(lái)源的34S啟動(dòng)子(M.Sanger et al.，1990)也能夠被應(yīng)用。更多的例子還包括肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位(rbcS)啟動(dòng)子等植物來(lái)源的啟動(dòng)子。
終止子包括能夠有效的終止植物中目的結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄的核酸序列，并包括用于植物轉(zhuǎn)化相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域在植物中有功能的所有終止子。具體的，例如胭脂氨酸合成酶(nos)終止子作為典型例子。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含所述元件，其能夠用于誘導(dǎo)或調(diào)控被轉(zhuǎn)入到植物中的基因的表達(dá)，并且這通常廣泛應(yīng)用于植物中。
植物包括但不限制于農(nóng)業(yè)上有用的植物，而不論其為單子葉植物或雙子葉植物。例如在單子葉植物中有玉米，稻，小麥，大麥，非洲或印度黍，燕麥，黑麥，黍和其它谷類農(nóng)作物，以及百合，蘭花，鳶尾屬植物，棕櫚，郁金香，莎草等其它不同種類的觀賞植物。雙子葉植物包括菊花，金魚草，康乃馨，木蘭，罌粟，甘藍(lán)，玫瑰，豌豆，猩猩木，棉花，仙人掌，胡蘿卜，越橘，胡椒薄荷，向日葵，西紅柿，榆樹，橡樹，楓樹，白楊，大豆，瓜類，甜菜，油菜，馬鈴薯，萵苣，番木瓜等。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)基因植物，其包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件或者本發(fā)明的包含所述元件的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中對(duì)于被轉(zhuǎn)入的目的外源基因由位置效應(yīng)造成的基因沉默(滅活)現(xiàn)象已經(jīng)被抑制，或外源基因的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)被活化。所述的轉(zhuǎn)基因植物包括其后代。
在此使用的“植物”這一術(shù)語(yǔ)是指不僅包括完全的植物體還包括植物體的一部分，例如葉子，種子，莖或切開物。其進(jìn)一步包括原生質(zhì)體，植物愈傷組織，分生組織和類似的植物細(xì)胞。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法沒(méi)有特別的限制，可以為任何一種常規(guī)用于相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的DNA轉(zhuǎn)移方法。具體的，為一種用包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件或包含所述元件的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒將DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的方法；還包括如已知的用土壤桿菌，電學(xué)方法(電穿孔)和基因槍方法。
所得到的植物細(xì)胞包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件，所述元件的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，或者表達(dá)質(zhì)粒，該細(xì)胞能夠用所描述的植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)制，例如S.B.Gelvin，R.A.Schilperoot and D.P.S.VermaPlant Molecular Biology Manual(1991)，Kluwer AcademicPublishers or Valvekens et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，855536-5540(1988)，可以得到來(lái)源于所述植物細(xì)胞的植物體或其部分。
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒可以為任何一種，只要它包括要被插入目的DNA序列(轉(zhuǎn)基因)以及轉(zhuǎn)錄活化元件和功能性DNA序列例如啟動(dòng)子和終止子。但優(yōu)選的這些DNA序列被可操縱的相互連接。術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”是指質(zhì)粒具有達(dá)到預(yù)期目的的功能。具體的，當(dāng)所討論的質(zhì)粒被引入到植物細(xì)胞中時(shí)，目的轉(zhuǎn)基因(結(jié)構(gòu)基因)在轉(zhuǎn)錄活化元件的控制下進(jìn)行表達(dá)并且表達(dá)能夠被終止子有效的終止，在所述的質(zhì)粒中不存在啟動(dòng)子的滅活。
本發(fā)明進(jìn)一步包括能夠使轉(zhuǎn)基因在植物中表達(dá)的方法。這種方法的實(shí)現(xiàn)至少如上文所述的通過(guò)將整合著外源基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)入到植物中的步驟，以及使所述轉(zhuǎn)基因在所述植物中表達(dá)的步驟。將轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(DNA)轉(zhuǎn)入到植物中以及所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)實(shí)施(Plant Molecular Biology Manual，1991，KluwerAcademic Publishers)。
2)胡蘿卜PAL基因gDCPAL3和gDCPAL4的克隆從胡蘿卜基因組文庫(kù)中克隆得到胡蘿卜基因組序列。按照如發(fā)明人以前所描述的(Ozeki，Y.，Davies，E.and Takeda，J.Structure andexpression of chalcone synthase gene in carrot suspension cultured cellsregulated by 2，4-D.Plant Cell Physiol.，341029-1037(1993))，用λEMBL3質(zhì)粒(Toyobo的產(chǎn)品)從培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞中(Ozaki，Y.andKomamine，A.Induction of anthocyanin synthesis in relation toembryogenesis in a carrot suspension culture；Correlation of metabolicdifferentiation with morphological differentiation.Physiol.Plantarum，53570-577(1981))構(gòu)建胡蘿卜基因組文庫(kù)。
具體的，按照Murray和Thompson(1980)的方法(Murray，M.G.and Thompson，W.F.；Rapid isolation of high molecular weight plantDNA.Nucl.Acids Res.84321-4325(1980))用溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)溶液從凍干的胡蘿卜中制備胡蘿卜基因組DNA。所得到的基因組DNA用Sau3AI部分酶切，酶切得到的DNA片段用蔗糖密度梯度方法根據(jù)大小使其分開。收集15到20kb的DNA片段并將其連接到經(jīng)BamHI酶切的λEMBL3載體上，隨后用噬菌體顆粒包裝從而構(gòu)建了胡蘿卜核酸文庫(kù)。
然后，，按照Ozeki et al.的方法(Ozeki，Y.，Matsui，K.，Sakuta，M.，Matsuoka，M.，Ohashi，Y.，Kano-Murakami，Y.，Yamamoto，N，and Tanaka，Y.Differential regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes duringanthocyanin synthesis and by transfer effect in carrot cell suspensioncultures.Physiol.Plantarum，80379-387(1990))使用PAL cDNA(ANT-PAL cDNA)作為克隆探針，從胡蘿卜基因組文庫(kù)中篩選(Sambrook et al.，1989)PAL的基因組克隆。用于篩選胡蘿卜基因組文庫(kù)的雜交反應(yīng)于68℃經(jīng)過(guò)夜處理，使用的溶液包含6×SSC，60mM磷酸鈉(pH6.8)，10mM EDTA，1％SDS，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％Ficoll 400和100μg/ml變性鮭精DNA。膜在室溫下在包含0.5％SDS的2×SSC溶液中清洗兩次(15分鐘×2)，在室溫下在包含0.1％SDS的0.1×SSC或1×SSC溶液中清洗兩次(10分鐘×2)，最后，在68℃在0.1×SSC溶液中清洗兩次(30分鐘×2)。
結(jié)果，得到8個(gè)陽(yáng)性克隆。制備這些克隆的限制性酶譜，并根據(jù)酶譜，克隆鑒別為兩個(gè)基因，分別命名為gDCPAL3和gDCPAL4。
用gDCPAL3，培養(yǎng)陽(yáng)性克隆的λ噬菌體，提取λDNA，用BamHI酶切，并根據(jù)Sambrook et al.(1989)等所描述的Southern方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。然后，從上述ANT-PAL cDNA經(jīng)EcoRI酶切并在所得到的DNA片段(984 bp)的5′端標(biāo)記[32P]，其作為探針進(jìn)行Southern分析，得到與上述探針雜交的2.77kbp DNA片段。該DNA片段用BamHI酶切，并亞克隆到經(jīng)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理過(guò)的pBluescript SK質(zhì)粒上，得到gDCPAL3-pro/SK(圖3)。然后，所得的質(zhì)粒gDCPAL3-pro/SK用限制性內(nèi)切酶SalI和ApaI酶切，并按照Sambrooket al.(1989)所描述的方法用核酸外切酶III和綠豆核酸酶酶切得到一系列缺失的DNA片段，用這些片段來(lái)測(cè)定gDCPAL3 DNA的核酸序列。按照Ozeki and Takeda(1994)所描述的方法(Regulation ofphenylalanine ammonia-lyase genes in carrot suspension cultured cells.Plant Cell.Tissue and Organ Culture，38221-225(1994))，從胡蘿卜中提取的mRNA用于延伸引物方法，根據(jù)得到的條帶的位置來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)。
用gDCPAL4，根據(jù)上述同樣的方法得到gDCPAL4-pro/SK質(zhì)粒并測(cè)定gDCPAL4 DNA的核酸序列。具體的，從陽(yáng)性gDCPAL4克隆的λ噬菌體中所得到的λDNA用HindIII和BamHI酶切，用上述探針進(jìn)行Southern分析，與探針雜交的1.63kbp DNA片段用HindIII和BamHI酶切，并亞克隆到經(jīng)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理過(guò)的pBluescript SK質(zhì)粒上，得到gDCPAL4-pro/SK。然后，得到的gDCPAL4-pro/SK質(zhì)粒用限制性酶XbaI和BstXI酶切，并按照Sambrook et al.(1989)所描述的方法用核酸外切酶III和綠豆核酸酶酶切得到一系列缺失的DNA片段，用這些片段來(lái)測(cè)定gDCPAL4 DNA的核酸序列。
3)結(jié)果對(duì)照gDCPAL3和gDCPAL4的核酸序列表明gDCPAL3的啟動(dòng)子區(qū)有微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)，其具有在gDCPAL4中未發(fā)現(xiàn)的完全反向重復(fù)序列，存在于兩處，即-1897到-1599(長(zhǎng)度為299bp)和-1157到-389(長(zhǎng)度為769bp)(圖4)。這些序列被分別命名為IS1和IS2。
這些序列和插入位點(diǎn)周圍的核酸序列用自動(dòng)測(cè)序儀(LICOR 4000L型產(chǎn)品)進(jìn)行測(cè)序。IS1的核酸序列如SEQ ID NO2所示，IS2的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
IS1和IS2的特征如下所述(1)IS1其具有如SEQ ID NO2(全長(zhǎng)299bp)所示的核酸序列，分別在5′和3′末端區(qū)域具有非完全反向重復(fù)序列(32bp)，以及在基因組插入位點(diǎn)具有靶重復(fù)序列TA來(lái)作為靶基因。基于這些事實(shí)，估計(jì)新型MITE元件的核酸序列屬于已經(jīng)報(bào)道的Stowaway家族(Bureau，T.E.andWessler，S.R.Stowawaya new family of inverted repeat elementsassociated with the genes of both monocotyledonous and dicotyledonousplants.Plant Cell，6907-16(1994))。IS1的主干結(jié)構(gòu)和末端反向重復(fù)序列區(qū)域和插入位點(diǎn)區(qū)域的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
基于所得到的核酸序列的信息，用商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(如，GENE TYX-MAC/CD1995)對(duì)核酸序列進(jìn)行同源性分析，在其末端反向重復(fù)序列中，發(fā)現(xiàn)MITE元件有70-90％的同源性屬于Stowaway家族(Bureau andWessler(1994))。證實(shí)了所述元件為屬于Stowaway家族的轉(zhuǎn)座元件(圖5)。
(2)IS2其具有如SEQ ID NO1(全長(zhǎng)769bp)所示的核酸序列，分別在5′和3′末端區(qū)域具有非完全反向重復(fù)序列(158bp)，以及在基因組插入位點(diǎn)具有靶重復(fù)序列AAAAGAAAA來(lái)作為靶基因。核酸序列進(jìn)行同源性比較，但沒(méi)有檢測(cè)到其與已知的轉(zhuǎn)座元件具有同源性。因而發(fā)現(xiàn)其為一類轉(zhuǎn)座元件，特別為MITE類似元件，組成了一類不屬于任何已知的轉(zhuǎn)座元件家族的新的家族。IS2的全部結(jié)構(gòu)(主干結(jié)構(gòu))如
圖1所示，其末端反向重復(fù)序列區(qū)和其插入位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)如圖6所示。
(ii)IS2的克隆(圖8)從來(lái)源于如實(shí)施例1所述的制備用于核酸序列測(cè)定的gDCPAL3啟動(dòng)子區(qū)的3′終點(diǎn)具有缺失DNA片段的質(zhì)粒中，選擇具有缺失到-389的質(zhì)粒gDCPAL3-IS12/SK，用Kpn I酶切質(zhì)粒，并用T4DNA聚合酶使其末端補(bǔ)平并用DdeI酶切隨后用瓊脂凝膠電泳得到797bp DNA片段。該片段被亞克隆到用HincII酶切并經(jīng)CIP處理過(guò)的pBluescript SK質(zhì)粒。從含有上述亞克隆的大腸桿菌中提取質(zhì)粒，并測(cè)定核酸序列來(lái)表明每個(gè)插入DNA片段的方向。通過(guò)這種方式，具有IS2的5′末端被插入到pBluescript SK質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的KpnI端的質(zhì)粒被選擇并被命名為IS2/SK-1。具有IS2的3′末端被插入到KpnI端，也即反方向，被選擇并被命名為IS2/SK-2(反向)。
IS2/SK-1用KpnI和HindIII酶切并用用瓊脂糖凝膠電泳回收插入的DNA片段，該片段被亞克隆到經(jīng)KpnI和HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過(guò)的35S/SK質(zhì)粒，所得的質(zhì)粒命名為IS2-35S/SK，其在35S啟動(dòng)子區(qū)域的上游具有IS2區(qū)域(正向鏈)。
(iii)IS12的克隆(IS1-IS2串聯(lián)產(chǎn)物)(圖9)如上(ii)描述所得到的IS2/SK-2(反向)用Kpn I酶切質(zhì)粒，并用T4DNA聚合酶使其末端補(bǔ)平，用HindIII酶切隨后用瓊脂凝膠電泳回收插入DNA片段。該片段經(jīng)PstI酶切，并用T4DNA聚合酶使其末端補(bǔ)平，然后被亞克隆到用HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過(guò)的IS1-35S/SK質(zhì)粒，得到具有IS1區(qū)和IS2區(qū)以串聯(lián)形式在35S啟動(dòng)子區(qū)的上游區(qū)域的IS12-35S/SK。
(iv)MU3的克隆(
圖10)關(guān)于MU3，gDCPAL3-IS12/SK用KpnI酶切，并用T4DNA聚合酶使其末端補(bǔ)平，用ScaI酶切隨后用瓊脂凝膠電泳回收得到1,514bpDNA片段。該片段被亞克隆到用HincII酶切并經(jīng)CIP處理過(guò)的pBluescript SK質(zhì)粒。從含有上述亞克隆的大腸桿菌中提取質(zhì)粒，并測(cè)定核酸序列來(lái)檢查每個(gè)插入DNA片段的方向。具有IS1的5′末端被插入到pBluescript SK質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的KpnI端的質(zhì)粒被選擇并被命名為MU3/SK。用KpnI和HindIII酶切MU3/SK所得的插入DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳回收。并被亞克隆到經(jīng)KpnI和HindIII酶切并經(jīng)CIP處理過(guò)的35S/SK質(zhì)粒，得到MU3-35S/SK，其經(jīng)由gDCPAL3來(lái)源的區(qū)域序列(441bp)，在35S啟動(dòng)子區(qū)域的上游區(qū)域有IS1區(qū)和IS2區(qū)。
(2)IS1，IS2，IS12和MU3插入到植物基因表達(dá)載體(
圖11)pABN-Hm1(Mita，S.，Suzuki-Fujii，K.and Nakamura，K.Sugar-inducible expression of a gene for β-amylase in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol.，107895-904(1995)；gift from Dr.Kenzo Nakamura atNagoya Univeristy)用HindIII酶切得到β-淀粉酶啟動(dòng)子(1.7kb)，其用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端，然后用XbaI酶切，CIP處理，并用瓊脂糖凝膠電泳分離得到的10kbp DNA片段包含Ti質(zhì)粒區(qū)和卡那霉素抗性基因[nos啟動(dòng)子/新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II的編碼區(qū)基因(nptII)/nos終止子]，β-葡萄糖苷酸酶基因的編碼區(qū)(GUS)/nos終止子，潮霉素抗性基因[35S啟動(dòng)子/潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的編碼區(qū)基因(HPT)/nos終止子]。在其上亞克隆35S片段，其通過(guò)用HindIII酶切，T4DNA聚合酶補(bǔ)平并用XbaI酶切得到，構(gòu)建pAB35S。
所得質(zhì)粒用XhoI和XbaI酶切并用CIP處理，然后通過(guò)切去35SDNA片段用瓊脂糖凝膠電泳制備載體。按照前述方法所制備的IS1-35S/SK，IS2-35S/SK，IS12-35S/SK和MU3-35S/SK分別用XhoI和XbaI酶切，用瓊脂糖凝膠電泳回收DNA片段用于插入(外源基因表達(dá)盒)。這些DNA片段被連接到上述的載體上并用來(lái)轉(zhuǎn)化E，coli DH5α。用所得的每種大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種于包含25μg/L卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中(1％酪蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，1.5％用于細(xì)菌培養(yǎng)基的瓊脂粉)，用快速質(zhì)粒DNA抽提法從克隆中抽提質(zhì)粒，所得到的質(zhì)粒用限制性酶切圖譜來(lái)檢查，構(gòu)建得到pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S，也即將上面的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒分別插入到負(fù)責(zé)卡那霉素抗性的nptII基因和為結(jié)構(gòu)基因的GUS基因中，構(gòu)建物的證實(shí)如
圖11所示。
(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備YEP固體培養(yǎng)基(通過(guò)在包含1％酵母提取物，1％細(xì)菌蛋白胨和0.5％氯化鈉的YEP培養(yǎng)基中加入用于細(xì)菌培養(yǎng)基的瓊脂粉到達(dá)濃度為1.5％，隨后用高壓滅菌固化制備)上，用取自甘油保藏的根癌農(nóng)桿菌EHA 101在其上劃線涂板，并在28℃避光培養(yǎng)2天。長(zhǎng)出的根癌農(nóng)桿菌單克隆被分別用牙簽挑取接種到1.5ml的YEP培養(yǎng)基中并于28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。80ml的YEP培養(yǎng)基被放于500-ml的燒瓶中，加入0.8ml的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，于28℃振蕩培養(yǎng)直到OD600＝0.4。并用冰冷卻，轉(zhuǎn)移到預(yù)先用冰冷卻過(guò)的離心管中，在4℃以6,000rpm離心5分鐘，除去上清液，并加入20ml 10％的甘油來(lái)懸浮沉淀。該過(guò)程被重復(fù)三次，培養(yǎng)基被充分的去除來(lái)得到根癌農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。為了保存，細(xì)胞懸浮于400μl 10％甘油中，懸浮液按照每管40μl分配到管中，隨后用液氮進(jìn)行快速冷凍。
(4)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌中如上面(2)所得到的構(gòu)建物(質(zhì)粒pIS1-35S/AB35S，pIS2-35S/AB35S，pIS12-35S/AB35S和pMU3-35S/AB35S)用電穿孔(使用Shimadzu GTE-10)被分別轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中。具體的，如上(2)所述制備的每種質(zhì)粒各約100ng，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)和pMU3-35S/AB35S(MU3)，以及質(zhì)粒pAB35S(35S)作為沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活化元件(IS1和/或IS2)插入的對(duì)照，分別和40μl按照上述(3)制備的感受態(tài)細(xì)胞，每種混合物被轉(zhuǎn)入到電穿孔池中。給予電脈沖(1.2kV，35μF，550Ω)，并立即加入1mlYEP培養(yǎng)基，并在28℃孵育1小時(shí)。取出約50μl并涂板于包含50μg/L潮霉素的YEP固體培養(yǎng)基，然后在28℃下避光孵育2天。用鉑環(huán)將已經(jīng)生長(zhǎng)的單一克隆再涂于包含50μg/L潮霉素的YEP固體培養(yǎng)基的其它部分之上并于28℃孵育24小時(shí)。取出一部分細(xì)胞于5ml包含50μg/L潮霉素的YEP培養(yǎng)基中在28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
首先，上述的培養(yǎng)于5ml YEP液體培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子被轉(zhuǎn)入到50ml離心管并在3,000rpm離心10分鐘。棄去上清液，25ml的Linsmaier & Skoog培養(yǎng)基(Linsmaier，E.M.and Skoog，F(xiàn).；Physiol.Plantarum 18，100-127(1965)；下文中命名為＂Lins培養(yǎng)基＂)被加入到沉淀物中，經(jīng)過(guò)重新懸浮，室溫下3,000rpm再次離心10分鐘，棄去上清液。這個(gè)過(guò)程被重復(fù)4次。收集根癌農(nóng)桿菌的細(xì)胞，Lins培養(yǎng)基被加入用于懸浮使OD600＝0.2，加入乙酰丁香酮使其達(dá)到10μg/ml的濃度，然后重新懸浮。
被用來(lái)轉(zhuǎn)入每種構(gòu)建物的培養(yǎng)的煙草細(xì)胞BY-2(由東京大學(xué)Dr.Toshiyuki Nagata惠贈(zèng))預(yù)先培養(yǎng)于45ml包含2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)Lins培養(yǎng)基中，每隔一周，1ml包含細(xì)胞的培養(yǎng)液的懸浮液被加入到新鮮的Lins培養(yǎng)基中，使用轉(zhuǎn)入后經(jīng)過(guò)約100小時(shí)的潛伏期并已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
無(wú)菌的90-mm培養(yǎng)皿被接種所述煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2(4ml)，經(jīng)上述程序清洗的100μl根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞被均一的加入到煙草培養(yǎng)細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)輕微混合，在22℃避光共培養(yǎng)3天。
然后，12mlLins培養(yǎng)基被加入到培養(yǎng)細(xì)胞液中進(jìn)行懸浮，懸浮物被轉(zhuǎn)入到50-ml離心管中并以1,000rpm離心1分鐘，棄去上清。該程序被重復(fù)4次。然后，12ml包含250μg/ml claforan的Lins培養(yǎng)基被加入并將上述程序重復(fù)一次。棄去上清液后，約25mlLins培養(yǎng)基被加入到沉淀細(xì)胞中來(lái)將其懸浮，取0.25μl培養(yǎng)基，用血球計(jì)對(duì)其中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞被均一的接種于包含100μg/ml或300μg/ml卡那霉素(進(jìn)一步包含250μg/ml的claforan)的Lins固體選擇性培養(yǎng)基使得每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到4×105，6×105，8×105，10×105或15×105。它們?cè)?8℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)后1個(gè)月，轉(zhuǎn)基因的培養(yǎng)煙草細(xì)胞數(shù)目(愈傷組織轉(zhuǎn)化子)在每個(gè)皿中形成并且測(cè)定其形成率或產(chǎn)量。所得到的結(jié)構(gòu)出示在表1和
圖12中。
表1培養(yǎng)于包含卡那霉素的培養(yǎng)基上煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2形成的愈傷組織轉(zhuǎn)化子的數(shù)目以及愈傷組織轉(zhuǎn)化子的形成率卡那霉素100μg/ml細(xì)胞數(shù)目 46 8 10(×105)IS1 4±0 20±4 43±3 99±10(0.10) (0.33)(0.54)(0.99)IS2 10±772±1384±4 137±12(0.25) (1.20)(1.05)(1.37)IS1216±370±6 124±16 220±4(0.40) (1.67)(1.55)(2.20)35S 3±2 40±8 47±2 83±13(對(duì)照) (0.08) (0.67)(0.59)(0.83)卡那霉素300μg/ml細(xì)胞數(shù)目 4 68 10(×105)IS1 0 3±0 10±3 20±5(0.00)(0.05) (0.1 3) (0.20)IS2 0 4±2 36±4 72±11(0.00)(0.07) (0.45)(0.72)IS122±1 15±141±2 89±5(0.05)(0.25) (0.5 1) (0.89)35S 0 0 3±2 37±16(對(duì)照) (0.00)(0.00) (0.04)(0.37)上形成的愈傷組織的數(shù)目下產(chǎn)率(×10-2％)
從上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建物IS2或IS1的插入到煙草培養(yǎng)細(xì)胞中能夠增強(qiáng)在包含卡那霉素的培養(yǎng)基中愈傷組織轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)量并且其產(chǎn)量高于沒(méi)有這種元件插入的培養(yǎng)煙草細(xì)胞(35S)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)化子。具體的，其中引入構(gòu)建物IS2或IS12的愈傷組織轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)量(轉(zhuǎn)基因的煙草培養(yǎng)細(xì)胞)與沒(méi)有引入這種元件的對(duì)照(35S)相比高1.6到2.6倍。
特別當(dāng)培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度達(dá)到300μg/ml時(shí)，可以觀察到通過(guò)引入構(gòu)建物IS2或IS12，愈傷組織轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)量與對(duì)照(35S)相比增加到10倍或更高。這表明構(gòu)建物IS2或IS12的插入導(dǎo)致了負(fù)責(zé)卡那霉素抗性的ntpII基因的表達(dá)水平和在所述構(gòu)建物的附近或邊緣區(qū)出現(xiàn)的上升。
(2)煙草愈傷組織轉(zhuǎn)化子的GUS活性的測(cè)定基于上述結(jié)果，作為報(bào)道基因的GUS基因的表達(dá)被用上述構(gòu)建物pIS12-35S/AB35S(IS12)來(lái)檢查，以檢查上述插入的構(gòu)建物是否能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
檢查GUS基因的表達(dá)首先通過(guò)從多個(gè)煙草愈傷組織轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)獨(dú)立的選擇愈傷組織，從每個(gè)愈傷組織中提取核DNA，并且經(jīng)過(guò)Southern分析證實(shí)了基因的轉(zhuǎn)入后，從愈傷組織中提取蛋白并測(cè)量GUS活性。具體的，取0.75g煙草愈傷組織轉(zhuǎn)化子并用GUS-Light(Tropix，Inc.)抽提蛋白。用Bio-Rad的蛋白試劑盒來(lái)測(cè)定蛋白濃度，然后用GUS-Light(Tropix)和發(fā)光計(jì)Lumat LB905(Bertold Japan)，GUS活性測(cè)定5秒。所得結(jié)果出示在
圖13中。在圖中，所示的GUS活性(縱座標(biāo))的按照光度值比每單位重量的蛋白，其通過(guò)從光度計(jì)所得的光度值除以蛋白重量來(lái)計(jì)算。
圖13中很明顯的表明與沒(méi)有元件插入pAB35S(35S)所形成的對(duì)照相比，轉(zhuǎn)入IS12構(gòu)建物的煙草愈傷組織轉(zhuǎn)化子平均具有超過(guò)2.6倍的GUS活性。從這點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)構(gòu)建物IS12的插入能夠顯著增加GUS基因的表達(dá)。
這表明上述構(gòu)建物中包含的每種元件(IS1元件，IS2元件，其連接產(chǎn)物(如IS12元件))為轉(zhuǎn)錄活化元件。實(shí)施例4將包含轉(zhuǎn)錄活化元件的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到煙草植物中(葉盤法)所用的根癌農(nóng)桿菌帶有實(shí)施例2中制備的構(gòu)建物，也即將pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)或pIS12-35S/AB35S(IS12)轉(zhuǎn)入其中(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子”)，利用葉盤法將構(gòu)建物IS1，IS2和IS12分別轉(zhuǎn)入到煙草葉中。對(duì)照試驗(yàn)中，使用轉(zhuǎn)入不含構(gòu)建物的pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌并采用如下所述同樣的程序。
具體的，每個(gè)煙草(SR1)葉浸入到10％次氯酸溶液，用藥匙作為攪拌器輕柔攪拌2分鐘以除去氣泡，更新溶液并重復(fù)同樣的程序5次。葉子被取出并浸入到滅菌水中，并進(jìn)行輕柔攪拌。當(dāng)用新的次氯酸溶液置換原有的溶液時(shí)，同樣的過(guò)程被重復(fù)三次。用滅菌的紙巾除去水分后，用軟木塞鉆孔器在葉子上打孔產(chǎn)生葉盤(葉脈被除去)。然后浸入到10ml的滅菌水中。所制備的葉盤浸入到上述培養(yǎng)于5mlYEP培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子中(用滅菌水調(diào)整OD600＝0.25)。然后，細(xì)菌懸浮物和葉盤共同倒入滅菌的紙巾中并用另一塊滅菌的紙巾除去水分。
葉子里面朝外的放置于MS感染培養(yǎng)基中，通過(guò)補(bǔ)加含40mg/L乙酰丁香酮和0.2％植物凝膠的MS培養(yǎng)基來(lái)制備(Murashige，T.and Skoog，F(xiàn).；Physiol.Plantarum 15，473-497(1962))，將其于25℃避光培養(yǎng)2天。然后，每個(gè)葉盤通過(guò)用MS區(qū)別培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.1mg/Lα-萘乙酸，1mg/L芐基腺嘌呤，150mg/L卡那霉素，500mg/L claforan和0.2％植物凝膠)擦拭除去細(xì)菌細(xì)胞，然后里面朝外的放置于MS區(qū)別培養(yǎng)基中在25℃進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2周用新鮮的MS區(qū)別培養(yǎng)基置換原來(lái)培養(yǎng)基，一個(gè)月的潛伏期后，對(duì)新生的芽進(jìn)行計(jì)數(shù)。所得的結(jié)果出示在表2中。
表2在煙草葉盤上新生芽的數(shù)目對(duì)照

從上述結(jié)果很清楚的表明，與不含元件的對(duì)照相比(35S)，當(dāng)煙草植物包含構(gòu)建物IS1或IS2時(shí)，其芽的新生率為對(duì)照的1.4倍，而且特別當(dāng)其包含IS1和IS2的串聯(lián)形式時(shí)(IS12)，所得的芽為對(duì)照的兩倍。這表明本發(fā)明的元件(IS1元件，IS2元件以及兩者連接所得產(chǎn)物(IS12或者類似物))能夠增加出現(xiàn)在煙草植物內(nèi)所述元件附近或邊緣區(qū)的卡那霉素基因(ntpII基因)的活性。這些結(jié)果支持了實(shí)施例3中所得的論斷，即本發(fā)明中的元件為轉(zhuǎn)錄活化元件。實(shí)施例5 將包含轉(zhuǎn)錄活化元件的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到胡蘿卜體細(xì)胞胚中用根癌農(nóng)桿菌，其中轉(zhuǎn)入有實(shí)施例2中制備的構(gòu)建物，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)，pIS12-35S/AB35S(IS12)或pMU3-35S/AB35S(MU3)(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子”)，構(gòu)建物IS1，IS2，IS12和MU3被分別轉(zhuǎn)入到胡蘿卜體細(xì)胞胚中。對(duì)照試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)入有pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌被使用并按照下述同樣的程序。
首先，胡蘿卜發(fā)芽的胚軸在無(wú)菌條件下被切成約1cm的長(zhǎng)度，然后放置于包含4.5×10-6M 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)的MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)24小時(shí)，然后放置于不含2，4-D的MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基被置換并按照同樣的方式培養(yǎng)7天使得胡蘿卜體細(xì)胞胚開始在胚軸上產(chǎn)生。
上述的培養(yǎng)于5ml YEP液體培養(yǎng)基的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子在3,000rpm離心10分鐘，棄去上清液，約30ml MS培養(yǎng)基被加入到沉淀物中去懸浮細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程被重復(fù)兩次并充分除去YEP培養(yǎng)基。然后，在3,000rpm離心10分鐘，棄去上清液，加入包含10mg/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基到沉淀中并調(diào)整OD600＝約0.3。
將上面用網(wǎng)收集的胡蘿卜胚軸加入到其中，并將混合物輕柔振蕩5分鐘。用滅菌的紙巾擦拭除去胚軸的水分，并將其浸入到包含10mg/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中于22℃避光培養(yǎng)3天。用滅菌的紙巾擦拭除去胚軸的水分，并將其浸入到包含500μg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中并用此培養(yǎng)基通過(guò)輕柔振蕩進(jìn)行清洗。用同樣的方式除去水分，胚軸避光培養(yǎng)于包含500μg/L羧芐青霉素和100μg/L卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上(包含0.8％瓊脂)。經(jīng)過(guò)1.5到3個(gè)月，有新生愈傷組織的胚軸被計(jì)數(shù)。所得的結(jié)果出示在表3中。
表3含新生愈傷組織的胚軸數(shù)目對(duì)照

表3很清楚的表明，胡蘿卜體細(xì)胞胚和煙草愈傷組織的例子一樣，在包含2，4-D培養(yǎng)基(+2，4-D)的去分化生長(zhǎng)條件和不包含2，4-D培養(yǎng)基(-2，4-D)的分化生長(zhǎng)條件下當(dāng)插入構(gòu)建物IS1，IS2，IS12和MU3時(shí)能夠增強(qiáng)再生的效率。所觀察到再生效率增加最大的為插入IS2構(gòu)建物的例子中。實(shí)施例6 將包含轉(zhuǎn)錄活化元件的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到水稻中用根癌農(nóng)桿菌，其中轉(zhuǎn)入有實(shí)施例2中制備的構(gòu)建物，也即pIS1-35S/AB35S(IS1)，pIS2-35S/AB35S(IS2)或pIS12-35S/AB35S(IS12)(下文中命名為“根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子”)，構(gòu)建物IS1，IS2和IS12被分別轉(zhuǎn)入到水稻的種子中。對(duì)照試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)入有pAB35S(35S)的根癌農(nóng)桿菌被使用并按照同樣的程序。
具體的，從充分成熟的水稻種子中(Nihonbare)，首先選擇那些外形和顏色都正常的，然后在缽中輕柔去殼。去殼的種子被放置于50mlFalcon試管中，加入2.5％的次氯酸鈉，混合物在100-120rpm振蕩20分鐘。然后，棄去上清液，加入滅菌水并輕柔振蕩混合物。重復(fù)該過(guò)程3次，種子放置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并于28℃避光培養(yǎng)。
經(jīng)過(guò)3到4周，愈傷組織從盾片上形成并長(zhǎng)出黃色的胚芽，只有那些直徑為2-3mm并且看上去分散的被放置于新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并于28℃避光培養(yǎng)7天。
將上述的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子種植于YEP固體培養(yǎng)基并于28℃避光培養(yǎng)3天。用藥匙將根癌農(nóng)桿菌的細(xì)胞刮下并加入到AAI培養(yǎng)基中(Toriyama，K.and Hirata，K.；Plant Science 41，179-183(1985))，并補(bǔ)加有乙酰丁香酮，OD600調(diào)整到0.18到0.2。于25℃避光振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。
按照上述方式培養(yǎng)的水稻愈傷組織被放置于滅菌的濾茶器中，并加入上面培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌所形成的懸浮液。濾茶器被振蕩3分鐘并間隔的搖晃以保證整個(gè)愈傷組織的浸入，然后將濾茶器和其內(nèi)容物整個(gè)放置于滅菌的紙巾上，除去多余的細(xì)菌培養(yǎng)液。愈傷組織被放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中并于25℃避光培養(yǎng)3天。
共培養(yǎng)的愈傷組織被收集到濾茶器中，浸入到補(bǔ)加有500mg/lclaforan的滅菌水中，濾茶器被振蕩以除去根癌農(nóng)桿菌，濾茶器和其內(nèi)容物被共同放置于滅菌的紙巾上除去水分。愈傷組織被放置于選擇性培養(yǎng)基中并于28℃避光培養(yǎng)。3到4周后，從大量的愈傷組織中隨機(jī)挑選愈傷組織，取被選定的愈傷組織的一部分并放置于GUS染色溶液中(0.75mM X-Gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸)，0.5mM高鐵氰化鉀，0.5mM亞鐵氰化鉀，0.3％Triton X-100，20％甲醇，50mM磷酸緩沖液(pH7.0))。在37℃反應(yīng)過(guò)夜以檢測(cè)GUS的活性。愈傷組織被染成藍(lán)色并且表現(xiàn)出GUS活性的為轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。所得結(jié)果出示在表4中。
表4水稻愈傷組織用于GUS的染色結(jié)果

表4結(jié)果清楚的表明與對(duì)照相比(35S)，轉(zhuǎn)入有構(gòu)建物IS1和IS2的轉(zhuǎn)化效率為對(duì)照的1.5倍和約2倍。
上述實(shí)施例1到6表明通過(guò)用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件(IS1，IS2，IS12，MU3)，再生效率(轉(zhuǎn)化效率)能夠被增強(qiáng)。下述的三種可能性被認(rèn)為是其原因(1)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的效率被增強(qiáng)的可能性；(2)由于IS1和/或IS2元件使得nos啟動(dòng)子活性增強(qiáng)以及隨后nptII基因轉(zhuǎn)錄起始活性增強(qiáng)使得基因產(chǎn)物數(shù)量的增加，并且導(dǎo)致能夠在用于選擇的包含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目增加，共同導(dǎo)致細(xì)胞再生的效率被增強(qiáng)的可能性；(3)IS1和/或IS2元件活化其附近或邊緣區(qū)基因或阻止所述基因區(qū)被滅活的可能性。
通過(guò)Ti質(zhì)粒方式轉(zhuǎn)入的基因不導(dǎo)致在植物染色體的預(yù)定位點(diǎn)上的插入，其插入位點(diǎn)是不確定的。所以，所討論的基因能否插入到活性位點(diǎn)是偶然的，其是由染色體的結(jié)構(gòu)或在隱藏位點(diǎn)的附近通過(guò)基因組DNA甲基化或其它原因?qū)е禄蛉セ罨鶝Q定的。認(rèn)為如果轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)入到隱藏位點(diǎn)，其會(huì)被染色體的“場(chǎng)”所影響導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因被滅活。
用于上述實(shí)施例的構(gòu)建物中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活化元件(IS1或/和IS2)插入到nptII基因(卡那霉素抗性基因)的終止子端，也即卡那霉素抗性基因的nos啟動(dòng)子的相反端。所以，不可能是這些元件對(duì)于卡那霉素抗性基因的順式作用。
但是，上述例子中的結(jié)果表明即使在本發(fā)明中的轉(zhuǎn)錄活化元件插入到的位置不能夠直接作用于nos啟動(dòng)子的情況下，在培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中卡那霉素抗性細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的煙草愈傷組織)的數(shù)目增加，特別是即使當(dāng)培養(yǎng)基中的卡那霉素的含量高達(dá)300mM時(shí)，卡那霉素抗性細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的煙草愈傷組織)的數(shù)目增加(實(shí)施例3(1))，并且通過(guò)將上述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到不同植物的植物細(xì)胞中時(shí)，卡那霉素抗性植物的再生效率增加(實(shí)施例4到6)。這些結(jié)果表明IS1或/和IS2元件作用于出現(xiàn)在所述元件附近的卡那霉素抗性基因，不是通過(guò)直接導(dǎo)致nos啟動(dòng)子順式活化的模式來(lái)起作用，結(jié)果細(xì)胞保持所述的卡那霉素抗性基因的活性(包括活化和阻止滅活)。因此，這表明可能和傳統(tǒng)的作為增強(qiáng)子出現(xiàn)在特定基因啟動(dòng)子附近的轉(zhuǎn)錄活化元件(因子)并通過(guò)順式作用于所述啟動(dòng)子來(lái)活化轉(zhuǎn)錄不同，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件當(dāng)其插入到基因組基因中時(shí)，能夠活化出現(xiàn)在其附近或邊緣的一組基因或多組基因(不論其作用的基因啟動(dòng)子的位置和方向)并且促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性，也即通過(guò)上述(3)的機(jī)制來(lái)起作用。
在上述實(shí)施例使用的構(gòu)建物中，IS1或/和IS2元件被插入到GUS基因的35S啟動(dòng)子端。實(shí)施例3(2)中插入所述構(gòu)建物的煙草培養(yǎng)細(xì)胞所表現(xiàn)出的GUS活性清楚的表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件也能夠作用于出現(xiàn)在下游附近的35S啟動(dòng)子從而增強(qiáng)GUS基因的轉(zhuǎn)錄活性。這個(gè)結(jié)果支持了上面所作的論斷并表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件表現(xiàn)出上述(3)中的活性，也即“IS1或/和IS2元件活化其鄰近基因區(qū)或阻止基因區(qū)被滅活”。
在上述實(shí)施例中，已知不僅在培養(yǎng)細(xì)胞(實(shí)施例3)而且在植物組織中，在煙草葉盤試驗(yàn)(實(shí)施例4)中煙草植物胚芽的再生效率被確實(shí)的提高，作為從胡蘿卜胚軸進(jìn)行植株再生基礎(chǔ)的胚性愈傷的形成效率增加(實(shí)施例5)，并且作為水稻植株再生基礎(chǔ)的愈傷組織的形成效率增加(實(shí)施例6)，都是通過(guò)用本發(fā)明中的轉(zhuǎn)錄活化元件。這些結(jié)果表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件作用于由于位置效應(yīng)使所討論的轉(zhuǎn)入植物基因組的外源基因產(chǎn)生基因沉默(滅活)而導(dǎo)致植物細(xì)胞變得不能進(jìn)行植物再生或形成愈傷組織，使得植物再生或形成的效率增加，因此特別有用。
考慮到最近的發(fā)現(xiàn)MITE如MAR一樣能夠結(jié)合核基質(zhì)(Tikhonovet al.，Plant Cell 12249-264(2000))，認(rèn)為MITE能夠在核內(nèi)起和MAR相同的作用?；谶@點(diǎn)，可以預(yù)期本發(fā)明中的轉(zhuǎn)錄活化元件，MITE能夠單獨(dú)或和如MAR的元件聯(lián)合使用來(lái)產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的植物來(lái)進(jìn)一步增加植物再生或形成的效率工業(yè)適用性在產(chǎn)生遺傳修飾的植物中要克服的最重要的問(wèn)題是導(dǎo)致外源基因表達(dá)失活的基因沉默現(xiàn)象。在發(fā)展遺傳修飾植物中為避免基因沉默現(xiàn)象，必須從大量植物個(gè)體中選擇出那些所討論的外源基因插入到盡可能少的導(dǎo)致基因沉默的位點(diǎn)的植物個(gè)體。
本發(fā)明提供新型植物來(lái)源的MITE類似元件，當(dāng)所述MITE類似元件插入到植物基因組中，非?？赡茉斐苫蚪M結(jié)構(gòu)的變化，基于此，對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化有作用，例如能夠促進(jìn)基因組DNA的展開或造成核小體結(jié)構(gòu)的變化，通過(guò)與常規(guī)的增強(qiáng)子元件不同的機(jī)制來(lái)起作用。
因此，通過(guò)使用本發(fā)明的MITE類似元件的特征，利用不同于以前的技術(shù)使調(diào)控出現(xiàn)在其附近的基因表達(dá)變得可能。也就是，用具有上述特征的本發(fā)明的MITE類似元件，可以增加或活化轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入的外源基因降低的表達(dá)能力。在這一方面，本發(fā)明的MITE類似元件可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒和包含所述表達(dá)盒的質(zhì)粒來(lái)產(chǎn)生遺傳修飾的生物體并進(jìn)一步用于穩(wěn)定的產(chǎn)生能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的經(jīng)遺傳修飾的生物體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件包括轉(zhuǎn)座元件例如如上所述的MITE類似元件中的一種(優(yōu)選的為IS1元件或/和IS2元件)，具有抑制和解決植物中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移由于位置效應(yīng)造成的基因表達(dá)失活現(xiàn)象(基因沉默現(xiàn)象)的活性。因此，可以預(yù)期通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件單獨(dú)使用或和其它參與到核DNA結(jié)構(gòu)中的元件例如MAR(基質(zhì)結(jié)合元件)聯(lián)合使用，可能使基因穩(wěn)定的表達(dá)并顯著的減少通常在基因轉(zhuǎn)移后進(jìn)行的篩選步驟以及用于傳種和生長(zhǎng)的重組植物數(shù)量。
基因組大小巨大的植物如百合，菊花和小麥在其基因組內(nèi)具有大量的隱藏位點(diǎn)，因此外源基因大都被插入到隱藏位點(diǎn)。對(duì)于這些植物，用先前技術(shù)很難或幾乎不可能產(chǎn)生重組植物。相反，用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件，可以顯著的抑制被引入到植物基因組中的外源基因的基因沉默并可以預(yù)期所述元件能夠有效的將外源基因轉(zhuǎn)入到如上所述那些被認(rèn)為很難來(lái)產(chǎn)生基因重組的植物中來(lái)產(chǎn)生重組植物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件也被認(rèn)為是能夠活化(包括轉(zhuǎn)錄活化)被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在其插入位點(diǎn)的附近或邊緣區(qū)的基因的元件。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件被預(yù)期不僅使轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠?qū)嵱米兊每赡?，即使?duì)于那些如上所述由于基因組過(guò)大使基因沉默頻繁出現(xiàn)而難于產(chǎn)生遺傳修飾的植物而言；而且對(duì)于即使已經(jīng)用于遺傳工程的植物種類如大豆，棉花，馬鈴薯和西紅柿而言，也可能增加基因傳遞的效率，同時(shí)，增加有用特性的基因轉(zhuǎn)錄的活性，例如除草劑抗性基因和殺蟲劑蛋白基因，通過(guò)用這些轉(zhuǎn)錄活化元件插入到這些有用特性基因的啟動(dòng)子的上游位點(diǎn)或其附近位點(diǎn)。而且與常規(guī)的產(chǎn)生遺傳修飾植物的方法相比，它們被預(yù)期可以產(chǎn)生具有高產(chǎn)量和高質(zhì)量的遺傳修飾植物。
序列表<110>小關(guān)良宏<110>三榮源有限公司<120>新的類似微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)的轉(zhuǎn)座元件和轉(zhuǎn)錄活化元件<130>P00-14<150>JP 1999/206316<151>1999-07-21<150>JP 1999/206320<151>1999-07-21<150>JP 2000/175825<151>2000-06-12<160>14<210>1<211>769<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>1gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgtaa aagttgccag tgaggttgca 180aaagttgcaa atgagtttgt aaaagttgca aatgaggttg caaaagttgc aaataaaaat 240ggaaagttgc aacagttgca actgcaattg caactagttc aactgaaaac tgtaagttgc 300aaaagttgca aatgaggttg caactaaatg caactgaaaa ctgtaagtaa caacagatgt 360atggtgtgcc cctggcgggg ccgttagatt acaatagaat caactgaatg caatcatatg 420caactgaata caactatatg caatcatata tgcaattaca aatcctgatt tcaagttcca 480gttttcgaat gtcattttcg aaatcgatat atatatatat atatatatat cgatttcgaa 540aatgacattc gaaaactgga acttgaaatc aggaattcag ctgcatatga agttgcaaaa 600gaggttgcaa cacggctggc 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gatttccc158<210>12<211>32<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>12ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tt32<210>13<211>32<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>13aaactcattc acataaaatg ggacagaggg ag32<210>14<211>1553<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus carota L.cv.Kurodagosun)<400>14ggtaccgggc cccccctcga ggtcactccc tacgtcccat tttatgtgac ctcattttct60ttttgggacg tctcaaaaaa aataacctag aatacttact attttttaac actatttttc120actattacac ccaccaactc tatattttat actattttat tattaaataa acactattac 180acccactact tttctccact atctcaaatc tattattaaa tattgatagg tccaccactt 240tacccacttt tcaactacat ttactacatt tttcttaatc tccgtgaaag tcaaactcat 300tcacataaaa tgggacagag ggagtaatta ttaattttaa taaattatat gtgattttga 360ttatgtgtgg attcttgata aaatatcaca gagttgatat aaattctaaa gatttaacca 420caatgtttca aaatctcata gattttagta ggattcaaaa aatttaaaat acgttcaaaa 480atctcataaa attcatcatt ttattaaatc caaaaaaatc cagtaatatt tgacaatcag 540attttaatga attttaaatt gaacaatctc agttgaatac catgagattt taaaatataa 600tttaaaattc 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aattctggaa ggtagtattt ttgaaaacaa 1500taaaagaaaa ggtaggtagt tttgtagatt tcccagacgg tatcgataag ctt 155權(quán)利要求
1.一種微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)類似元件，其能夠造成在基因組基因插入位點(diǎn)的靶序列(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]重復(fù)。
2.如權(quán)利要求1所述的MITE類似元件，在其5′和3′末端區(qū)域具有完全或非完全末端反向重復(fù)序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的MITE類似元件，在其序列中包括以復(fù)數(shù)形式重復(fù)的至少一個(gè)核苷酸序列，所述核苷酸序列由公式(1)代表XttgcaaY(其中的X代表g或t，Y代表a或c)或由公式(2)代表Zatgcaa(其中的Z代表t或a)。
4.如權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的MITE類似元件，其具有末端反向重復(fù)序列，所述末端反向重復(fù)序列在5′末端區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO1所示的核苷酸序列，在3′末端區(qū)域?yàn)槿鏢EQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.MITE類似元件，其包括如SEQ ID NO3.所示的核苷酸序列。
6.MITE類似元件，其具有末端反向重復(fù)序列，所述末端反向重復(fù)序列在5′末端區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO4所示的核苷酸序列，在3′末端區(qū)域?yàn)槿鏢EQ ID NO5所示的核苷酸序列，所述MITE類似元件能夠造成在基因組基因插入位點(diǎn)的靶序列TA的重復(fù)。
7.MITE類似元件，其包括如SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。
8.轉(zhuǎn)錄活化元件，其特征在于包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)座元件。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)錄活化元件，其中的轉(zhuǎn)座元件為MITE類似元件。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)錄活化元件，其中的轉(zhuǎn)座元件包括至少一個(gè)包括如下DNA(a)或(b)的MITE類似元件(a)一種DNA，其具有如SEQ ID NO1的核苷酸序列；(b)一種DNA，其能夠與具有上述(a)中的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并編碼MITE類似元件，所述MITE類似元件能夠造成基因組基因插入位點(diǎn)的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]的重復(fù)；或包括如下DNA(c)或(d)的MITE類似元件(c)一種DNA，其具有如SEQ ID NO2的核苷酸序列；(d)一種DNA，其能夠與具有上述(c)中的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并編碼MITE類似元件，所述MITE類似元件能夠造成基因組基因插入位點(diǎn)的TA的重復(fù)。
11.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)錄活化元件，其中的轉(zhuǎn)座元件為包括下述DNA(a)或(b)的MITE類似元件以及包括如下DNA(c)或(d)的MITE類似元件產(chǎn)生的串聯(lián)產(chǎn)物(a)一種DNA，其具有如SEQ ID NO1的核苷酸序列；(b)一種DNA，其能夠與具有上述(a)中的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并編碼MITE類似元件能夠造成基因組基因插入位點(diǎn)的(A)nG(A)n[n為不小于1的整數(shù)]的重復(fù)；(c)一種DNA，其具有如SEQ ID NO2的核苷酸序列；(d)一種DNA，其能夠與具有上述(c)中的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并編碼MITE類似元件能夠造成基因組基因插入位點(diǎn)的TA的重復(fù)。
12.轉(zhuǎn)錄活化元件，其包括具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA。
13.轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其包括如權(quán)利要求8到12中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)錄活化元件，和可操縱地連接到所述的元件上的DNA序列。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中的DNA序列可操縱地連接到包括啟動(dòng)子和/或終止子的轉(zhuǎn)錄活化元件上。
15.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，當(dāng)所述DNA序列可操縱地連接到轉(zhuǎn)錄活化元件上時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒進(jìn)一步包括將要被表達(dá)的目的轉(zhuǎn)基因序列。
16.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求8到12中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)錄活化元件。
17.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。
18.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。
19.如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因植物，其為玉米、水稻、小麥、百合、菊花、棉花、大豆、甜菜、馬鈴薯或番木瓜。
全文摘要
本發(fā)明提供新型胡蘿卜來(lái)源的MITE類似元件(轉(zhuǎn)座元件)。進(jìn)一步提供包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)錄活化元件,特別是上述MITE類似元件。具體的,提供具有包括如SEQID NO:1所示核酸序列或其功能類似物的DNA和/或包含如SEQ ID NO:2所示核酸序列或其功能類似物的轉(zhuǎn)錄活化元件。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄活化元件能夠增加或活化被減少的通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入的外源基因的表達(dá)。因此,轉(zhuǎn)基因活化元件對(duì)于轉(zhuǎn)入到植物基因組的外源基因的穩(wěn)定表達(dá)起作用,并用于穩(wěn)定的產(chǎn)生遺傳修飾的植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1361826SQ00810648
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月21日
發(fā)明者小關(guān)良宏, 小柳美喜子, 福田崇, 香田隆俊 申請(qǐng)人:三榮源有限公司, 小關(guān)良宏