專利名稱：利用ppar核受體的表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)節(jié)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明描述研制和發(fā)展藥理學(xué)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的新系統(tǒng)。本發(fā)明特別基于使用人源構(gòu)建體激活轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明描述例如在肌肉細(xì)胞中，在試管中、在活體外或在活體內(nèi)能有效調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的新組合物、構(gòu)建體和方法。源于本發(fā)明的應(yīng)用場(chǎng)合多種多樣，例如見諸實(shí)驗(yàn)、臨床、治療或診斷方面。
控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平與時(shí)間對(duì)于許多應(yīng)用都是必不可少的。于是，在基因治療方面，成功的治療可能要求特定劑量由轉(zhuǎn)基因合成的蛋白。同樣地，使用例如能夠分開生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可改善在活體外重組蛋白的生產(chǎn)。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、研究基因作用或蛋白的生物利用率等都是屬于適當(dāng)控制遺傳表達(dá)并帶來許多改善的情況。
現(xiàn)有技術(shù)已設(shè)想出不同的人工轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，它們被與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列連接的異生素分子激活。
通過大腸桿菌Lac抑制子與單純皰疹病毒(HSV)的VP16反式激活域融合構(gòu)建首先說明的這些調(diào)節(jié)基因。這些調(diào)節(jié)基因有兩個(gè)版本，一個(gè)可以用異丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)激活，另一個(gè)被IPTG失活(Baim S.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，88，(1991)5072-5076；Labow M.及其同事，《Mol.Cell.Biol.》，10(1990)3343-3356)。
通過大腸桿菌Tet抑制子與HSV的VP16反式激活域融合構(gòu)建另一個(gè)系統(tǒng)。這些調(diào)節(jié)基因也有兩個(gè)版本，一個(gè)可用四環(huán)素或其衍生物激活，另一個(gè)可被這些同樣分子失活(Gossen M.和Bujard H.，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，89，(1992)5547-5551；Gossen M.及其同事，《科學(xué)》，268(1995)1766-1769)。
S.cerevisiae的GAL4蛋白DNA的鏈區(qū)與黃體酮上人受體配體鏈區(qū)和HSV的VP16反式激活域融合構(gòu)建另一個(gè)系統(tǒng)，這個(gè)版本可用如RU486黃體酮類似物激活(Wang Y.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，91，(1994)8180-8184)。還描述過果蠅蛻皮激素受體與HSV的VP16反式激活域融合，用蛻皮激素和這種甾類激素類似物激活(No D.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，93，(1996)3346-3351)。另一個(gè)系統(tǒng)利用促進(jìn)某些細(xì)胞蛋白群聚的某些免疫抑制分子(環(huán)孢霉素A，納巴霉素及其衍生物)的本領(lǐng)。這時(shí)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因由兩種蛋白亞單位構(gòu)成，第一種可由嵌合DNA鏈區(qū)與FKBP人蛋白的三個(gè)復(fù)制品融合而成，第二種由FRAP人蛋白的納巴霉素鏈區(qū)與人NFkB的p65亞單位反式激活域融合而成。這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因可用有可能將兩種亞單位二聚化的納巴霉素激活(Rivera V及其同事，《Nat.Med》，2(1996)1028-1032)。
雖然這些系統(tǒng)在某些組織中能夠達(dá)到令人滿意的調(diào)節(jié)水平，但它們?nèi)匀挥心承┲萍s其使用條件的不足。因此，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因在人體中是異體蛋白。它們事實(shí)上是由來自細(xì)菌、病毒、酵母或昆蟲的蛋白片段構(gòu)成，或蛋白區(qū)是人源的時(shí)，它們由人的外部序列產(chǎn)生接合。這些蛋白區(qū)因此可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒素的免疫反應(yīng)，于是使得在異體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因控制下表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞受到破壞，這樣停止了轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這種情況可迫使采取重復(fù)施用治療基因，這樣構(gòu)成在涉及創(chuàng)傷外科行為時(shí)尤為嚴(yán)重的缺陷，這種治療不總是有效的，特別是在治療基因的載體是第一次注射引起免疫反應(yīng)的病毒時(shí)。另外，用現(xiàn)有技術(shù)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)所觀察到的表達(dá)水平不總是令人滿意的。
因此，需要一種得到改善的表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這種系統(tǒng)與在活體內(nèi)使用是相容的，還可在不同組織中使用，并且還保證在激活狀態(tài)下具有很高的表達(dá)水平。本發(fā)明針對(duì)這些問題提出一種解決方案。
本發(fā)明事實(shí)上涉及使用人源激活子的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)應(yīng)能夠避免反復(fù)施用治療基因。
本發(fā)明特別地描述一種使用PPAR核受體(激活過氧化物酶體增生子的受體)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的改善誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。在申請(qǐng)WO 98/21349中曾描述過在肝特效表達(dá)系統(tǒng)中使用PPRE?，F(xiàn)在，本發(fā)明的改善系統(tǒng)能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(人源PPAR蛋白，因此在人體中屬于基本上非異體蛋白)，控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子由最小啟動(dòng)子和對(duì)PPAR(PPRE)反應(yīng)的成分組成。本發(fā)明的系統(tǒng)，無論在活體外還是在活體內(nèi)，特別是在肌肉中，都可用PPAR特效配體激活。此外，在激活后達(dá)到的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平與諸如hCMV-IE啟動(dòng)子之類強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)水平相似。
本發(fā)明的系統(tǒng)因此在大量誘導(dǎo)、耐性(特別對(duì)于在活體內(nèi)使用)、力和利用條件方面都具有許多優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明描述了用于實(shí)施和使用這種系統(tǒng)的新構(gòu)建體，特別是啟動(dòng)子區(qū)，表達(dá)盒和質(zhì)粒。本發(fā)明還描述能改善基因表達(dá)控制的新的PPAR構(gòu)建體以及這些不同構(gòu)建體的組合。本發(fā)明還表明這些方法和組合物能在活體外和在活體內(nèi)大量控制和調(diào)節(jié)表達(dá)。本發(fā)明還涉及例如包含本發(fā)明構(gòu)建體的細(xì)胞，以及PPAR配體化合物的篩選方法。
更具體地，本發(fā)明第一個(gè)目的在于組合物，該組合物包含a)第一個(gè)成分，它包含在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的目的核酸，該誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含對(duì)PPAR反應(yīng)的成分和最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以及b)第二個(gè)成分，它包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼PPAR的核酸，以便同時(shí)地、分別地或以一定時(shí)間間隔地使用它們。
在更特別的方式中，本發(fā)明組合物還包括(c)PPAR配體，也是為了同時(shí)，分別地或以一定時(shí)間間隔地使用它們。
有利地，這些組合物還包含成分(d)，它包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼X類視黃醛衍生物受體(RXR)的核酸。
其目的在于同時(shí)地、分別地或以一定時(shí)間間隔地使用的表達(dá)表明可以分別地制備、分別地調(diào)節(jié)和相繼使用成分(a)、(b)、必要時(shí)(c)和/或(d)，以便能控制目的核酸的表達(dá)。典型地，制備成分(a)和(b)以及任選的(d)并且將其包裝在一起，而化合物(c)則被分開包裝，并與(a)和(b)以及任選的(d)以一定時(shí)間間隔被使用，這些不同成分在細(xì)胞、組織、器官等中組合得到所要求的表達(dá)調(diào)節(jié)效果。
對(duì)此，在本發(fā)明組合物的特定實(shí)施方式中，通過不同的遺傳構(gòu)建體加入成分(a)和(b)和任選的(d)。
在本發(fā)明組合物的另一個(gè)特定和優(yōu)選的實(shí)施方式中，成分(a)和(b)以及任選的(d)集合在同一個(gè)遺傳構(gòu)建體中。于是，本發(fā)明描述了能表達(dá)目的產(chǎn)品和PPAR的復(fù)合遺傳構(gòu)建體。這些構(gòu)建體是特別有利的，因?yàn)椋鼈儶?dú)自包含了在調(diào)節(jié)表達(dá)目的核酸所需的全部遺傳成分。
一種或多種遺傳構(gòu)建體可以是天然的和/或各種不同來源的，特別是質(zhì)粒附加體、染色體、病毒、噬菌體等。優(yōu)選地，遺傳構(gòu)建體是質(zhì)?；虿《据d體。
為了說明分別地帶有成分(a)或(b)的質(zhì)粒，例如可以列舉JxnS-TK-pGL3、JxnAS-TK-pGL3、DR1xnS-TK-pGL3、DR1xnAS-TK-pGL3、JxnAS-CMV-pGL3、pSG5-hPPARg2g2或Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒，這些將在后面詳細(xì)描述。
為了說明其中已集合成分(a)和(b)的質(zhì)粒，例如可以列舉Jx5AS-TK-Luc-bPPARg2、SV-g2-J10-C-pGL3、hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3或hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，這些將在后面詳細(xì)描述。
作為病毒載體實(shí)例，特別可以列舉重組腺病毒，重組反錄病毒，AAV，皰疹病毒，疫苗病毒等，其制備可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法進(jìn)行。
在本文下面將更詳細(xì)地描述遺傳構(gòu)建體的配置與結(jié)構(gòu)。
對(duì)此，如前面所指出的，成分(a)包含可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，它包含至少-對(duì)PPAR反應(yīng)的成分，以及-最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
對(duì)PPAR反應(yīng)的成分(PPRE，“過氧化物酶體增生子反應(yīng)成分”)是能夠固定PPAR的核酸區(qū)，PPAR鏈然后可以向附近核酸區(qū)傳遞信號(hào)。對(duì)PPAR反應(yīng)的成分因此是能夠連接PPAR的核酸區(qū)。為了實(shí)施本發(fā)明，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分更特別地包含一個(gè)或多個(gè)PPAR鏈的位點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)中曾描述過這樣一些鏈位點(diǎn)，例如像在不同人的啟動(dòng)子中(例如AII載脂蛋白基因)。這樣一些位點(diǎn)還可以是人工構(gòu)建的，并且試驗(yàn)過它們的PPRE性質(zhì)，如下所述。
在一種特定實(shí)施方式中，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分包含一個(gè)或多個(gè)TCAACCTTTACCCTGGTAG序列(SEQ ID NO1)位點(diǎn)，或這種序列的功能性變體。SEQID NO1序列相應(yīng)于人apoAII啟動(dòng)子的J區(qū)(核苷酸-734位至-716位)。
在另一種特定實(shí)施方式中，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分包含一個(gè)或多個(gè)AGGTCAAAGGTCA序列(SEQ ID NO5)位點(diǎn)，或這種序列的功能性變體。SEQ ID NO5序列相應(yīng)于DR1共有區(qū)。
術(shù)語功能性變體是指保持上述PPRE性質(zhì)，即特別是連接PPAR的能力的所有修飾序列。這些修飾可以包括在所研究序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、突變、缺失和/或取代?？梢圆捎梅肿由飳W(xué)的常規(guī)方法，特別地例如通過定向突變發(fā)生或更實(shí)際地通過在合成器中人共合成序列加入這些修飾。一般地，變體保留至少50％標(biāo)出起始序列的殘留序列。更優(yōu)選地，這些變體具有對(duì)所研究序列中少于5個(gè)核苷酸產(chǎn)生影響的修飾。這樣得到的變體然后進(jìn)行它們的PPRE活性試驗(yàn)。這些性質(zhì)可采用不同方式加以證實(shí)，特別地(i)讓試驗(yàn)序列與PPAR和X類視黃醛衍生物受體(RXR)接觸，優(yōu)選地在非細(xì)胞的試驗(yàn)中進(jìn)行接觸，以及(例如通過在凝膠上遷移的滯后)檢測(cè)復(fù)合物形成；(ii)在包含最小啟動(dòng)子和報(bào)道基因的表達(dá)盒中插入試驗(yàn)序列，將這種盒加入細(xì)胞中，以及在存在下或不存在PPAR和PPAR配體的條件下，檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)(如果需要測(cè)定劑量)；(iii)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他技術(shù)，這些技術(shù)使得可能證明例如核酸與蛋白之間的相互作用。
例如上述(ii)中測(cè)量的活性優(yōu)選地至少等于用SEQ ID NO1或5序列位點(diǎn)測(cè)量的活性50％，更優(yōu)選地至少等于75％時(shí)，變體可被認(rèn)為是本發(fā)明意義的功能變體。本發(fā)明意義上的PPAR鏈位點(diǎn)的功能變體例如在下述文獻(xiàn)中描述過Juge-Aubry等人，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，272(1997)25252和Nakshatri等人，《NAR》26(1998)2491，這些文獻(xiàn)作為參考文獻(xiàn)引用于本文。
用三個(gè)RXRα、RXRβ和RXRγ基因編碼X類視黃醛衍生物受體(RXR)，其分離與序列曾得到描述(Mangelsdorf DJ等人(1990)《自然》345，224-229；Mangelsdorf DJ等人(1992)，《基因發(fā)展》6，329-344)。優(yōu)選地，成分(d)編碼人的RXRα。
關(guān)于PPAR/RXR異源二聚化作用，可以討論兩個(gè)考查結(jié)果Mangelsdorf DJ和Evans RM(1995)，《細(xì)胞》83，841-850和Wilson TM和Wahli W(1997)，《化學(xué)生物學(xué)中的通用觀點(diǎn)》(Current Opinion in Chemical Biology)，1，235-241。Schulman IG等人(1998)，在《分子與細(xì)胞生物學(xué)》(Molecular andCellular Biology)，18，3483-3494中的文章描述了通過PPARγ/RXRα異源二聚體的反式激活作用。
使用成分(d)能對(duì)成分(b)的活性產(chǎn)生協(xié)同作用。
正如前面所指出的，在本發(fā)明組合物中，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分可以包含多個(gè)PPAR鏈位點(diǎn)?？梢陨婕跋嗤稽c(diǎn)的重復(fù)或不同位點(diǎn)的組合，相同位點(diǎn)重復(fù)是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，反應(yīng)成分包含多達(dá)30個(gè)鏈位點(diǎn)，優(yōu)選地3-20個(gè)鏈位點(diǎn)，更優(yōu)選地5-15個(gè)鏈位點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是一種包含10-15鏈位點(diǎn)的構(gòu)建體，實(shí)施例中列出的結(jié)果事實(shí)上表明這樣一些構(gòu)建體特別是在肌肉細(xì)胞中在誘導(dǎo)和表達(dá)水平方面的有利性質(zhì)。
為了根據(jù)本發(fā)明組合物中成分(a)制造誘導(dǎo)啟動(dòng)子，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分與最小的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合。最小啟動(dòng)子是基礎(chǔ)活性低或沒有基礎(chǔ)活性并且其基礎(chǔ)活性在轉(zhuǎn)錄激活子存在(激活的PPAR與PPRE成分相互作用)下能增加的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。因此，最小啟動(dòng)子可以是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自然地弱型啟動(dòng)子，即對(duì)于獲得顯著生物作用產(chǎn)生無毒性表達(dá)和/或不充分表達(dá)的啟動(dòng)子。有利地，最小啟動(dòng)子是使用天然的啟動(dòng)子通過一種或多種具有轉(zhuǎn)錄活性的非必需區(qū)的缺失所制備的構(gòu)建體。因此，優(yōu)選地涉及一種基本上包含TATA盒的啟動(dòng)子，其盒的尺寸一般小于160個(gè)核苷酸，并以轉(zhuǎn)錄的起始密碼子為中心。最小啟動(dòng)子還可以用強(qiáng)或弱細(xì)胞病毒啟動(dòng)子例如像皰疹病毒的胸苷激酶(TK)基因的啟動(dòng)子、CMV的立即啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、肌肉肌酸激酶(MCK)基因啟動(dòng)子、骨骼肌肌動(dòng)蛋白不同同種型基因的啟動(dòng)子、結(jié)蛋白基因的啟動(dòng)子、波形蛋白基因的啟動(dòng)子、肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動(dòng)子等制備。最小啟動(dòng)子的特定實(shí)例例如可用CMV的-54至+48位核苷酸或TK啟動(dòng)子的-105至+56位核苷酸表示。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以構(gòu)建由其他啟動(dòng)子得到這些啟動(dòng)子或類似構(gòu)建體的所有變體，并且可用于本發(fā)明范圍內(nèi)。
最小啟動(dòng)子(Pmin)，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分(PPRE)和目的核酸(AN)功能性地配置在成分(a)中，也就是說以便使最小啟動(dòng)子控制目的核酸的表達(dá)，其活性由PPRE成分調(diào)節(jié)。一般地，這些區(qū)因此按照下述順序配置，在5’->3’方向PPRE-Pmin-AN。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的條件下考慮任何其他的功能性配置。
另外，上述不同的功能區(qū)彼此可以直接連接或者被對(duì)成分(a)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)特性不產(chǎn)生明顯的不利影響的核苷酸分開。這樣一些核苷酸可以是在功能方面是中性殘基，例如由克隆步驟得到的中性殘基(PCR端，限制位點(diǎn)等)。這些核苷酸還可能具有生物學(xué)性質(zhì)，能夠賦予本發(fā)明系統(tǒng)以改善的特性或性能(管理基因擴(kuò)增子，特異組織擴(kuò)增子，沉默子，內(nèi)含子，剪接位點(diǎn)等)。對(duì)此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，誘導(dǎo)啟動(dòng)子還包含擴(kuò)增區(qū)。這樣一個(gè)區(qū)有利地能夠提高目的核酸表達(dá)水平。根據(jù)下述示意圖(5’->3’)PPRE-Pmin-AN，這樣一個(gè)擴(kuò)增區(qū)(E)優(yōu)選地定位在處于最小啟動(dòng)子與目的核酸之間的該啟動(dòng)子3’位。
另一方面，在本發(fā)明的構(gòu)建體中，最小啟動(dòng)子和對(duì)PPAR反應(yīng)的成分可以同樣方向(即以轉(zhuǎn)錄方向)，或以相反方向(即與通過Pmin啟動(dòng)子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄相比，對(duì)PPAR反應(yīng)的成分處于反方向)存在。正如實(shí)施例中說明的，這兩種實(shí)施方式能夠如在活體內(nèi)一樣在活體外有效控制表達(dá)調(diào)節(jié)。
如上所述，本發(fā)明組合物的成分(b)至少包括-編碼PPAR的核酸，-在第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下。
PPAR屬于核激素受體的超家族，并歸并成三個(gè)不同的組，PPARα、PPARδ(還被稱作NCU-1或PPARβ)和PPARγ。在文獻(xiàn)中曾描述過許多人PPAR的分離和序列(具體參見Sher T.及其同事，《生物化學(xué)》，32(1993)5598-5604；Mukher jee R.及其同事，《J.Steroid Biochem.Molec.Biol.》，51(1994)157-166；Fajas L.及其同事，《生物化學(xué)雜志》，272(1997)18779-18789；Mukher jee R.及其同事，《生物化學(xué)雜志》，272(1997)8071-8076；Schmidt A.及其同事，《Mol.Endocrinol.》6(1992)1634-1641)。如專利申請(qǐng)WO99/05161所描述的，近來還曾克隆PPARγ啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，編碼PPAR的核酸編碼了人的PPAR，具體地是PPARα或PPARγ。這些實(shí)施例中列出的結(jié)果事實(shí)上表明，使用這些分子可保證本發(fā)明系統(tǒng)高調(diào)節(jié)水平和高表達(dá)水平，特別是在肌肉細(xì)胞中。
根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方式，涉及其自然形態(tài)的PPARα或PPARγ，即與自然分子相比，沒有修飾原始結(jié)構(gòu)。
根據(jù)另一種實(shí)施方式，涉及修飾的PPAR，它包含多個(gè)配體鏈位點(diǎn)。
對(duì)此，本發(fā)明描述并且同時(shí)涉及所有任何修飾的PPAR，它包含多個(gè)配體鏈位點(diǎn)。更特別地，涉及PPARα或PPARγ，還更優(yōu)選地涉及PPARγ。優(yōu)選地，本發(fā)明修飾的PPAR包含2-5個(gè)配體鏈位點(diǎn)，更優(yōu)選地2-4個(gè)鏈位點(diǎn)。更特別地涉及PPAR，它包含在配體鏈E和F區(qū)的2-5個(gè)復(fù)制品。PPAR蛋白包含不同的區(qū)包含非依賴配體的反式激活區(qū)的A/B N-端區(qū)，作為DNA(DBD)鏈區(qū)的C區(qū)，作為鉸鏈接頭區(qū)的D區(qū)，以及E/F區(qū)，它包含依賴配體的反式激活區(qū)。E/F區(qū)還稱之配體鏈區(qū)(LBD)(具體參見Schoon jans K.及其同事，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》(Biochim.Biophys.Acta)，1302(1996)93-109)。E/F區(qū)的限從一個(gè)PPAR改變到另一個(gè)PPAR。作為實(shí)例，對(duì)于所使用人的PPARγ2的同種型，E/F區(qū)從284位氨基酸擴(kuò)展到505位氨基酸。本發(fā)明現(xiàn)在表明有可能構(gòu)建包含多個(gè)重復(fù)E和F區(qū)的修飾PPAR，并且這些修飾的PPAR是功能性的，具有通過PPAR配體改善的誘導(dǎo)性。這樣一些構(gòu)建體因此代表一種實(shí)施方式和本發(fā)明的特定目的。
根據(jù)本發(fā)明修飾的典型PPAR實(shí)例是包含2個(gè)配體鏈位點(diǎn)(即兩個(gè)E和F區(qū))的PPARγ。SEQ ID NO24中列出PPARγ2γ2蛋白序列。
SEQ ID NO24MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY本發(fā)明還涉及保持PPAR模式活性的SEQ ID NO24序列的所有變體(激活能力，在如BRL49653的PPAR配體存在下，包含PPRE序列的啟動(dòng)子)。這些變體可以被理解為所有突變體，缺失體和/或包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)殘基的多肽。優(yōu)選地，一種變體保持至少80％ ID NO24序列殘基。
另外，本發(fā)明還涉及編碼這樣一種修飾PPAR的所有核酸?？梢陨婕癉NA(特別是cDNA或合成的或半合成的DNA)或RNA。這個(gè)DNA可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)常規(guī)方法構(gòu)建(合成，連接，庫(kù)篩選等)。有利地涉及包含編碼SEQ ID NO24序列多肽的序列，或與編碼SEQ ID NO24多肽的序列雜化，以及編碼具有PPAR模式活性多肽的所有核酸。另外，這種DNA可以包含例如啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止子。
控制編碼PPAR的核酸表達(dá)的第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，可以是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，特別是在人的細(xì)胞中的任何強(qiáng)或弱的、普遍存在或選擇性的、構(gòu)成的或調(diào)節(jié)的功能性啟動(dòng)子?？梢陨婕凹倚蠹?xì)胞啟動(dòng)子(即哺乳動(dòng)物基因啟動(dòng)子，特別是人的基因啟動(dòng)子)，天然或合成的，簡(jiǎn)單或復(fù)雜的病毒、細(xì)菌、昆蟲、植物啟動(dòng)子等。適用于這種成分(b)的啟動(dòng)子實(shí)例特別是病毒啟動(dòng)子(SV40病毒的直接啟動(dòng)子，CMV病毒直接啟動(dòng)子，反錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)順序，皰疹病毒TK啟動(dòng)子)或細(xì)胞的啟動(dòng)子(PGK啟動(dòng)子，白蛋白，EF1α，或在肌肉中強(qiáng)表達(dá)的基因，如肌的肌酸激酶(MCK)基因啟動(dòng)子，骨骼肌肌動(dòng)蛋白的不同同種型基因的啟動(dòng)子，結(jié)蛋白基因的啟動(dòng)子，波形蛋白基因啟動(dòng)子，肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動(dòng)子)。另外，啟動(dòng)子可通過加入一種或多種增強(qiáng)子區(qū)進(jìn)行修飾，如β球蛋白基因的2基因內(nèi)區(qū)的增強(qiáng)子區(qū)，CMV病毒的非常早期基因的增強(qiáng)子EF1α的增強(qiáng)子，一種或多種沉默子，賦予組織特效性(例如由特效組織啟動(dòng)子分離的區(qū)，如肌的肌酸激酶(MCK)基因啟動(dòng)子，骨骼肌肌動(dòng)蛋白的不同異構(gòu)重整體基因的啟動(dòng)子，結(jié)蛋白基因的啟動(dòng)子，波形蛋白基因啟動(dòng)子，肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動(dòng)子)或可調(diào)節(jié)特性的區(qū)，或例如通過具有活性的非必需區(qū)的缺失進(jìn)行修飾。這樣一些啟動(dòng)子可用于表達(dá)在成分(d)中包含的RXR。
第二啟動(dòng)子的優(yōu)選實(shí)例是病毒啟動(dòng)子，特別是SV40病毒早期啟動(dòng)子和CMV直接啟動(dòng)子或它們的衍生物。
另外，在特定的實(shí)施方式中，當(dāng)成分(a)和(b)以及任選的(d)集合在同一遺傳構(gòu)建體中時(shí)，(成分(b)的)第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和成分(a)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，以及任選的成分(d)的啟動(dòng)子可以集合以便只生成共同的啟動(dòng)子區(qū)，特別是雙向的共同啟動(dòng)子區(qū)，如在下文將詳細(xì)解釋的那樣。
對(duì)此，本發(fā)明另一個(gè)目的在于包含如前面定義的成分(a)和(b)以及任選的(d)的載體。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，成分(a)和(b)，以及任選的(d)在載體中取相同的方向。例如用SV-g2-J10-C-pGL3質(zhì)粒說明這樣一種實(shí)施方案(圖17)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，成分(a)和(b)，以及任選的(d)在載體中相反取向。例如用圖16、18和19中表示的質(zhì)粒說明這樣一種實(shí)施方案。更優(yōu)選地，在這種實(shí)施方案中，成分(a)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子和成分(b)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子集合在載體中以便形成可調(diào)節(jié)的雙向啟動(dòng)子。例如用圖18和19中表示的質(zhì)粒說明這樣一種實(shí)施方式。
對(duì)此，本發(fā)明的特定目的在于一種載體，其特征在于它在5’->3’方向包含第一個(gè)編碼PPAR的核酸，控制所述第一個(gè)核酸表達(dá)的第一個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，一個(gè)或多個(gè)對(duì)PPAR反應(yīng)的成分，第二個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和處在所述第二個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼目的產(chǎn)物的第二個(gè)核酸。
這種構(gòu)建模式是有利的，因?yàn)樗试S在同一質(zhì)粒中共-表達(dá)兩個(gè)核酸、并且通過PPAR及其配體調(diào)節(jié)兩個(gè)核酸而擴(kuò)增這種表達(dá)。
一般地，在PPAR配體(成分(c))存在下，本發(fā)明組合物中目的核酸的表達(dá)被激活。對(duì)此，根據(jù)使用的PPAR，可以使用不同類型配體，天然的或合成的配體。
因此，PPARα的激活子配體例如是纖維酸鹽(fibrate)，例如纖維酸及其類似物。作為纖維酸類似物，特別可以列舉吉非貝齊(《動(dòng)脈粥樣硬化》，114(1)(1995)61)，苯扎貝特(《肝臟病學(xué)》，21(1995)1025)，環(huán)丙貝特(《BCE& M》，9(4)(1995)825)，安妥明(《藥物安全》(Drug Safety)，11(1994)301)，非諾貝特(非諾貝特專論，牛津大學(xué)臨床通訊，1995)，克利貝特(KidneyInternational，44(6)(1993)1352)，pirinixique酸(Wy-14643)或5，8，11，14-二十烷四酸(ETYA)。這些不同的化合物在活體外或在活體內(nèi)與生物使用和/或藥理學(xué)使用是相容的。
PPARγ的激活子配體可以選自天然或合成配體。作為天然配體，可以提及脂肪酸和eicosanoides(例如亞油酸，亞麻酸，9-HODE，5-HODE)，作為合成配體，可以列舉噻唑烷二酮，具體如rosiglitazone(BRL49653)，pioglitazone或troglitazone(例如參見Krey G.及其同事，《Mol.Endocrinol.》11(1997)779-791或Kliewer S.和Willson T.《(Curr.Opin.IN Gen.Dev.》8(1998)576-581)或化合物RG12525。
另外，本發(fā)明的組合物可以包含幾種配合的PPAR的激活子，特別是與視黃醛衍生物配合的纖維酸鹽或纖維酸鹽類似物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是使用如前面定義的組合物或載體，表達(dá)在活體外或試管內(nèi)細(xì)胞中的目的核酸。
對(duì)此，核酸可以是編碼目的產(chǎn)物(RNA、蛋白、多肽、肽等)的任何核酸(DNA，RNA)?？梢陨婕稗r(nóng)業(yè)食品、治療、疫苗、標(biāo)記物等的目的產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及上述組合物或載體在制備用于表達(dá)在活體內(nèi)細(xì)胞中目的核酸的產(chǎn)品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)表達(dá)細(xì)胞中核酸的方法，該方法包括讓所述細(xì)胞與前面定義的組合物或載體接觸。
對(duì)于在試管或在活體外應(yīng)用，根據(jù)不同的方案，細(xì)胞可以與本發(fā)明的組合物或載體進(jìn)行接觸。因此，培養(yǎng)物中的細(xì)胞可以與本發(fā)明的成分(a)、(b)和(c)以及任選的(d)一起，例如與包含成分(a)和(b)的載體并且在配體(c)存在下直接培養(yǎng)。作為可供選擇替代的方案，細(xì)胞首先可以與成分(a)和(b)，以及任選的(d)一起培養(yǎng)(具體地集合在同一個(gè)載體中)，然后，其次(在培養(yǎng)與任選地選擇修飾細(xì)胞后)，可以加入成分(c)。這后一種方案例如能夠?qū)⑴囵B(yǎng)期(或細(xì)胞擴(kuò)展期)與核酸表達(dá)期分開。這些試驗(yàn)可以在任何設(shè)備和適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行，優(yōu)選地在板、盒、瓶中在滅菌條件下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)施例中提供的信息及其常識(shí)很容易確定細(xì)胞、載體和配體的量。
對(duì)于活體內(nèi)應(yīng)用，細(xì)胞(或器官，組織等)以同時(shí)，分開或以一定時(shí)間間隔的方式加入成分(a)、(b)和(c)，以及任選的(d)進(jìn)行接觸。為此，一般地通過腸胃外、特別地采用肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)或立體定位途徑任選地以唯一遺傳構(gòu)建體形式加入成分(a)和(b)以及任選的(d)。可以由所考慮的應(yīng)用，靶組織和/或被轉(zhuǎn)基因編碼的目的產(chǎn)物類型指導(dǎo)用藥方式的選擇。對(duì)于這種用藥，本發(fā)明組合物可以包含任何有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑(陽離子聚合物，脂類等)。在特定方式中，采用肌內(nèi)方法給藥該組合物，以“null露”核酸形式，即在無添加的轉(zhuǎn)染劑存在下使用遺傳構(gòu)建體。
同樣地，在采用病毒載體加入成分(a)和(b)以及任選的(d)時(shí)，無需任何補(bǔ)充的轉(zhuǎn)染劑。
正如實(shí)施例中所描述的，配體(c)可以在成分(a)和(b)以及任選的(d)之前、與其同時(shí)或之后加入。
對(duì)此，例如可以采用口服、肛門、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥配體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)文獻(xiàn)中公開的在活體內(nèi)的數(shù)據(jù)可調(diào)整使用的劑量。因此，例如對(duì)于在水中不溶的形式，如BRL49653配體典型劑量是5-50毫克/千克，例如30毫克/千克，這樣的劑量至少能夠達(dá)到質(zhì)粒濃度接近大約15微克/毫升。對(duì)于其生物利用率較大的配體的水溶性形式(例如BRL49653馬來酸鹽)，典型劑量較低，一般低于5毫克/千克，例如0.01-1毫克/千克。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以根據(jù)使用的構(gòu)建體、使用的配體以及所尋求的應(yīng)用與效果，可調(diào)整這些劑量。一般地，實(shí)施例中列出的結(jié)果有利地表明，本發(fā)明組合物以配體劑量低于通常使用的劑量能夠達(dá)到在活體內(nèi)強(qiáng)而可調(diào)節(jié)的表達(dá)。另外，盡管可以反復(fù)給藥配體，但列出的結(jié)果還表明，僅一次給藥配體后表達(dá)就很強(qiáng)。
一般地，根據(jù)所尋求的應(yīng)用，使用的載體劑量可以是0.01-1000微克或更多。
本發(fā)明可以用于在試管中，在活體外或在活體內(nèi)表達(dá)不同類型細(xì)胞、組織或器官中的基因。特別地，可以涉及哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地人的細(xì)胞、組織或器官。說明性地，可以列舉肌細(xì)胞(或肌肉)，肝細(xì)胞(或肝臟)，心臟細(xì)胞(或心臟，動(dòng)脈壁或血管壁)，神經(jīng)細(xì)胞(或腦，骨髓等)或腫瘤細(xì)胞(或腫瘤)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建體、組合物和方法用于在試管中、在活體外或在活體內(nèi)調(diào)節(jié)表達(dá)肌細(xì)胞(或肌肉)中的核酸。實(shí)施例中列出的結(jié)果更特別地說明了在活體內(nèi)或在試管中在這類細(xì)胞中本發(fā)明所呈現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及通過與上述組合物或載體接觸所修飾的任何細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及上述組合物、載體或細(xì)胞的應(yīng)用，其中目的核酸是用于在試管中，在活體外或在活體內(nèi)(特別在肌細(xì)胞或肌肉中)篩選PPAR配體的報(bào)道基因(例如分泌的熒光素酶或堿性磷酸酶)。對(duì)此，本發(fā)明還描述了PPAR配體鑒定方法，該方法包括使上述細(xì)胞與試驗(yàn)分子(或組合物)接觸并且證明目的核酸的表達(dá)(它優(yōu)選地是報(bào)道基因)。為了評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物的活性，還可以將這種表達(dá)與沒有試驗(yàn)化合物或有參比配體時(shí)所觀察的表達(dá)進(jìn)行比較。
本發(fā)明還涉及如前面定義的組合物或載體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是非人哺乳動(dòng)物方面的應(yīng)用，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)于潛伏期研究或生物利用率、標(biāo)記等研究是很有效的。
通過下述實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例被認(rèn)為是說明性的，而不是限制性的。


圖1圖示法說明FTKpGL3質(zhì)粒。
圖2圖示法說明Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒。
圖3圖示法說明Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒。
圖4圖示法說明DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒。
圖5圖示法說明DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒。
圖6鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克FTKpGL3質(zhì)粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARg2質(zhì)粒，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖7鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克FTKpGL3質(zhì)粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARa(Koz)質(zhì)粒，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖8圖示法說明Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。
圖9鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒(a)，或Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2質(zhì)粒，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖10鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克JxnAS-TK-pGL3質(zhì)粒；②10納克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖11鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克JxnAS-CMV-pGL3質(zhì)粒；②10納克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒(a)或50納克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒(b)，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖12圖示法說明pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒。
圖13hPPARg2和hPPARg2g2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的比較。鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)用①10納克Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒；②增加量的pSG5-hPPARg2質(zhì)粒(a)或pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒(b)，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示了用Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinuspyralis的熒光素酶活性用pSG5-hPPARg2質(zhì)?；騪SG5-hPPARg2g2質(zhì)粒得到的BRL49653的誘導(dǎo)因子。通過用DMSO存在下的活性除以在BRL49653存在下的活性，可計(jì)算出這個(gè)誘導(dǎo)因子。
圖14圖示法說明Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒。
圖15鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)在試管中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)所評(píng)價(jià)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些細(xì)胞用①10納克Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒(a)，或Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒，以及③20納克pRL-null質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renilla reniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖16圖示法說明Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質(zhì)粒。
圖17圖示法說明SV-g2-J10-C-pGL3質(zhì)粒。
圖18圖示法說明hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒。
圖19圖示法說明hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。
圖20在試管中不同誘導(dǎo)系統(tǒng)版本的比較。每個(gè)系統(tǒng)版本，使用相同摩爾數(shù)的誘導(dǎo)表達(dá)盒轉(zhuǎn)染鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)。以通過使用pCMV-前導(dǎo)TK質(zhì)粒得到的hCMV-IE啟動(dòng)子活性百分?jǐn)?shù)表示這些結(jié)果。通過用有DMSO存在時(shí)的活性除以有BRL49653存在時(shí)的活性，可計(jì)算出BRL49653誘導(dǎo)因子。1＝pSG5-hPPARg2+Jx5AS-TK-pGL3；2＝Jx5AS-TK-luc-hPPARg2；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；5＝SV-g2-J10-C-pGL3；6＝hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3；7＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3；8＝hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3；9＝hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3。
圖21BRL49653和RG12525配體在試管中的比較。鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)用①10納克其表達(dá)盒存在于(a)的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒；和②10納克pRL-null質(zhì)粒(b)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性表示通過Renillareniformis的熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的Photinus pyralis的熒光素酶活性。
圖22在活體中不同誘導(dǎo)系統(tǒng)版本的比較。在C57Bl/6鼠(每組6只鼠)顱側(cè)脛骨兩側(cè)注射對(duì)于每個(gè)系統(tǒng)版本而言相同摩爾數(shù)的誘導(dǎo)表達(dá)盒。在每塊肌肉上施加電轉(zhuǎn)移。處理的動(dòng)物每天采用強(qiáng)飼法接受30毫克/千克BRL49653。在注射DNA后四天，動(dòng)物經(jīng)宰殺后，取下肌肉測(cè)量熒光素酶活性。1＝pCMV-前導(dǎo)TK；2＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3。
圖23在活體內(nèi)不同BRL49653誘導(dǎo)方案的比較。在C57Bl/6鼠(每組6只鼠)顱側(cè)脛側(cè)骨兩側(cè)注射10微克包含1微克其表達(dá)盒存在于(a)中的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒的DNA。用不同誘導(dǎo)方案得到的活性匯集在部分(b)中。
圖24圖示法說明pRDA02質(zhì)粒。
圖25在活體內(nèi)用誘導(dǎo)系統(tǒng)得到的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。(A)在十只C57Bl/6鼠顱側(cè)脛側(cè)骨兩側(cè)注射包含3毫克pRDA02質(zhì)粒和3毫克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒的DNA混合物。這時(shí)在每塊肌肉上施加電轉(zhuǎn)移。在注射DNA后第四天，然后第39天，采用強(qiáng)飼法用30毫克/千克BRL49653處理動(dòng)物。在不同時(shí)間抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix，PE Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)，測(cè)量質(zhì)粒中分泌的堿性磷酸酶的酶活性。(B)在C57Bl/6鼠(兩組各十只)顱側(cè)脛側(cè)骨兩側(cè)注射包含3毫克pRDA02質(zhì)粒和3毫克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒的DNA混合物。這時(shí)在每塊肌肉上施加電轉(zhuǎn)移。在注射DNA后四天，采用強(qiáng)飼法，動(dòng)物或者僅一次接受劑量30毫克/千克BRL49653，或者5天內(nèi)每天接受一次劑量(30毫克/千克)。在不同時(shí)間取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，測(cè)量血漿中hSeAP的酶活性。列出的結(jié)果(誘導(dǎo)因子)相應(yīng)于在有意義那天測(cè)量的hSeAP活性與第四天得到的活性的比。
圖26在活體內(nèi)比較不同PPARg配體并且研究其中一種配體的劑量效果。在C57Bl/6鼠(每組五只)顱側(cè)脛骨兩側(cè)注射包含5毫克pRDA02質(zhì)粒和5毫克pSG5-hPPARg2質(zhì)粒的DNA混合物。這時(shí)在每塊肌肉上施加電轉(zhuǎn)移。在注射DNA后六天(A)或十天(B)，采用強(qiáng)飼法，動(dòng)物或者用不同的PPARg配體(A；BRL49653，ActosTM(Takeda Phamaceuticals)和AvandiaTM(SmithKline Beecham))，或者用不同劑量BRL49653(B)處理。在不同時(shí)間抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，測(cè)量血漿中hSeAP的酶活性。列出的結(jié)果(誘導(dǎo)因子)相應(yīng)于在有意義那天測(cè)量的hSeAP活性與第六天(A)或第十天(B)得到的活性的比。
圖27圖示法說明Jx10AS-CMV-VEGFA165質(zhì)粒。
材料與方法分子生物學(xué)中通常使用的方法，例如質(zhì)粒DNA制備提取法，質(zhì)粒DNA的氯化銫梯度離心法，瓊脂糖凝膠電泳法，DNA片段電洗脫純化法，在鹽介質(zhì)中采用乙醇或異丙醇完成的質(zhì)粒DNA沉淀法，在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化法，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知內(nèi)容并且在文獻(xiàn)中作過大量描述(Sambrook及其同事，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
被用于克隆不同啟動(dòng)子區(qū)的pGL3-Basic質(zhì)粒以及pRL-null質(zhì)粒都是商業(yè)來源的質(zhì)粒(Promega Corportion)，pSG5(Stratagene)，pBluescript IISK+(Stratagene)和pSL301(Invitrogen Corportion)質(zhì)粒也是商業(yè)來源的質(zhì)粒。前面描述過構(gòu)建pSG5-hPPARg2表達(dá)質(zhì)粒(Fajas及其同事，《生物化學(xué)雜志》272，(1997)18779-18789)和pSG5-hPPARa(Koz)(Gervois P.及其同事，《Mol.Endocrinol.》13(1999)400-409)。
在25/09/98的法國(guó)專利申請(qǐng)F(tuán)R98/120000和美國(guó)專利申請(qǐng)US SN 60/123298(臨時(shí)申請(qǐng))中也描述過構(gòu)建pCMV-前導(dǎo)TK質(zhì)粒。
需要注意的是這種質(zhì)粒以下述方式構(gòu)建。Tanaka及其同事描述過的pCGN表達(dá)載體(《細(xì)胞》，60(1990)375-386)包含CMV啟動(dòng)子(-522/+72)，在編碼血凝素抗原決定簇的序列上游，該啟動(dòng)子與HSV的tk基因(+51/+101)的《頂枝》融合。pGCN質(zhì)粒(10納克)被用作ACP擴(kuò)增的基質(zhì)。曾使用的引物如下
-6718引物(5’CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG3’)(SEQ ID NO26)，這種引物與-522位的CMV啟動(dòng)子(在pGCN的EcoRI位點(diǎn)下游8個(gè)核苷酸)雜化。
-6719引物(5’GGGACGCGCTTCACAAGGCGCTGGCCGAA3’)(SEQ ID NO27)，這種引物發(fā)生雜化直到tk《前導(dǎo)區(qū)》的101位為止。如下面所解釋的，采用粗體字標(biāo)記的第一核苷酸G用于修復(fù)pGL3-Basic的Ncol位點(diǎn)。
如此得到的ACP片段經(jīng)純化后，再用T4噬菌體的多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化(New Englands Biolabs)。同時(shí)，pGL3-Basic載體(Promega)用Ncol線性化，純化，然后用Klenow DNA聚合酶(Boehringer Manheim)處理，以便填平Ncol位點(diǎn)。這種載體然后用堿性磷酸酶(Boehringer Manheim)進(jìn)行去磷酸化，再用于插入磷酸化ACP片段。于是，只有當(dāng)用在pGL3-Basic的HindIII位點(diǎn)下游的5’部分(6718引物，CMV的-522位)使CMV-前導(dǎo)區(qū)tk片段定向，并且其3’端(6719引物，前導(dǎo)區(qū)tk)與pGL3-Basic的Ncol位點(diǎn)(熒光素酶的第一個(gè)ATG)連接時(shí)，6719引物的鳥苷(G)能夠修復(fù)Ncol位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒命名為pCMV-前導(dǎo)TK。
根據(jù)生產(chǎn)者的推薦，通過使用DNA熱循環(huán)器TM(Perkin Elmer Cetus)，可以借助ACP(通過聚合酶擴(kuò)增鏈)技術(shù)進(jìn)行DNA片段酶擴(kuò)增。
根據(jù)生產(chǎn)者的推薦，使用電穿孔儀在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒DNA的電穿孔。
采用Sanger及其同事研制的方法(《Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.》74，(1977)5463-5467)，根據(jù)生產(chǎn)者推薦，使用由應(yīng)用生物系統(tǒng)提供的試劑盒，確認(rèn)核苷酸序列。
在補(bǔ)充10％胎牛血清(SVF)的DMEMTM介質(zhì)(Life Technologies Inc.)中培養(yǎng)C2C12鼠的成肌細(xì)胞。在37℃烘箱中，在潮濕氣氛與5％CO2分壓下進(jìn)行培養(yǎng)。
在24孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)轉(zhuǎn)染進(jìn)行三次。在轉(zhuǎn)染前二十四小時(shí)，每個(gè)孔接種在DMEMTM介質(zhì)中的3×104個(gè)細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)孔，500納克質(zhì)粒DNA(目的質(zhì)粒和pBluescript II SK+，以補(bǔ)充到500納克)與RPR120535 B陽離子脂類(WO97/18185)，按照每微克DNA 6納摩爾脂類，在包含150毫摩爾NaCl和50毫摩爾碳酸氫鹽的DMEMTM介質(zhì)(最后20微升)中混合。在室溫下20分鐘后，在沒有SVF的情況下，20微升DNA/脂類混合物與這些細(xì)胞接觸2小時(shí)。培養(yǎng)介質(zhì)這時(shí)補(bǔ)加SVF和ULTROSERTM(BioSepra Inc.)，以便最后濃度分別達(dá)到10％或2％。與SVF或ULTROSERTM同時(shí)，將溶于DMSO中的PPAR配體加入培養(yǎng)介質(zhì)中。在轉(zhuǎn)染后四十八小時(shí)，取出培養(yǎng)介質(zhì)，用PBS(Life Technologies Inc.)清洗細(xì)胞兩次。這時(shí)根據(jù)供應(yīng)商的推薦，使用Dual-Luciferase Reporter AssaySystemTM(Promega)，測(cè)定Renilla pyralis的熒光素酶活性和Renillarenifomis的熒光素酶活性。
用6周齡C57BI/6雌鼠在活體內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。這些動(dòng)物用250微升氯胺酮(Rhne Mérieux，最后為10毫克/毫升)/甲苯噻嗪(Bayer Pharma，最后為0.3毫克/毫升)的混合物，通過腹膜內(nèi)方式進(jìn)行麻醉。這時(shí)，在每個(gè)顱側(cè)脛骨肌中注射總量為10微克DNA。然后，每個(gè)爪被施加電場(chǎng)(頻率1Hz；在250伏/厘米下4個(gè)脈沖，每個(gè)脈沖為20毫秒)。在整個(gè)試驗(yàn)期，在每天早晨采用強(qiáng)飼法，讓這些動(dòng)物接受30毫克/千克BRL49653(SmithKline Beecham)在1％(重量/體積)羧基纖維素中的溶液，或者只是接受1％羧基纖維素。在轉(zhuǎn)移基因后四天，宰殺這些動(dòng)物，在Lysing MatrixTM管(BIO 101，Inc.)的PLBTM細(xì)胞溶解緩沖液(Promega Corporation)中取下肌肉。使用FastPrepTM(BIO 101，Inc.)以6.5米/秒磨碎肌肉25秒，這樣能夠提取熒光素酶。根據(jù)供應(yīng)商推薦，這時(shí)使用Luciferase Assay SystemTM盒(Promega Corporation)測(cè)定Photinuspyralis的熒光素酶活性。
實(shí)施例實(shí)施例1用PPAR構(gòu)建誘導(dǎo)啟動(dòng)子和構(gòu)建包含這些啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒1.1 FTKpGL3質(zhì)粒使用pBLCAT2質(zhì)粒(Luckow B.和Schutz G.，《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)，15(1987)5490)作為基質(zhì)并且利用5’CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGCCCA GCG 3’(SEQ ID NO28)和5’TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3’(SEQID NO2)寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增相應(yīng)于一部分1型單純皰疹病毒TK基因啟動(dòng)子的DNA片段，與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相比，該片段位-105位至+56位之間。這個(gè)片段用BaIII和HindIII消化，然后在預(yù)先用BaIII和HindIII消化的pGL3-Basic質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，以便得到FTKpGL3質(zhì)粒。這個(gè)質(zhì)粒的示意圖說明于圖1中。
1.2 JxnS-TK-pGL3質(zhì)粒使用J3TK-pGL3質(zhì)粒(Vu-Dac N.及其同事，《J.Clin.Invest.》96(1995)741-750)作為基質(zhì)并且利用3RDA37(5’ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTAGAG GAT CTC TAC CAG G3’；SEQ ID NO3’)和4RDA48(5’CGA TGG TAC CCT CGAGCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3’；SEQ ID NO4)寡核苷酸作為引物，借助ACP使包含一個(gè)或多個(gè)(n)人ApoA-II基因的啟動(dòng)子J位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增。這個(gè)片段用Xhol和Spel消化，然后在預(yù)先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質(zhì)粒中，沿TK(S)最小啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄方向進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的J位點(diǎn)數(shù)得到Jx1S-TK-pGL3、Jx2S-TK-pGL3和Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒。Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒的示意圖如圖2所示。
通過使用J3TKpGL3質(zhì)粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物被ACP擴(kuò)增的、用Xhol和Spel消化的DNA片段，也在預(yù)先用Xhol和Nhel消化的Jx3S-TK-pGL3質(zhì)粒中克隆，以便根據(jù)存在的J位點(diǎn)數(shù)得到Jx4S-TK-pGL3、Jx5S-TK-pGL3和Jx6S-TK-pGL3質(zhì)粒。
1.3 JxnAS-TK-pGL3質(zhì)粒A JxnAS-TK-pGL3質(zhì)粒在存在于誘導(dǎo)啟動(dòng)子中的J位點(diǎn)定向方面與JxnS-TK-pGL3質(zhì)粒不同。通過使用J3TKpGL3質(zhì)粒作為基質(zhì)，3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增包含一個(gè)或多個(gè)人ApoA-II基因的啟動(dòng)子J位點(diǎn)的DNA片段。這個(gè)片段用Sall和Nhel消化，然后在用Xhol和Nhel預(yù)先消化的FTXpGL3質(zhì)粒中，沿TK(AS)最小啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄相反方向進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的J位點(diǎn)數(shù)得到Jx1AS-TK-pGL3、Jx2AS-TK-pGL3和Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒。Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒的示意圖如圖3所示。
通過使用J3TKpGL3質(zhì)粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物被ACP擴(kuò)增的、用Kpnl和Spel消化的DNA片段，也在預(yù)先用Kpnl和Nhel消化的Jx3AS-TK-pGL3質(zhì)粒中，沿反方向(AS)進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的J位點(diǎn)數(shù)得到Jx4AS-TK-pGL3和Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒。
1.4 DR1xnS-TK-pGL3質(zhì)粒這些質(zhì)粒包含被稱作共有DR1的共有序列(AGGTCA A AGGTCA，SEQ ID NO5)作為對(duì)PPAR反應(yīng)的成分(PPRE)。通過使用1RDA69(5’ACG TGT CGA CAC TAGTCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AACTAG3’；SEQ ID NO6)和2RDA64(5’CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCGTGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3’；SEQ ID NO7)寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增包含一個(gè)或多個(gè)共有DR1位點(diǎn)的DNA片段。這個(gè)片段用Xhol和Spel消化，然后在預(yù)先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質(zhì)粒中，沿取向方向進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的共有DR1位點(diǎn)數(shù)得到DR1x2S-TK-pGL3和DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒。DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒的示意圖如圖4所示。
通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物時(shí)借助ACP擴(kuò)增的用Xhol和Spel消化的DNA片段，還在用Xhol和Nhel預(yù)先消化的DR1x3S-TK-pGL3質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的共有DR1位點(diǎn)數(shù)得到DR1x5S-TK-pGL3、DR1x6S-TK-pGL3和DR1x7S-TK-pGL3質(zhì)粒。
1.5 DR1xnAS-TK-pGL3質(zhì)粒DR1xnAS-TK-pGL3質(zhì)粒與DR1xnS-TK-pGL3質(zhì)粒在存在于誘導(dǎo)啟動(dòng)子中的共有DR1位點(diǎn)的定向方面不同。通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增包含一個(gè)或多個(gè)共有DR1序列的DNA片段。這個(gè)片段用Sall和Nhel消化，然后在預(yù)先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質(zhì)粒中，沿反方向進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的共有DR1位點(diǎn)數(shù)得到DR1x2AS-TK-pGL3和DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒。DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒的示意圖如圖5所示。
通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增的Kpnl和Spel消化的DNA片段，還在預(yù)先用Kpnl和Nhel消化的DR1x3AS-TK-pGL3質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，以便根據(jù)存在的共有DR1位點(diǎn)數(shù)得到DR1x5AS-TK-pGL3和DR1x6AS-TK-pGL3質(zhì)粒。
實(shí)施例2PPAR對(duì)不同反應(yīng)成分的特效性2.1.使用hPPARg2的系統(tǒng)在鼠的成肌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中(圖6)，曾評(píng)價(jià)過使用hPPARg2作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因時(shí)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。這些結(jié)果表明，根據(jù)使用的反應(yīng)成分(PPRE)，使用hPPARg2(BRL49653)的配體的誘導(dǎo)作用與激活后最后的活性都隨之改變。使用J位點(diǎn)作為PPRE時(shí)得到最佳結(jié)果。另外，PPRE方向也很重要。在J位點(diǎn)的情況下，AS方向更為有利(部分c)。
2.2.使用hPPARa的系統(tǒng)使用hPPARa作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因所得到的結(jié)果匯集于圖7。與hPPARg2相反，對(duì)于hPPARg2，共有DR1才是最佳PPRE(部分d和e)。
因此，這些結(jié)果表明(1)本發(fā)明質(zhì)粒的泛函性和(2)根據(jù)選自誘導(dǎo)系統(tǒng)的PPAR，重要的是選擇對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因最合適的PPRE。由于配體存在，這種選擇可能影響誘導(dǎo)因子，但也影響誘導(dǎo)后所達(dá)到的活性水平。不言而喻，其他PPRE也可以用于本發(fā)明系統(tǒng)。
實(shí)施例3用PPAR構(gòu)建誘導(dǎo)啟動(dòng)子，它們包含除HSV1-TK啟動(dòng)子外的最小啟動(dòng)子，例如像hCMV-IE最小啟動(dòng)子3.1.構(gòu)建包含hCMV-IE最小啟動(dòng)子的質(zhì)粒通過使用pCMVβ質(zhì)粒(Clontech)作為基質(zhì)并且利用5RDA32(5’ACG TAGATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3’；SEQ ID NO8)和6RDA29(5’ACG TAAGCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3’；SEQ ID NO9)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增包含hCMV-IE最小啟動(dòng)子(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從-54位到+48位)的DNA片段。這個(gè)片段用HindIII和BqIII消化，然后在用HindIII和BqIII預(yù)先消化的FTKpGL3質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，以便得到FCMVpGL3質(zhì)粒。
用BgIII和Nhel消化Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒，以便分離包含5個(gè)J位點(diǎn)復(fù)制品的179pb BgIII-Nhel片段。這個(gè)片段被插入用BgIII和Nhel預(yù)先消化的FCMVpGL3質(zhì)粒以便得到Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒示意圖如圖8所示。
用Sphl和Nhel消化Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，分離出包含5個(gè)J位點(diǎn)復(fù)制品，hCMV-IE最小啟動(dòng)子和編碼熒光素酶的基因5’部分的982pb Sphl-Nhel片段。這個(gè)片段被插入用Sphl和Spel預(yù)先消化的Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中以便得到Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。根據(jù)同樣的構(gòu)想，可得到Jx15AS-CMV-pGL3和Jx20AS-CMV-pGL3質(zhì)粒3.2.包含hCMV-IE最小啟動(dòng)子的質(zhì)?；钚栽谒矔r(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)可被用于誘導(dǎo)系統(tǒng)中的最小啟動(dòng)子進(jìn)行過比較。匯集于圖9中的結(jié)果表明，根據(jù)最小啟動(dòng)子，誘導(dǎo)后的最后活性可以增大或減少一倍。這些結(jié)果特別地表明，在試驗(yàn)條件下，CMV啟動(dòng)子似乎給出較高的活性。當(dāng)然，其他的最小啟動(dòng)子，如不包含TATA盒的啟動(dòng)子，也可以使用。
實(shí)施例4在誘導(dǎo)啟動(dòng)子中存在的反應(yīng)成分?jǐn)?shù)的重要性在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)存在于誘導(dǎo)啟動(dòng)子中的PPRE數(shù)的最優(yōu)化進(jìn)行研究。在圖10中列出的結(jié)果表明，PPRE復(fù)制品數(shù)量越大，配體的誘導(dǎo)因子和誘導(dǎo)活性就越高。相反地，如果這個(gè)數(shù)太大，誘導(dǎo)因子和誘導(dǎo)活性同時(shí)隨之降低，不管試驗(yàn)中存在的hPPAPRg2量如何都是如此(圖11)。最佳PPRE數(shù)似乎是10-15。
實(shí)施例5用PPAR的配體構(gòu)建強(qiáng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因5.1.構(gòu)建包含兩個(gè)配體鏈區(qū)復(fù)制品的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因。構(gòu)建pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒通過使用pSG5-hPPARg2質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用20RDA21(5’GGT TTG CTGAAT GTG AAG CCC 3’；SEQ ID NO10)和21RDA42(5’AGT CTC TAG AGC TAC GCGTAC AAG TCC TTG TAG ATC TCC TGC3’；SEQ ID NO11)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增被標(biāo)記為A的DNA片段，該片段包含編碼F區(qū)C-端部的hPPARg2的互補(bǔ)DNA區(qū)。通過使用pSG5-hPPARg2質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用22RDA32(5’AGTCAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3’；SEQ ID NO12)和23RDA21(5’GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3’；SEQ ID NO13)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增被標(biāo)記為B的DNA片段，該片段包含編碼E和F區(qū)的hPPARg2互補(bǔ)DNA區(qū)。用Sacl和Mlul消化的A片段與用Mlul和Xbal消化的B片段一起，在用Sacl和Xbal預(yù)先消化的pSG5-hPPARg2質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，得到pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒。其示意圖如圖8所示的這個(gè)質(zhì)粒包含編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(記為hPPARg2g2)的互補(bǔ)DNA，而該調(diào)節(jié)基因包含兩個(gè)E和F區(qū)復(fù)制品，即兩個(gè)配體鏈區(qū)。
下面列出PPARγ2γ2的完全序列(SEQ ID NO24)MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY
包含E和F區(qū)的PPARγ2γ2的C-端部分的序列是下述SEQ ID NO25序列MMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY5.2.pSG5-hPPARg2g2質(zhì)粒的活性圖13中列出的結(jié)果表明，如果使用hPPARg2g2作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因時(shí)，誘導(dǎo)活性比較低(圖13a和b)，則使用這種調(diào)節(jié)基因時(shí)，配體的誘導(dǎo)因子(圖13c)明顯地較高。兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因之間的差別可用下述事實(shí)解釋對(duì)于hPPARg2g2，沒有配體存在時(shí)系統(tǒng)的基底噪聲是低的，盡管存在一定量的調(diào)節(jié)基因，但仍然保持低水平。另一方面，hPPARg2g2量增加越大，誘導(dǎo)活性也越強(qiáng)，使用看來飽和的hPPARg2的系統(tǒng)就不是這種情況。
因此，第二個(gè)配體鏈區(qū)(hPPARg2g2)的存在通過配體賦予轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因以更大的誘導(dǎo)性。
實(shí)施例6提高誘導(dǎo)啟動(dòng)子的最后活性6.1.構(gòu)建包含hEF1a基因內(nèi)區(qū)的誘導(dǎo)表達(dá)盒。構(gòu)建Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒通過使用25RDA35(5’AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG3’；SEQ ID NO14)和26RDA36(5’AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTCACG ACC 3’；SEQ ID NO15)寡核苷酸作為引物借助ACP擴(kuò)增包含編碼hEF1a的基因的第一個(gè)基因內(nèi)區(qū)的DNA片段(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從+16位到+984位；進(jìn)入Genbank的編號(hào)E02627)。這個(gè)片段用HindIII和NcoI消化，然后在用HindIII和NcoI預(yù)先消化的Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中進(jìn)行克隆，得到Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒。Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒示意圖如圖14所示。
6.2.Jx10AS-CMV-EF-pGL3質(zhì)粒的活性為了提高系統(tǒng)的最后活性，在誘導(dǎo)啟動(dòng)子附近克隆位于hEF1a基因的第一個(gè)基因內(nèi)區(qū)中的增強(qiáng)子序列。圖15中列出的結(jié)果表明，增強(qiáng)子區(qū)的存在提高了系統(tǒng)的誘導(dǎo)活性，無論轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因使用量為多少仍然如此。
實(shí)施例7構(gòu)建同時(shí)包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因表達(dá)盒和誘導(dǎo)表達(dá)盒的質(zhì)粒7.1.Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質(zhì)粒用Mlul和Scal消化pSG5-hPPARa(Koz)質(zhì)粒，以便分離包含hPPARa互補(bǔ)DNA的3’區(qū)的1229pb Mlul-Scal片段。這個(gè)片段插入用Mlul和Smal預(yù)先消化的pSL-301質(zhì)粒中，得到pSL-3’hPPARa質(zhì)粒。
用Sall和Mlul消化pSG5-hPPARa(Koz)質(zhì)粒，以便分離包含SV40病毒早期啟動(dòng)子和hPPARa互補(bǔ)DNA的5’區(qū)的1406pb Mlul-Scal片段。這個(gè)片段插入用Xhol和Mlul預(yù)先消化的pSL-3’hPPARa質(zhì)粒，得到pSL-hPPARa質(zhì)粒。
用Spel和Sall消化pSL-hPPARa質(zhì)粒，以便分離包含SV40病毒早期啟動(dòng)子和hPPARa互補(bǔ)DNA的2664pb Spel-Sall片段。這個(gè)片段插入用Spel和Sall預(yù)先消化的pBluescript II SK+質(zhì)粒中，得到pBS-hPPARa質(zhì)粒。
用Avrll和Sacl消化pSG5-hPPARg2質(zhì)粒，以便分離包含hPPARg2互補(bǔ)DNA的5’區(qū)的2070pb Avrll-Sacl片段(標(biāo)記為C)。通過使用pSG5-hPPARg2質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用10RDA21(5’CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3’；SEQ ID NO16)和11RDA40(5’TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTGC3’；SEQ ID NO17)寡核苷酸作為引物；借助ACP擴(kuò)增包含hPPARg2互補(bǔ)DNA的3’區(qū)的DNA片段(標(biāo)記為D)。在用Avrll和Sall預(yù)先消化的pBS-hPPARa質(zhì)粒中，使采用Sacl和Sall消化的片段C和片段D一起進(jìn)行克隆，得到pBS-hPPARg2質(zhì)粒。
使用Kpnl和Sall消化Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒，以便分離在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下包含luc+基因的2324pb Kpnl-Sall片段。這個(gè)片段插入用Kpnl和Sall預(yù)先消化的pBS-hPPARg2質(zhì)粒中，得到Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質(zhì)粒。Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質(zhì)粒示意圖如圖16所示。
7.2.SV-g2-J10-C-pGL3質(zhì)粒用Notl和Sall消化pBS-hPPARg2質(zhì)粒，以便分離在SV40早期啟動(dòng)子控制下包含hPPARg2互補(bǔ)DNA的2622pb Notl-Sall片段(標(biāo)記為E)。通過使用FTK-pGL3質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用18RDA31(5’AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACATGA TAA G 3’；SEQ ID NO18)和19RDA35(5’AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTTATC GAT TTT ACC AC 3’；SEQ ID NO19)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增包含SV40病毒的多腺苷酸化位點(diǎn)的DNA片段(標(biāo)記為F)。在用Notl和Nhel預(yù)先消化的Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中，使采用Sall和Nhel消化的片段E和片段F一起進(jìn)行克隆，得到SV-g2-J10-C-pGL3質(zhì)粒。SV-g2-J10-C-pGL3質(zhì)粒示意圖如圖17所示。
7.3.hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒通過使用Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用12RDA50(5’GTCAGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3’；SEQID NO20)和13RDA42(5’TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGAGTT TGG 3’；SEQ ID NO21)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增包含hPPARg2互補(bǔ)DNA的DNA片段(標(biāo)記為G)。通過使用pCMVβ質(zhì)粒作為基質(zhì)并且利用14RDA33(5’GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3’；SEQ ID NO22)和15RDA33(5’TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GCG 3’；SEQID NO23)寡核苷酸作為引物，采用ACP擴(kuò)增包含hCMV-IE最小啟動(dòng)子(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)，從-54位到+48位)的DNA片段(標(biāo)記為H)。在用Kpnl和Nhel預(yù)先消化的Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒中，采用Kpn和Xhol消化的片段G和采用Xhol和Nhel消化的片段H一起進(jìn)行克隆，得到hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒。hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒示意圖如圖18所示。
7.4.hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3質(zhì)粒用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，以便分離在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下包含luc+基因5’區(qū)的982pb Nhel-Sphl片段。這個(gè)片段插入用Spel和Sphl預(yù)先消化的hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質(zhì)粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒示意圖如圖19所示。
用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，以便分離在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下包含luc+基因5’區(qū)的982pb Nhel-Sphl片段。這個(gè)片段插入用Spel和Sphl預(yù)先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。
用Nhel和Sphl消化Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，以便分離在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下包含luc+基因5’區(qū)的1151pb Nhel-Sphl片段。這個(gè)片段插入用Spel和Sphl預(yù)先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3質(zhì)粒。
實(shí)施例8在活體外不同誘導(dǎo)系統(tǒng)版本的比較圖20匯集了在活體外用多種誘導(dǎo)系統(tǒng)版本得到的結(jié)果。這些結(jié)果表明，與僅具有一個(gè)質(zhì)粒的系統(tǒng)(圖20，曲線2和5-9)一樣，使用兩個(gè)質(zhì)粒的系統(tǒng)(圖20，曲線1、3和4)是功能性的也就是說PPARg(在此為BRL49653)配體的存在明顯增強(qiáng)了置于誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的基因表達(dá)。還應(yīng)該指出，對(duì)于某些系統(tǒng)(圖20，曲線3和7-9)，配體誘導(dǎo)因子高于30，而對(duì)于圖20曲線4所示系統(tǒng)，誘導(dǎo)后的活性等于強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，如hCMV-IE啟動(dòng)子活性。
實(shí)施例9不同的PPAR配體能夠激活誘導(dǎo)系統(tǒng)9.1.使用hPPARg2的系統(tǒng)圖21中的結(jié)果表明除BRL49653外的hPPARg配體，在此為RG12525(hPPARg的RPR配體)，可以用于激活誘導(dǎo)系統(tǒng)。在100微摩爾濃度下，用RG12525處理甚至得到與采用BRL49653得到的誘導(dǎo)作用相比更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。hPPARg的所有其它配體因此可以用作系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑。
9.2.使用hPPARa的系統(tǒng)與使用hPPARg的系統(tǒng)一樣，使用hPPARa作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)可以用例如纖維酸鹽或WY-14643或hPPARa的任何其它配體激活。
實(shí)施例10在活體內(nèi)在肌肉中可以激活誘導(dǎo)系統(tǒng)圖22匯集了使用不同版本的誘導(dǎo)系統(tǒng)在活體肌肉中所得到的結(jié)果。這些結(jié)果表明，對(duì)于三種試驗(yàn)的版本(圖22，曲線2-4)，采用強(qiáng)飼法用hPPARg配體處理能夠在肌肉中明顯提高誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。誘導(dǎo)因子是，圖22曲線2版本為×14，圖22曲線3版本為×8，圖22曲線4版本為×24。此外，對(duì)于其中一個(gè)版本(圖22曲線2)，在被BRL49653處理的動(dòng)物體內(nèi)所達(dá)到的活性與諸如hCMV-IE啟動(dòng)子之類強(qiáng)啟動(dòng)子的活性處于同一數(shù)量級(jí)。
在圖23中列出的結(jié)果還表明，僅一次施用配體就可以誘導(dǎo)該系統(tǒng)，并且這種施用可在基因轉(zhuǎn)移前或后進(jìn)行。這個(gè)試驗(yàn)還表明比常用劑量小兩倍的劑量就能夠達(dá)到同樣的誘導(dǎo)因子。
使用PPAR核受體作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)，因此在活體內(nèi)是功能性的，通過口服PPAR配體可以誘導(dǎo)該系統(tǒng)。
實(shí)施例11構(gòu)建能夠誘導(dǎo)表達(dá)分泌產(chǎn)物的基因的質(zhì)粒11.1.構(gòu)建pRDA02質(zhì)粒用HindIII和Mlul消化Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒，以便分離459pbHindIII-Mlul片段。這種片段插入用HindIII和Mlul預(yù)先消化的pXL3010質(zhì)粒中(Bettan M.及其同事，《Anal.Biochem.》，271(1999)187-189)，得到pRDA02質(zhì)粒。這種質(zhì)粒包含編碼人胎盤堿性磷酸酶分泌形式(hSeAP)的基因的互補(bǔ)DNA，其磷酸酶表達(dá)通過利用PPAR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)處在誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下。pRDA02質(zhì)粒示意圖說明于圖24中。
實(shí)施例12誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠在活體內(nèi)調(diào)節(jié)分泌蛋白中的質(zhì)粒濃度圖25中列出的結(jié)果表明，使用誘導(dǎo)系統(tǒng)時(shí)，可以隨時(shí)調(diào)節(jié)由肌肉分泌的蛋白中的質(zhì)粒濃度，這一點(diǎn)可以通過僅口服一次PPAR配體來實(shí)現(xiàn)。在施用配體后兩天，增加hSeAP質(zhì)粒濃度的17倍(圖25A)，一星期后恢復(fù)到其基礎(chǔ)水平。在第21天至第39天之間，觀察到對(duì)人源的hSeAP免疫反應(yīng)，并表現(xiàn)為這種蛋白質(zhì)粒濃度降低。盡管存在這種免疫反應(yīng)，仍然可能進(jìn)行第二個(gè)誘導(dǎo)周期(圖25A)。
正如圖25B所表明的，每天多次服用配體，在與處理時(shí)間相同的時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)系統(tǒng)也能夠使hSeAP質(zhì)粒濃度保持高水平。
實(shí)施例13不同的PPAR配體可以激活在活體內(nèi)的誘導(dǎo)系統(tǒng)，并以依賴劑量的方式激活誘導(dǎo)系統(tǒng)呈現(xiàn)用于治療II型糖尿病的銷售形式的BRL49653(AvandiaTM，SmithKlineBeecham)和用于這種同樣治療的呈銷售形式的pioglitazone(ActosTMTakedaPharmaceuticals)也可以激活誘導(dǎo)系統(tǒng)(圖26A)。圖26B還表明，誘導(dǎo)因子與使用的配體劑量直接相關(guān)。
使用PPAR核受體作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)因此能夠非常精確地控制分泌蛋白的質(zhì)粒含量。此外，使用不同的PPAR配體時(shí)，可以達(dá)到這種調(diào)節(jié)。
實(shí)施例14構(gòu)建能誘導(dǎo)表達(dá)其產(chǎn)物是血管生成因子的基因的質(zhì)粒
14.1.構(gòu)建Jx10AS-CMV-VEGFA165質(zhì)粒由人胎盤總RNA通過反轉(zhuǎn)錄和PCR克隆人VEGF165閱讀區(qū)(Clontech)(Houck等人，《Mol.Endocrinol.》12(1991)1806-1814)，然后插入包含-522位至+72位的CMV E/P啟動(dòng)子和SV40的緩步類polyA的pBluescript質(zhì)粒(Stratagene)，以便得到pXL3218質(zhì)粒。這個(gè)質(zhì)粒然后用HindIII和BsrGI消化，以便分離482pb HindIII-BsrGI片段A。pXL3218質(zhì)粒還可用BsrGI和BamHI消化，以便分離390pb BsrGI-BamHI片段B。A和B片段插入預(yù)先用HindIII和BamHI消化的Jx10AS-CMV-pGL3質(zhì)粒中，以便得到Jx10AS-CMV-VFGFA165質(zhì)粒。這個(gè)質(zhì)粒包含編碼VEGFA165的基因互補(bǔ)DNA，通過使用PPAR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)，在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下表達(dá)VEGFA165。Jx10AS-CMV-VEGFA質(zhì)粒示意圖如圖27所示。
這個(gè)質(zhì)粒例如能用于以治療目的隨時(shí)控制VEGF的血管生成活性。
序列表<110>阿文蒂斯藥物股份有限公司<120>使用PPAR核受體及其配體的藥理學(xué)調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)<130>序列<140><141><160>28<170>在2.1版本中專利<210>1<211>19<212>ADN<213>智人<400>1tcaaccttta ccctggtag 19<210>2<211>27<212>ADN<213>智人<400>2tcgccaagct tctcgtgatc tgcggca 27<210>3<211>37<212>ADN<213>智人<400>3acgtgtcgac actagtggct agaggatctc taccagg 37<210>4<211>48<212>ADN<213>智人<400>4cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagcga gatccttcaa cctttacc 48<210>5<211>13<212>ADN<213>智人<400>5aggtcaaagg tca 13<210>6<211>69<212>ADN<213>智人<400>6acgtgtcgac actagtcaaa actaggtcaa aggtcacgga aaactaggtc aaaggtcacg 60gaaaactag 69<210>7<211>64<212>ADN<213>智人<400>7cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagccg tgacctttga cctagttttc cgtgaccttt 60gacc64<210>8<211>32<212>ADN<213>智人<400>8acgtagatct cggtaggcgt gtacggtggg ag 32<210>9<211>29<212>ADN<213>智人<400>9acgtaagctt ctatggaggt caaaacagc 29<210>10<211>21<212>ADN<213>智人<400>10ggtttgctga atgtgaagcc c 21<210>11<211>42<212>ADN<213>智人<400>11agtctctaga gctacgcgta caagtccttg tagatctcct gc42<210>12<211>32<212>ADN<213>智人<400>12agtcacgcgt gggcgatctt gacaggaaag ac 32<210>13<211>21<212>ADN<213>智人<400>13gcctttgagt gagctgatac c 21<210>14<211>35<212>ADN<213>智人<400>14agtcactagt aagctttttg ccgccagaac acagg35<210>15<211>36<212>ADN<213>智人<400>15agtcactagt ccatggctgc ccagtgcctc acgacc 36<210>16<211>21<212>ADN<213>智人<400>16caggtttgct gaatgtgaag c 21<210>17<211>40<212>ADN<213>智人<400>17tgacgtgtcg acctagtaca agtccttgta gatctcctgc 40<210>18<211>31<212>ADN<213>智人<400>18agtcgtcgac gcttcgagca gacatgataa g31<210>19<211>35<212>ADN<213>智人<400>19agtcgctagc gacggatcct tatcgatttt accac35<210>20<211>50<212>ADN<213>智人<400>20gtcagctagc ctactcgagc caccatgggt gaaactctgg gagattctcc50<210>21<211>42<212>ADN<213>智人<400>21tacggggtac ccagacatga taagatacat tgatgagttt gg42<210>22<211>33<212>ADN<213>智人<400>22gtcagctagc cggtaggcgt gtacggtggg agg 33<210>23<211>33<212>ADN<213>智人<400>23tacgctcgag cttctatgga ggtcaaaaca gcg33<210>24<211>750<212>PRT<213>智人<400>24Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser1 5 10 15Phe Thr AsD Thr Leu Ser Ala Asn Ile Ser Gln Glu Met Thr Met Val20 25 30Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val35 40 45Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro50 55 60Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp65 70 75 80Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp85 90 95Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser100 105 110Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu115 120 125Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp130 135 140Lys Ala Ser G1y Phe His Tyr G1y Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys145 150 155 160Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys165 170 175Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr180 185 190Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile195 200 205Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu210 215 220Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg225 230 235 240Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu245 250 255Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys260 265 270Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp275 280 285Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu290 295 300Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala305 310 315 320Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn325 330 335Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu340 345 350Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu355 360 365Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu370 375 380Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val385 390 395 400Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile405 410 415Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys420 425 430Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln435 440 445Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu450 455 460Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu465 470 475 480Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu485 490 495Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly
500 505 510Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu515 520 525Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln530 535 540Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe545 550 555 560Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile565 570 575Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys580 585 590Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn595 600 605Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu610 615 620Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys625 630 635 640Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp645 650 655Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly660 665 670Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln675 680 685Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu690 695 700Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr705 710 715 720Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met725 730 735Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr740 745750<210>25<211>467<212>PRT<213>智人<400>25Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln1 5 10 15Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe20 25 30Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile35 40 45Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys50 55 60Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn65 70 75 80Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu85 90 95Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys100 105 110Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp115 120 125Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly130 135 140Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln145 150 155 160Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu165 170 175Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr180 185 190Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met195 200 205Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp210 215 220Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr225 230 235 240Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His245 250255Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe260 265 270Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu275 280 285Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln
290 295 300Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu305 310 315 320Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly325 330 335Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp340 345 350Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu355 360 365Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser370 375 380Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln385 390 395 400Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro405 410 415Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu420 425 430Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys435 440 445Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys450 455 460Asp Leu Tyr465<210>26<211>30<212>ADN<213>智人<400>26cccgttacat aacttacggt aaatggcccg 30<210>27<211>30<212>ADN<213>智人<400>27gggacgcgct tctacaaggc gctggccgaa 30<210>28<211>30<212>ADN<213>智人<400>28cgactctaga agatcttgcc ccgcccagcg 30
權(quán)利要求
1.組合物，其中包含(a)第一個(gè)成分，它包含處在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的目的核酸，該誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含對(duì)PPAR反應(yīng)的成分和最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，(b)第二個(gè)成分，它包含在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下編碼PPAR的核酸，以便它們同時(shí)地、分別地或以一定時(shí)間間隔使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于它還包含(c)PPAR配體以便同時(shí)地、分別地或以一定時(shí)間間隔使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于不同的遺傳構(gòu)建體帶有所述成分(a)和(b)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于所述成分(a)和(b)集合在同一的遺傳構(gòu)建體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的組合物，其特征在于所述遺傳構(gòu)建體是質(zhì)?；虿《据d體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于對(duì)PPAR反應(yīng)的成分包含一個(gè)或多個(gè)PPAR鏈的位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其特征在于所述對(duì)PPAR反應(yīng)的成分包含SEQID NO1序列或這個(gè)序列的功能性變體的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其特征在于所述對(duì)PPAR反應(yīng)的成分包含SEQID NO5序列或這個(gè)序列的功能性變體的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述反應(yīng)成分包含多達(dá)30個(gè)鏈位點(diǎn)，優(yōu)選地3-20個(gè)鏈位點(diǎn)，更優(yōu)選地5-15個(gè)鏈位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述最小啟動(dòng)子是缺失一個(gè)或多個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的非必需區(qū)的細(xì)胞基因或病毒基因啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述誘導(dǎo)啟動(dòng)子還包含擴(kuò)增區(qū)。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述最小啟動(dòng)子和對(duì)PPAR反應(yīng)成分的方向相同。
13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于最小啟動(dòng)子和對(duì)PPAR反應(yīng)成分的方向相反。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于編碼PPAR的核酸可編碼PPARα或PPARγ。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于編碼PPAR的核酸可編碼包含多個(gè)配體鏈位點(diǎn)的修飾PPAR。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于它還包含成分(d)，該成分包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼RXR的核酸。
17.包含權(quán)利要求所述的成分(a)和成分(b)的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的載體，其特征在于所述成分(a)和成分(b)的方向相反。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的載體，其特征在于所述成分(a)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子和成分(b)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子集合在載體中，以便生成可調(diào)節(jié)雙向啟動(dòng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的載體，其特征在于在5’->3’方向，它包含編碼PPAR的第一個(gè)核酸，控制所述第一個(gè)核酸表達(dá)的第一個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，一種或多種對(duì)PPAR反應(yīng)成分，第二個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以及在所述第二個(gè)最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼目的產(chǎn)品的第二個(gè)核酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的載體，其特征在于它還包含 16的成分(d)。
22.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的載體在活體外或試管內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)目的核酸的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的載體在制備用于活體內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)目的核酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
24.在活體外或或試管內(nèi)的細(xì)胞中調(diào)節(jié)表達(dá)核酸的方法，該方法包括所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的載體進(jìn)行接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征在于該方法涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地人細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于該方法涉及肌肉細(xì)胞。
27.通過與權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的載體接觸修飾的細(xì)胞。
28.修飾的PPAR，它包含多個(gè)配體鏈位點(diǎn)。
29.編碼權(quán)利要求28的PPAR的核酸。
30.PPAR配體的鑒定方法，該方法包括使權(quán)利要求27的細(xì)胞與試驗(yàn)分子接觸，再證明目的核酸的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于藥理學(xué)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的新方法與組合物。本發(fā)明特別涉及組合物,它包含:(a)第一個(gè)成分,它包含在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的目的核酸,該誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含對(duì)PPAR反應(yīng)的成分和最小轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子,(b)第二個(gè)成分,它包含在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下編碼PPAR的核酸,以便它們同時(shí)地、分別地或以一定時(shí)間間隔地使用。本發(fā)明涉及這些組合物和方法在實(shí)驗(yàn)、臨床、治療或診斷方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1370240SQ00811928
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2000年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日
發(fā)明者R·達(dá)特爾, J·克魯澤塔, B·斯塔爾斯, A·馬赫方蒂 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物股份有限公司