專利名稱：轉(zhuǎn)化真菌的新方法及其用于異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的用途的制作方法
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化真菌及將其用于生產(chǎn)異源蛋白的新方法。此方法包括對屬于醬油曲霉(Aspergillus sojae)的真菌進(jìn)行遺傳工程化。過去已提出將醬油曲霉用作轉(zhuǎn)化宿主菌株。然而沒有數(shù)據(jù)表明成功轉(zhuǎn)化和/或表達(dá)異源蛋白。另外發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)如肌醇六磷酸酶，其由于一些原因包括在除醬油曲霉之外的表達(dá)宿主中被蛋白酶降解而難以大量表達(dá)，但卻令人驚奇的在醬油曲霉中可表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)異源蛋白在醬油曲霉中的生產(chǎn)水平超過同樣的蛋白在黑曲霉(Aspergillusniger)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中的水平。除上述之外，本發(fā)明還涉及獲得改良的進(jìn)行表達(dá)的醬油曲霉菌株的方法，改良的醬油曲霉菌株特征在于一方面降低蛋白酶解活性，另一方面改良與真菌形態(tài)學(xué)相關(guān)的發(fā)酵特性。
背景技術(shù)：
過去已提出將醬油曲霉用作轉(zhuǎn)化宿主。然而，沒有數(shù)據(jù)表明成功轉(zhuǎn)化和/或生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，尤其關(guān)于肌醇六磷酸酶表達(dá)沒有任何證明。先前在除了醬油曲霉之外的表達(dá)宿主中表達(dá)水平特別低，主要由于蛋白酶降解所致。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在醬油曲霉中的表達(dá)水平超過在其它菌株，例如黑曲霉，泡盛曲霉和木霉屬(Trichoderma)菌株中的表達(dá)水平。在密切相關(guān)的菌株中發(fā)現(xiàn)這種改進(jìn)是令人驚奇的。因此，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于肌醇六磷酸酶生產(chǎn)的揭示呈現(xiàn)出缺點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)在使用醬油曲霉表達(dá)異源蛋白或多肽的揭示是不合適的。
直至目前還少有成功進(jìn)行醬油曲霉轉(zhuǎn)化的報(bào)道，這一事實(shí)值得注意，因?yàn)檫^去已經(jīng)闡述了與米曲霉(Aspergillus oryzae)密切相關(guān)的菌株的各種成功轉(zhuǎn)化?；谶@種密切關(guān)系，技術(shù)人員應(yīng)能期望與使用米曲霉的方法類似的方法也可用于醬油曲霉菌株。
例如WO97/04108闡述了編碼蛋白酶的核酸序列，尤其亮氨酸氨肽酶編碼序列的分離，及用亮氨酸氨肽酶編碼序列轉(zhuǎn)化各種宿主有機(jī)體，例如醬油曲霉。然而，沒有例證表明此特定轉(zhuǎn)化確已進(jìn)行。其只提出一些其它菌株作為潛在宿主菌株用于轉(zhuǎn)化的可能性，如Trichoderma reesei，黑曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)，和米曲霉。在所引用的文獻(xiàn)中，提出本領(lǐng)域常用的3種轉(zhuǎn)化菌株的方法。特別提出選擇標(biāo)記乙酰胺酶S(＝amdS)(例如保持在載體p3SR2上)，argB或潮霉素B(例如使用載體pAN7-1)，根據(jù)其所闡述的轉(zhuǎn)化方法可用作適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。
具有amdS標(biāo)記的載體p3SR2的使用，在用于轉(zhuǎn)化各種菌株的文獻(xiàn)中經(jīng)常闡述，例如米曲霉(EP 0.238.023)，Trichoderma reesei(EP0.244.234)和黑曲霉(EMBO雜志4，p475-479)。因此，類似用于一般轉(zhuǎn)化曲霉的方法見于基于這些出版物的WO97/04108所述。
特別是WO97/04108的第17頁闡述了在轉(zhuǎn)化之前，在包含作為唯一氮源的底物乙酰胺的基本培養(yǎng)基上生長緩慢的曲霉和木霉，可在用載體p3SR2轉(zhuǎn)化后由于明顯的生長優(yōu)勢選擇。接著，這樣獲得的轉(zhuǎn)化體需要進(jìn)一步選擇亮氨酸氨肽酶(LAP)產(chǎn)量，以發(fā)現(xiàn)所需的轉(zhuǎn)化體。如上所述，這只是基于少數(shù)除醬油曲霉之外其它菌株的成功轉(zhuǎn)化，提出的適用上述兩個(gè)屬的轉(zhuǎn)化方法。
然而，提出的轉(zhuǎn)化方法未成功用于醬油曲霉?，F(xiàn)有技術(shù)闡述的選擇標(biāo)準(zhǔn)，在使用載體p3SR2時(shí)，不能確保實(shí)際選擇到所需的轉(zhuǎn)化體。我們已經(jīng)進(jìn)行了此試驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)所述方法不可操作，因?yàn)檫^量的背景生長消除了實(shí)際可選擇性。
另一種選擇真菌轉(zhuǎn)化體的常用方法是轉(zhuǎn)化乳清苷-5-單磷酸脫羧酶(PyrG)突變體的選擇方法。Mattern等，在分子普通遺傳學(xué)210，p460-461中揭示了用黑曲霉pyrG基因轉(zhuǎn)化米曲霉的方法。標(biāo)準(zhǔn)方法是基于作為陽性選擇標(biāo)記的氟乳清酸的直接抗性，分離pyrG突變體。由此分離各種真菌的許多pyrG突變體。
在用許多不同的絲狀真菌進(jìn)行的試驗(yàn)中，基于營養(yǎng)缺陷的pyrG的系統(tǒng)有許多有利特性。在含有尿苷以支持突變體菌株生長的平板，使用標(biāo)準(zhǔn)程序基于對氟乳清酸(FOA)的抗性直接選擇，進(jìn)行試驗(yàn)以獲得醬油曲霉pyrG突變體菌株(Van Hartingsveldt等，分子普通遺傳學(xué)(1987)206，p71-75)。然而，對醬油曲霉菌株使用類似方法未能產(chǎn)生pyrG突變體。常用的方法不產(chǎn)生氟乳清酸抗性菌株，而是所有菌株均能不用尿苷生長。因此，這些菌株無一是pyrG突變體。通常地，可在尿苷選擇培養(yǎng)基上從氟乳清酸抗性菌株中直接分離pyrG突變體。然而對醬油曲霉而言，此方法不可操作。
明顯的，當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，醬油曲霉與密切相關(guān)的米曲霉呈現(xiàn)不同的性狀。使用amdS或pyrGF作為選擇標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)方法無效。不幸的是，argB作為選擇標(biāo)記的方法也不可選，因?yàn)檫@需要從每個(gè)期望使用的宿主菌株中分離相應(yīng)的argB突變體。這是基于反復(fù)試驗(yàn)的艱苦的工作。所需的argB突變體可通過隨機(jī)誘變，隨后篩選上萬個(gè)菌落而獲得。pyrG的情況較好，因?yàn)橥蛔凅w是自身可選擇的。在amdS的情況中，不需要突變體，因?yàn)榇嬖诘腶mdS作為顯性的選擇標(biāo)記。
還存在阻止技術(shù)人員使用醬油曲霉作為表達(dá)重組蛋白或多肽的宿主的其它問題。在JP-A-02-234666中，例如闡述了使用與其它真菌相似方法，基于argB選擇醬油曲霉。這種方法在生物技術(shù)(1988)6，p1419-1422中已就米曲霉加以闡述。所引用的文章還指出成功地類似轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。然而，當(dāng)分析該日本專利申請中揭示的醬油曲霉菌株ATCC42251時(shí)，發(fā)現(xiàn)非所需的蛋白酶分布圖。此菌株的蛋白酶分布圖不適于用作生產(chǎn)宿主。因此盡管現(xiàn)有技術(shù)對特殊的醬油曲霉已提出一種轉(zhuǎn)化方法，但即使轉(zhuǎn)化方法是成功的也不能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)。
由于醬油曲霉菌株產(chǎn)生過量的堿性蛋白酶和淀粉酶的鮮明特性，發(fā)現(xiàn)其有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。它們特別用于降解復(fù)雜聚合底物的過程中。因此最好的預(yù)期是，只有產(chǎn)物是不受其自身蛋白酶影響的醬油曲霉蛋白時(shí)，最終成功的醬油曲霉菌株的任何轉(zhuǎn)化體才導(dǎo)致良好的表達(dá)水平。技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)使用醬油曲霉菌株在工業(yè)規(guī)模表達(dá)異源重組蛋白的方法所面臨的困難是多種多樣的。首先，以用于其它真菌的方式導(dǎo)入所需表達(dá)的核酸材料的許多方法不可操作。這包括用于密切相關(guān)的米曲霉的基于pyrG和amdS的方法。其次，盡管已知宿主菌株醬油曲霉的過量蛋白酶解活性，仍存在高水平產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)是否是可行的這一問題。
意外地發(fā)現(xiàn)可解決上述問題，因此產(chǎn)生新的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的表達(dá)宿主，及生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的新方法。我們闡述了用amdS和pyrG選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化醬油曲霉菌株的方法。另外還闡述了有效的基因表達(dá)，包括肌醇六磷酸酶基因的表達(dá)。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及醬油曲霉菌株及其生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)和多肽的用途。首先，闡述醬油曲霉菌株。確定醬油曲霉真菌的分類學(xué)是一復(fù)雜問題。曲霉屬包含F(xiàn)lavi/Tamarii組中的醬油曲霉(見表1)。醬油曲霉明顯示出不同于位于相同組中的米曲霉(見表2)。目前，使用本領(lǐng)域已知的許多方法，可將屬于醬油曲霉的菌株與分類學(xué)密切相關(guān)的米曲霉，及也是密切相關(guān)的寄生曲霉區(qū)分。參見隨機(jī)PCR片段，ver-1，aflR或rDNA序列，分別見于Ushijama等，(1981)，Chang等，(1995)，Yuan等，(1995)，Kusomoto等，(1998)，和Watson等(1999)所述。另外，通過對比這些菌株的alpA序列，已發(fā)現(xiàn)米曲霉不同于醬油曲霉。特別是(在米曲霉與醬油曲霉之間沒有其它不同序列，可用作測定工具)，已發(fā)現(xiàn)醬油曲霉在alpA基因中的特殊位置包含XmnI位點(diǎn)。一些米曲霉菌株alpA基因中相應(yīng)位置沒有這種限制酶。由此提供了在兩種類型的真菌菌株之間的另一區(qū)別點(diǎn)。因此，許多方法適于技術(shù)人員用于確定一菌株是否是醬油曲霉。目前有10種以上限定為醬油曲霉的菌株保藏在ATCC中。對這10種最早保藏物已經(jīng)進(jìn)行分析。其中兩種不能通過所述的后一測定試驗(yàn)。其一是ATCC20235，其根據(jù)Ushijama等(1981)所述方法，基于形態(tài)學(xué)參數(shù)，也不符合作為醬油曲霉的分類要求。另一是ATCC46250。本專利申請中使用的醬油曲霉是指一種菌株，其優(yōu)選符合所引用的文獻(xiàn)所述的所有要求，并在alpA基因中存在XmnI限制位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了米曲霉和醬油曲霉序列的特異同源引物。它們可用于測試XmnI位點(diǎn)的存在與否，例如通過篩選測試以區(qū)分醬油曲霉和米曲霉(引物序列是SEQ ID NO1MBL17845’-CGGAATTCGAGCGCAACTACAAGATCAA-3’；和SEQ ID NO2 MBL17855’-CGGAATTCAGCCCAGTTGAAGCCGTC-3’)。它們衍生自alpA基因的編碼區(qū)?；谝阎蛄袛?shù)據(jù)，技術(shù)人員可對引物和探針加以改動。區(qū)分醬油曲霉和米曲霉菌株，可通過用這些引物對曲霉DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用XmnI對所得DNA片段進(jìn)行限制消化而進(jìn)行。通過對醬油曲霉菌株的限定，我們可進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
本發(fā)明一方面涉及重組醬油曲霉，其包含一個(gè)導(dǎo)入的乙酰胺酶S(amdS)基因作為選擇標(biāo)記。這種醬油曲霉在包含導(dǎo)入的amdS蛋白的底物作為唯一氮源的培養(yǎng)基上是可選擇的，這種培養(yǎng)基還包含碳底物，及沒有內(nèi)源的amdS誘導(dǎo)底物。一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基包含作為導(dǎo)入的amdS的底物的丙烯酰胺作為唯一氮源。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基還至少包含醬油曲霉生長所需的基本底物。根據(jù)本發(fā)明醬油曲霉的適當(dāng)類型是由在含有乙酰胺的培養(yǎng)基上不可選擇的醬油曲霉形成的。根據(jù)本發(fā)明的一種醬油曲霉是在無葡萄糖的培養(yǎng)基上可適當(dāng)選擇的醬油曲霉，即所述培養(yǎng)基中碳源不是葡萄糖。這種培養(yǎng)基可以是用山梨糖醇作為碳源的培養(yǎng)基。當(dāng)用山梨糖醇作為唯一碳源時(shí)，可達(dá)到最佳結(jié)果。
本發(fā)明醬油曲霉可包含另外導(dǎo)入的核酸序列，所述另外導(dǎo)入的核酸序列優(yōu)選編碼蛋白質(zhì)或多肽。另外導(dǎo)入的序列可以經(jīng)適應(yīng)使最佳的密碼子適于宿主菌株的密碼子，或具有衍生自其中的宿主的原始密碼子。導(dǎo)入的序列可以是技術(shù)人員希望表達(dá)的任何序列。導(dǎo)入的序列可以是異源的，即與導(dǎo)入其中的醬油曲霉是異源的。其可以是天然的，也可以是導(dǎo)入一或多個(gè)額外拷貝的形式。
本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)。技術(shù)人員已知許多關(guān)于肌醇六磷酸酶的序列。我們所指的且并入?yún)⒖嫉氖荅P684.313，EP897.010，WO 99/49022，EP911.416和EP897.985。這些文獻(xiàn)闡述了各種天然的和修飾的肌醇六磷酸酶序列。它們還闡述了共有序列。一適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案是由來自Peniophora的肌醇六磷酸酶序列形成的，可以是其天然的序列或修飾的序列。此新系統(tǒng)比現(xiàn)有的系統(tǒng)更靈活，因此在現(xiàn)有技術(shù)的真菌系統(tǒng)中難以表達(dá)的編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的異源序列，在本發(fā)明的新系統(tǒng)中可表達(dá)。
在上述任一實(shí)施方案中限定的包含一個(gè)導(dǎo)入的amdS基因作為選擇標(biāo)記的本發(fā)明的醬油曲霉，可合適地不具有活性的內(nèi)源性amdS基因。這種實(shí)施方案的醬油曲霉，可例如具有內(nèi)源性amdS基因，但該基因包含內(nèi)源性amdS失活突變?？梢援a(chǎn)生技術(shù)人員已知或可得到的任何形式的失活突變。這種失活突變例如可以是缺失或破壞。此突變可失活基因或基因產(chǎn)物。技術(shù)人員已知有許多方法可用于達(dá)到此目的，并易于達(dá)到。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組的醬油曲霉，其沒有活性的內(nèi)源amdS基因，并包含一個(gè)導(dǎo)入的amdS基因作為選擇標(biāo)記。本發(fā)明的重組醬油曲霉在含有amdS的底物作為唯一氮源的培養(yǎng)基上是可選擇的，所述培養(yǎng)基還包含碳底物。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基還至少包含醬油曲霉生長所需的基本底物。在一適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案中，內(nèi)源性amdS基因可例如是已經(jīng)失活的。此失活可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可達(dá)到的任何類型失活，而醬油曲霉仍然是存活的。例如內(nèi)源性amdS基因可包含的失活突變?nèi)缡侨〈?，缺失或插入基因或其部分，或影響基因表達(dá)如使其失活的突變。也可不存在完整的內(nèi)源性amdS基因。
本發(fā)明所述任一實(shí)施方案中的醬油曲霉，可以是導(dǎo)入amdS基因的醬油曲霉，這可通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染達(dá)到。本發(fā)明所得的醬油曲霉然后必須隨之從未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉中分離。本發(fā)明包括上述任一實(shí)施方案或其組合。
本發(fā)明不僅涉及這種醬油曲霉，還涉及將核酸序列導(dǎo)入醬油曲霉中的方法。該方法包括參考將核酸序列導(dǎo)入真菌的已知方式，將核酸序列導(dǎo)入醬油曲霉中。這種方式例如是轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染醬油曲霉。該方法包括將amdS基因作為核酸序列導(dǎo)入，隨后在培養(yǎng)基上選擇所得轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，該培養(yǎng)基沒有內(nèi)源性amdS誘導(dǎo)底物，所述培養(yǎng)基還包含導(dǎo)入的amdS的底物作為唯一氮源，和碳底物，所述培養(yǎng)基能使包含導(dǎo)入的amdS基因的醬油曲霉生長，同時(shí)消除沒有功能性amdS基因的醬油曲霉的生長。這種方法的一適當(dāng)實(shí)施方案包括應(yīng)用包含除乙酰胺之外的amdS的底物的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基包含作為導(dǎo)入的amdS的底物的丙烯酰胺作為唯一氮源。根據(jù)本發(fā)明的方法，此培養(yǎng)基包含除葡萄糖之外的碳源。適當(dāng)?shù)模糜诒景l(fā)明的培養(yǎng)基包含山梨糖醇作為碳源，優(yōu)選作為唯一碳源。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基至少還包含醬油曲霉生長所必需的基本底物。
如上述任何實(shí)施方案所限定，本發(fā)明的方法還包括導(dǎo)入除amdS基因之外的其它核酸序列。所述的其它核酸序列例如編碼蛋白質(zhì)或多肽，如肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)。此序列不是必需是非醬油曲霉序列，也可包括醬油曲霉衍生的序列。但需要指出的是導(dǎo)入的序列是未轉(zhuǎn)化的菌株中不存在的，或以低于本發(fā)明醬油曲霉中拷貝數(shù)存在的。
自然地，本發(fā)明還涉及通過上述方法獲得的任何醬油曲霉。基本上，此方法是導(dǎo)入一個(gè)序列，該序列能表明作為選擇標(biāo)記的足夠活性的amdS的存在情況，與之相反，序列未導(dǎo)入其中的醬油曲霉由于一些原因不能產(chǎn)生足夠活性的amdS，使其在作為唯一氮源的amdS的底物上生長。
選擇轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。此方法包括參考用核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真菌的已知方式，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染醬油曲霉(不含根據(jù)所述任一實(shí)施方案限定的活性的內(nèi)源性amdS基因)。此方法包括將amdS基因作為核酸序列導(dǎo)入，隨后選擇所得轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，所述選擇是在包含導(dǎo)入的amdS的底物作為唯一氮源的培養(yǎng)基上進(jìn)行，所述培養(yǎng)基還包含碳底物，該培養(yǎng)基能使所需的醬油曲霉生長，同時(shí)消除未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉生長，因?yàn)獒u油曲霉在未導(dǎo)入amdS基因的情況下，不具有在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基至少還包含醬油曲霉生長所必需的基本底物。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重組醬油曲霉的方法。該方法包括將所需的核酸序列，例如以已知方式轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入醬油曲霉中，所述所需的核酸序列側(cè)翼為內(nèi)源性amdS基因片段，其長度和同源性足以確保重組。導(dǎo)入之后，選擇具有所需核酸序列的重組醬油曲霉。此選擇是通過包含在所需核酸序列中或與其共轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記進(jìn)行的，所述選擇標(biāo)記在導(dǎo)入所需核酸序列之前的醬油曲霉中不存在。側(cè)翼序列也可以是相應(yīng)于內(nèi)源性amdS基因的確保重組的序列。技術(shù)人員基于雜交知識和內(nèi)源性amdS基因的序列數(shù)據(jù)，可易于確定哪個(gè)序列是適當(dāng)?shù)?。在這兩種情況中，重組均消除了內(nèi)源性amdS的活性。選擇標(biāo)記優(yōu)選是pyrG，但在選擇培養(yǎng)基中要用尿嘧啶代替尿苷。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括在含有尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)生長狀態(tài)的醬油曲霉，所述醬油曲霉在含有尿苷和氟乳清酸的培養(yǎng)基上不生長。這意味著醬油曲霉呈尿嘧啶輔源營養(yǎng)，不能利用尿苷，是pyrG陰性的，并呈現(xiàn)對氟乳清酸抗性。尿嘧啶輔源營養(yǎng)和氟乳清酸抗性可通過活性的導(dǎo)入的pyrG基因的互補(bǔ)作用而減輕。本發(fā)明的這種醬油曲霉可沒有活性的內(nèi)源性pyrG基因。本發(fā)明pyrG陰性的醬油曲霉可包含經(jīng)突變失活的內(nèi)源性pyrG基因。此突變可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或可達(dá)到的任何突變，所述突變失活pyrG基因或其表達(dá)產(chǎn)物。這種突變例如是在基因中插入核酸序列，取代基因的部分編碼序列，缺失基因的部分編碼序列，或缺失基因的全部編碼序列。此突變也可發(fā)生在基因的調(diào)節(jié)部分。在具有突變的pyrG基因的本發(fā)明醬油曲霉的情況中，所述醬油曲霉可具有與野生型醬油曲霉pyrG基因不同的突變的pyrG基因的核酸序列。另一實(shí)施方案包含pyrG陰性的本發(fā)明醬油曲霉，其還包含本發(fā)明所述amdS變體醬油曲霉的任何特性或其組合。
本發(fā)明還包括選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法。此方法包括根據(jù)上述用核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法，對本發(fā)明上述任何實(shí)施方案的pyrG陰性的醬油曲霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述方法包括用已知的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方式，將活性pyrG基因?qū)雙yrG陰性的醬油曲霉中。之后在沒有尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上選擇所得轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，所述培養(yǎng)基至少還包含醬油曲霉生長所必需的基本底物，該培養(yǎng)基能使所需的醬油曲霉生長，同時(shí)消除未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉生長，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的pyrG基因是失活的，在沒有尿嘧啶的培養(yǎng)基上沒有生長能力。在這種方法的一適當(dāng)實(shí)施方案中，導(dǎo)入的活性的pyrG基因的側(cè)翼為相同核酸序列片段，導(dǎo)入pyrG基因和側(cè)翼序列產(chǎn)生的pyrG陽性的醬油曲霉在無尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上選擇。接著，將pyrG陽性的醬油曲霉含有尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而消除導(dǎo)入的pyrG基因，這樣產(chǎn)生pyrG陰性的醬油曲霉，其可通過在含有尿嘧啶培養(yǎng)基上生長和氟乳清酸抗性而加以選擇。在上述方法的一適當(dāng)實(shí)施方案中，指導(dǎo)pyrG基因和側(cè)翼序列整合入特異位置的序列可進(jìn)一步位于側(cè)翼序列和pyrG基因的側(cè)翼，這是由于整合指導(dǎo)序列與轉(zhuǎn)化的醬油曲霉的特異序列同源。這可剔除(如果需要)與特異序列相關(guān)的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知產(chǎn)生剔除突變體的方法。所述選擇方法的任何實(shí)施方案還可包括一個(gè)步驟，其中醬油曲霉是用另一種異源核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的。此另外的核酸序列優(yōu)選編碼蛋白質(zhì)或多肽，且在根據(jù)本發(fā)明的醬油曲霉和一般真菌的其它實(shí)施方案中關(guān)于這種另外的核酸序列性質(zhì)的闡述，在此同樣有效。此另外序列可在相同載體上與活性pyrG基因一起導(dǎo)入或通過與欲導(dǎo)入的活性pyrG基因共轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入。所述選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法，也可與導(dǎo)入核酸序列的方法組合使用，導(dǎo)入方法包括導(dǎo)入上述任何本發(fā)明實(shí)施方案中的異源amdS基因。自然地，本發(fā)明包括通過選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法所得的任何重組醬油曲霉。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生重組醬油曲霉的方法，所述方法包括以已知方式用核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染pyrG陽性的醬油曲霉，該序列包含欲導(dǎo)入的序列和側(cè)翼的pyrG基因片段或相應(yīng)序列，其長度和特異性足以確保重組消除pyrG基因和導(dǎo)入所需的序列，隨后選擇含所需的序列的重組醬油曲霉，通過選擇具有pyrG陰性表型的醬油曲霉進(jìn)行選擇。技術(shù)人員通過其關(guān)于用核酸序列進(jìn)行雜交的知識，和pyrG基因的所需序列數(shù)據(jù)的知識，可確定相應(yīng)的序列。
本發(fā)明特別涉及這種呈現(xiàn)上述amdS變體醬油曲霉特性的醬油曲霉。因此通過導(dǎo)入amdS和/或pyrS的方法獲得的任何醬油曲霉菌株，是本發(fā)明范圍內(nèi)的一種新菌株，本發(fā)明還包括這種新菌株的應(yīng)用。這種新菌株可包含一種核酸序列，該序列在原始的醬油曲霉中，甚至在醬油曲霉，曲霉或真菌中不存在。此序列可以源自哺乳動物，或衍生自任何動物，植物或微生物。也可以表達(dá)天然存在于醬油曲霉菌株中的核酸序列，但其在相應(yīng)未轉(zhuǎn)化的醬油曲霉中以較低拷貝數(shù)存在。因此，當(dāng)涉及本發(fā)明的pyrG和/或amdS醬油曲霉菌株時(shí)，本發(fā)明還包括同源蛋白的生產(chǎn)。一優(yōu)選的實(shí)施方案是其中產(chǎn)生的特殊蛋白或多肽在相應(yīng)的未處理的醬油曲霉中不存在，和/或在相應(yīng)的未處理的醬油曲霉中以較低拷貝數(shù)存在，未處理的醬油曲霉即導(dǎo)入核酸序列之前的醬油曲霉。通過醬油曲霉的任何新菌株以已知在真菌中產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的方式表達(dá)異源蛋白質(zhì)，因此包括與菌株天然或異源的兩種序列。基本上，只有天然未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉不受保護(hù)。生產(chǎn)方法包括將真菌在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，以發(fā)生所需的序列表達(dá)。生產(chǎn)方法任選的包括以已知方式分離由真菌產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，此蛋白質(zhì)或多肽分泌于培養(yǎng)基中。
優(yōu)選的蛋白質(zhì)或多肽是通過黑曲霉或泡盛曲霉表達(dá)易于降解的。現(xiàn)有技術(shù)已揭示了許多這種蛋白質(zhì)和多肽，仍有大量需要測定。這種測定對技術(shù)人員是常事。表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的另一優(yōu)選實(shí)施方案是此蛋白質(zhì)或多肽不同于醬油曲霉蛋白酶或淀粉酶。一優(yōu)選的實(shí)施方案包括一種非醬油曲霉蛋白或多肽。
特別感興趣的一實(shí)施方案包括組合上述導(dǎo)入核酸序列的兩種方法。其優(yōu)點(diǎn)是用pyrG標(biāo)記獲得的轉(zhuǎn)化的頻率，明顯高于amdS標(biāo)記。然而，對在丙烯酰胺選擇平板上最佳生長的pyrG陽性菌株的二次篩選，可以鑒別呈現(xiàn)最高拷貝數(shù)的那些重組醬油曲霉，因此最可能最高水平基因表達(dá)。
如實(shí)施例所述，可使用醬油曲霉的同源和異源表達(dá)調(diào)節(jié)序列，即可使用菌株自身天然發(fā)生的序列或與菌株異源的序列。因此根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可包括任何這種調(diào)節(jié)序列。技術(shù)人員可根據(jù)特殊應(yīng)用選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)域。調(diào)節(jié)序列可以是組成型或是可誘導(dǎo)的。調(diào)節(jié)序列可以是真菌或非真菌的。在實(shí)施例中例證了大量序列。大量表達(dá)調(diào)節(jié)序列是現(xiàn)有技術(shù)用于其它系統(tǒng)，尤其真菌系統(tǒng)，如曲霉的，并根據(jù)本發(fā)明可無需過度勞動而常規(guī)應(yīng)用。
為將所需的核酸序列導(dǎo)入醬油曲霉中，可使用適于將核酸序列導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞的任何載體。本領(lǐng)域有許多適當(dāng)?shù)妮d體。尤其可應(yīng)用已發(fā)現(xiàn)適于在曲霉，如黑曲霉，泡盛曲霉和米曲霉中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染或表達(dá)的載體。
除上述之外，本發(fā)明闡述了重組醬油曲霉產(chǎn)生蛋白質(zhì)的效率。這種生產(chǎn)效率在那些具有蛋白酶分布圖優(yōu)于ATCC42251，或至少與ATCC9362，ATCC11906和ATCC20387一樣好的菌株中示出。由此證明一些已知的醬油曲霉菌株是非常適于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，多肽和代謝物的。這些醬油曲霉菌株與參比菌株醬油曲霉ATCC42251相比，呈現(xiàn)較低的蛋白酶解活性。尤其兩種已知菌株ATCC11906和ATCC20387是特別合適的。因此優(yōu)選的生產(chǎn)蛋白質(zhì)，多肽和代謝物的醬油曲霉菌株是與這兩種優(yōu)選菌株相比，表達(dá)相同或較低蛋白酶解活性的菌株。菌株ATCC11906是現(xiàn)有技術(shù)中在ATCC中保藏的醬油曲霉中最好的實(shí)施方案。將生產(chǎn)適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)或多肽。本發(fā)明可導(dǎo)入核酸序列，由此可用醬油曲霉作為表達(dá)宿主選擇任何蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明提供了對現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)。許多現(xiàn)有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)由于蛋白酶解而存在許多問題。本發(fā)明的新系統(tǒng)好于目前通用的表達(dá)系統(tǒng)黑曲霉和泡盛曲霉。本發(fā)明提供了重組醬油曲霉，其包含編碼蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列，以進(jìn)行表達(dá)，所述蛋白質(zhì)或多肽通過黑曲霉或泡盛曲霉表達(dá)是易于降解的。本發(fā)明還提供了重組醬油曲霉，其包含編碼蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列，以進(jìn)行表達(dá)，所述蛋白質(zhì)或多肽不是醬油曲霉蛋白酶和淀粉酶。一優(yōu)選的實(shí)施方案是其中導(dǎo)入的核酸序列編碼非醬油曲霉蛋白或多肽。這種重組醬油曲霉菌株也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
另外，本發(fā)明提供了已經(jīng)修飾的醬油曲霉菌株，以增強(qiáng)其作為表達(dá)宿主的適應(yīng)性。這些修飾可以是通過任何方法誘導(dǎo)的降低蛋白酶解活性。特別地，例證了使用UV隨機(jī)誘變。還例證了一或多個(gè)蛋白酶基因的突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知進(jìn)行這種突變的方法，且有許多其它的方法可用以得到所需的突變體。一適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案是堿性蛋白酶解活性降低的突變體。特別例證了消除主要35kDa堿性蛋白酶的特異活性，以確保提高蛋白質(zhì)和多肽的表達(dá)。因此本發(fā)明還包括一種新菌株，其呈現(xiàn)蛋白酶解活性降低，尤其堿性蛋白酶解活性降低。這種菌株可通過技術(shù)人員已知的任何特異突變而獲得。呈現(xiàn)上述蛋白酶解活性降低的這種表達(dá)宿主的一優(yōu)選實(shí)施方案還包含可選擇的標(biāo)記。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是amdS，pyrG或其組合。
本發(fā)明還包括一種通過剔除35kDa堿性蛋白酶基因，生產(chǎn)蛋白酶缺陷型突變體的方法?；谒峁┑拇嘶虻男蛄袛?shù)據(jù)，有許多方法可達(dá)到此目的。尤其一種方法是用連于兩個(gè)側(cè)翼區(qū)的pyrG選擇標(biāo)記進(jìn)行重組，引起35kDa堿性蛋白酶交換，從而所得菌株具有pyrG選擇標(biāo)記，并失去堿性蛋白酶。接著可除去此pyrG選擇標(biāo)記，由此產(chǎn)生35kDa堿性蛋白酶陰性的醬油曲霉突變體，其可用于表達(dá)導(dǎo)入的任何所需的序列。自然，導(dǎo)入的序列在前面的步驟中，已在與pyrG相同的載體上，或在共轉(zhuǎn)化的情況中摻入。也可進(jìn)行類似的方法，其中與35kDa堿性蛋白酶基因不同的蛋白酶基因被剔除?；诒疚奶峁┑睦C和其它蛋白酶序列知識，技術(shù)人員可進(jìn)行類似的測定。根據(jù)本發(fā)明也可類似使用amdS選擇標(biāo)記。
本發(fā)明另一方面提供了呈現(xiàn)發(fā)酵特性得以改良的突變真菌。本發(fā)明特別涉及一種真菌，其包含蛋白原轉(zhuǎn)化酶或等價(jià)蛋白的活性抑制的突變體。本領(lǐng)域已知許多蛋白原轉(zhuǎn)化酶。圖1列出了一些這種蛋白的序列數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的真菌選自傘菌屬，曲霉屬，木霉屬，根霉屬，毛霉屬，Phanerochaete，栓菌屬，青霉屬，頭孢屬，鏈孢霉屬，Tolypocladium和草根霉屬。優(yōu)選的真菌是黑曲霉，臭曲霉，醬油曲霉，泡盛曲霉，米曲霉，Trichoderma reesei，Penicilliumchrysosporum，Cephalosporium acremonium，Neurospora crassa，Tolypocladium geodes和Thielavia terrestris。當(dāng)其是醬油曲霉時(shí)，一優(yōu)選的實(shí)施方案包括突變體，尤其優(yōu)選本發(fā)明上述的醬油曲霉，即包含異源核酸序列，例如與選擇標(biāo)記amdS和/或pyrG組合。
蛋白原轉(zhuǎn)化酶的一適當(dāng)?shù)葍r(jià)物是一種蛋白質(zhì)或多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO3(＝編碼黑曲霉蛋白原轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的基因片段)，SEQ ID NO4(＝編碼醬油曲霉蛋白原轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的部分基因片段)，或SEQ ID NO5-9所示任何DNA序列推斷的氨基酸序列，有40％以上，優(yōu)選45％以上的相似性或相同性。功能等價(jià)蛋白可具有在嚴(yán)格雜交條件下，能與SEQ ID NO3-9的核酸序列雜交的核酸序列。技術(shù)人員可易于確定嚴(yán)格雜交條件。嚴(yán)格雜交條件例如是在50℃，優(yōu)選56℃雜交，并最后用3×SCC沖洗。PE4，PCL1和PCL2例如是特別提及的相當(dāng)于編碼鏈的適當(dāng)寡核苷酸混合物(即SEQ ID NO10，11和12)。提及的非編碼鏈?zhǔn)荘E6，PCL2-rev，PCL3和PCL4(即分別是SEQ ID NO13，14，15和16)。在現(xiàn)有技術(shù)中的擴(kuò)增程序中使用這些引物，可提供等價(jià)序列，本發(fā)明包括這種使用和所得新發(fā)現(xiàn)的序列及其以類似本發(fā)明所述方式的應(yīng)用。產(chǎn)生寡核苷酸的序列是非常保守的，可從所提供的蛋白質(zhì)的各種氨基酸序列對比加以確定(見圖1)。本發(fā)明還包括與本專利申請中提供的蛋白質(zhì)或其相關(guān)活性部分的序列相同或呈較高相同性，相似性或同源性的任何其它核酸序列，以及將其用作引物或探針以發(fā)現(xiàn)其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶或等價(jià)蛋白編碼序列，和/或接著在這種蛋白質(zhì)編碼序列中導(dǎo)入突變的用途。例如Maniatis等，(1982)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，或其它任何關(guān)于克隆和/或篩選核酸序列的手冊所述。等價(jià)蛋白或多肽呈現(xiàn)具有SEQ ID NO3-9所示氨基酸序列的蛋白原轉(zhuǎn)化酶活性。突變真菌可在蛋白原轉(zhuǎn)化酶或等價(jià)蛋白的編碼序列中包含取代，插入或缺失。突變真菌可合適地包括在調(diào)節(jié)編碼蛋白原轉(zhuǎn)化酶或等價(jià)蛋白的基因表達(dá)中存在的突變。本發(fā)明的突變真菌在適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案中，在相同培養(yǎng)條件下與相應(yīng)未突變的真菌相比呈現(xiàn)粘度降低。本發(fā)明包括表現(xiàn)為所需導(dǎo)入的編碼蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列表達(dá)提高的上述任何實(shí)施方案中的突變真菌，所述真菌與野生型真菌相比，在相同條件下產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)或多肽。醬油曲霉蛋白原轉(zhuǎn)化酶的活性位點(diǎn)已確定在SEQID NO3和4推斷的氨基酸序列內(nèi)。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)或任何其它蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選生產(chǎn)重組肌醇六磷酸酶或任何其它異源蛋白質(zhì)或多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述任何實(shí)施方案的突變真菌。本發(fā)明還包括如從此細(xì)胞中，或在細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)或多肽后，獲得蛋白質(zhì)或多肽的方法。
本發(fā)明還包括使用所述任何新菌株轉(zhuǎn)化編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)或任何其它蛋白質(zhì)或多肽，及接著表達(dá)導(dǎo)入其中的任何核酸序列，及任選的隨后的加工和/或分泌和/或分離步驟。
可適當(dāng)使用任何肌醇六磷酸酶或類肌醇六磷酸酶或任何其它異源蛋白質(zhì)或多肽編碼序列。其可以源自真菌或非真菌。一優(yōu)選的實(shí)施方案是由酸不穩(wěn)定蛋白質(zhì)或多肽編碼序列形成的。適當(dāng)?shù)?，蛋白質(zhì)編碼序列編碼非類蛋白酶蛋白。實(shí)施例示出了一種肌醇六磷酸酶序列，和一些適用于轉(zhuǎn)化及在醬油曲霉宿主中表達(dá)的異源序列。適當(dāng)?shù)谋槐磉_(dá)的蛋白質(zhì)的其它實(shí)例對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例得以進(jìn)一步例證。實(shí)施例無任何限制本發(fā)明范圍之意。技術(shù)人員基于本發(fā)明的闡述和相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的知識，可對本發(fā)明的實(shí)施方案加以改動。文中所引用的內(nèi)容并入?yún)⒖?。?quán)利要求例證了本發(fā)明的范圍。實(shí)施例構(gòu)建醬油曲霉基因文庫醬油曲霉的基因組DNA是用先前闡述的方法從得自ATCC11906的原生質(zhì)體中分離的(Punt，van den Hondel，1992)。在分離后，用Kolar等1988所述方法從原生質(zhì)體中提取DNA。接著，將此DNA用MboI部分消化，產(chǎn)生平均大小為30-50kb的DNA片段。
用于構(gòu)建基因文庫的載體pAOpyrGcosarpl，是通過在Acc65I-BamHI消化的pHELPl(Gems等，1991)中，連接pANsCosl的3kbBamHI-HindIII片段(Osiewacs，1994)和pAO4.2的3.2kb Acc65I-HindIII片段(De Ruiter-Jacobs，1989)構(gòu)建的。此粘粒載體攜帶米曲霉pyrG選擇標(biāo)記，并在絲狀真菌中自身復(fù)制。
將MboI消化的基因組DNA與BamHI消化的pAOpyrGcosarpl連接，并將此連接混合物用Stratagene Supercosl載體試劑盒包裝入噬菌體顆粒中。獲得全部30000個(gè)克隆，代表近30倍的醬油曲霉基因組。將所得克隆的貯存液(在15％甘油中)集合貯存在-80℃直至使用。amdS轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化體用兩種通用的原生質(zhì)體方法和轉(zhuǎn)化方法對醬油曲霉菌株ATCC9362進(jìn)行測試(修改的OM方法(Yelton等，P.N.A.S.81(1984)1470-1474)和NaCl方法(Punt和Van den Hondel等，酶學(xué)方法216(1993)447-457)。這兩種方法均產(chǎn)生原生質(zhì)體，但用OM方法所得的原生質(zhì)體的存活性明顯較好。總產(chǎn)量低于用黑曲霉所得產(chǎn)量。使用OM方法，用全部醬油曲霉菌株進(jìn)行原生質(zhì)體/轉(zhuǎn)化預(yù)試驗(yàn)。
為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，組合使用載體p3SR2(攜帶amdS標(biāo)記)和pAOpyrGcosARPl。后一載體是在測試的所有曲霉物種中自主復(fù)制型曲霉載體Arpl的衍生物，當(dāng)其用作共轉(zhuǎn)化載體時(shí)，導(dǎo)致(不穩(wěn)定的)轉(zhuǎn)化體的數(shù)目明顯提高。幾乎全部的菌株均獲得足夠的原生質(zhì)體(每次轉(zhuǎn)化大約106-107)。對各種醬油曲霉菌株在適當(dāng)amdS選擇條件下分析，表明大多數(shù)菌株在通用的選擇性乙酰胺培養(yǎng)基上茁壯生長。明顯的，WO97/04108中報(bào)道的對醬油曲霉amdS轉(zhuǎn)化體提出的乙酰胺選擇條件，不適用于選擇醬油曲霉轉(zhuǎn)化體。我們的試驗(yàn)令人驚奇的證明，amdS陽性轉(zhuǎn)化體只可用丙烯酰胺選擇。即使在選擇性丙烯酰胺平板上，也觀測到來自未轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的值得重視的背景。初級轉(zhuǎn)化體要求在大約3周進(jìn)行選擇，開始選擇的推定的轉(zhuǎn)化體有一些結(jié)果是假陽性的，在移至新鮮選擇性丙烯酰胺平板上只顯示背景生長。為最佳選擇轉(zhuǎn)化體，嘗試降低此背景生長。通過從選擇性平板中除去葡萄糖可獲得改良的結(jié)果。在表3中，提供了改良的選擇培養(yǎng)基的組分和常用的培養(yǎng)基。圖2a，b和c示出在WO97/04108所述的選擇培養(yǎng)基上，和在表3所示改良的丙烯酰胺選擇培養(yǎng)基上，選擇菌株觀測的背景生長情況。
用3種選擇的醬油曲霉菌株進(jìn)行的另外的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，用NaCl方法ATCC11906和ATCC20387的原生質(zhì)體效力較好。用各種商購的原生質(zhì)體酶制品如NOVOZYM，環(huán)化酶，Glucanex等，獲得成功的原生質(zhì)體化。基于NaCl轉(zhuǎn)化方法，用amdS選擇載體p3SR2或其衍生物轉(zhuǎn)化3種選擇的醬油曲霉菌株。使用修改的丙烯酰胺選擇平板，獲得許多茁壯生長的轉(zhuǎn)化體，而在未用DNA轉(zhuǎn)化的對照組中，未觀測到生長。另一種防止未轉(zhuǎn)化的菌絲體背景生長的方法是，消除野生型醬油曲霉amdS基因的活性。這可例如通過破壞醬油曲霉基因而達(dá)到。第一步，將攜帶ATCC11906 amdS序列的特異DNA片段，用衍生自公布的米曲霉amdS序列(Gomi等，1991，基因108，91-98)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增。先前的試驗(yàn)已示出通過嚴(yán)格雜交進(jìn)行克隆不能成功，因?yàn)闃?gòu)巢曲霉和醬油曲霉amdS序列之間的低水平序列保守所致。獲得大約1.6kb的期望片段，其應(yīng)攜帶amdS基因的大部分編碼區(qū)。對克隆的PCR片段的兩個(gè)末端(圖3a和3b)進(jìn)行的序列分析證實(shí)，部分醬油曲霉amdS基因得以克隆。嚴(yán)格雜交條件是在56℃，最后用3×SSC沖洗?？寺〉男蛄蟹浅ｎ愃朴诠嫉拿浊筧mdS序列。用克隆的ATCC11906 amdS片段作探針，從在pAOpyrGcosarpl中的ATCC11906粘粒文庫中分離到一些雜交克隆(7/10000)。在亞克隆攜帶完整amdS基因的片段后，將部分amdS基因用可再使用的pyrG選擇標(biāo)記置換，產(chǎn)生amdS置換載體。將此載體轉(zhuǎn)化至醬油曲霉ATCC11906 pyrG中，產(chǎn)生pyrG陽性轉(zhuǎn)化體。接著將這些轉(zhuǎn)化體在乙酰胺和丙烯酰胺選擇平板上分析之后，一些轉(zhuǎn)化體示出背景生長降低。對少量這些菌株進(jìn)行Southern分析，表明發(fā)生期望的基因置換。隨后，將這些菌株之一使用丙烯酰胺選擇平板，用構(gòu)巢曲霉amdS基因轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一些amdS陽性轉(zhuǎn)化體。pyrG轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化體(1)初始試驗(yàn)就醬油曲霉而言，使用現(xiàn)有技術(shù)中其它真菌產(chǎn)生pyrG突變體的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，產(chǎn)生眾多的氟乳清酸(FOA)抗性菌株。然而，所有這些菌株均能在沒有尿苷的培養(yǎng)基上生長，因此不認(rèn)為是pyrG突變體。我們最終目的是分離適當(dāng)?shù)耐蛔凅w菌株，一些變動方法如下。(2)近同源基因破壞基于來自醬油曲霉和米曲霉的pyrG基因的序列非常相似(在嚴(yán)格條件下通過Southern雜交證實(shí))，進(jìn)行用突變形式的米曲霉pyrG基因破壞醬油曲霉pyrG基因的試驗(yàn)，所用方法如先前Gouka等(1996)所述。嚴(yán)格條件是在65℃，最后用0.3×SSC沖洗。構(gòu)建米曲霉pyrG破壞載體，其中攜帶部分pyrG編碼序列的0.5kb ClaI片段缺失(圖4)。來自此新載體的XbaI pyrG片段用于轉(zhuǎn)化及直接選擇FOA抗性轉(zhuǎn)化體。所得FOA抗性克隆無一需要尿苷。(3)UV誘變和過濾濃縮另一種改良特異突變體菌株產(chǎn)量的方法是使用過濾富集措施(Bos等，1986，Thesis，Wageningen農(nóng)業(yè)大學(xué))。用UV誘變的孢子接種液態(tài)基本培養(yǎng)基(MM)。在所得重復(fù)過夜培養(yǎng)物中，將在基本培養(yǎng)基中不能萌發(fā)的那些孢子(即pyrG突變孢子)，通過myracloth過濾從生長的菌絲體中分離。對經(jīng)濃縮后所得孢子測試其pyrG表型，通過將孢子接種于含有FOA的平板進(jìn)行。再一次，在含有尿苷的MM平板上富集之后所得的菌落，無一需要尿苷。(4)修改的選擇條件我們從前嘗試從醬油曲霉中分離pyrG突變體失敗提示，所需的pyrG突變體不能利用外源的尿苷，該尿苷是用于FOA選擇培養(yǎng)基中以分析尿苷的輔源營養(yǎng)。將現(xiàn)在含有尿嘧啶而非尿苷的一種修改的選擇性FOA培養(yǎng)基用于新的分離嘗試。在此方法中獲得一些需要尿嘧啶的FOA抗性突變體。對這些菌株再測試示出，其不能在補(bǔ)加尿苷的基本培養(yǎng)基上生長。接著，對一些需要尿嘧啶的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示出，這些突變體確實(shí)可用真菌pyrG基因(如載體pAB4.1；黑曲霉pyrG)互補(bǔ)。在相關(guān)的曲霉菌種(構(gòu)巢曲霉，黑曲霉，米曲霉)和各種其它真菌菌種中，空前觀測到pyrG突變體不能在只補(bǔ)加尿苷的基本培養(yǎng)基中生長。(5)可再使用的選擇標(biāo)記醬油曲霉的通用遺傳修飾要求能修飾，破壞和表達(dá)在一個(gè)真菌菌株中的一些不同基因，這需要一系列不同選擇標(biāo)記。然而，可選擇突變體(FOA選擇)又可選擇轉(zhuǎn)化體(無尿嘧啶的培養(yǎng)基)的標(biāo)記，如pyrG，提供了在隨后的試驗(yàn)中重復(fù)使用相同的標(biāo)記的可能性。為此，設(shè)計(jì)一種pyrG標(biāo)記基因，其中互補(bǔ)序列側(cè)翼為源自pyrG基因3’側(cè)翼末端的直接重復(fù)序列。所得質(zhì)粒為pAB4-1rep。此載體的構(gòu)建詳見于圖5。此載體的全部序列如SEQ ID NO17所示。用此載體轉(zhuǎn)化醬油曲霉pyrG突變體，與用pAB4-1轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的pyrG陽性轉(zhuǎn)化體數(shù)目相似。然而，接下來將選擇的pAB4-1和pAB4-1rep轉(zhuǎn)化體的孢子鋪板于FOA選擇平板上，pAB4-1rep轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生更多的FOA抗性/需要尿嘧啶菌落。對這些FOA抗性/需要尿嘧啶的克隆進(jìn)行Southern分析示出，在大多數(shù)pAB4-1rep菌株中，黑曲霉pyrG標(biāo)記基因已經(jīng)缺失，在整合基因座只剩下0.7kb的重復(fù)區(qū)域，而在pAB4-1菌株中，黑曲霉基因仍存在，并推測獲得產(chǎn)生pyrG陰性表型的突變。表達(dá)宿主菌株選擇蛋白酶產(chǎn)生醬油曲霉真菌表達(dá)系統(tǒng)的非常重要的特性是，在各種培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的真菌蛋白酶的水平和類型。有時(shí)一些易于轉(zhuǎn)化的菌株不適于作為表達(dá)宿主，因?yàn)榈鞍酌傅漠a(chǎn)生或培養(yǎng)基的酸化對表達(dá)產(chǎn)物有害。對各種醬油曲霉菌株的生長習(xí)性的分析表明，與黑曲霉相反，在瓊脂基礎(chǔ)的平板(MacConkey)或搖瓶培養(yǎng)中，不發(fā)生培養(yǎng)基酸化。事實(shí)上，在搖瓶培養(yǎng)中，不管分析的3種培養(yǎng)基類型(表4)，在大多數(shù)情況下甚至獲得堿性pH值培養(yǎng)物。基于這些結(jié)果和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，預(yù)期在醬油曲霉培養(yǎng)液中主要存在堿性蛋白酶。為分析各種菌株培養(yǎng)液的蛋白酶活性，進(jìn)行乳透明分析。另外，將培養(yǎng)基樣品用不同蛋白質(zhì)溫育(例如牛血清白蛋白(BSA))，并隨后降解這些蛋白質(zhì)，以評價(jià)測試的菌株作為一些產(chǎn)物的表達(dá)宿主的適應(yīng)性。BSA是在我們先前的試驗(yàn)中用黑曲霉選擇的。此蛋白質(zhì)示出對蛋白酶特別敏感。選擇A.terreus肌醇六磷酸酶作為另一種對蛋白酶解不穩(wěn)定蛋白。通過在生長菌落周圍形成乳透明帶所示出的乳蛋白降解，是公認(rèn)的蛋白酶活性標(biāo)準(zhǔn)。通過SDS-PAGE凝膠的Coomassie染色，檢測BSA。對肌醇六磷酸酶而言，用特異抗體進(jìn)行Western分析。如表4所示，與在醬油曲霉培養(yǎng)液中相對比，在黑曲霉培養(yǎng)液中的降解明顯不同。在黑曲霉培養(yǎng)液中(pH3-4)，BSA迅速降解。在富含醬油曲霉的培養(yǎng)液中，也發(fā)生BSA降解，但比在黑曲霉中少。在大多數(shù)醬油曲霉培養(yǎng)液中(pH7-8)，A.terreus肌醇六磷酸酶迅速降解，除ATCC 9362，ATCC11906和ATCC20387培養(yǎng)液之外。通常，在測試條件下，肌醇六磷酸酶降解最低的菌株BSA降解也低。特別的，兩種米曲霉菌株ATCC20235和ATCC46250，呈現(xiàn)比大多數(shù)醬油曲霉菌株高的蛋白酶解活性。
為排除培養(yǎng)液的pH不同導(dǎo)致的觀測結(jié)果，將培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)為pH4.5(50mM Na/HAc)，pH5.8(50mM Na/HAc)，和pH8.3(50mMTris/HCl)，進(jìn)行相似的降解試驗(yàn)。表5示出用這些樣品所得降解數(shù)據(jù)。從表中可以看出，在pH7-8具有最高蛋白酶解活性的米曲霉ATCC20235，在其它pH值也示出高蛋白酶解活性。與先前的發(fā)現(xiàn)相似，ATCC11906和ATCC20387示出低肌醇六磷酸酶降解活性。ATCC9362在豐富培養(yǎng)基中示出肌醇六磷酸酶降解。由醬油曲霉所降解的BSA與表4所示數(shù)據(jù)沒有明顯不同。
總之，這些蛋白酶分析鑒別了3種低蛋白酶醬油曲霉菌株，稱為ATCC9362，ATCC11906和ATCC20387。因此，醬油曲霉可用作許多蛋白質(zhì)的表達(dá)宿主，并比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)勢。菌株改良一旦確定醬油曲霉的潛在轉(zhuǎn)化能力和表達(dá)，考慮產(chǎn)生特性加強(qiáng)的其它菌株以進(jìn)行表達(dá)的方法。開發(fā)了可這樣使用或組合使用的兩種不同的方法，以提供新改良的菌株以表達(dá)蛋白質(zhì)。
一方面，研究產(chǎn)生蛋白酶缺陷的突變體的可能性，并確定由此對表達(dá)水平的影響。另一方面，產(chǎn)生形態(tài)改變的菌株，以改良發(fā)酵特性。為此，以下進(jìn)行一種迄今未揭示或提出的途徑，該途徑不僅可用于醬油曲霉，也可用于曲霉和一般的真菌。
產(chǎn)生蛋白酶缺陷的突變體為獲得蛋白酶缺陷的醬油曲霉菌株，使用兩種方法。第一種方法是用UV誘變來自ATCC11906和ATCC11906衍生的菌株的孢子。第二種方法是破壞主要堿性蛋白酶的基因。
UV突變體將從醬油曲霉ATCC11906或其pyrG衍生物之一中新收集的孢子，在Biorad UV室中經(jīng)UV誘變，劑量為產(chǎn)生20-50％存活性。將系列稀釋液鋪板于脫脂乳平板上(Mattern等，1992)。在5000個(gè)UV存活菌株中，獲得4個(gè)乳透明帶減少的突變菌株。
破壞alpA基因在此方法中，將克隆自ATCC11906的內(nèi)源性alpA(堿性蛋白酶)基因，用上述攜帶可再使用的pyrG選擇標(biāo)記的破壞載體進(jìn)行破壞。
構(gòu)建ATCC11906粘粒文庫(在pyrG粘粒中)。從10000個(gè)獨(dú)立粘?？寺≈?，開始發(fā)現(xiàn)4個(gè)克隆在同源條件下與醬油曲霉alpA片段雜交，醬油曲霉alpA片段是用MBL1784H和MBL1785引物通過PCR擴(kuò)增獲得的。對這4個(gè)克隆再篩選表明，只有一個(gè)克隆強(qiáng)雜交。將預(yù)期攜帶完整基因的該克隆的一個(gè)4kb EcoRI片段和一個(gè)2.5kbHindIII片段亞克隆，并通過限制酶消化和序列分析定性。基于這些亞克隆，構(gòu)建一種新的基因置換載體，如圖6所示。為轉(zhuǎn)化ATCC11906pyrG衍生物，將載體用EcoRI消化，并將8.7kb的alpA缺失片段用于轉(zhuǎn)化(見圖6)。用置換盒轉(zhuǎn)化ATCC11906pyrG5，產(chǎn)生許多乳帶減少的轉(zhuǎn)化體。對這些菌株進(jìn)行Southern分析表明成功缺失alpA基因。為接著用pyrG標(biāo)記轉(zhuǎn)化這些菌株的一種，將此菌株的孢子鋪板于含有FOA的培養(yǎng)基上，以選擇pyrG突變體。從具有經(jīng)可再使用的pyrG標(biāo)記正確整合的破壞盒的菌株中，獲得大量FOA抗性菌落。與野生型菌株的自發(fā)FOA抗性突變體中所得結(jié)果相反，得自這些破壞菌株的FOA菌株實(shí)質(zhì)上均需要尿嘧啶，并是pyrG陰性的。用Southern分析證實(shí)在alpA基因座除去了pyrG標(biāo)記基因，只剩下700bp的“足跡”。
在UV和破壞突變體中分析蛋白酶活性為分析在ATCC11906的不同低蛋白酶衍生物中蛋白酶的產(chǎn)生水平，進(jìn)行對照發(fā)酵試驗(yàn)。從所得培養(yǎng)物上清中，在各種pH值確定蛋白酶活性。缺失alpA基因在堿性pH值蛋白酶解活性明顯降低。對一種UV突變體的蛋白酶活性的分析示出，在pH6和pH8幾乎完全沒有蛋白酶解活性。因此認(rèn)為對在這些菌株中產(chǎn)生的分泌性蛋白質(zhì)的蛋白酶解水平小于在親代菌株中觀測的水平。
產(chǎn)生低粘度突變體用醬油曲霉進(jìn)行初始控制的分批或補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)生可觀的生物量產(chǎn)量，然而在發(fā)酵罐中這兩種培養(yǎng)物的粘度和孢子生成現(xiàn)象代表非有利的特性。
因此嘗試在所需的宿主中改良這些特性。各種專利申請教導(dǎo)了低粘度的突變體可通過各種篩選方法分離。WO96/02653和WO97/26330闡述了呈低粘度的非限定的突變體。然而，在此我們闡述了一種新的完全定性及充分限定的來自醬油曲霉低粘度突變體。發(fā)現(xiàn)來自這一生物體的蛋白原加工突變體具有意外的異常生長表型(高度分支)，且對蛋白質(zhì)的產(chǎn)生無不利影響。用此菌株進(jìn)行的對照發(fā)酵試驗(yàn)表明，在較低粘度值生物量濃度提高。所觀測到的特性不僅在醬油曲霉中存在，也存在于其它真菌中如黑曲霉。
(1)構(gòu)建黑曲霉蛋白原加工突變體為克隆來自黑曲霉的蛋白原轉(zhuǎn)化酶的編碼基因，用來自Saccharomyces cerevisiae KEX2，Schizosaccharomyces pombe KEX1和Xenopus laevis PC2基因的特異性探針進(jìn)行異源雜交。然而，即使在非常低的嚴(yán)格雜交條件下(47℃，用6×SSC沖洗)，也未獲得特異雜交信號，因此排除用此方法克隆相應(yīng)的黑曲霉基因。
另一種克隆來自黑曲霉的蛋白原轉(zhuǎn)化酶編碼基因的方法，是使用PCR。在對比來自各種酵母屬和高等真核細(xì)胞的各種蛋白原轉(zhuǎn)化酶基因(圖1)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)不同的PCR引物(SEQ ID NO10，13，和18-23)，這些引物分別簡并2048，49152，4，2，2，512，2048和4608倍。在用PE4和PE6引物擴(kuò)增中，獲得兩個(gè)單獨(dú)的克隆，其編碼的蛋白質(zhì)序列示出與S.cerevisiae KEX2序列(SEQ IDNO24)明顯同源。將這些克隆用于進(jìn)一步試驗(yàn)。
基于觀測到的與克隆的PCR片段的其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶基因的同源性，將相應(yīng)的黑曲霉基因稱為pclA(來自類蛋白原轉(zhuǎn)化酶)。對黑曲霉的基因組消化產(chǎn)物進(jìn)行的Southern分析表明，pclA基因是一單拷貝基因，與黑曲霉基因組的基因不密切相關(guān)，因?yàn)榧词乖趪?yán)格雜交條件下(50℃；用6×SSC沖洗)，也無明顯另外的雜交信號。對黑曲霉N401的EMBL3基因組文庫(Hartingsveldt等，1987)的第一次篩選，盡管篩選了大約10-20個(gè)基因組等價(jià)物，但未產(chǎn)生任何陽性的雜交噬斑。在第二次篩選中，從EMBL4中的黑曲霉N400基因組文庫(Goosen等，1987)中分離了pclA基因的全長基因組拷貝。在篩選5-10個(gè)基因組等價(jià)物后獲得的8個(gè)雜交噬斑中，在第一次再篩選后剩下6個(gè)。這6個(gè)克隆幾乎均攜帶pclA基因的全部拷貝，因?yàn)樵谒锌寺?觀測基因組DNA)的PCR片段中，均存在兩個(gè)3和4kb的雜交EcoRV片段(注意此PCR片段(SEQ ID NO24)含有一個(gè)EcoRV限制位點(diǎn))?；谂c其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶的大小相對比，這些片段均含有具有5’和3’側(cè)翼序列的完整的pclA基因。將這兩個(gè)EcoRV片段和一個(gè)重疊5kb EcoRI片段亞克隆以進(jìn)一步定性。攜帶pclA基因的DNA片段的詳細(xì)限制圖譜見圖7所示。
基于圖7所示的限制圖譜，在EcoRI和EcoRV亞克隆中確定pclA基因的完整DNA序列(SEQ ID NO3)。對所得序列進(jìn)行分析表明，一個(gè)開放讀框與S.cerevisiae KEX2基因和其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶的開放讀框具有公認(rèn)的相似性?；谶M(jìn)一步對比，在編碼區(qū)鑒別了兩個(gè)推定的內(nèi)含子序列(SEQ ID NO3，1838-1889位，和2132-2181位)。接著用在推定的內(nèi)含子兩側(cè)的引物，對基于pEMBLyex的黑曲霉cDNA文庫進(jìn)行PCR分析表明，只在這兩個(gè)序列的5’端有真正的內(nèi)含子。編碼的pclA蛋白的一般結(jié)構(gòu)與其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶的結(jié)構(gòu)非常相似(SEQ ID NO25和圖8)。PclA蛋白與其它蛋白原轉(zhuǎn)化酶的完全相似性為大約50％(圖1)。
為證實(shí)克隆的pclA基因是編碼功能蛋白的功能基因，嘗試構(gòu)建沒有pclA基因的菌株。因此，產(chǎn)生一種缺失pclA的載體pPCLlA，其中大部分pclA編碼區(qū)用米曲霉pyrG選擇標(biāo)記基因置換。接著，從此載體中將5kb的EcoRI插入片段用于轉(zhuǎn)化各種黑曲霉菌株。在這些轉(zhuǎn)化中(基于pyrG選擇)，獲得許多轉(zhuǎn)化體。令人感興趣的是，一部分轉(zhuǎn)化體(1-50％)表現(xiàn)非常明顯的異常表型(圖9)。對一些野生型和異常轉(zhuǎn)化體的Southern分析表明，表現(xiàn)嚴(yán)重限制生長表型的這些異常轉(zhuǎn)化體缺失pclA基因。野生型生長的所有菌株示出攜帶一個(gè)置換片段的拷貝，該片段整合至野生型pclA基因的附近或在非同源位置。
對選擇的攜帶各種葡糖淀粉酶融合基因的pclA突變體菌株產(chǎn)生蛋白質(zhì)的分析表明，產(chǎn)生未加工的融合蛋白。在pclA突變體中可高水平產(chǎn)生未加工的葡糖淀粉酶-白細(xì)胞介素-6融合蛋白。蛋白質(zhì)分析表明，在pclA突變體菌株中也形成完全加工的內(nèi)源葡糖淀粉酶，但只是葡糖淀粉酶原。
為進(jìn)一步改良融合蛋白的產(chǎn)量，進(jìn)行對照組和補(bǔ)料分批發(fā)酵。令人驚奇的，pclA突變菌株的發(fā)酵特性明顯超過親代菌株，產(chǎn)生更低的粘度/生物量比值，而生產(chǎn)力不降低。
(2)構(gòu)建醬油曲霉蛋白原加工突變體為構(gòu)建相應(yīng)的醬油曲霉突變體，從ATCC11906粘粒文庫中分離黑曲霉基因組粘?？寺〉牡驼扯韧蛔凅w的功能補(bǔ)體，其包含醬油曲霉蛋白原加工蛋白酶pclA基因。對分離的SEQ ID NO4序列進(jìn)行的部分序列分析證實(shí)，醬油曲霉pclA基因克隆。圖10示出部分醬油曲霉和黑曲霉pclA基因的DNA序列對比?；卺u油曲霉序列和醬油曲霉pclA基因編碼區(qū)的部分限制圖譜，用醬油曲霉pclA基因中的EcoRV位點(diǎn)產(chǎn)生置換載體，以克隆在SmaI片段內(nèi)的可再使用的pyrG標(biāo)記(圖11)。將所得載體用ClaI部分消化，獲得10.5kb的δ-pcl片段(見圖11)。分離此片段，以用于轉(zhuǎn)化醬油曲霉pyrG菌株。此基因置換載體用于在ATCC11906和ATCC11906衍生物中產(chǎn)生pclA突變體。所得菌株用于表達(dá)同源和異源蛋白質(zhì)。用一些所得轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的對照發(fā)酵試驗(yàn)表明，發(fā)酵特性改良，尤其培養(yǎng)物粘度/生物量比值較低。(3)克隆與曲霉pclA同源的真菌基因在將黑曲霉和醬油曲霉pclA基因的氨基酸序列與其它蛋白原加工酶的氨基酸序列進(jìn)行對比的基礎(chǔ)上(圖1)，設(shè)計(jì)一些相當(dāng)于良好保守的序列的編碼或非編碼鏈的寡核苷酸混合物(SEQ ID NO10-16)。
將這些寡核苷酸混合物用來自Trichoderma reesei QM9414，F(xiàn)usarium venenatum ATCC20334，Penicillium chrysogenum P2，Trametes versicolor，Rhizopus oryzae ATCC200076，和Agaricusbisporus HORST的染色體DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增。根據(jù)所用的模板DNA，對一或多個(gè)編碼和非編碼鏈寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增(30次循環(huán)；1分鐘94℃；1分鐘40℃；2分鐘68℃)，產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物。表6示出了各種擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。對用兩種寡核苷酸混合物之一擴(kuò)增所得的一些PCR片段進(jìn)行序列分析。這些分析從不同的真菌中鑒別了各種pclA同源物。圖12示出了相應(yīng)的各種DNA片段的氨基酸序列(SEQ ID NO5-9)。
(4)生物量和粘度測定實(shí)施例以下運(yùn)用的參數(shù)范圍已經(jīng)用許多不同真菌菌株發(fā)酵確定。粘度粘度是在Haake Viscotester VT500上，用傳感器系統(tǒng)MV DIN(管數(shù)7)，在20℃操作確定的。在測定細(xì)胞中，獲得發(fā)酵肉湯的新鮮樣品，并將40ml肉湯置于測定細(xì)胞中。在設(shè)定軸速度短時(shí)(4分鐘)平衡后，測定粘度。在10種不同的軸速度重復(fù)此測定。用測定細(xì)胞因子的多個(gè)軸速度產(chǎn)生剪切速率。用剪切速率γ(l/s)繪制粘度η(厘泊cP)圖，并提供發(fā)酵肉湯的粘度分布圖。
利用以上方法，使用特異的真菌有機(jī)體確定發(fā)酵粘度范圍(表7)。生物量通過以下方法確定生物量將5.5cm的濾紙(Whatman 54)在鋁稱重盤上預(yù)稱重。在Buchner漏斗上用5.5cm濾紙過濾25.0ml完全肉湯，用25.0ml去離子水沖洗濾紙上塊狀物，將沖洗的塊狀物和濾物置于稱重盤中，在60℃干燥過夜。最后在100℃干燥1小時(shí)，然后置于干燥器中冷卻。測定干燥物的重量?？偵锪?g/l)等于(初始重量-最終重量)×40。蛋白質(zhì)使用BioRad分析程序確定蛋白質(zhì)水平。上述數(shù)據(jù)代表在發(fā)酵進(jìn)行直至發(fā)酵結(jié)束的48小時(shí)內(nèi)的測定值；所有曲霉和木霉值均是對于商業(yè)相關(guān)真菌有機(jī)體的，并反應(yīng)真實(shí)商業(yè)數(shù)據(jù)。
真菌菌株如醬油曲霉lfvA和醬油曲霉pclA具有低粘度的優(yōu)點(diǎn)，可在發(fā)酵中使用較低能量輸入和/或剪切，以符合在那些情況中的氧需求，所述情況是由于對產(chǎn)物分子的物理破壞，對產(chǎn)物的剪切力對生產(chǎn)力不利的情況。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)力高而生物量較低表示一種在發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物中更有效的有機(jī)體。因此醬油曲霉突變體提供了較好的生物量和粘度數(shù)據(jù)，同時(shí)還釋放至少如此多的蛋白質(zhì)，事實(shí)上除了商業(yè)使用的這兩種系統(tǒng)外，有許多更好的蛋白質(zhì)典型保藏曲霉或Trichoderma reesei菌株。
由醬油曲霉產(chǎn)生的高蛋白質(zhì)產(chǎn)量低生物量濃度，如果提供生物量導(dǎo)致生產(chǎn)力提高，可研制更高提高生物量的發(fā)酵條件，以在達(dá)到限定發(fā)酵條件之前生產(chǎn)所需的產(chǎn)物。由木霉longibrachiatum和黑曲霉有機(jī)體產(chǎn)生的現(xiàn)有高水平生物量和粘度限制生物量提高，因?yàn)楝F(xiàn)有水平的生物量和粘度接近限定的實(shí)際發(fā)酵條件。效應(yīng)基因表達(dá)(1)異源調(diào)節(jié)序列將3種選擇的醬油曲霉菌株用攜帶不同真菌表達(dá)信號的3種GUS報(bào)道載體(構(gòu)巢曲霉PgpdA；pGUS54，黑曲霉PglaA；pGUS64，黑曲霉PbipA；pBIPGUS)，和amdS選擇載體p3SR2或其衍生物共轉(zhuǎn)化。在代表性轉(zhuǎn)化體中分析GUS基因的表達(dá)(表8)。結(jié)果表明在測試條件下，gpdA啟動子是最好的啟動子，產(chǎn)生大約5000UGUS/mg蛋白質(zhì)。這相當(dāng)于細(xì)胞蛋白總量的大約5％。bipA啟動子產(chǎn)生大約30％的gpdA活性，這相當(dāng)于在黑曲霉中獲得的數(shù)據(jù)。令人驚奇的，在黑曲霉中非常有活性的(至少如gpdA活性)的glaA啟動子，在醬油曲霉中產(chǎn)生少于1％的gpdA活性。(2)醬油曲霉調(diào)節(jié)序列我們還分離了醬油曲霉同源啟動子并確定了在表達(dá)系統(tǒng)中的可應(yīng)用性。在一些表達(dá)情況中，優(yōu)選使用同源啟動子而不用異源啟動子。確定同源啟動子是否比異源啟動子更有效也是令人感興趣的。
用基于得自米曲霉的序列(SEQ ID NO26-31)的引物，對3個(gè)有效表達(dá)的醬油曲霉基因進(jìn)行PCR克隆，這三個(gè)基因稱為alpA(堿性蛋白酶；可誘導(dǎo)型)，amyA(淀粉酶；可誘導(dǎo)型)，和gpdA(甘油醛-3-磷酸脫氫酶；組成型)。圖13a，b和c示出了本方法中使用的各種PCR引物的序列和在公布的米曲霉序列中的位置。來自醬油曲霉ATCC11906的基因組模板DNA用于PCR擴(kuò)增。初始PCR(30次循環(huán)；1分鐘94℃；1分鐘40℃；2分鐘68℃)產(chǎn)生期望大小的(400bp)的gpdA的特異PCR產(chǎn)物。在另兩個(gè)PCR反應(yīng)中，未獲得產(chǎn)物。因此，對alpA所進(jìn)行的PCR條件較低(10次循環(huán)；1分鐘94℃；1分鐘25℃；2分鐘68℃加上20次循環(huán)；1分鐘94℃；1分鐘40℃；2分鐘68℃)，這樣產(chǎn)生大約1000bp的特異alpAPCR產(chǎn)物。
測定克隆的基因的完整序列。如圖14所示，醬油曲霉ATCC11906 gpdA啟動子區(qū)域，與其它gpdA啟動子序列有非常高的同源性，且alpA啟動子明顯與米曲霉alpA啟動子相同(SEQ ID NO32和33)。異源蛋白產(chǎn)生對一些異源蛋白質(zhì)進(jìn)行測試，這些蛋白質(zhì)已知對酸性蛋白酶解敏感，并因此在其它熟知的表達(dá)系統(tǒng)中不能有效表達(dá)。對在另外的系統(tǒng)中有效表達(dá)的蛋白質(zhì)也進(jìn)行測試，通過對比用醬油曲霉與用其它已知的表達(dá)系統(tǒng)如黑曲霉所得的表達(dá)水平加以評價(jià)。肌醇六磷酸酶產(chǎn)生將攜帶各種真菌肌醇六磷酸酶(Wyss等，(1999)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)65，359-366)的DNA片段，在pAN52-1NotI中，與在構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子的ATG密碼子-3’平端片段下游導(dǎo)入的5’NcoI或BspHI位點(diǎn)連接。將所得載體用于使用amdS和/或pyrG選擇標(biāo)記共轉(zhuǎn)化醬油曲霉試驗(yàn)。用所述肌醇六磷酸酶平板分析篩選產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化體。
用多拷貝粘粒方法產(chǎn)生進(jìn)一步改良的肌醇六磷酸酶表達(dá)載體。在此方法中，將肌醇六磷酸酶表達(dá)盒的一些拷貝再克隆至多克隆位點(diǎn)載體中(pMTL系列，Chambers等，(1988)基因68，139-149)，以使其分離為EcoRI片段。將這些EcoRI片段的一些拷貝通過包裝克隆入粘粒載體pAN4cos1中(Verdoses等，(1993)轉(zhuǎn)基因研究2，84-92)，產(chǎn)生攜帶一些表達(dá)盒的粘粒克隆。將所得克隆用amdS選擇標(biāo)記導(dǎo)入醬油曲霉中。用肌醇六磷酸酶平板分析篩選amdS陽性克隆以生產(chǎn)肌醇六磷酸酶。
用GLA融合方法(如Broekhuijsen等，(1993)生物技術(shù)雜志31，135-145)，產(chǎn)生進(jìn)一步的肌醇六磷酸酶表達(dá)載體。結(jié)果，編碼成熟曲霉fumigatus肌醇六磷酸酶蛋白的肌醇六磷酸酶基因片段，用常規(guī)限制位點(diǎn)和融合PCR，在載體pAN56-1中與葡糖淀粉酶載體基因(基因庫登記號No Z32700)的3’末端融合。在基因融合體的葡糖淀粉酶與肌醇六磷酸酶之間，導(dǎo)入編碼蛋白原加工位點(diǎn)的序列(Asn-Val-Ile-Ser-Lys-Arg)。將所得載體用于使用amdS和或pyrG選擇標(biāo)記共轉(zhuǎn)化醬油曲霉的試驗(yàn)中。使用所述的肌醇六磷酸酶平板分析篩選產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化體。
進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生明顯活性水平的肌醇六磷酸酶。此產(chǎn)量明顯高于那些報(bào)道的(Hartingsveldt等，(1993)基因127，87-94；VanGorcom等，(1991)EP 420358)用黑曲霉進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果。用多拷貝粘粒載體所得水平平均高于用單拷貝載體所得水平。用葡糖淀粉酶-肌醇六磷酸酶融合載體所得肌醇六磷酸酶水平產(chǎn)生高水平的葡糖淀粉酶和肌醇六磷酸酶。用一些選擇的產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的醬油曲霉轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的對照組和補(bǔ)料分批發(fā)酵表明，肌醇六磷酸酶水平進(jìn)一步提高。葡糖淀粉酶產(chǎn)生一種有效生產(chǎn)的真菌蛋白例如是由黑曲霉glaA基因報(bào)道的。載體pGLA6S(圖15)衍生自pGLA6(Punt等，(1991)生物技術(shù)雜志17，19-334)，是通過將一個(gè)攜帶作為選擇標(biāo)記的構(gòu)巢曲霉amdS基因的5kb的EcoRI片段導(dǎo)入pGLA6的唯一EcoRI位點(diǎn)中產(chǎn)生的。將攜帶amdS選擇標(biāo)記和在構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子控制下的葡糖淀粉酶基因的載體pGLA6S(圖15)，導(dǎo)入醬油曲霉ATCC11906pyrG中，用載體pAB4.1共轉(zhuǎn)化。淀粉平板分析表明，在這些轉(zhuǎn)化體中淀粉酶解活性提高。在所得轉(zhuǎn)化體中，對在丙烯酰胺培養(yǎng)基上茁壯生長的轉(zhuǎn)化體分析葡糖淀粉酶產(chǎn)生情況。在一些這種轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清中，經(jīng)Coomassie Briljant Blue染色的SDS-PAGE凝膠上，觀測到相當(dāng)于葡糖淀粉酶的一個(gè)單獨(dú)的顯性蛋白條帶。使用抗葡糖淀粉酶的單克隆抗體(Verdoes等，(1993)轉(zhuǎn)基因研究2，84-92)的Western分析，證實(shí)此蛋白質(zhì)條帶的相同性。白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6是一種對蛋白酶解降解高度敏感的蛋白質(zhì)，在黑曲霉中不用gla融合策略和蛋白酶缺陷菌株不會產(chǎn)生。即使用所有這些改良措施，在每升培養(yǎng)液中也只產(chǎn)生幾毫克的IL-6。將IL-6載體pAN56-4(Broekhuijsen等，(1993)，生物技術(shù)雜志31，134-145)導(dǎo)入醬油曲霉中，通過用pyrG或amdS標(biāo)記共轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生表達(dá)在此載體中的IL-6融合基因的轉(zhuǎn)化體。從這些轉(zhuǎn)化體中選擇幾個(gè)進(jìn)一步分析。用這些轉(zhuǎn)化體進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。對這些菌株的培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western分析，令人驚奇的示出正確加工的IL-6水平高于在黑曲霉中報(bào)道的最佳水平。使用醬油曲霉的各種類型的蛋白酶缺陷和最佳發(fā)酵的突變體，進(jìn)一步提高得自對照發(fā)酵試驗(yàn)的IL-6生產(chǎn)水平(Broekhuijsen等，(1993)，生物技術(shù)雜志31，134-145)。綠色熒光蛋白(GFP)我們在醬油曲霉中嘗試產(chǎn)生的另一種酸性不穩(wěn)定型蛋白是GFP，其來自海蜇Aequoria victoria。此蛋白不僅對蛋白酶解敏感，且在酸性pH喪失活性。將攜帶GFP或GLA-GFP融合基因(在構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子驅(qū)動下)的載體，導(dǎo)入醬油曲霉中，用pyrG或amdS選擇標(biāo)記共轉(zhuǎn)化。這兩種載體的醬油曲霉轉(zhuǎn)化體均產(chǎn)生明亮的熒光表達(dá)。基于觀測到的熒光和隨后進(jìn)行的培養(yǎng)上清分析(培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE和Western分析選擇的搖瓶培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體獲得的)，確定完整的胞質(zhì)GFP和分泌的GLA-GFP的產(chǎn)量均高于在黑曲霉蛋白酶缺陷宿主中所得結(jié)果(Siedenberg等，生物技術(shù)Prog.(1999)15，43-50；Gordon等，微生物學(xué)(2000)146，415-426)。與在黑曲霉培養(yǎng)上清中的情況相反，分泌的GFP也示出明顯的熒光。


圖1該圖對比了來自X.laevis(XENPC2和XNFURIN)，S.cerevisiae(SCKEX2)，K.lactis(KLKEX1)，C.albicans(CAKEX2)，S.pombe(SPKRP)，和Y.lipolytica(YLKEX2)的類KEX2加工蛋白酶的氨基酸序列。編碼具有最高整體相同性的氨基酸序列(用淡藍(lán)色框表示)的引物是MBL793，MBL1208，MBL794，MBL1158，PE6，PCL1，PCL2(rev)，PE6，PCL3，MBL789，PCL4和MBL1219。整體相同的區(qū)域(7個(gè)中有4個(gè))用紫色框表示。缺口用·表示；無序列數(shù)據(jù)用～表示；*表示蛋白質(zhì)的終止密碼子。
圖2由2a，2b和2c組成圖2a示出專利申請WO97/04108所述醬油曲霉菌株在33℃溫育5天后的背景生長情況。上圖表示在非選擇培養(yǎng)基上的生長。左下圖示出WO97/04108的選擇培養(yǎng)基，右下圖示出用本發(fā)明改良的培養(yǎng)基(丙烯酰胺)所得結(jié)果。
圖2b示出醬油曲霉菌株ATCC11906在33℃溫育5天后的背景生長情況。上圖表示在非選擇培養(yǎng)基上的生長。左下圖示出WO97/04108的選擇培養(yǎng)基，右下圖示出用本發(fā)明改良的培養(yǎng)基(丙烯酰胺)所得結(jié)果。
圖2c示出醬油曲霉菌株ATCC20387在33℃溫育5天后的背景生長情況。上圖表示在非選擇培養(yǎng)基上的生長。左下圖示出WO97/04108的選擇培養(yǎng)基，右下圖示出用本發(fā)明改良的培養(yǎng)基(丙烯酰胺)所得結(jié)果。
圖3(a和b)此圖對比了醬油曲霉ATCC11906和米曲霉amdS序列的兩個(gè)末端。A和B表示兩個(gè)末端。使用克隆的1.6kb的醬油曲霉序列。下劃線的黑體堿基在菌種/菌株之間不同。
圖4(a和b)此圖例證了通過pAO4-13和pAO4-13δCla構(gòu)建pyrG破壞載體。
圖5此圖例證了通過分離XhoI和HindIII片段，隨后克隆入pMTL24中，從pAB4-1中構(gòu)建pAB4-1rep的過程。
圖6此圖示出構(gòu)建alpA基因置換載體的過程。以3片段連接將來自具有ATCC11906基因組片段的pAS1-1的一個(gè)4.4kb的EcoRI-StuI片段，來自pAB4-1rep的一個(gè)2.6kb的SmaI-NcoI片段，和來自pAS1-2A的一個(gè)4.4kb的NcoI-EcoRI片段連接，產(chǎn)生pAS1-δalp。
圖7此圖示出攜帶黑曲霉pclA基因的DNA片段的限制圖譜。
圖8此圖示出黑曲霉pclA基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(功能性結(jié)構(gòu))。從左至右示出前蛋白(pre)結(jié)構(gòu)域，蛋白原(pro)結(jié)構(gòu)域，活性域和P結(jié)構(gòu)域。淺色三角形表示KR位點(diǎn)。黑色三角形表示糖基化位點(diǎn)。豎紋淺色框是S/P/T富集區(qū)。在右側(cè)的暗色框是D/E富集區(qū)。
圖9此圖例證了黑曲霉pclA突變體菌株的生長表型。
圖10此圖提供了醬油曲霉和黑曲霉pclA基因之間的DNA序列對比。垂直條代表相同性；表示5；·表示1；發(fā)現(xiàn)72.139％相似性和72.073％相同性。
圖11此圖示出構(gòu)建pclA基因置換載體的過程。將是ATCC11906基因組片段的一個(gè)7.6kb的ClaI片段克隆入pMTL23p中。在此構(gòu)建體中，將來自pAB4-1rep的一個(gè)2.6kb的SmaI片段克隆入EcoRV位點(diǎn)中，產(chǎn)生pAS2-δpcl。
圖12此圖示出各種pclA同源物的氨基酸序列對比，這些同源物來自S.cerevisiae(Sckex2)，K.lactis(Klkex1)，醬油曲霉(Aspcla)，黑曲霉(A.niger)，P.chrysogenum(Penpcl1)，A.bisporus(Agarmbl129)，T.reesei(Trichpcl1)，R.oryzae(Rhizpcl1)，F(xiàn).venenatum(Fuspcl1)，S.pombe(Spkrp)，C.albicans(Cakex2)，和Y.lipolytica(Ylkex2)。整體相同的區(qū)域(12個(gè)中由8個(gè))用黃色框表示。缺口用·表示；無序列數(shù)據(jù)用～表示。
圖13圖13a示出米曲霉alpA啟動子序列(Q11755)。指出了進(jìn)行PCR克隆的引物位置。在圖13b中，示出米曲霉amyA啟動子序列(A02532)，也包括引物位置。圖13c示出ATCC42149米曲霉衍生的gpdA啟動子序列(EP0.436.858 al)，也包括引物位置。
圖14此圖示出曲霉的各種gpdA啟動子序列對比，從上至下為醬油曲霉ATCC11906，米曲霉，黑曲霉和構(gòu)巢曲霉。*表示啟動子5’未翻譯區(qū)中推定的內(nèi)含子?！硎綜T富集區(qū)域。黑體下劃線字母表示米曲霉和醬油曲霉序列之間的不同。
圖15此圖示出12700bp的載體pGLA6S的圖譜。
表1.曲霉屬的分類圖解(Samson，1992)屬亞屬 組 所選菌種a“亞種”b曲霉屬Circumdati 文氏文氏曲霉(葡糖苷酶)Flavi/Tamarii 米曲霉(淀粉酶，蛋白酶)塔木里曲霉tox醬油曲霉(發(fā)酵食品，蛋白酶)寄生曲霉tox黃曲霉toxNigri 黑曲霉-------------------------→A.pulverulentes(發(fā)酵食品， 海棗曲霉各種蛋白質(zhì)， 泡盛曲霉有機(jī)酸) 臭曲霉川地曲霉宇佐美氏曲霉無花果曲霉日本曲霉 -----------------→棘孢曲霉(內(nèi)切葡聚糖酶) (葡糖苷酶，半乳聚糖酶)橢圓曲霉塔賓曲霉-----------------------→＂黑曲霉＂Circumdati 赭色曲霉tox(xulanase)洋蔥曲霉toxCandidi 白色曲霉(脂酶，葡糖苷酶)Cremei 分解烏頭酸曲霉(有機(jī)酸)Sparsi 稀疏曲霉曲霉屬曲霉亞屬 曲霉組 灰綠曲霉(發(fā)酵食品)Restricti 局限曲霉toxFumigati Fumigati煙曲霉toxCerviniOrnatiClavatiClavati 巨大曲霉toxNidulantes Nidulantes 構(gòu)巢曲霉toxVersicolores薩氏曲霉(脂酶)UstiTerrei 土曲霉tox(葡聚糖酶)Flavipedesa對于本表所選的菌種，除了塔木里曲霉、稀疏曲霉和橢圓曲霉外，均描述了蛋白質(zhì)/有機(jī)酸/發(fā)酵食品的產(chǎn)生(以括號示出)和/或DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序(以下劃線示出)。已記錄有毒素產(chǎn)生的菌種以tox標(biāo)出。b基于各種方法，所列名字可被認(rèn)為與給出的菌種名同義。表2不同ATCC菌株的分類

注ND＝未確定1)參考文獻(xiàn)Ushijima S，Hayashi K and Murakami H(1982)醬油發(fā)酵中所用醬油曲霉的當(dāng)前分類地位。Agric.Biol.Chem.，462365-2367，1981.2)參考文獻(xiàn)Yuan GF，Liu CS and Chen CC(1995)通過多態(tài)DNA隨機(jī)擴(kuò)增區(qū)分寄生曲霉和醬油曲霉.Appl.Environm.Microbiol.，612384-2387.3)參考文獻(xiàn)Chang PK，Bhatnagar D，Cleveland TE and Bennett JW(1995)黃曲霉毒素途徑基因aflR同系物中的序列可變性區(qū)分曲霉屬黃曲霉組的菌種Appl.Environm.Microbiol.，6140-43.4)基于此表數(shù)據(jù)由TNO得出的分類總結(jié)5)此菌株以米曲霉保藏在ATCC，但是隨后根據(jù)Yuan et al.19952)和Chang et al.19953)重新分類為醬油曲霉6)此菌株以寄生曲霉保藏在ATCC但是隨后根據(jù)Ushijima et al，19811)和Yuan etal，19952)重新分類為醬油曲霉7)參考文獻(xiàn)ATCC目錄8)參考文獻(xiàn)Liu BH，Chu FS(1998)Appl.Env.Microbiol.，643718-3723.表3.選擇培養(yǎng)基的組成

1)礦物溶液CuSO4.5H2O 0.16g/lFeSO4.7H2O 0.5g/lZnSO4.7H2O 2.2g/lMnCl2.4H2O 0.5g/lCoCl2.6H2O 0.17g/lNa2MoO4.2H2O 0.15g/lH3BO31.1g/lEDTA 5g/l表4.不同培養(yǎng)基中的蛋白酶活性

注+在4小時(shí)保溫后蛋白質(zhì)(部分)降解，有大的乳透明圈-在4小時(shí)保溫后無蛋白質(zhì)降解，有小的乳透明圈/無乳透明圈在30℃保溫27ul培養(yǎng)基樣品2.5ulBSA(25mg/ml)0.5ul肌醇六磷酸酶(A.terreus，3-4g/l)在從培養(yǎng)物取培養(yǎng)基樣品后加入BSA和肌醇六磷酸酶，這一樣品在30℃保溫并在一定時(shí)間后分析樣品中BSA和肌醇六磷酸酶的降解。表5.在不同pH下的蛋白酶活性

注+在4小時(shí)保溫后蛋白質(zhì)(部分)降解-在4小時(shí)保溫后無蛋白質(zhì)降解在30℃保溫25ul培養(yǎng)基樣品50mMNaAc pH＝4.22ul緩沖液 →50mM NaAc pH＝5.850mM Tris/HCI pH＝8.32.5ul BSA(25mg/ml)0.5ul肌醇六磷酸酶(A.terreus，3-4g/l)在從培養(yǎng)物取培養(yǎng)基樣品后加入BSA、肌醇六磷酸酶和緩沖液，這一樣品在30℃保溫并在一定時(shí)間后分析樣品中BSA和肌醇六磷酸酶的降解。表6.克隆真菌pclA基因的PCR結(jié)果


注+特異PCR產(chǎn)物-非特異或無PCR產(chǎn)物+該P(yáng)CR產(chǎn)物用于測序表7各種醬油曲霉菌株的粘度

表8.醬油曲霉轉(zhuǎn)化子中的啟動子強(qiáng)度

序列表SEQ ID No.1MBL17845′-CGGAATTCGAGCGCAACTACAAGATCAA-3′SEQ ID No.2MBL17855′-CGGAATTCAGCCCAGTTGAAGCCGTC-3′SEQ ID No.3編碼的黑曲霉蛋白原轉(zhuǎn)化酶基因的序列起始密碼子和終止密碼子以粗體下劃線字母表示。內(nèi)含子以下劃線小寫字母表示1 CCATGGCAAG CCTCCTACTT GGCCTGATTA CATCGTCCTG AGAGAGAGAG51 TTCACCAAAA CTCTCCCCCA AACGATGCGT CTTACAGGTG GTGTCGCTGC101 GGCTCTGGGC CTCTGCGCTG CTGCCTCCGC TTCTCTCCAT CCCCATCGTT151 CCTACGAGAC CCATGATTAC TTCGCTCTAC ACCTTGATGA ATCCACCTCG201 CCGGCCGACG TCGCCCAACG ACTAGGTGCT CGCCACGAAG GCCCCGTCGG251 AGAATTACCC TCACATCATA CCTTCTCGAT ACCCCGTGAA AACAGTGACG301 ATGTCCATGC GCTGCTGGAT CAATTGCGCG ATCGTCGGAG GTTACGCCGC351 CGCTCCGGAG ATGACGCCGC TGTCCTTCCC TCCTTGGTCG GGCGAGACGA401 AGGTCTAGGT GGCATTCTTT GGTCCGAGAA GCTGGCTCCC CAGAGAAAGC451 TCCATAAAAG AGTGCCGCCG ACAGGATATG CTGCCAGATC GCCCGTCAAC501 ACTCAGAATG ACCCCCAAGC GCTTGCGGCG CAGAAACGCA TTGCCTCGGA551 ATTGGGCATC GCGGACCCCA TCTTCGGCGA ACAATGGCAT TTGTATAATA601 CTGTTCAGTT GGGCCATGAT CTTAACGTGA CGGGTATCTG GCTGGAGGGC651 GTTACAGGGC AGGGTGTCAC GACGGCCATT GTCGATGACG GTTTGGACAT701 GTACAGCAAC GATCTTAGGC CGAACTATTT TGCGGCGGGT TCTTATGACT751 ATAACGACAA AGTACCAGAG CCGAGGCCGC GCTTGAGCGA TGACCGCCAC801 GGTACTAGAT GCGCGGGTGA AATCGGTGCG GCGAAGAACG ACGTGTGCGG851 GGTTGGTGTT GCGTATGATA GTCGCATCGC TGGTATTCGG ATTCTCTCCG901 CACCCATCGA TGACACTGAT GAGGCTGCGG CTATTAACTA CGCCTATCAG951 GAGAACGATA TCTACTCGTG TTCCTGGGGT CCCTATGATG ATGGCGCCAC1001 AATGGAAGCC CCGGGCACTC TGATCAAGCG GGCCATGGTC AATGGTATCC1051 AAAATGGTCG AGGTGGAAAA GGCTCGGTTT TTGTATTTGC GGCTGGTAAC1101 GGTGCCATTC ATGACGATAA CTGTAACTTT GACGGTTACA CCAACAGTAT1151 CTACAGCATC ACGGTGGGTG CCATTGATCG GGAGGGTAAC CATCCTCCGT1201 ATTCGGAATC CTGCTCGGCG CAACTGGTGG TTGCCTACAG CAGCGGCGCC1251 AGTGATGCAA TTCATACCAC GGACGTCGGC ACAGACAAGT GCTCGACTAC1301 CCATGGTGGA ACTTCGGCGG CCGGCCCGCT CGCTGCGGGA ACCGTGGCGC1351 TGGCCCTCAG TGTGCGGCCG GAACTCACCT GGCGTGACGT TCAGTATTTG1401 ATGATTGAGG CGGCAGTGCC TGTTCATGAA GATGATGGAA GCTGGCAGGA1451 CACTAAGAAC GGGAAGAAGT TCAGCCATGA CTGGGGATAT GGTAAGGTCG1501 ACACATATAC GCTGGTGAAA CGGGCAGAGA CCTGGGATCT GGTGAAGCCT1551 CAAGCCTGGC TCCATTCCCC CTGGCAGCGG GTTGAGCATG AGATCCCACA1601 GGGCGAGCAG GGCTTGGCTA GTTCGTACGA GGTGACGGAG GATATGTTGA1651 AGGGAGCCAA CCTGGAACGG CTGGAGCATG TCACGGTCAC CATGAATGTT1701 AACCACACCC GCCGAGGCGA TCTCAGCGTG GAGTTACGGA GCCCTGATGG1751 TCGGGTCAGT CACCTCAGTA CGCCCCGGCG GCCAGATAAT CAAGAGGTGG1801 GCTATGTTGA TTGGACCTTC ATGAGCGTTG CTCACTGgtaagtaaaaact1851ttttctcggttgtcggttcttctgctaatacatatctagG GGCGAGTCCG1901 GGATTGGCAA ATGGACTGTG ATTGTCAAGG ACACCAATGT CAACGAGCAT1951 ACTGGGCAAT TCATCGATTG GCGACTCAAC TTGTGGGGCG AGGCGATTGA2001 CGGAGCCGAG CAGCCTCTCC ACCCCATGCC TACTGAACAC GATGACGACC2051 ACAGCTATGA GGAAGGAAAC GTGGCTACCA CGAGCATCAG CGCCGTTCCC2101 ACGAAAACCG AGCTGCCTGA CAAGCCCACT GGTGCGTTG ATCGCCCGGT2151 GAACGTTAAG CCTACAACAT CCGCGATGCC GACCGGTAGT CTTACAGAGC2201 CCATCGATGA TGAAGAACTC CAGAAGACCC CTAGTACAGA GGCAAGCTCA2251 ACACCAAGTC CTTCTCCGAC CACCGCGTCA GATAGTATCC TGCCTTCCTT2301 CTTCCCCACG TTCGGTGCGT CGAAGCGGAC CGAAGTTTGG ATCTACGCTG2351 CGATCGGCTC CATCATTGTG TTCTGCATTG GCCTGGGCGT CTACTTCCAT2401 GTGCAGCGCC GCAAACGTAT TCGCGACGAC AGCCGGGATG ACTACGATTT2451 CGAGATGATC GAGGACGAGG ATGAGCTACA GGCAATGAAC GGACGGTCGA2501 ACCGTTCACG TCGCCGGGGT GGCGAGCTGT ACAATGCTTT TGCGGGCGAG2551 AGCGATGAGG AACCATTATT CAGTGATGAG GATGATGAAC CGTATCGGGA2601 TCGGGGGATC AGCGGCGAAC AAGAACGGGA GGGCGCAGAT GGAGAGCATT2651 CTCGGAGATGAAAGTGCAGT AGATGAGGGT TGACTTTATT TCGGACAGTG2701 TTTCTAACTT GTTGGATGAC CTGCGTTGAA CAATATTTCT GCTGTGTATG2751 CTGCATAGAG AAGCGTGTAT ATACCATGTA TGTGTGCATC ATCGTGATCG2801 GGTTTATCAT TCTTCATCTG CCATGGTTTG TGATCTCCGG AATAGTACCA2851 AAGGAACACT AAATTAAGGG TCTTGGCGAT GACGCTTCCC GTCGCTGCTT2901 TTGACTTCCT CCGCATCTCG TCTCTCCTGC TGTTGACCGC GCGCCAACCA2951 ACCTCCATCT CCTCACTCCT CCCACCTTAA TCTTGCTGTG CTGCTTCTAG3001 AACCCCCCAG TTTAATTTAA AAACCGGCTT TTCCTAGCTC CACGTATTGT3051 ACCTCGCACT GATCCCCATC TCCGCCCACT CCAACGCTAC CGACCCAGGC3101 TTCTCTGGCG GCTCCAGGCG GCAGGCAATC AAACCAACCC CTCGATGGAT3151 CAGCACGACG ACTTCGACAG SGTCTCGTGG AGGCATGACC CGGACAGCGA3201 TCTCTCGCGA CCCACGAACT CCGGAACAGA CACAGAGGAA CAGGCGCCAT3251 ACACTCACGA TGTCAATGGC AAACGGAGGA TGAGCAACCG CTCAAGAAAG3301 CCCTCAGGCT GGACCACTGG CGGATGCCGT CGACCTGGCG GGCATCGCGA3351 CGGCGTACTA GAGTGTCGGG TAGATTCACC GTTGAAGGAG AATATGGACG3401 AAAGACGCTT ATATCTCCTA TTTGGTACAC TACTAGGTGG GTATCTTACC3451 TCAGTGATCT CAGATGGASEQ ID No.4編碼醬油曲霉蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 CGCGGATCCA TGGAACACGA TGTGCGGGTG AAATTGGAGC AGCTAGGAAT51 GATGTCTGTG GAGTAGGTGT TGCATACGAC AGCCAAGTTG CCGGAATTCG101 GATTTTGTCC GCACCCATTG ACGACGCAGA TGAGGCTGCT GCCATCAACT151 ATGGCTTCCA GCGCAATGAT ATATATTCAT GCTCCTGGGG CCCTCCGGAT201 GATGGCGCCA CGATGGAGGC GCCAGGGATT CTTATCAAAC GAGCTATGGT251 CAACGGTATC CAAAATGGCC GAGGAGGTAA AGGTTCTATC TTCGTCTTTG301 CAGCTGGAAA TGGTGCAGGG TACGATGACA ACTGCAATTT CGACGGTTAT351 ACAAACAGCA TTTACAGCAT CACCGTCGGC GCTATTGATC GAGAGGGCAA401 ACATCCCAGC TACTCGGAAT CATGCTCTGC CCAGTTGGTT GTCGCTTATA451 GCAGTGGCTC GAGTGACGCG ATTCATACCA CCGACGTTGG AACTGATAAA501 TGTTATTCAC TNTCACGGGC GGAACTTCTG CAACTGGACC GCTAGCTGCG551 GGTACTATTG CCCTCGCTCT TAGTGCCCGA CCGGAACTAA CTTGGCGAGA601 TGCCCAGTAC CTGATGATAG AGACCGCAGT TCCCGTCCAC GAAGACGACG651 GGAGCTGGCA GACTACCAAA ATGGGGAAGA AGTTTAGCCA TGACTGGGGT701 TTTGGGAAAG TAGATGCATA TTCACTGGTC CAGCTGGCCA AGACGTGGGA751 GCTGGTGAAA CCACAGGCGT GGTTCCACTC ACCGTGGCTG CGGGTGAAGC801 ATGAAATCCC ACAAGGTGAC CAGGGCCTTG CCAGCTCATA CGAAATTACC851 AAGGATATGA TGTACCAGGC CAATGTCGAG AAATTGGAAC ATGTCACTGT901 GACCATGAAT GTAAATCACA CTCGCCGAGG CGATATCAGC GTGGAGTTGC951 GCAGCCCCGA AGGTATCGTC AGTCATCTGA GTACAGCGCG GCGGTCAGAT1001 AATGCAAAGG CTGGCTATGA AGATTGGACG TTTATGACTG TGGCTCATTG1051 GTATGTATTT GCTCCCGTAA TTTAGTTTTC GTGCTCAGTC CTGACATTTA1101 CATTTAGGGG TGAGTCCGGT GTTGGAAAGT GGACGGTCAT TGTGAAGGAT1151 ACCAATGTCA ATGATCATGT TGGAGAATTC ATCGACTGGC GGCTCAACCT1201 CTGGGGACTT TCGATCGACG GCTCCAGCCA GCCCCTTCAT CCTATGCCCG1251 ATGAGCATGA CGATGACCAC TCGATTGAAG ATGCCATTGT TGTTACCACT1301 AGTGTTGACC CTATCCCAAC TAAGACTGAA GCCCCACCTG TCCCAACTGA1351 TCCCGTGGAT CGTCCTGTGA ACGCAAAGCC ATCTGCGCAG CCAACGATGC1401 CTTCAGAGGC TCCTGCTCAA GAGACATCTG AAGTTCCCAC CCCGACGAAA1451 CCTAGTTCTA CTGAATCACC TTCTTACCAC CTCCTCTGCG GATAGCTTTT1501 TGCCATCCTT CTTCCCCACG TTCGGTGCGT CGTGAGGATC CAAGCTTGGG1551 TACGTSEQ ID No.5編碼Trichoderma reesei QM9414蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 GCTGTCCGCA CTGATGCGTG CGGCCTTGGC GTTGCCTACG ACTCCAAGAT51 TGCTGGCATC CGCATCCTTA GTAGTGCCAT CAGCGATGCG GACGAGGCCG101 AGGCCATGAT TTACAAGTTC CAGGACAACC AGATCTACTC GTGCTCCTGG151 GGGCCTCCCG ACGATGGGAG GTCCATGGAA GCCCCCGACG TCCTGATTCG201 ACGAGCCATG CTCAAGGGCG TCCAGGAGGG ACGAGGAGGC CTCNGCTCCA251 TCTACGNCTT TGCTAGTGGT AACGGTGCCG CCAGTGGCGA TAACTGCAAC301 TNCGACGGAT ACNCAAACASEQ ID No.6編碼Fusarium venenatum ATCC20334蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 GGTTTNNCCG TTGGTGTTGC TACGACTCCA AGTCGCCGGA ATCCGTATTC51 TCAGCAAACT GATCAGCGAC GCCGACGAAG CAGAAGCGCT TATGTACAAG101 TACCATGACA ACCATATTTA CTCTTGCTCA TGGGGTCCTT CCGATGATGG151 CCAGACTATG GAGGCACCCG ATGTTGTCAT TCGACGAGCA ATGCTTAAGG201 CGATTCAGGA GGGACGTAAT GGTCTTGGCT CTGTCTACGT CTTTGCCAGT251 GGAAACGGTG CAGGCCAAGG AGATAACTGC AACTNCGACG GATCCACCAA301 ACASEQ ID No.7編碼Penicillium chrysogenum P2蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 GTGGGTGTTG CCTATGACAG CAAGGTGTCA GGTATCCGGA TTCTGTCCAA51 GGCGATTGAC GACGTCGACG AAGCAGCTGC CATCAACTTT GCCTTCCAAG101 ATAACGATAT ATACTCCTGC TCGTGGGGTC CTCCTGATGA TGGTGCGACC151 ATGGATGCGC CGGGCTTGTT GATCAAGCGG GCGATGGTCA ATGGTGTGCA201 NGAGGGACGA GGTGGAAAGG GTTCGATCTT CGTGTTNGCC GCAGGCAACG251 GTGCTCTTTT TGGCGACAAC TGCAACTTCG ACGGATACAA CAAACASEQ ID No.8編碼Rhizopus oryzae ATCC200076蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 ACTNGGGGCA TTGGTGAAAT NTTGCTTGTG GNTTGGTGTT GCTTACGACG51 CAAAAATATC TGGTATACGT ATATTATCAG GTGAAATCAC AGAGGCAGAC101 GAGGCTGCTG CTTTGAATTA CAAATATCAA GAAAATCAAA TCTACTCCTG151 CTCNTGGGGC CCASEQ ID No.9編碼Agaricus bisporus HORST蛋白原轉(zhuǎn)化酶的基因的編碼區(qū)的部分序列1 ATGTGGTCTT GGTCTCGCCT ACGAATCCAA GGTCGCTGGT GTTCGCATAT51 TGTCTGGTCC CATAACGGAC GTCGATGAAG CGACTGCGCT CAACTATGGT101 TTCCAAAATG TATCTATCTT CAGCTGTAGT TGGGGCCCAC CTGACAATGG151 TATGTCCATG GAAGGCCCAG GATACCTCAT CAAAAAAGCT GTCGTCAACG201 GCATTAACCA GGGACGTGGC GGGAAGGGCT CCATTTTCGT CTTCGCCAGT251 GGCAACGGCG CTGCTTCGGA TGACCAATGC AACTACGACG GATACACAAA301 CASEQ ID No.10編碼鏈BamHI-位點(diǎn)下劃線PE4 5′-CG CGGATC CA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GG-3′簡并2048次SEQ ID No.11編碼鏈PCL15′-CA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GGX GA-3′簡并8192次SEQ ID No.12編碼鏈PCL25′-AT(C/T/A)TA(T/C)TCX TG(T/C)TCX TGG GGX CC-3′簡并768次SEQ ID No.13非編碼鏈BamHI-位點(diǎn)下劃線PE65′-CGCGGA TCCXCC(A/G)TT XCC X(C/G)(A/G)XGC(G/A/C)(C/A)A XAC-3′簡并49152次SEQ ID No.14非編碼鏈PCL2rev 5′-GG XCC CCA XGA(A/G)CA XGA(A/G)TA(A/T/G)AT-3′簡并768次SEQ ID No.15非編碼鏈PCL35′-(A/G)TT XGT(A/G)TA XCC(A/G)TC(A/G)(A/T)A(A/G)TT-3′簡并1024次SEQ ID No.16非編碼鏈PCL45′-GC XGC XGA XGT XCC XCC(A/G)TG-3′簡并2048次SEQ ID No.17pAB4-1rep的序列........59-499bp...............................pAB4-1的0.4kb HindIII片段1-58bp........500-513bp.............2873-2930bppMTL24的多接頭序列(以下劃線小寫字母表示)......................514-2872bp...............pAB4-1的2.3kb Xhol片段1ggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgc51aggcatgcAA GCTTGGTCAG CAGTACCAGA CGCCCGGATC GGCTATCGGC101 CGGGGTGCTG ACTTCATTAT CGCGGGTCGC GGTATCTACG CCGCCGCGGA151 TCCGGTGCAG GCTGCGCAAC AGTATCAGAA GGAGGGGTGG GAAGCCTACC201 TGGCCCGTGT CGGCGGAAAC TAATACTATA AAAGGAGGAT CGAAGTTCTG251 ATGGTTATGA ATGATATAGA AATGCAACTT GCCGCAACGG ATACGGAAGC301 GGAAACGGAC CAATGTCGAG CACGGGTAGT CAGACTGCGG CATCGGATGT351 CCAAACGGTA TTGATCCTGC AGGCTACTAT GGTGTGGCAC AAGGATCAAT401 GCGGTACGAC GATTTGATGC AGATAAGCAG GCTGCGAAGT AGTAACTCTT451 GCGTAGAGAA AATGGCGACG GGTGGGCTGA TAAGGGCGGT GATAAGCTTg501catgcctgcaggcCTCGAGC TAACATACAT TCCGAACCGT GCAGCCCAAG551 GCCGAGCAGT TCAACTGCGC TCAGCGCGCT CATGCCAACT TCCTTGAGAA601 CTCCAGCCAA ACTATGCTCT TCCTCCTGGT AGCTGGACTG AAGTACCCCC651 AGTTGGCGAC TGGCCTCGGA AGCATCTGGG TCCTCGGTCG CTCACTGTTC701 CTTTACGGAT ATGTGTACTC CGGCAAGCCG CGGGGTCGCG GTCGTTTGTA751 CGGCAGCTTC TACTTGCTTG CACAGGGAGC TCTCTGGGGC NTGACGTCTT801 TTGGAGTTGC GAGGGAGTTG ATTTCCTACT TCTAAGTTTG GACTTGAATC851 CGTGGTGTGA TTGAGGTGAT TGGCGATGTT TGGCTATACC AGCTATATGT901 AATAATCTCT ACTGTATACT ACTATTCAAC GCATTTTACT ATGCGTGCTG951 CTAGGGTCGG CAATGACAAT GGCAATCTGA CTGACGTGGT CTATTTCTCC1001 ATGTGCAGCA GGGAATACGA GCTCCAATGG ACCTCGGGAG TGGCACAGTC1051 AATGGCAAGG AAACTCCGCC TTTGCAGGTG TGGCTGAACC CCACGGGTCG1101 GAGGCGGAGC AATCCACCCC CGATGTGGCT GGTGCGTGGA GGGGCTCGCG1151 ATGATTTTAC TGAGCTTGCT TTTCTTGTCG ACATTGAACA TTGTCCTTGG1201 TCTTCCTTCA GATTTAAGGG TCAGTCACTG CTACATTTCT CAGTAGTATC1251 CGCGCACGTC TCTGGATTTA CGAATCAGGG TCCACCAGTC AAACTTCGA1301 ACTACTCTCA TTATACAATC CTCTTTCCAT TCCCGCATTA ACCCCTCCAT1351 CAACACCATG TCCTCCAAGT CGCAATTGAC CTACACTGCC CGTGCCAGCA1401 AGCATCCCAA TGCTCTGGCG AAGAGGCTGT TCGAGATTGC CGAGGCCAAG1451 AAGACCAATG TGACTGTCTC GGCTGACGTT ACCACCACTA AGGAGCTACT1501 AGATCTTGCT GACCGTAGGC CGACCCGCTA CTCTGCCTGA TTATGCTGCA1551 TGCAAACTTA TTAACGGTGA TACCGGACTG CAGGTCTCGG TCCCTACATT1601 GCCGTGATCA AAACCCACAT CGATATCCTC TCTGATTTCA GCAACGAGAC1651 CATTGAGGGA CTTAAGGCTC TCGCGCAGAA GCACAACTTT CTCATCTTCG1701 AGGACCGCAA GtTCATTGAC ATCGGCAACA CGGTCCAGAA GCAATACCAC1751 GGCGGTACCC TCCGTATCTC GGAATGGGCC CACATCATCA ACTGCAGCAT1801 TCTCCCTGGT GAGGGTATCG TCGAGGCTCT CGCTCAGACG GCGTCTGCAC1851 CGGACTTCGC CTACGGCCCC GAACGCGGTC TGTTGATCTT GGCAGAGATG1901 ACCTCTAAGG GCTCCTTGGC TACCGGCCAG TACACTACTT CCTCGGTCGA1951 TTATGCCCGG AAATACAAGA ACTTCGTTAT GGGATTCGTG TCGACGCGCG2001 CGTTGGGTGA GGTGCAGTCG GAAGTCAGCT CTCCTTCGGA TGAGGAGGAC2051 TTTGTGGTCT TCACGACTGG TGTGAACATT TCTTCCAAGG GAGATAAGCT2101 TGGTCAGCAG TACCAGACGC CCGGATCGGC TATCGGCCGG GGTGCTGACT2151 TCATTATCGC GGGTCGCGGT ATCTACGCCG CGCCGGATCC GGTGCAGGCT2201 GCGCAACAGT ATCAGAAGGA GGGGTGGGAA GCCTACCTGG CCCGTGTCGG2251 CGGAAACTAA TACTATAAAA GGAGGATCGA AGTTCTGATG GTTATGAATG2301 ATATAGAAAT GCAACTTGCC GCAACGGATA CGGAAGCGGA AACGGACCAA2351 TGTCGAGCAC GGGTAGTCAG ACTGCGGCAT CGGATGTCCA AACGGTATTG2401 ATCCTGCAGG CTACTATGGT GTGGCACAAG GATCAATGCG GTACGACGAT2451 TTGATGCAGA TAAGCAGGCT GCGAAGTAGT AACTCTTGCG TAGAGAAAAT2501 GGCGACGGGT GGGCTGATAA GGGCGGTGAT AAGCTTAATT GTCATCGCAG2551 ATAAGCACTG CTGTCTTGCA TCCAAGTCAG CGTCAGCAGA AATACGGGAC2601 TTCCGAAAGT ATATGGCAAA ATTAAAGAAC TTGACTCTCC AGCAATGTTT2651 TGCCCTGACC GTCGCTAAAA CGTTACTACC CCTATACCCG TCTGTTTGTC2701 CCAGCCCGAG GCATTAGGTC TGACTGACAG CACGGCGCCA TGCGGGCTTG2751 GGACGCCATG TCCGTCGCGT GATAAGGGTT GATCCATGCA GCTACTATCC2801 TTCCATCGTT CCATTCCCAT CCTTGTCCTA TCTCCATCCT TGAAACTTTA2851 CTAGTTTAGT TGGATGCTCG AGatctccatggacgcgtgacgtcgactct2901gaggatccccgggtaccgagctcgaattcgSEQ ID No.18MBL789EcoRI下劃線5′-GGAA TTC(A/G)GA ATA(T/A)GG AGG ATG TAG-3′簡并4次SEQ ID No.19MBL 793BamHI下劃線5′-CGGATCCG CAG TGG CAC TTG(G/A)TC AAT CCA A-3′簡并2次SEQ ID No.20MBL 794EcoRI下劃線5′-GGA ATT CTT AAA A(T/G)C CCA AGA ACC TTC A-3′簡并2次SEQ ID No.21MBL 1158EcoRI下劃線5′-GGAA TTC(T/C)TC(T/G)CC(T/G)GC(A/G)CA(C/G)C(T/G)(C/G)GT(T/G)CC(A/G)TG-3′簡并512次SEQ ID No.22MBL 1208ClaI下劃線
5′-CGGATC GA(T/C)GGX ACX(C/A)GX TG(T/C)GCX GG-3′簡并2048次SEQ ID No.23MBL 1219BamHI下劃線5′-CGG ATC(C/T)TG XA(G/T/C)(A/G)TC XC(T/G)CCA XGT(C/A/G)AG-3′簡并4608次SEQ ID No.24限制位點(diǎn)粗體字表示引物下劃線表示BaHmI PE4引物GGATCCATGG CACGAGATGT GCAGGTGAAAPTCGGTGCGGC GAAAGAAAACAACGTGTGCG 60GGGTTGGTGT TGCGTATGAT AGTCGCATCG CTGGTATTCG GATTCTCTCCACACCCATCG 120EcoRVATGACACTGA TGAGGCTGCG GCTATTAACT ACGCCTATCA GGAGAACGATATCTACTCGT 180GTTCCTGGGG TCCCTATGAT GATGGCGCCA CAATGGAAGC CCCGGGCACTCTGATCAAGC 240GGGCCATGGT CAATGGTATC CAAAATGGTC GAGGTGGAAA AGGCTCGGTTTTTGTCTGCG300PE6引物CCCCCGGAAA TGGTGGATCC320BamHISEQ ID No.25Aspergillus niger PclA蛋白序列1 Met Arg Leu Thr Gly Gly Val Ala Ala Ala Leu Gly Leu CysAla16 Ala Ala Ser Ala Ser Leu His Pro His Arg Ser Tyr Glu ThrHis31 Asp Tyr Phe Ala Leu His Leu Asp Glu Ser Thr Ser Pro AlaAsp46 Val Ala Gln Arg Leu Gly Ala Arg His Glu Gly Pro Val GlyGlu61 Leu Pro Ser His His Thr Phe Ser Ile Pro Arg Glu Asn SerAsp76 Asp Val His Ala Leu Leu Asp Gln Leu Arg Asp Arg Arg ArgLeu91 Arg Arg Arg Ser Gly Asp Asp Ala Ala Val Leu Pro Ser LeuVal106 Gly Arg Asp Glu Gly Leu Gly Gly Ile Leu Trp Ser Glu LysLeu121 Ala Pro Gln Arg Lys Leu His Lys Arg Val Pro Pro Thr GlyTyr136 Ala Ala Arg Ser Pro Val Asn Thr Gln Asn Asp Pro Gln AlaLeu151 Ala Ala Gln Lys Arg Ile Ala Ser Glu Leu Gly Ile Ala AspPro166 Ile Phe Gly Glu Gln Trp His Leu Tyr Asn Thr Val Gln LeuGly181 His Asp Leu Asn Val Thr Gly Ile Trp Leu Glu Gly Val ThrGly196 Gln Gly Val Thr Thr Ala Ile Val Asp Asp Gly Leu Asp Met
Tyr211 Ser Asn Asp Leu Arg Pro Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Ser TyrAsp226 Tyr Asn Asp Lys Val Pro Glu Pro Arg Pro Arg Leu Ser AspAsp241 Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Gly Ala Ala LysAsn256 Asp Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asp Ser Arg Ile AlaGly271 Ile Arg Ile Leu Ser Ala Pro Ile Asp Asp Thr Asp Glu AlaAla286 Ala Ile Asn Tyr Ala Tyr Gln Glu Asn Asp Ile Tyr Ser CysSer301 Trp Gly Pro Tyr Asp Asp Gly Ala Thr Met Glu Ala Pro GlyThr316 Leu Ile Lys Arg Ala Met Val Asn Gly Ile Gln Asn Gly ArgGly331 Gly Lys Gly Ser Val Phe Val Phe Ala Ala Gly Asn Gly AlaIle346 His Asp Asp Asn Cys Asn Phe Asp Gly Tyr Thr Asn Ser IleTyr361 Ser Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp Arg Glu Gly Asn His ProPro376 Tyr Ser Glu Ser Cys Ser Ala Gln Leu Val Val Ala Tyr SerSer391 Gly Ala Ser Asp Ala Ile His Thr Thr Asp Val Gly Thr AspLys406 Cys Ser Thr Thr His Gly Gly Thr Ser Ala Ala Gly Pro LeuAla421 Ala Gly Thr Val Ala Leu Ala Leu Ser Val Arg Pro Glu LeuThr436 Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Met Ile Glu Ala Ala Val ProVal451 His Glu Asp Asp Gly Ser Trp Gln Asp Thr Lys Asn Gly LysLys466 Phe Ser His Asp Trp Gly Tyr Gly Lys Val Asp Thr Tyr ThrLeu481 Val Lys Arg Ala Glu Thr Trp Asp Leu Val Lys Pro Gln AlaTrp496 Leu His Ser Pro Trp Gln Arg Val Glu His Glu Ile Pro GlnGly511 Glu Gln Gly Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Val Thr Glu Asp MetLeu526 Lys Gly Ala Asn Leu Glu Arg Leu Glu His Val Thr Val ThrMet541 Asn Val Asn His Thr Arg Arg Gly Asp Leu Ser Val Glu LeuArg556 Ser Pro Asp Gly Arg Val Ser His Leu Ser Thr Pro Arg ArgPro571 Asp Asn Gln Glu Val Gly Tyr Val Asp Trp Thr Phe Met SerVal586 Ala His Trp Gly Glu Ser Gly Ile Gly Lys Trp Thr Val IleVal601 Lys Asp Thr Asn Val Asn Glu His Thr Gly Gln Phe Ile AspTrp616 Arg Leu Asn Leu Trp Gly Glu Ala Ile Asp Gly Ala Glu GlnPro631 Leu His Pro Met Pro Thr Glu His Asp Asp Asp His Ser TyrGlu646 Glu Gly Asn Val Ala Thr Thr Ser Ile Ser Ala Val Pro ThrLys661 Thr Glu Leu Pro Asp Lys Pro Thr Gly Gly Val Asp Arg ProVal676 Asn Val Lys Pro Thr Thr Ser Ala Met Pro Thr Gly Ser LeuThr691 Glu Pro Ile Asp Asp Glu Glu Leu Gln Lys Thr Pro Ser ThrGlu706 Ala Ser Ser Thr Pro Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Ser AspSer721 Ile Leu Pro Ser Phe Phe Pro Thr Phe Gly Ala Ser Lys ArgThr736 Glu Val Trp Ile Tyr Ala Ala Ile Gly Ser Ile Ile Val PheCys751 Ile Gly Leu Gly Val Tyr Phe His Val Gln Arg Arg Lys ArgIle766 Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Tyr Asn Phe Glu Met Ile GluAsp781 Glu Asp Glu Leu Gln Ala Met Asn Gly Arg Ser Asn Arg SerArg796 Arg Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Asn Ala Phe Ala Gly Glu Ser
Asp811 Glu Glu Pro Leu Phe Ser Asp Glu Asp Asp Glu Pro Tyr ArgAsp826 Arg Gly Ile Ser Gly Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ala Asp GlyGlu841 His Ser Arg ArgSEQ ID Nos.26 to 31醬油曲霉啟動子克隆所用PCR引物限制位點(diǎn)下劃線

SEQ IDNo.26SEQ IDNo.27SEQ IDNo.28SEQ IDNo.29SEQ IDNo.30SEQ IDNo.31SEQ ID No.32醬油曲霉gpdA啟動子區(qū)1 AATTGCGGCC GCTATGAAAC CGGAAAGGGC TGCTGAGAGC TGGGGAACGG51 CGCAAGCCGG GAAAACAGCT GACAAGGACC CATTTCACTC TGGATCTTGA101 GGAGAGCTGT AGCTTTTGCC CCGTCTGTCC ACCCGGTGAC TGGATTAGTG151 ACCTGGTCGT TGCGTCAGTC AACATTGCTC TTTTTTTATC TCCCCCTCCC201 CCGCCGTCCG ACTTTTCTCC CCTTTTCTAC TCTCTTCGTA TACTCACCAC251 TGCAATCATC TTATCCCTTT GTCTTCTTAC TTAAAGTGAG TCGTCTCCCG301 CCCATCGTTC CCTTTGAACC TTGTAAATCA GAGCCACTTT CAAGTGTCTA351 CCGTTTCCTT TCCACATAGA TTGACTGACA GCTACCCCGC CACACCAGCA401 GACACATCTA AACCATGGSEQ ID No.33醬油曲霉alpA啟動子區(qū)的序列1 GCGGCCGCGG TTATTCTGCG GAAGCGGACC CCCCCCTTCC GCCCAAACAG51 GGCGAATGTG CCCAAGTTCT GATACTATCA GAAGACCTCC AGGAGCACAT101 GCCTGTTCGC ATAACCCTGG TGTAGCACCA GGAATTGCTT AGCTTAGCTT151 CTTCGACTGA GGGGCCAGAA AGTGCTTATC GCAAAGATCC CACTTCTTTG201 TGTGATAGCC CCTCCCGCGG CCCTTGATCA AGCCGTTCTC GCTATCCAAT251 ATTGAAAGCG TGATATTATA GGTGCACATG GTTATTATCC TTTTTCTTTT301 TCTCTTTCTT TGCTTTTCAT GCAACCCCAT ACGTTGCCGA ATTTGGCTAC351 ACCTTGGGGC TCATTCTTCG AAGTTTAGAT TCCGACAAGA CCTCACCACC401 CAATCAAAAC CCTTGATTCC TGATAAAAGA CGTGGAAAGA AGCGGATATC451 GCGTGAGGAT GCCAAGCAAA GGGAATGGGT CACATTGATC TCTGTCGCGT501 TGTTAGGATG ATCTTCACTC CTAAAGGCAT CGCCCGCGGC ACTAGGTCCT551 TCCTGTCCAG GATATCGTTT ACTCCTCTCA TTATGGCGAG CTACTTTGTG601 AATTAATTGA CTGAGGGATA TACCACCTTC CCTTTGAAGG TACCAAGCCA651 CTACCTTGAG CGTTAGTTAC TTTTTCGAGG AAAGCGTCCT ATGCTGGTCT701 CCGCCAAACC CTCGACAACT TGCCATAGCC TTGTGTTCTT CATGGTCTAT751 CGGAGTACCC GTTCATGACT GAAGCGGGTC AGCGTCCGTG GTGGTCATCA801 TCATTCTCAT CTTTCATCAT GCCCGCTGAT TGATAGAGTA ATTTCCGGTG851 GAGCACAACG CCGTCCTCTG AGATGCAATG TCACCCTGTA AGTTTCAACT901 ACACTCTGTA GTACAGAGCA TCCTTGCCAT TGCATGCTGT GCAAGTGATC951 TAAATCCGTA GAATCTGCTC GAGAACGGGG AAATATAGAA CTCCTGAAGG1001 TTATAAATAC CACATGCATC CCTCGTCCAT CCTCATTTCC ATCATCAAGC1051 CAGCGGTTTC TATCCTCCGA CTTGAGTCGT TCTCGCGCAT CTTTACAATC1101 TTCTCACCAT GG
權(quán)利要求
1.一種重組的醬油曲霉，其包含一個(gè)導(dǎo)入的乙酰胺酶S(amdS)基因作為選擇標(biāo)記。
2.權(quán)利要求1的醬油曲霉，所述醬油曲霉在包含導(dǎo)入的amdS的底物作為唯一氮源的培養(yǎng)基上可選擇，所述培養(yǎng)基還包含碳源，且沒有內(nèi)源性amdS誘導(dǎo)底物。
3.權(quán)利要求1或2的醬油曲霉，其中氮源是丙烯酰胺。
4.前述任一權(quán)利要求的醬油曲霉，其中醬油曲霉沒有活性內(nèi)源性amdS基因，例如因?yàn)閮?nèi)源性amdS基因包含內(nèi)源性amdS失活突變，例如缺失或破壞。
5.一種將核酸序列導(dǎo)入醬油曲霉的方法，所述方法包括根據(jù)已知的將核酸序列導(dǎo)入真菌的方法，將核酸序列導(dǎo)入醬油曲霉中，例如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述方法包括將amdS基因作為核酸序列(此后稱為導(dǎo)入的amdS基因)導(dǎo)入，隨后在無內(nèi)源性amdS誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基上選擇所得的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，所述培養(yǎng)基還包含作為唯一氮源的導(dǎo)入的amdS的底物，并還包含碳底物，所述培養(yǎng)基能使包含所述核酸序列的所需醬油曲霉生長，同時(shí)消除無所述導(dǎo)入核酸序列的醬油曲霉的生長，因?yàn)檫@種醬油曲霉不導(dǎo)入amdS基因在選擇培養(yǎng)基上沒有生長能力，所述培養(yǎng)基還包含作為唯一氮源的除乙酰胺外的amdS的底物，例如作為導(dǎo)入的amdS的底物的丙烯酰胺。
6.一種通過權(quán)利要求5的方法獲得的醬油曲霉。
7.一種選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-4和6任一項(xiàng)的醬油曲霉，根據(jù)已知用核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真菌的方法轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述方法包括將amdS基因作為核酸序列導(dǎo)入，隨后在培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，所述培養(yǎng)基包含導(dǎo)入的amdS的底物作為唯一氮源，還包含碳底物，所述培養(yǎng)基能使所需的醬油曲霉生長，同時(shí)消除未轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的生長，因?yàn)檫@種醬油曲霉不導(dǎo)入amdS基因在選擇培養(yǎng)基上沒有生長能力。
8.一種生產(chǎn)重組醬油曲霉的方法，所述方法包括將一種核酸序列以已知方式例如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染導(dǎo)入權(quán)利要求1-4和6任一項(xiàng)的醬油曲霉中，所述核酸序列包含欲導(dǎo)入的所需序列及其側(cè)翼的長度和同源性足以保證重組的內(nèi)源性amdS基因片段或相應(yīng)序列，從而同時(shí)消除內(nèi)源性amdS基因，并導(dǎo)入所需序列，隨后選擇具有所需序列的重組醬油曲霉，這是通過選擇包含在所需序列中或與所需序列共轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記而進(jìn)行，所述選擇標(biāo)記在導(dǎo)入核酸序列之前的醬油曲霉中不存在，合適的選擇標(biāo)記是pyrG。
9.一種能在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上生長的醬油曲霉，所述醬油曲霉在包含尿苷和氟乳清酸的培養(yǎng)基上不生長，即所述醬油曲霉呈尿嘧啶輔源營養(yǎng)，所述醬油曲霉不能利用尿苷，所述醬油曲霉是pyrG陰性的，所述醬油曲霉對氟乳清酸有抗性，所述尿嘧啶輔源營養(yǎng)和氟乳清酸抗性可通過導(dǎo)入的活性pyrG基因的互補(bǔ)作用而減輕，合適地，所述醬油曲霉沒有活性的內(nèi)源性pyrG基因；例如醬油曲霉內(nèi)源性pyrG基因在基因或基因調(diào)節(jié)序列中包含插入，取代或缺失形式的突變，例如缺失整個(gè)基因編碼序列。
10.權(quán)利要求9的醬油曲霉，其組合權(quán)利要求1-4和6任一項(xiàng)的醬油曲霉的特性。
11.一種選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法，所述方法包括將權(quán)利要求9或10的醬油曲霉用核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述方法包括將活性的pyrG基因根據(jù)已知轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真菌的方式，導(dǎo)入醬油曲霉中，隨后在不含尿嘧啶和氟乳清酸培養(yǎng)基上選擇所得轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉，所述培養(yǎng)基至少還包含醬油曲霉生長所必需的基本底物，所述培養(yǎng)基能使所需醬油曲霉生長，同時(shí)消除未轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)染的醬油曲霉生長，因?yàn)檫@種醬油曲霉由于pyrG基因失活而無尿嘧啶不能生長。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中導(dǎo)入的活性pyrG基因側(cè)翼為相同核酸序列片段，在不含尿嘧啶和氟乳清酸培養(yǎng)基上選擇通過導(dǎo)入pyrG基因和側(cè)翼序列而產(chǎn)生的pyrG陽性醬油曲霉，接著將pyrG陽性醬油曲霉在包含尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而消除已導(dǎo)入的pyrG基因，由此產(chǎn)生pyrG陰性醬油曲霉，其可通過在包含尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長和氟乳清酸抗性加以選擇，適當(dāng)?shù)?，?cè)翼序列和pyrG基因的側(cè)翼進(jìn)一步包括指導(dǎo)pyrG基因和側(cè)翼序列整合入特異位置的序列，因?yàn)檎现笇?dǎo)序列與待轉(zhuǎn)化的醬油曲霉的特異序列同源，從而如果需要可剔除與該特異序列相關(guān)的基因。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中權(quán)利要求9或10的醬油曲霉還導(dǎo)入了另外一種核酸序列，所述另外的核酸序列優(yōu)選編碼蛋白質(zhì)或多肽，所述另外的核酸序列是與活性pyrG基因在相同載體上導(dǎo)入的，或通過與導(dǎo)入的活性pyrG基因共轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入的。
14.一種選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的醬油曲霉的方法，通過組合權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法和權(quán)利要求5的方法進(jìn)行。
15.一種生產(chǎn)重組醬油曲霉的方法，所述方法包括將一種核酸序列導(dǎo)入pyrG陽性醬油曲霉中，例如通過已知的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方式，所述核酸序列包含所需序列及其側(cè)翼的長度和同源性足以保證重組的pyrG基因片段或相應(yīng)序列，從而消除pyrG基因并導(dǎo)入所需序列，隨后通過選擇具有pyrG陰性表型的醬油曲霉而選擇具有所需序列的重組醬油曲霉。
16.一種通過權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法獲得的重組醬油曲霉，其任選的還包含權(quán)利要求1-4，6，9和10任一項(xiàng)的醬油曲霉的特性。
17.一種重組醬油曲霉，其包含編碼用于表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或多肽通過黑曲霉或泡盛曲霉表達(dá)時(shí)易被降解。
18.一種重組醬油曲霉，其包含編碼用于表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列，所述蛋白質(zhì)或多肽不是醬油曲霉蛋白酶和淀粉酶，所述蛋白質(zhì)或多肽優(yōu)選是非醬油曲霉蛋白質(zhì)或多肽。
19.一種突變的或重組的醬油曲霉，其包含失活蛋白酶基因、合適地是堿性蛋白酶基因的一種突變。
20.一種突變或重組的醬油曲霉，其包含失活主要蛋白酶基因的一種突變，合適地是失活主要堿性蛋白酶基因例如編碼35kDa主要堿性蛋白酶基因的基因的突變。
21.一種生產(chǎn)重組醬油曲霉的方法，所述重組醬油曲霉顯示蛋白酶解活性降低，所述方法包括將一種核酸序列以已知方式例如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染導(dǎo)入醬油曲霉中，所述核酸序列包含一種欲導(dǎo)入的選擇標(biāo)記編碼序列，及其側(cè)翼的欲消除的蛋白酶基因片段，所述側(cè)翼序列和選擇標(biāo)記編碼序列包含在長度和同源性足以保證在蛋白酶基因重組的序列中，由此同時(shí)消除蛋白酶基因并導(dǎo)入所需的選擇標(biāo)記編碼序列，導(dǎo)入后通過選擇選擇標(biāo)記而選擇重組醬油曲霉，其中在例如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染導(dǎo)入核酸序列之前，醬油曲霉不含欲導(dǎo)入的選擇標(biāo)記，例如將醬油曲霉在導(dǎo)入核酸序列之前突變，由此醬油曲霉不能產(chǎn)生活性的選擇標(biāo)記，合適的選擇標(biāo)記是pyrG基因，合適地此方法與權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法組合使用。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求21的方法獲得的重組醬油曲霉。
23.權(quán)利要求17-20或22任一項(xiàng)的突變或重組的醬油曲霉，其包含一種選擇標(biāo)記，優(yōu)選地是權(quán)利要求1-4或6任一項(xiàng)中定義的amdS和/或權(quán)利要求9，10或16中定義的pyrG。
24.權(quán)利要求1-4，6，9，10，16-20，22和23任一項(xiàng)的重組醬油曲霉，其包含編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的導(dǎo)入的核酸序列。
25.一種表達(dá)編碼蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列的方法，所述蛋白質(zhì)或多肽包含于權(quán)利要求1-4，6，9，10，16-20，22-24任一項(xiàng)定義的，或通過權(quán)利要求5，7，8，11-15和21任一項(xiàng)的方法獲得的重組或突變的醬油曲霉中，所述表達(dá)方法包括培養(yǎng)重組或突變的醬油曲霉，合適地，編碼蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入的核酸序列在相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化或野生型醬油曲霉中不存在和/或以較低拷貝數(shù)存在。
26.一種重組真菌，其在編碼蛋白原轉(zhuǎn)化酶或功能等價(jià)蛋白的基因中包含一種突變。
27.權(quán)利要求26的真菌，當(dāng)與相應(yīng)野生型真菌相比時(shí)，在相同條件下其產(chǎn)生蛋白質(zhì)，多肽或代謝物的能力提高。
28.權(quán)利要求26或27的真菌，所述突變是通過用已知方式轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)行特異基因修飾而獲得的。
29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的真菌，所述蛋白原轉(zhuǎn)化酶或功能等價(jià)蛋白是由一種核苷酸序列編碼的，該序列的片段可以用SEQID NO10-16中給出任何兩種核苷酸混合物，通過體外DNA擴(kuò)增方法而擴(kuò)增。
30.權(quán)利要求27所述的真菌，所述蛋白原轉(zhuǎn)化酶或功能等價(jià)蛋白是由一種核苷酸序列編碼的，這種核苷酸序列功能性互補(bǔ)黑曲霉突變體的生長表型，該黑曲霉突變體具有一種抑制蛋白原轉(zhuǎn)化酶或功能等價(jià)蛋白活性的突變。
31.權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的真菌，所述真菌是醬油曲霉。
32.權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的真菌，所述真菌還含有一個(gè)導(dǎo)入的amdS基因或pyrG基因。
33.一種表達(dá)由一種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)或多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求26-32任一項(xiàng)的真菌。
34.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)或多肽的方法，所述方法包括權(quán)利要求33的表達(dá)方法，任選的還包括加工和/或分泌和/或分離表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽。
35.一種生產(chǎn)肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組的肌醇六磷酸酶或重組的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括權(quán)利要求33的方法，任選的還包括加工和/或分泌和/或分離表達(dá)的肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含導(dǎo)入的乙酰胺酶S(amdS)基因作為選擇標(biāo)記的重組醬油曲霉。描述了在含尿嘧啶和氟乳清酸的培養(yǎng)基上生長的醬油曲霉,所述醬油曲霉進(jìn)一步在含尿苷和氟乳清酸的培養(yǎng)基上不生長,即所述醬油曲霉顯示尿嘧啶輔源營養(yǎng),所述醬油曲霉不能利用尿苷,所述醬油曲霉是pyrG陰性的,所述醬油曲霉顯示對氟乳清酸的抗性,所述尿嘧啶輔源營養(yǎng)和所述氟乳清酸抗性當(dāng)用一導(dǎo)入的活性pyrG基因互補(bǔ)時(shí)可被減輕。該醬油曲霉還包含編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)或任何其它異源蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列,其可用于所述肌醇六磷酸酶或所述其它異源蛋白質(zhì)或多肽的生物工程生產(chǎn)。本發(fā)明還公開了顯示改變的形態(tài)學(xué)的另外的突變體。描述了產(chǎn)生這種表達(dá)宿主的方法。
文檔編號C12N15/80GK1369016SQ00811088
公開日2002年9月11日 申請日期2000年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月30日
發(fā)明者瑪格麗特·希瑞克胡伊森, 科內(nèi)利斯·范登洪德爾, 彼得·蓬特, 尼克·范比澤恩, 阿爾溫·阿爾伯斯, 庫爾特·福格爾 申請人:荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究會(Tno), F·霍夫曼－羅氏股份有限公司