專利名稱：植物甾醇酰基轉(zhuǎn)移酰的制作方法
相關(guān)申請的相互參考本發(fā)明要求1999年8月30日提交的美國臨時申請流水號60/152,493的優(yōu)先權(quán)，并完整收入本文作為參考用于所有目的。
背景需要改進(jìn)由生物合成或天然植物來源獲得或處理甾醇組合物的方法。在植物中提高甾醇產(chǎn)量或改變甾醇組成的能力可為用于人和動物營養(yǎng)的甾醇提供新來源。
甾醇生物合成由類異戊二烯途徑中的法尼二磷酸(farnesyldiphosphate)中間物分支。在哺乳動物和高等植物中，甾醇生物合成是經(jīng)依賴甲羥戊酸的途徑發(fā)生的(Goodwin，1981，《類異戊二烯化合物的生物合成》(Biosynthesis of Isoprenoid Compounds)，第1卷，J.W.Porter和S.L.Spurgeon編，第443-480頁，John Wiley & Sons，紐約)，而認(rèn)為在綠藻中甾醇生物合成是經(jīng)不依賴甲羥戊酸的途徑發(fā)生的(Schwender等人，1997，《植物脂類的生理學(xué)、生物化學(xué)、和分子生物學(xué)》(Physiology，Biochemistry，and Molecular Biology ofPlant Lipids)，J.P.Williams、M.U.Khan、和N.W.Lem編，第180-182頁，Kluwer Academic Publishers，Norwell，MA)。
甾醇酯的溶解特征提示這是甾醇的儲存形式(Chang等人，1997，生物化學(xué)年鑒(Annu.Rev.Biochem.)66613-638)。甾醇O-?；D(zhuǎn)移酶，諸如?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，催化膽固醇酯的形成，由此對于控制胞內(nèi)膽固醇儲存非常關(guān)鍵。據(jù)報導(dǎo)，酵母中LRO1(人LCAT的同源物)和磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的過度表達(dá)可提高脂類合成(Oelkers等人，2000，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2615609-15612；Dahlqvist等人，2000，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)976487-6492)。
多種?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的鑒定對于進(jìn)一步研究植物甾醇合成系統(tǒng)和開發(fā)新的和/或候選甾醇來源是有用的。植物機(jī)制的研究可提供用于進(jìn)一步增強(qiáng)、控制、修飾、或改變植物細(xì)胞甾醇組成的方法。此外，甾醇含量和/或組成的這種改變可為獲得針對壓力和昆蟲損害的耐受性提供方法。特別感興趣的是編碼可用于遺傳工程應(yīng)用的蛋白質(zhì)的基因核酸序列。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽(Lecithincholesterol acyltransferase-like polypeptide，本文也稱為LCAT)和酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽(acyl CoAcholesterol acyltransferase-like polypeptide，本文也稱為ACAT)。具體而言，本發(fā)明涉及編碼這些甾醇?；D(zhuǎn)移酶的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、以及這些多核苷酸用于改變甾醇組成和油產(chǎn)量的用途。本發(fā)明的多核苷酸包括由植物來源衍生的多核苷酸。
因此，本發(fā)明的一個方面提供了編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或其片段、植物酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或其片段的分離核酸序列。
另一方面提供了基本上由SEQ ID NO2、4、6、8、10-29、43-51、73、或75組成的分離核酸序列。還提供了由SEQ ID NO2、4、6、8、10-29、43-51、73、或75組成的分離核酸序列。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO3的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO3的分離多核苷酸；SEQ ID NO2；與SEQ ID NO2具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO3的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO3的分離多核苷酸；SEQ ID NO2；與SEQ ID NO2具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO5的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO5的分離多核苷酸；SEQ ID NO4；與SEQ ID NO4具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO5的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO5的分離多核苷酸；SEQ ID NO4；與SEQ ID NO4具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO7的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO7的分離多核苷酸；SEQ ID NO6；與SEQ ID NO6具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO7的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO7的分離多核苷酸；SEQ ID NO6；與SEQ ID NO6具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO9的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO9的分離多核苷酸；SEQ ID NO8；與SEQ ID NO8具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO9的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO9的分離多核苷酸；SEQ ID NO8；與SEQ ID NO8具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO74的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO74的分離多核苷酸；SEQ ID NO73；與SEQ ID NO73具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO73發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO74的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO74的分離多核苷酸；SEQ ID NO73；與SEQ ID NO73具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列編碼SEQ ID NO76的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO76的分離多核苷酸；SEQ ID NO75；與SEQ ID NO75具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO75發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自編碼SEQ ID NO76的多肽或含至少一個保守氨基酸替代的SEQ ID NO76的分離多核苷酸；SEQ ID NO75；與SEQ ID NO75具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列SEQID NO42或其簡并變體；與SEQ ID NO42具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交且編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
另一方面提供了基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R2是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自SEQ ID NO42或其簡并變體；與SEQID NO42具有至少70％、80％、90％、或95％序列同一性的分離多核苷酸；在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交的至少10個氨基酸的分離多核苷酸；與任何上述多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交且編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
還提供了包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽和/或?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組核酸構(gòu)建物。在一個實施方案中，甾醇?；D(zhuǎn)移酶是植物甾醇?；D(zhuǎn)移酶。在另一個實施方案中，重組核酸構(gòu)建物還包含終止序列。調(diào)控序列可以是組成性啟動子、可誘導(dǎo)啟動子、發(fā)育調(diào)控啟動子、組織特異性啟動子、細(xì)胞器特異性啟動子、種子特異性啟動子、或前述任意組合。還提供了包含這種重組核酸構(gòu)建物的植物，及其種子和后代。還可將這種重組核酸構(gòu)建物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞以提供本發(fā)明的另一方面。若宿主細(xì)胞是植物宿主細(xì)胞，則該細(xì)胞可用于生成植株以提供本發(fā)明的另一方面。其它方面包括這種植株的種子和后代。
還有一個方面提供了包含選自下組的氨基酸序列的純化多肽SEQID NO3、5、7、9、74、76、或包含至少一個保守氨基酸替代的上述任一序列。
還有一個方面提供了包含選自下組的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸的純化免疫原性多肽SEQ ID NO3、5、7、9、74、76、或包含至少一個保守氨基酸替代的上述任一序列。還提供了可特異結(jié)合上述免疫原性多肽的多克隆或單克隆抗體。
一個方面提供了用于生成卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的方法，包括在允許表達(dá)所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明的任何重組核酸構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。
另一方面提供了用于修飾宿主細(xì)胞甾醇含量的方法，包括用包含與編碼卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
另一方面提供了用于修飾宿主細(xì)胞甾醇含量的方法，包括用包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)酰基輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
另一方面提供了包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
另一方面提供了包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
另一方面提供了由本發(fā)明的任何植物或宿主細(xì)胞獲得的油。
還有一個方面提供了用于生成具有經(jīng)修飾甾醇組成的油的方法，包括提供本發(fā)明的任何植物或宿主細(xì)胞，并通過任何已知方法由所述植物提取油。還提供了由上述方法生成的油。
另一方面提供了用于改變宿主細(xì)胞油產(chǎn)量的方法，包括用包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
另一方面提供了用于改變宿主細(xì)胞油產(chǎn)量的方法，包括用包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
還提供了包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
還提供了包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
另一方面提供了包含本發(fā)明的任何油、植物、或宿主細(xì)胞的食品、食品成份、或食品產(chǎn)品；包含本發(fā)明的任何油、植物、或宿主細(xì)胞的營養(yǎng)或飲食補(bǔ)充物；和包含本發(fā)明的任何油、植物、或宿主細(xì)胞，以及合適的稀釋劑、載體、或賦形劑的藥用組合物。
其它方面將由下文描述和實施例變得清晰。
圖的簡述借助下文的描述、所附權(quán)利要求、和此處附圖，將更好的理解本發(fā)明的這些和其它特征、方面、和優(yōu)勢。


圖1顯示了酵母、人、和大鼠卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列與擬南芥LCAT1、LCAT2、LCAT3、和LCAT4推導(dǎo)氨基酸序列的比對。
圖2顯示了來自在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT4的植株(pCGN9998)的T2種子的NMR甾醇酯分析結(jié)果。
圖3顯示了來自對照系(pCGN8640)和在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT3的系(pCGN9968)的T2種子油提取物的HPLC/MS甾醇分析結(jié)果。
圖4顯示了來自對照系(pCGN8640)和在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT1(pCGN9962)、LCAT2(pCGN9983)、LCAT3(pCGN9968)、和LCAT4(pCGN9998)的植株系的T2種子油提取物的HPLC/MS甾醇分析結(jié)果。另外，還顯示了在35S啟動子控制下表達(dá)LCAT4的3個品系(pCGN9996)的數(shù)據(jù)。
圖5顯示了來自對照系(pCGN8640)和在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT1(pCGN9962)、LCAT2(pCGN9983)、和LCAT3(pCGN9968)的植株系的T2種子油含量的Nir分析結(jié)果。另外，還顯示了在35S啟動子控制下表達(dá)LCAT2的16個品系(pCGN9981)的數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述提供下面的詳述以幫助本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員實踐本發(fā)明。即使如此，不應(yīng)當(dāng)將詳述解釋成對本發(fā)明的不適當(dāng)限制，因為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對本文討論的實施方案進(jìn)行修飾和變化而不偏離本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)的精神或范圍。
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本發(fā)明涉及卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，特別是編碼植物來源的卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離核酸序列；本發(fā)明還涉及?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)，特別是編碼植物來源的?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離核酸序列。當(dāng)用于本文時，卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣包括編碼植物來源的氨基酸序列的任何核酸序列，諸如可由展示能夠在酶反應(yīng)條件下利用卵磷脂(磷脂酰膽堿)作為酰基供體用于?；薮蓟蚋视王ヒ孕纬甚サ募?xì)胞來源獲得的蛋白質(zhì)、多肽、或肽。當(dāng)用于本文時，酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣包括編碼植物來源的氨基酸序列的任何核酸序列，諸如可由展示能夠在酶反應(yīng)條件下利用酰基輔酶A作為?；w用于酰化甾醇或甘油酯以形成酯的細(xì)胞來源獲得的蛋白質(zhì)、多肽、或肽。“酶反應(yīng)條件”指環(huán)境(即諸如溫度、pH、抑制物的缺乏等因素)中可獲得的并允許酶發(fā)揮功能的任何必需條件。
術(shù)語“甾醇”在應(yīng)用于植物時指可由角鯊烯氧化物經(jīng)具有與trans-syn-trans-anti-trans-anti構(gòu)型(例如原類甾醇陽離子)相似的立體化學(xué)的過渡狀態(tài)環(huán)化形成，并在C-3處保留極性基團(tuán)(羥基或酮基)、在環(huán)系統(tǒng)中保留all-trans-anti立體化學(xué)、保留側(cè)鏈20R-構(gòu)型的任何手性四環(huán)類異戊烯(isopentenoid)(Parker等人，1992，在《類異戊烯代謝的調(diào)控》(Regulation of Isopentenoid Metabolism)一書中，Nes等人編，ACS討論會系列編號497，第110頁；美國化學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū))。
甾醇可以包含或不含C-5＝C-6雙鍵，因為這是在生物合成途徑的后期引入的。甾醇在C-17處包含C8-C10側(cè)鏈。
術(shù)語“植物甾醇(phytosterol)”應(yīng)用于唯一發(fā)現(xiàn)于植物中的甾醇，指包含C-5(在有些情況中是C-22)雙鍵的甾醇。植物甾醇進(jìn)一步表征為C-17側(cè)鏈的烷化，以及在C-24處的甲基或乙基取代基。主要的植物甾醇包括但不限于谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、蕪菁甾醇、等。缺乏C-24甲基或乙基側(cè)鏈的膽固醇發(fā)現(xiàn)于植物中，但不是其獨有的，也不是“植物甾醇”。
“植物烷甾醇(phytostanol)”是植物甾醇的飽和形式，其中C-5和(當(dāng)存在時)C-22雙鍵被還原，包括但不限于谷烷甾醇、菜油烷甾醇、和22-二氫蕪菁烷甾醇。
“甾醇酯”進(jìn)一步表征為在C-3處存在脂肪酸或酚酸部分而非羥基。
術(shù)語“甾醇”包括甾醇、植物甾醇、植物甾醇酯、植物烷甾醇、和植物烷甾醇酯。
術(shù)語“甾醇化合物”包括甾醇、植物甾醇、植物甾醇酯、植物烷甾醇、和植物烷甾醇酯。
術(shù)語“植物甾醇化合物”指至少一種植物甾醇、至少一種植物甾醇酯、或其混合物。
術(shù)語“植物烷甾醇化合物”指至少一種植物烷甾醇、至少一種植物烷甾醇酯、或其混合物。
術(shù)語“甘油酯”指甘油的脂肪酸酯，包括單酰甘油、二酰甘油、和三酰甘油。
當(dāng)用于本文時，“重組構(gòu)建物”由其制備方法或其結(jié)構(gòu)定義。在提及其制備方法時，如某個方法的產(chǎn)物，該方法是重組核酸技術(shù)的應(yīng)用，如在核苷酸序列中包含人類干預(yù)，通常是選擇或生成。或者，在結(jié)構(gòu)方面，它可以是包含天然不相連或可操作連接的兩種或多種核酸序列的融合序列。
當(dāng)用于本文時，“調(diào)控序列”指涉及基因表達(dá)控制的DNA序列；如啟動子、操縱基因、和衰減子。“異源調(diào)控序列”指與基因天然相連的調(diào)控序列不同的調(diào)控序列。
當(dāng)用于本文時，“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，指通過磷酸二酯鍵連在一起的至少2個核苷酸的聚合物，可由核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸組成。
當(dāng)用于本文時，“序列”指聚合物中單體出現(xiàn)的線性順序，例如多肽中的氨基酸順序或多核苷酸中的核苷酸順序。
當(dāng)用于本文時，“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指由通過肽鍵相連的兩個或多個氨基酸組成的化合物。
當(dāng)用于本文時，“互補(bǔ)”指雙鏈核酸中通過氫鍵結(jié)合的堿基(嘌呤和嘧啶)的配對。例如，下面的堿基對是互補(bǔ)的鳥嘌呤與胞嘧啶；腺嘌呤與胸腺嘧啶；以及腺嘌呤與尿嘧啶。當(dāng)用于本文時，該術(shù)語包括完全和部分互補(bǔ)。分離蛋白質(zhì)、多肽、和多核苷酸本發(fā)明的第一個方面涉及分離LCAT多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸序列包括編碼具有序列表中列出的推導(dǎo)氨基酸序列的本發(fā)明多肽的分離多核苷酸，以及與這種序列及其變體密切相關(guān)的其它多核苷酸序列。
本發(fā)明提供了在整個長度上與序列表中列出的每一種編碼序列相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了成熟多肽或其片段的編碼序列，以及與其它編碼序列，諸如前導(dǎo)序列或分泌序列、前蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)原、或前蛋白質(zhì)原序列的編碼序列，處于同一讀碼框中的成熟多肽或其片段編碼序列。多核苷酸還可包含非編碼序列，包括例如但不限于5’和3’非編碼序列，諸如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、終止信號、核糖體結(jié)合位點、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子、多聚腺苷酸化信號、和編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可包含標(biāo)記序列以便于融合多肽的純化。本發(fā)明的多核苷酸還包括包含結(jié)構(gòu)基因和控制基因表達(dá)的天然相關(guān)序列的多核苷酸。
本發(fā)明還包括具有如下通式的多核苷酸X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y，其中位于5’末端的X是氫，位于3’末端的Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸殘基，n是0-3000之間的整數(shù)，優(yōu)選1-1000之間，R2是本發(fā)明的核酸序列，特別是選自序列表中列出的核酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO2、4、6、8、10-29、33、42-51、73、或75。在通式中，R2的取向是5’末端殘基位于左邊，連接R1，而3’末端殘基位于右邊，連接R3。用R基團(tuán)表示的任何核酸殘基片段(其中R超過1)，可以是雜聚物或均聚物，優(yōu)選雜聚物。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽變體的本發(fā)明多核苷酸變體。作為本發(fā)明多核苷酸片段的變體可用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。優(yōu)選實施方案是編碼多肽變體的多核苷酸，其中本發(fā)明多肽序列的5-10、1-5、1-3、2、1、或0個氨基酸殘基以任意組合被替代、添加、或刪除。特別優(yōu)選沉默的替代、添加、和刪除，即不改變多核苷酸或多肽的特性或活性。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是在整個長度上與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸至少50％、60％、或70％相同的多核苷酸以及與其互補(bǔ)的多核苷酸。更優(yōu)選的是包含在整個長度上與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸至少80％相同的區(qū)域的多核苷酸以及與其互補(bǔ)的多核苷酸。在這方面，特別優(yōu)選在整個長度上至少90％相同的多核苷酸，尤其優(yōu)選在整個長度上至少95％相同的多核苷酸。此外，高度優(yōu)選在整個長度上至少97％相同的多核苷酸，特別高度優(yōu)選在整個長度上至少98％和99％相同的多核苷酸，最高度優(yōu)選在整個長度上至少99％相同的多核苷酸。
優(yōu)選實施方案是經(jīng)本文所述方法測定，與由序列表中列出的多核苷酸編碼的成熟多肽相比，基本保留相同生物學(xué)功能或活性的多肽的編碼多核苷酸。
本發(fā)明還涉及與上述序列可發(fā)生雜交的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明涉及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述多核苷酸可發(fā)生雜交的多核苷酸。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的范例是在含50％甲酰胺、5× SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5× Denhardt氏液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml變性剪切鮭魚精DNA的溶液中于42℃保溫過夜，隨后用0.1× SSC于大約65℃清洗雜交支持物。還包括在0.1× SSC或0.1×SSPE(于50℃)的清洗嚴(yán)謹(jǐn)度下發(fā)生雜交的多核苷酸。其它雜交和清洗條件是眾所周知的，且例示于Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloingA Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，NY，1989，特別是第11章。
本發(fā)明還提供了基本上由可如下獲得的多核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下用具有所述多核苷酸序列或其片段的序列的探針篩選含序列表中列出的多核苷酸序列的完整基因的適當(dāng)文庫，并分離所述多核苷酸序列。用于篩選文庫的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且例示于Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloingA Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，NY，1989，特別是第8章和Ausubel等人，《分子生物學(xué)短方案》(Short Protocols in MolecularBiology)，第3版，Wiley & Sons，1995，第6章?？捎糜讷@得這種多核苷酸的核酸序列包括例如本文所述探針和引物，特別是SEQ ID NO2、4、6、8、10-29、33、42-51、73、或75。這些序列對于篩選來自擬南芥、大豆、和玉米的文庫以獲得編碼卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽以及編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶和?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的序列特別有用。
正如本文關(guān)于本發(fā)明多核苷酸實驗的討論，例如，本發(fā)明的多核苷酸可作為RNA、cDNA、或基因組DNA的雜交探針用于分離編碼多肽的全長cDNA或基因組克隆和分離與序列表中列出的多核苷酸(特別是SEQID NO2、4、6、8、10-29、33、42-51、73、或75)具有高度序列相似性的其它基因的cDNA或基因組克隆。這些探針通常包含至少15個堿基。優(yōu)選的是，這些探針包含至少30個堿基，可包含至少50個堿基。特別優(yōu)選的是，這些探針包含30-50(含)個堿基。
可使用序列表中提供的DNA序列合成寡核苷酸探針并通過篩選分離包含或包含于序列表中列出的多核苷酸序列的每個基因的編碼區(qū)。然后用具有本發(fā)明基因序列的互補(bǔ)序列的經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸篩選cDNA、基因組DNA、或mRNA文庫，以鑒定文庫中與探針發(fā)生雜交的成員。例如，制備對應(yīng)于LCAT EST序列的合成寡核苷酸。將寡核苷酸作為引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中用于獲得LCAT基因的5’和3’端序列?；蛘?，可由特定LCAT肽制備低簡并性寡核苷酸，這種探針可直接用于篩選基因文庫以獲得LCAT基因序列。由于背景雜交水平低，噬菌體載體中cDNA文庫的篩選在這種方法中特別有用。
通常，可使用核酸探針獲得的LCAT序列將顯示LCAT靶序列與所用探針編碼序列之間有60-70％的序列同一性。然而，也可獲得只具有50-60％序列同一性的較長序列。核酸探針可以是核酸序列的較長片段，或者也可以是較短的寡核苷酸探針。當(dāng)采用較長(超過大約100bp)核酸片段作為探針時，可以在較低嚴(yán)謹(jǐn)度進(jìn)行篩選，由靶樣品獲得與所用探針序列具有20-50％偏差(即50-80％序列同源性)的序列。寡核苷酸探針可顯著短于編碼LCAT酶的完整核酸序列，但是應(yīng)當(dāng)包含至少大約10個核苷酸，優(yōu)選至少大約15個核苷酸，更優(yōu)選至少大約20個核苷酸。當(dāng)使用較短區(qū)域時，與較長區(qū)域相反，需要較高程度的序列同一性。由此可能期望鑒定氨基酸序列高度保守的區(qū)域，以設(shè)計用于檢測和回收其它相關(guān)LCAT基因的寡核苷酸探針。較短探針常常在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中特別有用，尤其可用于鑒定高度保守序列(參閱Gould等人，1989，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(PNAS USA)861934-1938)。
本發(fā)明的另一個方面涉及LCAT多肽。這種多肽包括序列表中列出的分離多肽及其片段，特別是展示LCAT活性的多肽，以及與選自序列表列出的多肽序列具有至少50％、60％、或70％同一性，優(yōu)選至少80％同一性，更優(yōu)選至少90％同一性，最優(yōu)選至少95％同一性的多肽，還包括這種多肽的部分，其中這種多肽部分優(yōu)選包含至少30個氨基酸，更優(yōu)選包含至少50個氨基酸。
正如本領(lǐng)域所理解的，“同一性”指通過比較序列確定的兩種或多種多肽序列或者兩種或多種多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域，“同一性”還指通過序列排列之間的匹配確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度?？赏ㄟ^已知方法容易的計算“同一性”，包括但不限于下列文獻(xiàn)中描述的方法《計算分子生物學(xué)》(ComputationalMolecular Biology)，A.M.Lesk編，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988；《生物計算信息學(xué)和基因組計劃》(BiocomputingInformatics andGenome Projects)，D.W.Smith編，Academic出版社，紐約，1993；《序列資料的計算機(jī)分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1部分，A.M.Griffin和H.G.Griffin編，Humana出版社，新澤西，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》(Sequence Analysis in MolecularBiology)，G.von Heinje，Academic出版社，1987；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，M.Gribskov和J.Devereux編，Stockton出版社，紐約，1991；以及H.Carillo和D.Lipman，SIAM應(yīng)用數(shù)學(xué)雜志(SIAM J Applied Math)481073，1988)。同一性的測定方法設(shè)計用于給出待測序列之間的最大匹配。此外，同一性的測定方法已編成可公開獲得的程序?？捎糜跍y定兩種序列之間同一性的計算機(jī)程序包括但不限于GCG(J.Devereux等人，核酸研究(NucleicAcids Research)12(1)387，1984；一套5種BLAST程序，3種為核苷酸序列查詢而設(shè)計(BLASTN、BLASTX、和TBLASTX，2種為蛋白質(zhì)序列查詢而設(shè)計(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，生物技術(shù)趨勢(Trendsin Biotechnology)1276-80，1994；Birren等人，基因組分析(GenomeAnalysis)1543-559，1997)。BLASTX程序可由NCBI和其它來源公開獲得(《BLAST手冊》(BLAST Manual)，S.Altschul等人，NCBINLM NIH，Bethesda，MD 20894；S.Altschul等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215403-410，1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于測定同一性。
用于多肽序列比較的參數(shù)通常包括算法Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443-453，1970比較矩陣BLOSSUM62，Hentikoff和Hentikoff，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915-10919，1992缺口罰分12缺口長度罰分4
可與這些參數(shù)一起使用的程序是可由“遺傳學(xué)計算機(jī)小組”(Genetics Computer Group，Madison，威斯康星)公開獲得的“缺口”程序。上述參數(shù)與末端缺口不罰分一起作為肽比較的缺省(默認(rèn))參數(shù)。
用于多核苷酸序列比較的參數(shù)包括算法Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443-453，1970比較矩陣匹配＝+10；錯配＝0缺口罰分50缺口長度罰分3可與這些參數(shù)一起使用的程序是可由“遺傳學(xué)計算機(jī)小組”(Genetics Computer Group，Madison，威斯康星)公開獲得的“缺口”程序。上述參數(shù)是核酸比較的缺省(默認(rèn))參數(shù)。
本發(fā)明還包括具有如下通式的多肽X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y，其中位于氨基末端的X是氫，位于羧基末端的Y是氫或金屬，R1和R3是任意氨基酸殘基，n是0-1000之間的整數(shù)，R2是本發(fā)明的氨基酸序列，特別是序列表中列出的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO3、5、7、9、74、或76。在通式中，R2的取向是氨基末端殘基位于左邊，連接R1，而羧基末端殘基位于右邊，連接R3。用R基團(tuán)表示的任何氨基酸殘基段(其中R超過1)，可以是雜聚物或均聚物，優(yōu)選雜聚物。
本發(fā)明的多肽包括由包含選自SEQ ID NO2、4、6、8、73、和75的序列的多核苷酸編碼的分離多肽。
本發(fā)明的多肽可以是成熟蛋白質(zhì)，或是融合蛋白的一部分。
多肽的片段和變體也視為是本發(fā)明的一部分。片段是一種多肽變體，它具有與先前所述多肽的部分而非整個氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。片段可以是游離的，或是包含于較大多肽內(nèi)，其中片段構(gòu)成一個部分或區(qū)域，最優(yōu)選作為單個連續(xù)區(qū)域。優(yōu)選片段是生物學(xué)活性片段，即介導(dǎo)本發(fā)明多肽活性的片段，包括具有相似活性或改進(jìn)活性或降低活性的片段。還包括在動物中具有抗原性或免疫原性的多肽和多肽片段，特別是可特異結(jié)合抗原性片段的多克隆或單克隆抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，這種抗原性或免疫原性片段包含來自本文公開的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸，或是包含至少一個保守氨基酸替代的這種序列。在另一個實施方案中，這種抗原性或免疫原性片段包含來自本文公開的氨基酸序列的至少15個、至少25個、至少50個、或至少100個連續(xù)氨基酸，或是包含至少一個保守氨基酸替代的這種序列。用于由多肽和綴合載體分子的多肽生成抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且例示于《分子生物學(xué)短方案》(Short Protocols inMolecular Biology)，第3版，Wiley & Sons，1995，特別是第11章。
多肽變體還包括因保守氨基酸替代(用相似特性的另一種殘基進(jìn)行替代)而與序列表中列出的序列不同的多肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，肽、多肽、或蛋白質(zhì)氨基酸序列中的修飾可導(dǎo)致等同或可能改進(jìn)的第二代肽，即與最初的氨基酸序列相比展示等同或更好的功能特征。本發(fā)明因此涵蓋這種修飾后的氨基酸序列。改變可包括氨基酸的插入、刪除、替代、截短、融合、序列亞單位的改組、諸如此類，條件是與本文公開的天然對應(yīng)序列相比，通過這種修飾產(chǎn)生的肽序列具有基本相同的功能特性。
進(jìn)行這種可變時可以考慮的一種因素是氨基酸的親水指數(shù)。Kyte和Doolittle(分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)157105-132，1982)已經(jīng)討論了氨基酸親水指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)交互式生物學(xué)功能中的重要性。人們已經(jīng)接受，氨基酸的相對親水特征有助于產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。這繼而影響蛋白質(zhì)與諸如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原、等分子的相互作用。
根據(jù)疏水性和電荷特征，已經(jīng)為每一種氨基酸指定了親水指數(shù)，如下異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
正如本領(lǐng)域已知的，肽或蛋白質(zhì)中的某些氨基酸可用具有相似親水指數(shù)或評分的其它氨基酸進(jìn)行替代，產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的肽或蛋白質(zhì)，即仍保留生物學(xué)功能。在進(jìn)行這種變化時，優(yōu)選用親水指數(shù)±2以內(nèi)的氨基酸相互替代。更優(yōu)選用親水指數(shù)±1以內(nèi)的氨基酸進(jìn)行替代。最優(yōu)選用親水指數(shù)±0.5以內(nèi)的氨基酸進(jìn)行替代。
還可根據(jù)親水性替代相似氨基酸。美國專利號4,554,101公開了蛋白質(zhì)中由鄰近氨基酸親水性決定的最高局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性有關(guān)。已經(jīng)為氨基酸指定了親水性值，如下精氨酸/賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸/組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、和色氨酸(-3.4)。由此，肽、多肽、或蛋白質(zhì)中的一個氨基酸可用具有相似親水性評分的另一種氨基酸進(jìn)行替代，仍產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即仍保留正確的生物學(xué)功能。在進(jìn)行這種變化時，優(yōu)選用親水指數(shù)±2以內(nèi)，更優(yōu)選±1以內(nèi)，最優(yōu)選±0.5以內(nèi)的氨基酸相互替代。
如上所述，本發(fā)明肽中的氨基酸替代可基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小、等?？紤]多種上述特征從而在本發(fā)明肽中進(jìn)行導(dǎo)致靜默突變的保守氨基酸變化的例示性替代，可選擇天然氨基酸所屬類型的其它成員。氨基酸可分成如下4組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。這些組內(nèi)的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(帶負(fù)電荷)氨基酸諸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電荷)氨基酸諸如精氨酸、組氨酸、和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸諸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；以及(4)中性非極性氨基酸諸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。應(yīng)當(dāng)注意，預(yù)期并非有利的變化，若它們產(chǎn)生功能性序列，則也是有用的。
作為本發(fā)明多肽片段的變體可通過肽合成用于產(chǎn)生相應(yīng)的全長多肽。因此，這些變體可作為中間物用于產(chǎn)生本發(fā)明的全長多肽。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用于例如轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，諸如植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌、噬菌體、和病毒，本文將進(jìn)一步討論。
本發(fā)明還提供了含成熟蛋白質(zhì)及氨基或羧基末端或者內(nèi)部(例如當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的成熟形式超過一條多肽鏈時)額外氨基酸的多肽的編碼多核苷酸。這種序列可在例如由前體變成成熟形式的蛋白質(zhì)加工中發(fā)揮作用，使得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、縮短或延長蛋白質(zhì)的半壽期、或者便于實驗或生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)操作。預(yù)計細(xì)胞酶可用于由成熟蛋白質(zhì)除去任何額外氨基酸。
蛋白質(zhì)前體，即多肽的成熟形式融合一種或多種前序列(prosequence)，可能是多肽的無活性形式。無活性前體通常在除去前序列后激活。在激活前可能除去一些或所有前序列。這種蛋白質(zhì)前體通常稱為前蛋白質(zhì)(proprotein)。表達(dá)構(gòu)建物的制備和使用方法感興趣的是將重組DNA構(gòu)建物中的核苷酸序列用于指導(dǎo)本發(fā)明?；D(zhuǎn)移酶序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄及翻譯(表達(dá))的應(yīng)用。特別感興趣的是將重組DNA構(gòu)建物中的本發(fā)明多核苷酸序列用于指導(dǎo)本發(fā)明?；D(zhuǎn)移酶序列在植物宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄及翻譯(表達(dá))的應(yīng)用。
表達(dá)構(gòu)建物通常包含與編碼本發(fā)明卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的核酸序列可操作連接且在宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)控序列，以及在宿主植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。特別感興趣的是在植物宿主細(xì)胞中有功能的啟動子(也稱為轉(zhuǎn)錄起始區(qū))的應(yīng)用。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了在植物細(xì)胞中有功能的許多啟動子，包括組成性的、可誘導(dǎo)的、組織特異性的、細(xì)胞器特異性的、發(fā)育調(diào)控的、和環(huán)境調(diào)控的啟動子。還涵蓋葉綠體和質(zhì)體特異性啟動子、葉綠體或質(zhì)體功能性啟動子、以及葉綠體或質(zhì)體可操作啟動子。
一批啟動子是組成性啟動子，諸如在大多數(shù)植物器官中產(chǎn)生高水平表達(dá)的CaMV35S或FMV35S啟動子。增強(qiáng)或雙聯(lián)形式的CaMV35S和FMV35S啟動子可用于實踐本發(fā)明(Odell等人，1985，自然(Nature)313810-812；Rogers，美國專利號5,378,619)。其它有用的組成性啟動子包括但不限于甘露堿合酶(mas)啟動子、胭脂堿合酶(nos)啟動子、和章魚堿合酶(ocs)啟動子。
有用的可誘導(dǎo)啟動子包括熱休克啟動子(Ou-Lee等人，1986，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)836815；Ainley等人，1990，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)14949)、由菠菜亞硝酸還原酶基因衍生的硝酸可誘導(dǎo)啟動子(Back等人，1991，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)179)、激素可誘導(dǎo)啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等人，1990，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)15905；Kares等人，1990，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)15905)、以及與RuBP羧化酶小亞基和LHCP基因家族有關(guān)的光可誘導(dǎo)啟動子(Kuhlemeier等人，1989，植物細(xì)胞(Plant Cell)1471；Feinbaum等人，1991，分子和普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)226449；Weisshaar等人，1991，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)101777；Lam和Chua，1990，科學(xué)(Science)248471；Castresana等人，1988，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)71929；Schulze-Lefert等人，1989，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)8651)。
另外，還可能優(yōu)選在植物的特定組織(諸如葉、莖、根、塊莖、種子、果實、等)中產(chǎn)生?；D(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)，而選擇的啟動子應(yīng)當(dāng)具有預(yù)期的組織和發(fā)育特異性。組織特異性、發(fā)育調(diào)控的有用啟動子的范例包括果實特異性啟動子，諸如E4啟動子(Cordes等人，1989，植物細(xì)胞(Plant Cell)11025)、E8啟動子(Deikman等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)73315)、獼猴桃(kiwifruit)獼猴桃堿啟動子(Lin等人，1993，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(PNAS)905939)、2A11啟動子(Houck等人，美國專利號4,943,674)、和番茄pZ130啟動子(美國專利號5,175,095和5,530,185)；β-conglycinin 7S啟動子(Doyle等人，1986，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2619228；Slighton和Beachy，1987，植物(Planta)172356)，以及種子特異性啟動子(Knutzon等人，1992，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)892624；Bustos等人，1991，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)101469；Lam和Chua，1991，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26617131；Stayton等人，1991，澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant.Physiol.)18507)。美國專利號5,753,475中討論了果實特異性基因調(diào)控。其它有用的種子特異性啟動子包括但不限于napin、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、7S、ADR12、ACP、硬脂酰-ACP去飽和酶、油質(zhì)蛋白、Lasquerella羥化酶、和大麥醛糖還原酶啟動子(Bartels，1995，植物雜志(Plant J.)7809-822)，EA9啟動子(美國專利號5,420,034)，和Bce4啟動子(美國專利號5,530,194)。有用的胚特異性啟動子包括玉米球蛋白1和油質(zhì)蛋白啟動子。有用的胚乳特異性啟動子包括稻谷蛋白-1啟動子、低pI的β淀粉酶基因的啟動子(Amy32b)(Rogers等人，1984，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)25912234)、高pI的β淀粉酶基因的啟動子(Amy64)(Khurseed等人，1988，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26318953)、和大麥巰基蛋白酶基因的啟動子(“Aleurain”)(Whittier等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)152515)。
特別感興趣的是自優(yōu)先在植物種子組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)開始的本發(fā)明核酸序列的表達(dá)。這種種子優(yōu)先轉(zhuǎn)錄起始序列的范例包括由編碼植物儲存蛋白質(zhì)基因的序列或涉及油料種子中脂肪酸生物合成的基因衍生的序列。這種啟動子的范例包括來自這種基因，如napin(Kridl等人，種子科學(xué)研究(Seed Sci.Res.)1209-219，1991)、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、ACP、硬脂酰-ACP去飽和酶、β-conglycinin的大豆α亞基(大豆7S；Chen等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838560-8564，1986)、和油質(zhì)蛋白的5’調(diào)控區(qū)。EP 0 255 378 B1和美國專利號5,420,034及5,608,152中討論了種子特異性基因調(diào)控。還可構(gòu)建啟動子雜合物來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性(Hoffman，美國專利號5,106,739)，或者聯(lián)合預(yù)期的轉(zhuǎn)錄活性和組織特異性。
可能有利的是指導(dǎo)賦予LCAT的蛋白質(zhì)定位到特定的亞細(xì)胞區(qū)室，例如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、葉綠體、或其它質(zhì)體區(qū)室。例如，在將本發(fā)明的感興趣基因靶向質(zhì)體(諸如葉綠體)用于表達(dá)時，構(gòu)建物還將采用將基因?qū)蛸|(zhì)體的序列。本文優(yōu)選的這種序列是葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)或質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽(PTP)。如此，感興趣基因未直接插入質(zhì)體時，表達(dá)構(gòu)建物將額外包含編碼轉(zhuǎn)運肽的基因，從而將感興趣基因?qū)蛸|(zhì)體。葉綠體轉(zhuǎn)運肽可衍生自感興趣的基因，或者可衍生自具有CTP的異源序列。這種轉(zhuǎn)運肽在本領(lǐng)域是已知的。參閱，例如Von Heijne等人，1991，植物分子生物學(xué)報告(Plant Mol.Biol.Rep.)9104-126；Clark等人，1989，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26417544-17550；della-Cioppa等人，1987，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)84965-968；Romer等人，1993，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1961414-1421；以及Shah等人，1986，科學(xué)(Science)233478-481。
根據(jù)預(yù)定用途，構(gòu)建物可包含編碼完整LCAT蛋白質(zhì)或其部分、完整ACAT蛋白質(zhì)或其部分的核酸序列。例如，在期望反義抑制給定的LCAT或ACAT蛋白質(zhì)時，不需要完整序列。此外，在意欲使用用于構(gòu)建物的LCAT或ACAT序列作為探針時，制備只包含LCAT或ACAT編碼序列特定部分(例如編碼高度保守區(qū)的序列)的構(gòu)建物可能是有利的。
熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，多種方法可用于抑制內(nèi)源序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。這些方法包括但不限于反義遏制(Smith等人，1988，自然(Nature)334724-726)、共遏制(Napoli等人，1989，植物細(xì)胞(Plant Cell)2279-289)、核酶(PCT發(fā)表物WO 97/10328)、以及有義與反義的聯(lián)合(Waterhouse等人，1998，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9513959-13964)。用于遏制宿主細(xì)胞中內(nèi)源序列的方法通常采用遏制至少部分待遇制序列的轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄及翻譯。這些序列可以與內(nèi)源序列的編碼區(qū)以及非編碼區(qū)同源。
還可以在本發(fā)明的植物表達(dá)構(gòu)建物中提供調(diào)控性轉(zhuǎn)錄終止區(qū)?？赏ㄟ^編碼二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列或者由不同基因來源衍生的便利轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū))提供轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本發(fā)明的構(gòu)建物中可采用能夠在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄的任何便利轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
或者，可制備構(gòu)建物以指導(dǎo)由宿主植物細(xì)胞質(zhì)體直接表達(dá)LCAT或ACAT序列。這些構(gòu)建物和方法在本領(lǐng)域是已知的，且描述于例如Svab等人，1990，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)878526-8530；Svab和Maliga，1993，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90913-917；以及美國專利號5,693,507。
已經(jīng)導(dǎo)入了包含表達(dá)構(gòu)建物的重組DNA構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織、器官、或植株被視作是經(jīng)轉(zhuǎn)化的、經(jīng)轉(zhuǎn)染的、或轉(zhuǎn)基因的。轉(zhuǎn)基因或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植株還包括細(xì)胞或植株的后代，以及由在雜交中采用這種轉(zhuǎn)基因植株作為親本的育種程序產(chǎn)生且展示因存在LCAT核酸序列而引起的改變表型的后代。
具有植物L(fēng)CAT作為感興趣DNA序列用于提高或降低其表達(dá)的植物表達(dá)或轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物可用于廣泛的植物，特別是涉及用于食用和工業(yè)用途的植物油生產(chǎn)的植物。最特別優(yōu)選的是溫帶油料種子農(nóng)作物。感興趣的植物包括但不限于菜籽油菜(蕓苔和高芥子酸品種)、向日葵、紅花、棉花、大豆、花生、椰子和油椰子、以及玉米。根據(jù)將重組構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，可能需要其它DNA序列。重要的是，本發(fā)明可應(yīng)用于相似的雙子葉和單子葉物種，并將容易的應(yīng)用于新的和/或改進(jìn)的轉(zhuǎn)化和調(diào)控技術(shù)。
特別感興趣的是植物L(fēng)CAT和ACAT構(gòu)建物在植物中用于生成脂類和/或固醇酯含量受到修飾的植物或植物部分(包括但不限于葉、莖、根、繁殖組織、和種子)的用途或者改變植物油產(chǎn)量。
在本發(fā)明中特別感興趣的是將LCAT序列與ACAT基因一起用于提高種子甾醇含量的用途。由此，油料種子農(nóng)作物中編碼ACAT和LCAT的核酸序列的過度表達(dá)可用于本發(fā)明以提高植物組織中的甾醇水平和/或油產(chǎn)量。
預(yù)計可合成完整或部分基因序列，尤其在期望提供植物優(yōu)選序列時。由此，可使用選定宿主優(yōu)選的密碼子合成所有或部分的預(yù)期結(jié)構(gòu)基因(編碼LCAT或ACAT蛋白質(zhì)的基因部分)。例如可由在預(yù)期宿主物種中表達(dá)的蛋白質(zhì)中最頻繁使用的密碼子，確定宿主優(yōu)選密碼子。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易的認(rèn)識到，可制備抗體制劑、核酸探針(DNA和RNA)、諸如此類，并用于由多種植物來源篩選和回收“同源”或“相關(guān)”序列。當(dāng)通過序列信息(核酸或氨基酸)的比較或者通過已知LCAT與候選來源之間的雜交反應(yīng)確定存在序列同一性時，即找到了同源序列。在確定序列同源性時還可以考慮保守變化，諸如Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/Lys、和Gln/Asn。兩種完整成熟蛋白質(zhì)之間存在少至25％的序列同一性時，也認(rèn)為氨基酸序列是同源的(通常參閱R.F.Doolittle，《非開放讀碼框和開放讀碼框》(OF URFSand ORFS)，大學(xué)科學(xué)叢書(University Science Books)，CA，1986)。
由此，可由此處提供的特定序列獲得其它LCAT。此外，顯然，由例示的LCAT和ACAT序列以及通過使用這些例示序列獲得的序列，可獲得天然和合成的序列，包括經(jīng)修飾的氨基酸序列和用于合成蛋白質(zhì)模擬的起始材料。經(jīng)修飾的氨基酸序列包括經(jīng)突變、截短、增加、諸如此類的序列，無論這些序列是部分合成的還是完全合成的。實際上由植物制劑純化的序列或者與所述序列相同或編碼相同蛋白質(zhì)的序列，不管用何種方法獲得該蛋白質(zhì)或序列，同樣認(rèn)為是天然衍生的。
對于免疫學(xué)篩選，可通過給兔子或小鼠注射純化蛋白質(zhì)或其片段來制備針對該蛋白質(zhì)的抗體，這種制備抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。可產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體，雖然通常多克隆抗體在基因分離中更有用?？蛇M(jìn)行Western分析，通過與針對所編碼蛋白質(zhì)的抗體的交叉反應(yīng)來確定預(yù)期植物物種的粗制提取物中是否存在相關(guān)蛋白質(zhì)。當(dāng)觀察到交叉反應(yīng)性時，通過篩選代表預(yù)期植物物種的表達(dá)文庫來分離編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的基因?？稍诙喾N商品化載體中構(gòu)建表達(dá)文庫，包括λgt11，描述于Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。
為了確認(rèn)由經(jīng)鑒定核酸序列編碼的蛋白質(zhì)作為酰基轉(zhuǎn)移酶的活性和特異性，在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外實驗。這種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的，且描述于Lee等人，美國專利號5,348,886(完整收入本文作為參考)。
另外，可制備其它表達(dá)構(gòu)建物，利用不同的表達(dá)系統(tǒng)來測定蛋白質(zhì)活性。將這些表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到酵母或原核細(xì)胞宿主中，并測定酰基轉(zhuǎn)移酶活性。這些表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的，且可由商業(yè)來源容易的獲得。
用于獲得這種轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法在本發(fā)明中不是至關(guān)重要的，而且目前有多種植物轉(zhuǎn)化方法可供利用。此外，若有更新的方法可用于轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，則它們也可直接應(yīng)用于本文。例如，可通過由農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的三元或二元載體方法成功轉(zhuǎn)化天然易受農(nóng)桿菌感染的許多植物物種。在許多情況中，期望構(gòu)建物在一側(cè)或兩側(cè)以T-DNA為邊界，特別是具有左和右邊界序列，更特別的是右邊界序列。這在構(gòu)建物使用根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化模式時特別有用，雖然T-DNA邊界序列可用于其它轉(zhuǎn)化模式。另外，已經(jīng)開發(fā)了顯微注射、DNA顆粒轟擊、和電穿孔技術(shù)，能夠轉(zhuǎn)化多種單子葉和雙子葉植物物種。
通常，DNA構(gòu)建物將包含具有在宿主中表達(dá)所必需的調(diào)控區(qū)且提供轉(zhuǎn)化體細(xì)胞選擇的結(jié)構(gòu)基因。該基因可提供對毒害細(xì)胞試劑(如抗生素、重金屬、毒素、等)的抗性，對營養(yǎng)缺陷型宿主的原養(yǎng)型互補(bǔ)、病毒免疫性、諸如此類。根據(jù)將導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建物或其成份的不同宿主物種的數(shù)目，可采用一種或多種標(biāo)記，對于不同的宿主使用不同的選擇條件。
合適選擇標(biāo)記的非限制性范例包括賦予對博來霉素、慶大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、氨甲喋呤、腐草霉素、膦絲菌素、壯觀霉素、鏈霉素、磺胺、和磺脲類的抗性的基因(Maliga等人，《植物分子生物學(xué)方法》(Methods in Plant Molecular Biology)，冷泉港實驗室出版社，1995，第39頁)。標(biāo)記的范例包括但不限于堿性磷酸酶(AP)、myc、血凝素(HA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、螢光素酶、和綠色熒光蛋白(GFP)。
在將農(nóng)桿菌用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，可使用導(dǎo)入農(nóng)桿菌宿主后將與農(nóng)桿菌宿主中存在的T-DNA或者Ti或Ri質(zhì)粒發(fā)生同源重組的載體。包含T-DNA以進(jìn)行重組的Ti或Ri質(zhì)粒可以是未受損害的(能夠引起冠癭形成)或受到損害的(不能引起冠癭形成)，只要轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌宿主中存在vir基因，后者就是允許的。未受損害的質(zhì)?？僧a(chǎn)生正常植物細(xì)胞與冠癭的混合物。
在有些情況中，在將農(nóng)桿菌作為載體用于轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞時，以T-DNA邊界區(qū)為界的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物將插入能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制的宿主范圍廣泛的載體。文獻(xiàn)中描述了宿主范圍廣泛的載體。常用的是pRK2或其衍生物。參閱例如Ditta等人，1980，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)777347-7351；和EPA 0 120 515(收入本文作為參考)。或者，可將需要在植物細(xì)胞中表達(dá)的序列插入包含分開的復(fù)制序列的載體，其中的一種序列使載體在大腸桿菌中穩(wěn)定，另一序列使載體在農(nóng)桿菌中穩(wěn)定。參閱例如McBride和Summerfelt，1990，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)14269-276，其中利用pRiHRI(Jouanin等人，1985，分子和普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)201370-374)復(fù)制起點，并增加植物表達(dá)載體在宿主農(nóng)桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性。
除表達(dá)構(gòu)建物和T-DNA之外還可以包含一種或多種標(biāo)記，用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了許多用于植物細(xì)胞的標(biāo)記，諸如對氯霉素、卡那霉素、氨基糖苷G418、潮霉素、諸如此類的抗性。采用的具體標(biāo)記對于本發(fā)明不是實質(zhì)性的，根據(jù)具體的宿主和構(gòu)建方式，可能優(yōu)選一種或另一種標(biāo)記。
對于使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可將外植體與經(jīng)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌混合并保溫足夠時間以進(jìn)行轉(zhuǎn)化，殺死細(xì)菌，并在適當(dāng)選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物細(xì)胞。一旦形成愈傷組織，可根據(jù)已知方法采用適當(dāng)?shù)闹参锛に貋泶龠M(jìn)苗形成，并將苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基以再生植株。然后可培養(yǎng)植株以結(jié)實，并將種子用于建立重復(fù)世代和分離植物油。
由此，本發(fā)明的另一方面涉及用于修飾宿主細(xì)胞的甾醇和/或烷甾醇(stanol)組成的方法。特別感興趣的是用于修飾宿主植物細(xì)胞的甾醇和/或烷甾醇組成的方法。一般而言，該方法包括提高占總甾醇化合物一部分的甾醇酯化合物的水平。該方法通常包括使用表達(dá)構(gòu)建物指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
還提供了用于降低甾醇酯化合物占宿主植物細(xì)胞總甾醇化合物百分比比例的方法。該方法通常包括使用表達(dá)構(gòu)建物指導(dǎo)宿主細(xì)胞中對內(nèi)源?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的遏制。
特別感興趣的是使用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物來修飾宿主植物細(xì)胞中的甾醇化合物水平。更具體的說，該方法可用于修飾由植物種子獲得的種子油中的甾醇化合物水平。
同樣感興趣的是使用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物來改變宿主細(xì)胞的油產(chǎn)量，特別是提高油產(chǎn)量。特別感興趣的是使用含編碼LCAT和/或ACAT多肽的核酸序列的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，并使用這些宿主細(xì)胞再生與不含表達(dá)構(gòu)建物的相同植物相比油產(chǎn)量提高的完整植株。
由轉(zhuǎn)基因植物獲得的具有經(jīng)修飾的甾醇化合物含量的油具有廣泛的應(yīng)用。在本發(fā)明中特別感興趣的是含經(jīng)修飾的甾醇化合物水平的油在包括改進(jìn)人營養(yǎng)和心血管健康的應(yīng)用中的使用。例如，植物烷甾醇對于降低血清膽固醇是有利的(Ling等人，1995，生命科學(xué)(LifeSciences)57195-206)。
降低膽固醇的組合物包括使用本發(fā)明的方法獲得的油和甾醇酯化合物組合物。這種降低膽固醇的組合物包括但不限于含油和/或脂肪的食品、食品產(chǎn)品、經(jīng)加工食品、食品成份、食品添加組合物、或飲食/營養(yǎng)補(bǔ)充物。非限制性范例包括人造黃油、黃油、起酥油、烹飪油、煎炸油、調(diào)味品(諸如色拉調(diào)味品)、涂布劑(spreads)、蛋黃醬、和維生素/礦物質(zhì)補(bǔ)充物。涉及這些組合物的專利文獻(xiàn)包括美國專利號4,588,717和5,244,887，以及PCT國際發(fā)表物編號WO 96/38047、WO97/42830、WO 98/06405、和WO 98/06714。其它非限制性范例包括本文公開的澆料；奶制品(諸如干酪和經(jīng)加工干酪)；經(jīng)加工肉；面食；沙司；谷類；甜食(包括凍存和耐儲存甜食)；蘸料；油炸土豆片；烤食；面點；餅干；小吃；糖果蜜餞；巧克力；飲料；未提取種子；已經(jīng)進(jìn)行研磨、劈開、碾磨、碾軋、擠壓、丸化、脫脂、脫水、或其它加工但仍含油的未提取種子；等。
降低膽固醇的組合物還可以是包含降低膽固醇有效量的使用本發(fā)明方法獲得的油或甾醇化合物組合物以及制藥學(xué)可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑的藥用組合物的形式。這些藥用組合物可以是液體或固體的形式。液體可以是溶液或懸浮液；固體可以是粉末、顆粒、丸劑、片劑、凝膠、或壓出物的形式。美國專利號5,270,041涉及含甾醇的藥用組合物。
由此，通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明?；D(zhuǎn)移酶樣序列的核酸序列，有可能修飾宿主細(xì)胞的脂類含量和/或組成以及甾醇含量和/或組成。
現(xiàn)在一般性描述了本發(fā)明，通過參考下文實施例將更容易的理解本發(fā)明。這些實施例只是例示性目的，而非限制本發(fā)明。
實施例然后加入1倍體積的RecP(50mM Tris-HCl pH9、10mM EDTA、和0.5％w/v CTAB)沉淀RNA，并如上簡單離心回收。將RNA沉淀重新溶于0.4ml 1M NaCl。將RNA沉淀重新溶于水，并用酚/氯仿抽提。加入足夠的3M乙酸鉀(pH5)使混合物含0.3M乙酸鹽，隨后加入2倍體積的乙醇沉淀RNA。乙醇清洗后，將此最終RNA沉淀溶于水并凍存。
或者，可使用TRIzol試劑(BRL Lifetechnologies，Gaithersburg，MD)遵循制造商的方案獲得總RNA。將RNA沉淀溶于水并凍存。實施例2LCAT序列的鑒定在Silicon Graphics Unix計算機(jī)上使用由Compugen有限公司供應(yīng)的額外Bioaccellerator硬件和GenWeb軟件進(jìn)行搜索。該軟件和硬件能夠?qū)mith-Waterman算法用于搜索DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以特征描述作為檢索。用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的程序是profilesearch。這是搜索，其中查詢不是單一序列，而是基于氨基酸或核酸序列多重比對的特征描述。將特征描述用于檢索序列數(shù)據(jù)組，即序列數(shù)據(jù)庫。特征描述包含用于對序列中每個位置評分的所有有關(guān)信息，有效取代用于標(biāo)準(zhǔn)檢索搜索的“評分矩陣”。用蛋白質(zhì)特征描述檢索核苷酸序列的程序是tprofilesearch。tprofilesearch使用氨基酸特征描述檢索來搜索核酸數(shù)據(jù)庫。在進(jìn)行搜索時，將數(shù)據(jù)庫中的序列翻譯成6種讀碼框的氨基酸序列。tprofilesearch的輸出文件與profilesearch的輸出文件相同，區(qū)別只在于存在額外列指出發(fā)生最佳比對的讀碼框。
將Smith-Waterman算法(Smith和Waterman，1981，分子生物學(xué)雜志(J.Molec.Biol.)147195-197)用于搜索來自檢索的一種序列與數(shù)據(jù)庫所含的一組序列之間的相似性。
使用BLAST將來自人的卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)序列(J.McLean等人，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res.)14(23)9397-9406；SEQ ID NO1)用于搜索NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。由擬南芥鑒定到3種序列，GenBank編號AC004557(本文稱為LCAT1，SEQID NO2)、AC003027(本文稱為LCAT2，SEQ ID NO4)、和AL024486(本文稱為LCAT3，SEQ ID NO6)。推導(dǎo)氨基酸序列分別提供于SEQ IDNO3、5、和7。
由html(超文本鏈接標(biāo)示語言)文件剪下使用PSI-BLAST檢索產(chǎn)生的特征描述。位于ncbi的psiblast的萬維網(wǎng)(www)/html界面在psiblast每次反復(fù)運算后返回的html文件的隱藏區(qū)域存儲了當(dāng)前產(chǎn)生的特征描述矩陣。然而，該矩陣已經(jīng)編碼成string62(s62)格式，以便于通過html進(jìn)行傳輸。string62格式是將矩陣的數(shù)值簡單轉(zhuǎn)換成html法定的ascii字母。
編碼的矩陣寬度(x軸)是26個字母，并包括共有字母、以順序A、B、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、X、Y、Z(其中B代表D和N，Z代表Q和E，X代表任何氨基酸)表示的每種氨基酸的概率、缺口產(chǎn)生值、和缺口延伸值。
矩陣長度(y軸)對應(yīng)于由PSI-BLAST鑒定的序列的長度。氨基酸順序?qū)?yīng)于使用PSI-BLAST鑒定的序列的保守氨基酸序列，N末端位于矩陣頂部。在各個單字母氨基酸縮寫的下面，沿x軸描述了該位置處每一氨基酸被其它氨基酸代表的概率。
由此，特征描述的每一行包括得分最高的(共有的)氨基酸，隨后是序列矩陣中每種可能氨基酸位于該位置的得分、在該位置打開缺口的得分、和在該位置繼續(xù)缺口的得分。
將string62文件轉(zhuǎn)換回特征描述，以用于隨后的搜索。沿x軸，缺口開放域設(shè)成11，缺口延伸域設(shè)成1。根據(jù)PSI-BLAST算法的設(shè)置，缺口產(chǎn)生和缺口延伸的數(shù)值是已知的。將矩陣輸出成標(biāo)準(zhǔn)GCG特征描述形式。該格式能夠由Gen Web讀取。
表1概述了用于將string62格式的文件轉(zhuǎn)換成矩陣的算法。
表1
將LCAT1、LCAT2、和LCAT3的蛋白質(zhì)序列，以及PSI-BLAST特征描述用于對公開的和專有的數(shù)據(jù)庫搜索其它LCAT序列。鑒定到2種EST序列，似乎分別與LCAT1和LCAT3相同。由專有的數(shù)據(jù)庫鑒定到另一種擬南芥序列，LCAT4(SEQ ID NO8)。LCAT4的推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列提供于SEQ ID NO9。使用PSI-BLAST特征描述，由擬南芥生態(tài)型Columbia和Landsberg文庫鑒定到另外2種基因組序列，LCAT7(SEQ ID NO10)和LCAT8(SEQ ID NO11)。LCAT7序列存在于Columbia和Landsberg二者的基因組文庫中，而LCAT8序列只存在于Columbia的文庫中。
由擬南芥公開數(shù)據(jù)庫中的LCAT7的基因組序列預(yù)測到開放讀碼框，該序列稱為MSH12(本文稱為LCAT5，SEQ ID NO73)。LCAT5的推導(dǎo)氨基酸序列提供于SEQ ID NO74。
將PSI-BLAST特征描述和LCAT序列用于檢索公開的酵母數(shù)據(jù)庫以及包括玉米和大豆EST序列的專有文庫。酵母基因組只包含一種基因，即與人LCAT具有明顯相似性的LRO1(LCAT相關(guān)開放讀碼框，YNR008W，
圖1)。LRO1的DNA序列提供于SEQ ID NO75，蛋白質(zhì)序列提供于SEQ IDNO76。由大豆文庫鑒定到7種EST序列是LCAT序列。來自大豆的2種序列(SEQ ID NO12和13)與擬南芥LCAT1序列最密切相關(guān)，鑒定到一種序列與LCAT2最密切相關(guān)(SEQ ID NO14)，3種與LCAT3密切相關(guān)(SEQ ID NO15-17)，還鑒定到另一種序列(SEQ ID NO18)。鑒定到總共11種玉米EST序列與擬南芥LCAT序列相關(guān)。2種玉米EST序列(SEQ ID NO19和20)與LCAT1最密切相關(guān)，鑒定到2種序列與LCAT2密切相關(guān)(SEQ ID NO21和22)，鑒定到4種玉米EST序列與LCAT3密切相關(guān)(SEQ ID NO23-26)，還鑒定到另外3種玉米EST序列(SEQ IDNO27-29)。實施例3ACAT序列的鑒定既然植物ACAT在本領(lǐng)域是已知的，搜索公開數(shù)據(jù)庫，以鑒定來自哺乳動物來源的已知的和相關(guān)的ACAT序列。然后將這些序列用于搜索公開的和專有的EST數(shù)據(jù)庫，以鑒定植物ACAT樣序列。
對含小鼠表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列的公開數(shù)據(jù)庫(dBEST)搜索ACAT樣序列，鑒定了與已知的ACAT序列相關(guān)(大約20％相同)但又有分歧的2種序列(SEQ ID NO30和31)。
為了由其它生物體鑒定ACAT樣序列，將2種小鼠ACAT序列用于搜索包含來自人和大鼠組織的EST序列的公開的和專有的數(shù)據(jù)庫。搜索結(jié)果由人數(shù)據(jù)庫和大鼠數(shù)據(jù)庫鑒定了與小鼠序列密切相關(guān)的幾種序列。使用GCG裝配程序，裝配人和大鼠的ACAT樣EST序列，從而通過鑒定重疊序列構(gòu)建了完整的推斷cDNA序列(分別為SEQ ID NO32和33)。
使用Mac Vector(Oxford Molecular公司)，將人ACAT樣序列的蛋白質(zhì)序列與來自人(Chang等人，1993，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26820747-20755，SEQ ID NO34)和小鼠(Uelmen等人，1995，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27026192-26201，SEQ IDNO36；和Yang等人，1996，科學(xué)(Science)2721353-1356，SEQID NO37)的已知ACAT序列進(jìn)行比對。比對結(jié)果證明，該序列與已知序列相關(guān)，可是相關(guān)序列與已知序列只有大約25％相似。
將人甾醇O-?；D(zhuǎn)移酶(ACAT，酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，編號A48026)相關(guān)序列的蛋白質(zhì)序列用于搜索蛋白質(zhì)和核酸Genbank數(shù)據(jù)庫。在公開的擬南芥EST數(shù)據(jù)庫中鑒定到一種植物同源序列(編號A042298，SEQ ID NO38)。由EST序列翻譯成蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO39)，發(fā)現(xiàn)包含哺乳動物與酵母ACAT二者中保守的肽序列(Chang等人，1997，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem.)66613-638)。
為了獲得對應(yīng)于擬南芥ACAT樣EST的完整編碼區(qū)，設(shè)計了合成寡核苷酸引物來擴(kuò)增含ACAT樣序列的部分cDNA克隆的5’和3’端。引物是根據(jù)擬南芥ACAT樣EST序列設(shè)計的，并用于cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)反應(yīng)(Frohman等人，1988，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858998-9002)。
設(shè)計引物(5’-TGCAAATTGACGAGCACACCAACCCCTTC-3’(SEQ ID NO40)和5’-AAGGATGCTTTGAGTTCCTGACAATAGG-3’(SEQ ID NO41))以擴(kuò)增擬南芥ACAT EST序列的5’端。使用馬拉松cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，CA)由cDNA克隆擴(kuò)增側(cè)翼序列。
將由5’-RACE擴(kuò)增衍生的序列用于搜索專有的擬南芥EST文庫。鑒定到含與5’-RACE序列相同的序列的一個EST，編號LIB25-088-C7(SEQID NO42)。此外，發(fā)現(xiàn)LIB25-088-C7包含擬南芥ACAT樣產(chǎn)物的完整的推定編碼序列。
將A042298的核酸序列以及推定的翻譯產(chǎn)物序列用于搜索公開的和專有的數(shù)據(jù)庫。在大豆(SEQ ID NO43-46)和玉米(SEQ ID NO47-50)的專有數(shù)據(jù)庫中都鑒定到4種EST序列，由高山被孢霉(Mortierrella alpina)的EST序列鑒定到1種ACAT樣序列(SEQ ID NO51)。
比較了來自不同來源的ACAT序列之間的序列排列，以鑒定序列之間的相似性。將已知的人和小鼠ACAT的核苷酸序列，以及已知的酵母ACAT的核苷酸序列，與人和擬南芥的ACAT樣EST序列進(jìn)行了比較。
序列排列分析根據(jù)序列相似性揭示了幾類ACAT。已知的人和小鼠ACAT，核苷酸序列88％相似，構(gòu)成一類ACAT。另一類ACAT包括酵母ACAT，它們與已知的人和小鼠類ACAT的相似性小于20％。
最后一類ACAT包括本發(fā)明中公開的擬南芥和人序列。這類ACAT與已知的人和小鼠類大約22％相似，與酵母類大約23％相似。由此，本發(fā)明中公開的ACAT序列代表了一類新的ACAT酶。還提供了這類的部分小鼠序列。實施例4表達(dá)構(gòu)建物的制備制備了指導(dǎo)LCAT1、LCAT2、LCAT3、LCAT4、LCAT5、和酵母LRO1序列在植物和培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建物。使用下列寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由適當(dāng)EST克隆或擬南芥基因組cDNA文庫擴(kuò)增每種LCAT的完整編碼區(qū)。LCAT1編碼序列是使用引物5’-GGATCCGCGGCCGCACAATGAAAAAAATATCTTCACATTATTCGG-3’(SEQID NO52)和5’-GGATCCCCTGCAGGTCATTCATTGACGGCATTAACATTGG-3’(SEQ ID NO53)由EST克隆LIB25-082-Q1-E1-G4擴(kuò)增的。LCAT2編碼序列是使用合成寡核苷酸引物5’-GGATCCGCGGCCGCACAATGGGAGCGAATTCGAAATCAGTAACG-3’(SEQID NO54)和5’-GGATCCCCTGCAGGTTAATACCCACTTTTATCAAGCTCCC-3’(SEQ ID NO55)由擬南芥基因組cDNA庫擴(kuò)增的。LCAT3編碼序列是使用合成寡核苷酸引物5’-GGATCCGCGGCCGCACAATGTCTCTATTACTGGAAGAGATC-3’(SEQ IDNO56)和5’-GGATCCCCTGCAGGTTATGCATCAACAGAGACACTTACAGC-3’(SEQ ID NO57)由EST克隆LIB22-004-Q1-E1-B4擴(kuò)增的。LCAT4編碼序列是使用合成寡核苷酸引物5’-GGATCCGCGGCCGCACAATGGGCTGGATTCCGTGTCCGTGC-3’(SEQ IDNO58)和5’-GGATCCCCTGCAGGTTAACCAGAATCAACTACTTTGTG-3’(SEQ ID NO59)由EST克隆LIB23-007-Q1-E1-B5擴(kuò)增的。LCAT5編碼序列是使用合成寡核苷酸引物5’-GGATCCGCGGCCGCACAATGCCCCTTATTCATCGG-3’(SEQ ID NO77)和5’-GGATCCCCTGCAGGTCACAGCTTCAGGTCAATACG-3’(SEQ ID NO78)。由EST克隆LIB23-053-Q1-E1-E3擴(kuò)增的。酵母LRO1編碼序列是使用合成寡核苷酸引物5’GGATCCGCGGCCGCACAATGGGCACACTGTTTCGAAG3’(SEQ ID NO79)和5’GGATCCCCTGCAGGTTACATTGGGAAGGGCATCTGAG3’(SEQ ID NO80)。由酵母基因組DNA擴(kuò)增的。
擬南芥ACAT序列的完整編碼區(qū)(SEQ ID NO42)是使用寡核苷酸引物5’-TCGACCTGCAGGAAGCTTAGAAATGGCGATTTTGGATTC-3’(SEQ ID NO60)和5’-GGATCCGCGGCCGCTCATGACATCGATCCTTTTCGG-3’(SEQ ID NO61)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由EST克隆LIB25-088-C7擴(kuò)增的。
將產(chǎn)生的每種PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR2.1Topo(Invitrogen)中，并命名為pCGN9964(LCAT1)、pCGN9985(LCAT2)、pCGN9965(LCAT3)、pCGN9995(LCAT4)、pCGN10964(LCAT5)、pCGN10963(LRO1)、和pCGN8626(ACAT)。獲得雙鏈DNA序列以確認(rèn)PCR擴(kuò)增沒有引入錯誤。4A.桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建物的制備制備了指導(dǎo)擬南芥LCAT和酵母LCAT序列在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建物。通過NotI和Sse8387I消化，由相應(yīng)的構(gòu)建物切下LCAT蛋白質(zhì)的完整編碼區(qū)，隨后進(jìn)行凝膠電泳和凝膠純化。將含LCAT編碼序列的片段克隆到經(jīng)NotI和PstI消化的桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中。產(chǎn)生的桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建物稱為pCGN9992(LCAT1)、pCGN9993(LCAT2)、pCGN9994(LCAT3)、pCGN10900(LCAT4)、pCGN10967(LCAT5)、和pCGN10962(LRO1)。4B.植物表達(dá)構(gòu)建物的制備修飾含衍生自pCGN3223(描述于美國專利號5,639,790，完整收入本文作為參考)的napin盒的質(zhì)粒，使之更適用于克隆含多個限制性位點的大型DNA片段，并能夠?qū)⒍鄠€napin融合基因克隆到植物二元轉(zhuǎn)化載體中。在用限制性內(nèi)切核酸酶BssHII消化后，將包含自身退火寡核苷酸序列5’-CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT-3’(SEQ ID NO62)的銜接頭連接到克隆載體pBC SK+(Stratagene)中，構(gòu)建載體pCGN7765。用NotI消化質(zhì)粒pCGN3223和pCGN7765，并連接到一起。產(chǎn)生的載體pCGN7770包含pCGN7765的主鏈和來自pCGN3223的napin種子特異性表達(dá)盒。
克隆盒pCGN7787基本上包含與pCGN7770相同的調(diào)控元件，不同之處是已經(jīng)用雙鏈CaMV 35S啟動子和tml聚腺苷酸化信號及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)取代了pCGN7770的napin調(diào)控區(qū)。
由pCGN1558(McBride和Summerfelt，1990，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)14269-276)構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的二元載體pCGN5139。在pCGN5139中，以HindIII/Asp718片段用含唯一限制性內(nèi)切核酸酶位點AscI、PacI、XbaI、SwaI、BamHI、和NotI的多接頭取代pCGN1558的多接頭。在pCGN5139中保留了Asp718和HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點。
構(gòu)建了一系列turbo二元載體，得以將DNA序列快速克隆到包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的二元載體中。
通過將寡核苷酸5’-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3’(SEQ ID NO63)和5’-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3’(SEQ ID NO64)連接到經(jīng)SalI/XhoI消化的pCGN7770中構(gòu)建了質(zhì)粒pCGN8618。通過Asp718I消化由pCGN8618切下含napin啟動子、多接頭、和napin 3’區(qū)的片段；通過用Klenow片段填充5’突出端將片段末端補(bǔ)平；然后連接到經(jīng)Asp718I和HindIII消化并通過用Klenow片段填充5’突出端而補(bǔ)平末端的pCGN5139中。將以napin啟動子最接近pCGN5139的補(bǔ)平Asp718I位點、napin3’區(qū)最接近補(bǔ)平HindIII位點的取向包含插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，以確認(rèn)插入片段的取向和克隆連接的完整性。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8622。
通過將寡核苷酸5’-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3’(SEQ ID NO65)和5’-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3’(SEQ ID NO66)連接到經(jīng)SalI/XhoI消化的pCGN7770中構(gòu)建了質(zhì)粒pCGN8619。通過Asp718I消化由pCGN8619切下含napin啟動子、多接頭、和napin 3’區(qū)的片段；通過用Klenow片段填充5’突出端將片段末端補(bǔ)平；然后連接到經(jīng)Asp718I和HindIII消化并通過用Klenow片段填充5’突出端而補(bǔ)平末端的pCGN5139中。將以napin啟動子最接近pCGN5139的補(bǔ)平Asp718I位點、napin 3’區(qū)最接近補(bǔ)平HindIII位點的取向包含插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，以確認(rèn)插入片段的取向和克隆連接的完整性。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8623。
通過將寡核苷酸5’-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3’(SEQ ID NO67)和5’-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3’(SEQ ID NO68)連接到經(jīng)SalI/SacI消化的pCGN7787中構(gòu)建了質(zhì)粒pCGN8620。通過Asp718I完全消化和NotI部分消化由pCGN8620切下含d35S啟動子、多接頭、和tml 3’區(qū)的片段；通過用Klenow片段填充5’突出端將片段末端補(bǔ)平；然后連接到經(jīng)Asp718I和HindIII消化并通過用Klenow片段填充5’突出端而補(bǔ)平末端的pCGN5139中。將以d35S啟動子最接近pCGN5139的補(bǔ)平Asp718I位點、tml 3’區(qū)最接近補(bǔ)平HindIII位點的取向包含插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，以確認(rèn)插入片段的取向和克隆連接的完整性。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8624。
通過將寡核苷酸5’-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3’(SEQ ID NO69)和5’-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3’(SEQ ID NO70)連接到經(jīng)SalI/SacI消化的pCGN7787中構(gòu)建了質(zhì)粒pCGN8621。通過Asp718I完全消化和NotI部分消化由pCGN8621切下含d35S啟動子、多接頭、和tml 3’區(qū)的片段；通過用Klenow片段填充5’突出端將片段末端補(bǔ)平；然后連接到經(jīng)Asp718I和HindIII消化并通過用Klenow片段填充5’突出端而補(bǔ)平末端的pCGN5139中。將以d35S啟動子最接近pCGN5139的補(bǔ)平Asp718I位點、tml 3’區(qū)最接近補(bǔ)平HindIII位點的取向包含插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，以確認(rèn)插入片段的取向和克隆連接的完整性。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8625。
質(zhì)粒構(gòu)建物pCGN8640是上述pCGN8624的修改。用Pfu聚合酶將由編碼細(xì)菌壯觀霉素和鏈霉素抗性的轉(zhuǎn)座子Tn7(Fling等人，1985，核酸研究(Nucleic Acids Research)13(19)7095-7106)分離的938bpPstI片段(大腸桿菌和農(nóng)桿菌選擇的決定因素)補(bǔ)平末端。將末端補(bǔ)平的片段連接到經(jīng)SpeI消化并用Pfu聚合酶補(bǔ)平末端的pCGN8624中。將含PstI片段的區(qū)域測序，以確認(rèn)插入片段的取向和克隆連接的完整性。
如下將壯觀霉素抗性標(biāo)記導(dǎo)入pCGN8622和pCGN8623。如上所述，將來自pCGN8640的7.7kb AvrII-SnaBI片段連接來自pCGN8623或pCGN8622的10.9kb AvrII-SnaBI片段。產(chǎn)生的質(zhì)粒分別為pCGN8641和pCGN8643。
通過將寡核苷酸5’-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3’(SEQ ID NO71)和5’-TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3’(SEQ ID NO72)連接到經(jīng)BamHI-PstI消化的pCGN8640中構(gòu)建了質(zhì)粒pCGN8644。4C.植物L(fēng)CAT表達(dá)構(gòu)建物的制備以NotI/Sse8387I片段將LCAT1的編碼序列由pCGN9964克隆到pCGN8640、pCGN8641、pCGN8643、和pCGN8644中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN9960、pCGN9961、pCGN9962、和pCGN9963。構(gòu)建物pCGN9960設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT1編碼序列。構(gòu)建物pCGN9961設(shè)計用于以反義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT1編碼序列。構(gòu)建物pCGN9962設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT1編碼序列。構(gòu)建物pCGN9963設(shè)計用于以反義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT1編碼序列。
以NotI/Sse8387I片段將LCAT2的編碼序列由pCGN9985克隆到pCGN8640、pCGN8641、pCGN8643、和pCGN8644中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN9981、pCGN9982、pCGN9983、和pCGN9984。構(gòu)建物pCGN9981設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT2編碼序列。構(gòu)建物pCGN9982設(shè)計用于以反義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT2編碼序列。構(gòu)建物pCGN9983設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT2編碼序列。構(gòu)建物pCGN9984設(shè)計用于以反義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT2編碼序列。
以NotI/Sse8387I片段將LCAT3的編碼序列由pCGN9965克隆到pCGN8640、pCGN8641、pCGN8643、和pCGN8644中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN9966、pCGN9967、pCGN9968、和pCGN9969。構(gòu)建物pCGN9966設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT3編碼序列。構(gòu)建物pCGN9967設(shè)計用于以反義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT3編碼序列。構(gòu)建物pCGN9968設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT3編碼序列。構(gòu)建物pCGN9969設(shè)計用于以反義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT3編碼序列。
以NotI/Sse8387I片段將LCAT4的編碼序列由pCGN9995克隆到pCGN8640、pCGN8641、pCGN8643、和pCGN8644中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN9996、pCGN9997、pCGN9998、和pCGN9999。構(gòu)建物pCGN9996設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT4編碼序列。構(gòu)建物pCGN9997設(shè)計用于以反義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT4編碼序列。構(gòu)建物pCGN9998設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT4編碼序列。構(gòu)建物pCGN9999設(shè)計用于以反義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT4編碼序列。
以NotI/Sse8387I片段將LCAT5的編碼序列由pCGN10964克隆到pCGN9977和pCGN9979中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN10965和pCGN10966。構(gòu)建物pCGN10965設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LCAT5編碼序列。構(gòu)建物pCGN10966設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LCAT5編碼序列。
以NotI/Sse8387I片段將LRO1的編碼序列由pCGN10963克隆到pCGN9977和pCGN9979中，分別產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建物pCGN10960和pCGN10961。構(gòu)建物pCGN10960設(shè)計用于以有義取向由組成性啟動子CaMV35S表達(dá)LRO1編碼序列。構(gòu)建物pCGN10961設(shè)計用于以有義取向由napin啟動子表達(dá)LRO1編碼序列4D.植物ACAT表達(dá)構(gòu)建物的制備通過Sse8387I和NotI消化由pCGN8626切下含擬南芥ACAT樣編碼區(qū)的片段。將含ACAT樣序列的片段連接到經(jīng)PstI-NotI消化的pCGN8622中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8627。DNA序列分析確認(rèn)了克隆連接的完整性。
通過Sse8387I和NotI消化由pCGN8626切下含擬南芥ACAT樣編碼區(qū)(SEQ ID NO42)的片段。將該片段連接到經(jīng)PstI-NotI消化的pCGN8623中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8628。DNA序列分析確認(rèn)了克隆連接的完整性。
通過Sse8387I和NotI消化由pCGN8626切下含擬南芥ACAT樣編碼區(qū)的片段。將該片段連接到經(jīng)PstI-NotI消化的pCGN8624中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8629。DNA序列分析確認(rèn)了克隆連接的完整性。
通過Sse8387I和NotI消化由pCGN8626切下含擬南芥ACAT樣編碼區(qū)的片段。將該片段連接到經(jīng)PstI-NotI消化的pCGN8625中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pCGN8630。DNA序列分析確認(rèn)了克隆連接的完整性。
構(gòu)建了用于遏制內(nèi)源ACAT樣活性的另一種表達(dá)構(gòu)建物。通過由有義取向的pCGN8626克隆大約1kb的擬南芥ACAT樣編碼區(qū)構(gòu)建了全長擬南芥ACAT樣編碼區(qū)以反義取向置于napin轉(zhuǎn)錄起始序列調(diào)控控制下的構(gòu)建物pCGN8660。
對于大鼠ACAT樣序列在植物中的表達(dá)，將pCGN8592的NotI-Sse8387I片段克隆到經(jīng)NotI-PstI消化的二元載體pCGN8621、pCGN8622、和pCGN8624中，分別產(chǎn)生pCGN9700、pCGN9701、和pCGN9702。質(zhì)粒pCGN9700在napin啟動子的控制下表達(dá)大鼠ACAT樣cDNA的有義轉(zhuǎn)錄本，質(zhì)粒pCGN9701在napin啟動子的控制下表達(dá)大鼠ACAT樣cDNA的反義轉(zhuǎn)錄本，而質(zhì)粒pCGN9702在雙重35S啟動子的控制下表達(dá)大鼠ACAT樣cDNA的有義轉(zhuǎn)錄本。將質(zhì)粒pCGN9700、pCGN9701、和pCGN9702導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA101中。
制備了指導(dǎo)大鼠ACAT樣序列在大豆種子胚和玉米胚乳中表達(dá)的構(gòu)建物。對于大鼠ACAT樣DNA序列在大豆中的表達(dá)，使用綠豆核酸酶將來自pCGN8592、包含大鼠ACAT樣序列編碼區(qū)的1.5kb NotI/Sse8387I片段補(bǔ)平末端，并連接到turbo 7S二元/克隆載體pCGN8809的SmaI位點中，產(chǎn)生載體pCGN8817用于通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化到大豆中。載體pCGN8817包含下列可操作連接元件6大豆β-conglycinin α亞基的啟動子區(qū)(7S啟動子，Chen等人，1986，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838560-8564)、編碼完整大鼠ACAT樣蛋白質(zhì)的DNA序列、和豌豆RuBisCo小亞基的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(稱為E9 3’，Coruzzi等人，1984，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)31671-1679；和Morelli等人，1985，自然(Nature)315200-204)。該構(gòu)建物還包含在玄參花葉病毒(figwort mosaic virus，F(xiàn)MV)啟動子(美國專利號5,378,619)和E9轉(zhuǎn)錄終止區(qū)控制下表達(dá)的用于通過使用CP4 EPSPS篩選草甘膦抗性來選擇陽性轉(zhuǎn)化植物的序列(美國專利號5,633,435)。
對于大鼠ACAT樣DNA序列在玉米胚乳中的表達(dá)，使用綠豆核酸酶將來自pCGN8592、包含大鼠ACAT樣序列編碼區(qū)的1.5kb NotI/Sse8387I片段補(bǔ)平末端，并連接到稻pGt1表達(dá)盒pCGN8592的BamHI位點中，用于由pGt1啟動子(D.J.Leisy等人，1989，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)14，41-50)和HSP70內(nèi)含子序列(美國專利號5,593,874)進(jìn)行表達(dá)。該盒還包含胭脂堿合酶克隆位點下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)nos 3’(Depicker等人，1982，分子和應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Molec.Appl.Genet.)1562-573)。將含pGt1啟動子、編碼大鼠ACAT樣蛋白質(zhì)的DNA序列、和nos轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的的7.5kb片段克隆到二元載體pCGN8816中，產(chǎn)生載體pCGN8818用于轉(zhuǎn)化到玉米中。該構(gòu)建物還包含用于用卡那霉素選擇陽性轉(zhuǎn)化體的序列，使用來自Tn5細(xì)菌的卡那霉素抗性基因，置于CaMV 35S啟動子和tml轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的控制之下。實施例5在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)將桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)LCAT cDNA。
使用BAC-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)，參照制造商的指示，轉(zhuǎn)化并表達(dá)桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建物pCGN9992、pCGN9993、pCGN9994、pCGN10900、pCGN10962、和pCGN10967。
使用本領(lǐng)域已知方法(見實施例8)，將轉(zhuǎn)化后的昆蟲細(xì)胞用于測定酰基轉(zhuǎn)移酶活性。
將上述植物二元構(gòu)建物用于植物轉(zhuǎn)化，以指導(dǎo)甾醇?；D(zhuǎn)移酶在植物組織中的表達(dá)。通過Holsters等人的方法(1978，分子和普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)163181-187)，將二元載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA101細(xì)胞(Hood等人，1986，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1681291-1301)中。如Valverkens等人(1988，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855536-5540)、Bent等人(1994，科學(xué)(Science)2651856-1860)、和Bechtold等人(1993，C.R.Acad.Sci.，生命科學(xué)(Life Sciences)3161194-1199)所述，通過由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。實施例7經(jīng)修飾的甾醇含量/分布的植物測定法7A.T2種子的NMR
通過NMR分析了來自在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT1-4的植物的種子。將轉(zhuǎn)基因植物的擬南芥種子直接置于廣口MAS NMR樣品管中。
使用配備了碳觀測MAS NanoprobesTM的Varian NMR儀器(PaloAlto，CA)InovaTMNMR分光計于11.7T(1H＝500MHz，13C＝125mHz)測量高分辨率光譜。使用下列條件于環(huán)境溫度(大約21-22℃)14小時獲得了沒有場頻鎖定的13C光譜光譜寬度＝29.996kHz，收集時間＝2.185sec，p/2脈沖(3.8ms)無馳豫延遲，1H g B2＝2.5kHz帶Waltz去耦。數(shù)據(jù)處理條件通常是數(shù)字分辨度＝0.11Hz，0.3-1.5Hz線性加寬，前3個數(shù)據(jù)點時間反轉(zhuǎn)線性預(yù)測。通過向擬南芥種子中加入純的四甲基硅烷(TMS)來參考化學(xué)移位，并將產(chǎn)生的參考參數(shù)用于隨后的光譜。對于最窄的種子共振，13C分辨度是2-3Hz。光譜分辨度不依賴MAS掃描速度(1.5-3.5kHz)，通常用1.5kHz掃描速度獲取數(shù)據(jù)。掃描旁帶是主帶的大約1％。植物甾醇的13C排列基于包含三油酸甘油酯、β-豆甾醇、和膽固醇油酸酯的模型樣品。三酰甘油的13C排列得自與文獻(xiàn)排列或者由13C NMR數(shù)據(jù)庫(Advanced Chemical Development公司，版本3.50，Toronto，加拿大)計算的移位的比較。
這些分析的結(jié)果顯示于表2，而且顯示存在這樣的傾向來自在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT4基因(pCGN9998)的植物系5的種子中植物甾醇增加了大約2倍。在此分析過程中，還注意到來自在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT2構(gòu)建物(pCGN9983)的植物的種子中平均油含量高于對照。這是支持過度表達(dá)編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的核苷酸序列可提高油含量的概念的第一個植物證據(jù)。7B.T2種子的HPLC/MS使用促進(jìn)溶劑提取儀(accelerated solvent extractor，ASE)方法，由在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT1-4的T2植物提取種子油。使用研缽和乳杵研磨種子樣品，獲得精細(xì)的均質(zhì)粉。使用Dionex促進(jìn)溶劑提取儀(ASE)獲得油。將干凈的種子粉加到等量的硅藻土中。將種子粉樣品和硅藻土徹底混勻，直至實現(xiàn)均質(zhì)。然后將樣品加到儀器中，并參照經(jīng)確認(rèn)的實驗室方案使用己烷實現(xiàn)油萃取。
然后對來自這些種子樣品的油進(jìn)行甾醇酯分析，使用HPLC/MS分析游離的菜油甾醇、豆甾醇、和谷甾醇及其脂肪酸酯。向裝有大約0.1g油的自動進(jìn)樣管中加入0.3ml CDCl3。向900μl CHCl3中加入100μl該溶液。隨后將5μl該稀釋樣品注射到HPLC/MS中進(jìn)行陽離子大氣壓電離。使用2根連續(xù)的4.6×50mm C8 Zorbax柱并使用乙腈與含40％CHCl3的乙腈的梯度分離油中的各種成份。計算甾醇濃度，其中假設(shè)每種甾醇及其脂肪酸酯具有相同的摩爾應(yīng)答。在膽固醇及其酯中觀察到確是這種情況，并假設(shè)菜油甾醇、豆甾醇、和谷甾醇也是這種情況。在本研究中，鑒定為豆甾醇的甾醇實際上是該化合物的異構(gòu)體。
這些分析的結(jié)果顯示于圖3和圖4，并顯示在7株在napin啟動子控制下表達(dá)LCAT3(pCGN9968)的T2植物系中，在6株的種子中存在甾醇酯增加，增加水平為50％。實施例8用于甾醇酯化活性的桿狀病毒昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物使用BAC-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)，參照制造商的指示，轉(zhuǎn)化并表達(dá)桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建物pCGN9992、pCGN9993、pCGN9994、和pCGN10900(見實施例4)，不同之處是重組病毒的收獲是在轉(zhuǎn)染后5天進(jìn)行的。將轉(zhuǎn)染混合物的上清液用于產(chǎn)生病毒原液，繼而用于感染用于實驗的Sf9細(xì)胞。
使用本文所述方法，對經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞測定卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性。將昆蟲細(xì)胞離心，產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀或是直接使用，或是凍存于-70℃以供稍后分析。將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基A(100mM Tricine/NaOHpH7.8、10％w/v甘油、280mM NaCl，添加0.1μM抑酶肽、1μM亮抑酶肽、和100μM Pefabloc)(都購自Boehringer Mannheim，德國)，并通過超聲波(10秒鐘2次)裂解。通過離心(14,000×g，10分鐘，4℃)沉淀細(xì)胞壁和其它碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，并通過離心(100,000×g，Ti 70.1轉(zhuǎn)頭，46,000rpm，1小時，4℃)沉淀膜。將總膜重懸于培養(yǎng)基A。在含100mM Tris/HCl pH7、28mM NaCl、0.03％Triton X-100、0.1mM谷甾醇、20μM 1，2-[14C]-棕櫚酰磷脂酰膽堿(246420dpm/nmole)、和0.05-20mg膜蛋白質(zhì)的0.1ml反應(yīng)混合物中測定卵磷脂甾醇?；D(zhuǎn)移酶活性。于30℃保溫15分鐘后，加入含100μg膽固醇和膽固醇酯作為冷載體的0.5ml亞甲基氯∶甲醇(4∶1，v/v)溶液終止反應(yīng)。吸取底層有機(jī)層部分(0.1ml)，并在氮氣下蒸發(fā)。將濃縮提取物重懸于30μl己烷，并點到硅膠G薄層層析板上。將板在己烷∶二乙醚∶乙酸(80∶20∶1)中遷移至頂部，然后空氣干燥。通過暴露于低能磷成像屏測定放射性。曝光后，在磷成像儀上對屏讀數(shù)。
桿狀病毒膜中來自pCGN10900的LCAT4蛋白質(zhì)在TLC板的區(qū)域中顯示放射性斑點，其中膽固醇酯發(fā)生遷移，指示LCAT4有能力催化?；陕蚜字?PC)轉(zhuǎn)移至豆甾醇產(chǎn)生豆甾醇酯。實施例9用于經(jīng)修飾脂類含量的植物實驗Nir(近紅外光譜學(xué)掃描)可用于以非破壞性方式測定擬南芥種子的總油含量，條件是已經(jīng)繪制并確認(rèn)了用于種子油含量的光譜校準(zhǔn)曲線。使用來自85株擬南芥植株的種子樣品繪制種子油光譜校準(zhǔn)曲線。清潔種子并使用Foss NIR6500型(Foss-Nirs Systems公司)進(jìn)行掃描。將每種樣品大約50-100mg全種子塞到微量樣品圓杯(包括微型插入物[IH-0337]的石英透鏡[IH-0307])中，并以反射模式掃描以獲得光譜數(shù)據(jù)。然后使用研缽和乳杵研磨種子樣品，獲得精細(xì)的均質(zhì)粉。使用促進(jìn)溶劑提取儀(ASE)測量磨碎樣品的油含量。
在Dionex促進(jìn)溶劑提取儀(ASE)上進(jìn)行總油含量的測量。在9×9cm稱重皿上稱取大約500mg干凈的種子粉，精確至0.1mg。使用頂部加樣天平加入等量硅藻土，精確至0.01g。將種子粉樣品和硅藻土徹底混勻，直至實現(xiàn)均質(zhì)。然后將樣品加到儀器中，并參照經(jīng)確認(rèn)的實驗室方案使用己烷實現(xiàn)油提取。由Community Bureau of Reference(BCR)獲得標(biāo)準(zhǔn)油菜籽樣品。使用BCR參考方法驗證了ASE提取方法。實現(xiàn)了99-100％的總百分比油回收。使用下面的公式計算“現(xiàn)狀”油含量(精確至0.01重量百分比)油含量＝100％×(管加提取油的重量-最初管重)/(樣品重量)。
將由ASE產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜校準(zhǔn)。使用NirSystems winisi軟件中的內(nèi)置統(tǒng)計包產(chǎn)生Nir校準(zhǔn)方程。軟件的光譜校準(zhǔn)部分能夠進(jìn)行校準(zhǔn)和自身確認(rèn)。由總共85份樣品，將57份樣品用于產(chǎn)生總百分比油校準(zhǔn)。將剩余樣品用于確認(rèn)油校準(zhǔn)。將優(yōu)化平滑法、衍生大小(derivative size)、和數(shù)學(xué)處理(經(jīng)修飾部分最小平方(modifiedpartial least square))用于產(chǎn)生校準(zhǔn)。將未用于建立相應(yīng)校準(zhǔn)的樣品作為確認(rèn)組。將諸如相關(guān)系數(shù)(R)、決定系數(shù)(R2)、預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error of prediction，SEP)、和經(jīng)偏值校正的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error of prediction corrected for bias，SEPC)等統(tǒng)計工具用于評價校準(zhǔn)方程。
清潔來自用LCAT基因轉(zhuǎn)化的植物的T2種子，并使用Foss NIR 6500型(Foss-Nirs Systems公司)進(jìn)行掃描。將每種樣品大約50-100mg全種子塞到微量樣品圓杯(具有包括微型插入物[IH-0337]的石英透鏡[IH-0307])中，并以反射模式掃描以獲得光譜數(shù)據(jù)。使用上述種子油光譜校準(zhǔn)曲線測定每種種子樣品中的油百分比。
這些分析的結(jié)果顯示于圖5和表2，并顯示來自表達(dá)LCAT2基因的T2植物的種子油水平存在顯著增加。當(dāng)LCAT2是由35S組成性啟動子或種子特異性napin啟動子驅(qū)動時，在植物中看到這種油的增加。這些結(jié)果顯示編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的核酸序列的過度表達(dá)可提高植物中的種子油產(chǎn)量。
表2構(gòu)建物編號 種子油百分比(％)對照 24.7對照 28.0對照 31.8對照 32.4NAPIN LCAT1 PCGN996228.5NAPIN LCAT1 PCGN996228.9NAPIN LCAT1 PCGN996229.6NAPIN LCAT1 PCGN996230.1NAPIN LCAT1 PCGN996230.1NAPIN LCAT1 PCGN996230.1NAPIN LCAT1 PCGN996230.8NAPIN LCAT1 PCGN996231.0NAPIN LCAT1 pCGN996232.1NAPIN LCAT1 pCGN996234.2NAPIN LCAT3 pCGN996826.8NAPIN LCAT3 pCGN996827.4NAPIN LCAT3 pCGN996829.0NAPIN LCAT3 pCGN996829.0NAPIN LCAT3 pCGN996832.6NAPIN LCAT2 pCGN998326.5NAPIN LCAT2 pCGN998334.7NAPIN LCAT2 pCGN998334.8NAPIN LCAT2 pCGN998335.7NAPIN LCAT2 pCGN998335.8NAPIN LCAT2 pCGN998336.3NAPIN LCAT2 pCGN998336.7NAPIN LCAT2 pCGN998337.0NAPIN LCAT2 pCGN998337.2NAPIN LCAT2 pCGN998337.3NAPIN LCAT2 pCGN998337.3NAPIN LCAT2 pCGN998337.4NAPIN LCAT2 pCGN998337.8NAPIN LCAT2 pCGN998338.0NAPIN LCAT2 pCGN998338.035S LCAT2 pCGN998127.335S LCAT2 pCGN998128.135S LCAT2pCGN998128.235S LCAT2pCGN998128.635S LCAT2pCGN998129.835S LCAT2pCGN998130.335S LCAT2pCGN998132.435S LCAT2pCGN998132.535S LCAT2pCGN998133.635S LCAT2pCGN998134.135S LCAT2pCGN998135.535S LCAT2pCGN998136.435S LCAT2pCGN998137.135S LCAT2pCGN998138.335S LCAT2pCGN998138.535S LCAT2pCGN998139.1根據(jù)本發(fā)明的詳述和上文實施例，可以領(lǐng)會，已經(jīng)實現(xiàn)了本發(fā)明的幾個方面。
應(yīng)當(dāng)這樣理解，已經(jīng)通過例示和范例的方式詳細(xì)描述了本發(fā)明，以使本領(lǐng)域其他熟練技術(shù)人員了解本發(fā)明、其原理、及其實踐性應(yīng)用。本發(fā)明中具體的配方和過程不限于所述具體實施方案的描述，而是應(yīng)當(dāng)根據(jù)下文權(quán)利要求及其等同物來看待描述和實施例。雖然上文有些實施例和描述中包括關(guān)于本發(fā)明可能發(fā)揮功能的方式的一些結(jié)論，但是發(fā)明人并不想束縛于那些結(jié)論和功能，而只是提出來作為可能的解釋。
還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明提出具體實施方案的意圖不是詳盡的描述或限制本發(fā)明，根據(jù)上述實施例和詳述，許多改變、修飾、和變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，本發(fā)明意欲涵蓋屬于下文權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的所有這些改變、修飾、和變化。
序列表<110>Monsanto公司<120>植物甾醇?；D(zhuǎn)移酶<130>MTC671<140><141><150>60/152,493<151>1999-08-30<160>80<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>440<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>1Met Gly Pro Pro Gly Ser Pro Trp Gln Trp Val Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Leu Leu Leu Pro Pro Ala Ala Pro Phe Trp Leu Leu Asn Val Leu Phe20 25 30Pro Pro His Thr Thr Pro Lys Ala Glu Leu Ser Asn His Thr Arg Pro35 40 45Val Ile Leu Val Pro Gly Cys Leu Gly Asn Gln Leu Glu Ala Lys Leu50 55 60Asp Lys Pro Asp Val Val Asn Trp Met Cys Tyr Arg Lys Thr Glu Asp65 70 75 80Phe Phe Thr Ile Trp Leu Asp Leu Asn Met Phe Leu Pro Leu Gly Val85 90 95Asp Cys Trp Ile Asp Asn Thr Arg Val Val Tyr Asn Arg Ser Ser Gly100 105 110Leu Val Ser Asn Ala Pro Gly Val Gln Ile Arg Val Pro Gly Phe Gly115 120 125Lys Thr Tyr Ser Val Glu Tyr Leu Asp Ser Ser Lys Leu Ala Gly Tyr130 135 140Leu His Thr Leu Val Gln Asn Leu Val Asn Asn Gly Tyr Val Arg Asp145 150 155 160Glu Thr Val Arg Ala Ala Pro Tyr Asp Trp Arg Leu Glu Pro Gly Gln165 170 175Gln Glu Glu Tyr Tyr Arg Lys Leu Ala Gly Leu Val Glu Glu Met His180 185 190Ala Ala Tyr Gly Lys Pro Val Phe Leu Ile Gly His Ser Leu Gly Cys195 200 205Leu His Leu Leu Tyr Phe Leu Leu Arg Gln Pro Gln Ala Trp Lys Asp210 215 220Arg Phe Ile Asp Gly Phe Ile Ser Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gly Ser225 230 235 240Ile Lys Pro Met Leu Val Leu Ala Ser Gly Asp Asn Gln Gly Ile Pro245 250 255Ile Met Ser Ser Ile Lys Leu Lys Glu Glu Gln Arg Ile Thr Thr Thr260 265 270Ser Pro Trp Met Phe Pro Ser Arg Met Ala Trp Pro Glu Asp His Val275 280 285Phe Ile Ser Thr Pro Ser Phe Asn Tyr Thr Gly Arg Asp Phe Gln Arg290 295 300Phe Phe Ala Asp Leu His Phe Glu Glu Gly Trp Tyr Met Trp Leu Gln305 310 315 320Ser Arg Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ala Pro Gly Val Glu Val Tyr325 330 335Cys Leu Tyr Gly Val Gly Leu Pro Thr Pro Arg Thr Tyr Ile Tyr Asp340 345 350His Gly Phe Pro Tyr Thr Asp Pro Val Gly Val Leu Tyr Glu Asp Gly355 360 365Asp Asp Thr Val Ala Thr Arg Ser Thr Glu Leu Cys Gly Leu Trp Gln370 375 380Gly Arg Gln Pro Gln Pro Val His Leu Leu Pro Leu His Gly Ile Gln385 390 395 400His Leu Asn Met Val Phe Ser Asn Leu Thr Leu Glu His Ile Asn Ala405 410 415Ile Leu Leu Gly Ala Tyr Arg Gln Gly Pro Pro Ala Ser Pro Thr Ala420 425 430Ser Pro Glu Pro Pro Pro Pro Glu435 440<210>2<211>1299<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atgaaaaaaa tatcttcaca ttattcggta gtcatagcga tactcgttgt ggtgacgatg 60acctcgatgt gtcaagctgt gggtagcaac gtgtaccctt tgattctggt tccaggaaac 120ggaggtaacc agctagaggt acggctggac agagaataca agccaagtag tgtctggtgt 180agcagctggt tatatccgat tcataagaag agtggtggat ggtttaggct atggttcgat 240gcagcagtgt tattgtctcc cttcaccagg tgcttcagcg atcgaatgat gttgtactat 300gaccctgatt tggatgatta ccaaaatgct cctggtgtcc aaacccgggt tcctcatttc 360ggttcgacca aatcacttct atacctcgac cctcgtctcc gagatgccac atcttacatg 420gaacatttgg tgaaagctct agagaaaaaa tgcgggtatg ttaacgacca aaccatccta 480ggagctccat atgatttcag gtacggcctg gctgcttcgg gccacccgtc ccgtgtagcc 540tcacagttcc tacaagacct caaacaattg gtggaaaaaa ctagcagcga gaacgaagga 600aagccagtga tactcctctc ccatagccta ggaggacttt tcgtcctcca tttcctcaac 660cgtaccaccc cttcatggcg ccgcaagtac atcaaacact ttgttgcact cgctgcgcca 720tggggtggga cgatctctca gatgaagaca tttgcttctg gcaacacact cggtgtccct 780ttagttaacc ctttgctggt cagacggcat cagaggacct ccgagagtaa ccaatggcta 840cttccatcta ccaaagtgtt tcacgacaga actaaaccgc ttgtcgtaac tccccaggtt 900aactacacag cttacgagat ggatcggttt tttgcagaca ttggattctc acaaggagtt 960gtgccttaca agacaagagt gttgccttta acagaggagc tgatgactcc gggagtgcca 1020gtcacttgca tatatgggag aggagttgat acaccggagg ttttgatgta tggaaaagga 1080ggattcgata agcaaccaga gattaagtat ggagatggag atgggacggt taatttggcg 1140agcttagcag ctttgaaagt cgatagcttg aacaccgtag agattgatgg agtttcgcat 1200acatctatac ttaaagacga gatcgcactt aaagagatta tgaagcagat ttcaattatt 1260aattatgaat tagccaatgt taatgccgtc aatgaatga1299<210>3<211>432<212>PRT<213>擬南芥<400>3Met Lys Lys Ile Ser Ser His Tyr Ser Val Val Ile Ala Ile Leu Val1 5 10 15Val Val Thr Met Thr Ser Met Cys Gln Ala Val Gly Ser Asn Val Tyr20 25 30Pro Leu Ile Leu Val Pro Gly Asn Gly Gly Asn Gln Leu Glu Val Arg35 40 45Leu Asp Arg Glu Tyr Lys Pro Ser Ser Val Trp Cys Ser Ser Trp Leu50 55 60Tyr Pro Ile His Lys Lys Ser Gly Gly Trp Phe Arg Leu Trp Phe Asp65 70 75 80Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro Phe Thr Arg Cys Phe Ser Asp Arg Met85 90 95Met Leu Tyr Tyr Asp Pro Asp Leu Asp Asp Tyr Gln Asn Ala Pro Gly100 105 110Val Gln Thr Arg Val Pro His Phe Gly Ser Thr Lys Ser Leu Leu Tyr115 120 125Leu Asp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Thr Ser Tyr Met Glu His Leu Val130 135 140Lys Ala Leu Glu Lys Lys Cys Gly Tyr Val Asn Asp Gln Thr Ile Leu145 150 155 160Gly Ala Pro Tyr Asp Phe Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Gly His Pro165 170 175Ser Arg Val Ala Ser Gln Phe Leu Gln Asp Leu Lys Gln Leu Val Glu180 185 190Lys Thr Ser Ser Glu Asn Glu Gly Lys Pro Val Ile Leu Leu Ser His195 200 205Ser Leu Gly Gly Leu Phe Val Leu His Phe Leu Asn Arg Thr Thr Pro210 215 220Ser Trp Arg Arg Lys Tyr Ile Lys His Phe Val Ala Leu Ala Ala Pro225 230 235 240Trp Gly Gly Thr Ile Ser Gln Met Lys Thr Phe Ala Ser Gly Asn Thr245 250 255Leu Gly Val Pro Leu Val Asn Pro Leu Leu Val Arg Arg His Gln Arg260 265 270Thr Ser Glu Ser Asn Gln Trp Leu Leu Pro Ser Thr Lys Val Phe His275 280 285Asp Arg Thr Lys Pro Leu Val Val Thr Pro Gln Val Asn Tyr Thr Ala290 295 300Tyr Glu Met Asp Arg Phe Phe Ala Asp Ile Gly Phe Ser Gln Gly Val305 310 315 320Val Pro Tyr Lys Thr Arg Val Leu Pro Leu Thr Glu Glu Leu Met Thr325330 335Pro Gly Val Pro Val Thr Cys Ile Tyr Gly Arg Gly Val Asp Thr Pro340 345 350Glu Val Leu Met Tyr Gly Lys Gly Gly Phe Asp Lys Gln Pro Glu Ile355 360 365Lys Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Thr Val Asn Leu Ala Ser Leu Ala Ala370 375 380Leu Lys Val Asp Ser Leu Asn Thr Val Glu Ile Asp Gly Val Ser His385 390 395 400Thr Ser Ile Leu Lys Asp Glu Ile Ala Leu Lys Glu Ile Met Lys Gln405 410 415Ile Ser Ile Ile Asn Tyr Glu Leu Ala Asn Val Asn Ala Val Asn Glu420 425 430<210>4<211>1641<212>DNA<213>擬南芥<400>4atgggagcga attcgaaatc agtaacggct tccttcaccg tcatcgccgt ttttttcttg 60atttgcggtg gccgaactgc ggtggaggat gagaccgagt ttcacggcga ctactcgaag 120ctatcgggta taatcattcc gggatttgcg tcgacgcagc tacgagcgtg gtcgatcctt 180gactgtccat acactccgtt ggacttcaat ccgctcgacc tcgtatggct agacaccact 240aagcttcttt ctgctgtcaa ctgctggttt aagtgtatgg tgctagatcc ttataatcaa 300acagaccatc ccgagtgtaa gtcacggcct gacagtggtc tttcagccat cacagaattg 360gatccaggtt acataacagg tcctctttct actgtctgga aagagtggct taagtggtgt 420gttgagtttg gtatagaagc aaatgcaatt gtcgctgttc catacgattg gagattgtca 480ccaaccaaat tggaagagcg tgacctttac tttcacaagc tcaagttgac ctttgaaact 540gctttaaaac tccgtggcgg cccttctata gtatttgccc attcaatggg taataatgtc 600ttcagatact ttctggaatg gctgaggcta gaaattgcac caaaacatta tttgaagtgg 660cttgatcagc atatccatgc ttatttcgct gttggagctc ctcttcttgg ttctgttgag 720gcaatcaaat ctactctctc tggtgtaacg tttggccttc ctgtttctga gggaactgct 780cggttgttgt ccaattcttt tgcgtcgtca ttgtggctta tgccattttc aaagaattgc 840aagggtgata acacatcctg gacgcatttt tctgggggtg ctgcaaagaa agataagcgc 900gtataccact gtgatgaaga ggaatatcaa tcaaaatatt ctggctggcc gacaaatatt 960attaacattg aaattccttc cactagcgtt acagaaacag ctctagtcaa catgaccagc 1020atggaatgtg gccttcccac ccttttgtct ttcacagccc gtgaactagc agatgggact 1080cttttcaaag caatagaaga ctatgaccca gatagcaaga ggatgttaca ccagttaaag 1140aagttgtatc atgatgaccc tgtttttaat cctctgactc cttgggagag accacctata 1200aaaaatgtat tttgcatata tggtgctcat ctaaagacag aggttggtta ttactttgcc 1260ccaagtggca aaccttatcc tgataattgg atcatcacgg atatcattta cgaaactgaa 1320ggttccctcg tgtcaaggtc tggaactgtg gttgatggga acgctggacc tataactggg 1380gatgagacgg taccctatca ttcactctct tggtgcaaga attggctcgg acctaaagtt 1440aacataacaa tggctcccca gccagaacac gatggaagcg acgtacatgt ggaactaaat 1500gttgatcatg agcatgggtc agacatcata gctaacatga caaaagcacc aagggttaag 1560tacataacct tttatgaaga ctctgagagc attccgggga agagaaccgc agtctgggag 1620cttgataaaa gtgggtatta a 1641<210>5<211>546<212>PRT<213>擬南芥<400>5Met Gly Ala Asn Ser Lys Ser Val Thr Ala Ser Phe Thr Val Ile Ala1 5 10 15Val Phe Phe Leu Ile Cys Gly Gly Arg Thr Ala Val Glu Asp Glu Thr20 25 30Glu Phe His Gly Asp Tyr Ser Lys Leu Ser Gly Ile Ile Ile Pro Gly35 40 45Phe Ala Ser Thr Gln Leu Arg Ala Trp Ser Ile Leu Asp Cys Pro Tyr50 55 60Thr Pro Leu Asp Phe Asn Pro Leu Asp Leu Val Trp Leu Asp Thr Thr65 70 75 80Lys Leu Leu Ser Ala Val Asn Cys Trp Phe Lys Cys Met Val Leu Asp85 90 95Pro Tyr Asn Gln Thr Asp His Pro Glu Cys Lys Ser Arg Pro Asp Ser100 105 110Gly Leu Ser Ala Ile Thr Glu Leu Asp Pro Gly Tyr Ile Thr Gly Pro115 120 125Leu Ser Thr Val Trp Lys Glu Trp Leu Lys Trp Cys Val Glu Phe Gly130 135 140Ile Glu Ala Asn Ala Ile Val Ala Val Pro Tyr Asp Trp Arg Leu Ser145 150 155 160Pro Thr Lys Leu Glu Glu Arg Asp Leu Tyr Phe His Lys Leu Lys Leu165 170 175Thr Phe Glu Thr Ala Leu Lys Leu Arg Gly Gly Pro Ser Ile Val Phe180 185 190Ala His Ser Met Gly Asn Asn Val Phe Arg Tyr Phe Leu Glu Trp Leu195 200 205Arg Leu Glu Ile Ala Pro Lys His Tyr Leu Lys Trp Leu Asp Gln His210 215 220Ile His Ala Tyr Phe Ala Val Gly Ala Pro Leu Leu Gly Ser Val Glu225 230 235 240Ala Ile Lys Ser Thr Leu Ser Gly Val Thr Phe Gly Leu Pro Val Ser245 250 255Glu Gly Thr Ala Arg Leu Leu Ser Asn Ser Phe Ala Ser Ser Leu Trp260 265 270Leu Met Pro Phe Ser Lys Asn Cys Lys Gly Asp Asn Thr Ser Trp Thr275 280 285His Phe Ser Gly Gly Ala Ala Lys Lys Asp Lys Arg Val Tyr His Cys290 295 300Asp Glu Glu Glu Tyr Gln Ser Lys Tyr Ser Gly Trp Pro Thr Asn Ile305 310 315 320Ile Asn Ile Glu Ile Pro Ser Thr Ser Val Thr Glu Thr Ala Leu Val325 330 335Asn Met Thr Ser Met Glu Cys Gly Leu Pro Thr Leu Leu Ser Phe Thr340 345 350Ala Arg Glu Leu Ala Asp Gly Thr Leu Phe Lys Ala Ile Glu Asp Tyr355 360 365Asp Pro Asp Ser Lys Arg Met Leu His Gln Leu Lys Lys Leu Tyr His370 375 380Asp Asp Pro Val Phe Asn Pro Leu Thr Pro Trp Glu Arg Pro Pro Ile385 390 395 400Lys Asn Val Phe Cys Ile Tyr Gly Ala His Leu Lys Thr Glu Val Gly405 410 415Tyr Tyr Phe Ala Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Pro Asp Asn Trp Ile Ile420 425 430Thr Asp Ile Ile Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly435 440 445Thr Val Val Asp Gly Asn Ala Gly Pro Ile Thr Gly Asp Glu Thr Val450 455 460Pro Tyr His Ser Leu Ser Trp Cys Lys Asn Trp Leu Gly Pro Lys Val465 470 475 480Asn Ile Thr Met Ala Pro Gln Pro Glu His Asp Gly Ser Asp Val His485 490 495Val Glu Leu Asn Val Asp His Glu His Gly Ser Asp Ile Ile Ala Asn500 505 510Met Thr Lys Ala Pro Arg Val Lys Tyr Ile Thr Phe Tyr Glu Asp Ser515 520 525Glu Ser Ile Pro Gly Lys Arg Thr Ala Val Trp Glu Leu Asp Lys Ser530 535 540Gly Tyr545<210>6<211>1608<212>DNA<213>擬南芥<400>6atgtctctat tactggaaga gatcattaga tcagtagagg ctttgctgaa gctcagaaat 60cggaatcaag aaccctatgt tgacccgaat ctaaacccgg ttcttctagt tccaggaatc 120gctggatcaa ttctaaacgc cgttgatcat gagaacggga acgaagaacg tgtttgggtt 180aggatctttg gtgctgatca tgagtttcga acaaagatgt ggtctcgatt tgatccttca 240actggtaaaa cgatatctct tgatccaaaa acgagtattg ttgttcctca agacagagct 300gggctacatg caattgatgt cttagaccct gatatgattg ttggccgtga gtctgtgtac 360tatttccatg agatgattgt tgagatgatc ggatggggat ttgaagaagg gaaaaccctt 420tttggttttg gttatgattt ccgccaaagc aacagactgc aggaaacgtt ggaccagttt 480gctaaaaagt tggaaactgt ttataaagcc tcaggagaga agaagattaa tgttattagt 540cattctatgg gaggactatt ggtgaaatgt ttcatgggtc tgcatagtga tatattcgag 600aagtatgtac agaattggat tgctattgct gctccatttc gaggtgctcc tggatatatc 660acatcgactt tattgaatgg aatgtcgttt gtcaatggtt gggaacagaa ctttttcgtc 720tctaagtgga gcatgcatca gctgcttatt gagtgtccat ccatatatga gctgatgtgt 780tgtccgtatt ttaaatggga gctccctccc gtcttagagc tgtggagaga gaaagagagc 840aatgatggag ttggaacctc tgatgttgtt cttgagtctt accgtagcct ggagagcctt 900gaagttttta cgaaatctct ttcgaataat acagctgatt attgtggaga gtcgatcgat 960cttcctttta actggaagat catggagtgg gctcacaaaa ccaagcaagt attagcctct 1020gccaagctgc ctccgaaagt taaattctat aacatatatg ggaccaatct agaaacccct 1080catagtgttt gctatgggaa tgagaagatg cccgttaaag atctaacgaa tctaagatac 1140ttccagccga catatatatg cgtggatggt gatggcacag tcccgatgga atctgccatg 1200gcggatgggc ttgaagcagt agcaagagtt ggagtccctg gtgagcaccg aggaatcctc 1260aacgatcacc gtgtcttccg aatgctcaaa aaatggctaa atgtaggcga accagacccg 1320ttctacaacc cagtaaacga ttatgtcatc cttcccacca catatgaatt tgagaaattc 1380catgagaatg gactcgaggt tgcttccgtg aaagaatcgt gggacatcat atcagatgac 1440aacaatatcg gcacaaccgg gtcaaccgtg aactccatat cagtctctca acctggagat 1500gatcaaaacc ctcaagctga agctcgtgca accttaaccg tccaaccaca aagcgatggt 1560agacaacatg tagagctcaa tgctgtaagt gtctctgttg atgcataa 1608<210>7<211>535<212>PRT<213>擬南芥<400>7Met Ser Leu Leu Leu Glu Glu Ile Ile Arg Ser Val Glu Ala Leu Leu1 5 10 15Lys Leu Arg Asn Arg Asn Gln Glu Pro Tyr Val Asp Pro Asn Leu Asn20 25 30Pro Val Leu Leu Val Pro Gly Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asn Ala Val35 40 45Asp His Glu Asn Gly Asn Glu Glu Arg Val Trp Val Arg Ile Phe Gly50 55 60Ala Asp His Glu Phe Arg Thr Lys Met Trp Ser Arg Phe Asp Pro Ser65 70 75 80Thr Gly Lys Thr Ile Ser Leu Asp Pro Lys Thr Ser Ile Val Val Pro85 90 95Gln Asp Arg Ala Gly Leu His Ala Ile Asp Val Leu Asp Pro Asp Met100 105 110Ile Val Gly Arg Glu Ser Val Tyr Tyr Phe His Glu Met Ile Val Glu115 120 125Met Ile Gly Trp Gly Phe Glu Glu Gly Lys Thr Leu Phe Gly Phe Gly130 135 140Tyr Asp Phe Arg Gln Ser Asn Arg Leu Gln Glu Thr Leu Asp Gln Phe145 150 155 160Ala Lys Lys Leu Glu Thr Val Tyr Lys Ala Ser Gly Glu Lys Lys Ile165 170 175Asn Val Ile Ser His Ser Met Gly Gly Leu Leu Val Lys Cys Phe Met180 185 190Gly Leu His Ser Asp Ile Phe Glu Lys Tyr Val Gln Asn Trp Ile Ala195 200 205Ile Ala Ala Pro Phe Arg Gly Ala Pro Gly Tyr Ile Thr Ser Thr Leu210 215 220Leu Asn Gly Met Ser Phe Val Asn Gly Trp Glu Gln Asn Phe Phe Val225 230 235 240Ser Lys Trp Ser Met His Gln Leu Leu Ile Glu Cys Pro Ser Ile Tyr245 250 255Glu Leu Met Cys Cys Pro Tyr Phe Lys Trp Glu Leu Pro Pro Val Leu260 265 270Glu Leu Trp Arg Glu Lys Glu Ser Asn Asp Gly Val Gly Thr Ser Asp275 280 285Val Val Leu Glu Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Ser Leu Glu Val Phe Thr290 295 300Lys Ser Leu Ser Asn Asn Thr Ala Asp Tyr Cys Gly Glu Ser Ile Asp305 310 315 320Leu Pro Phe Asn Trp Lys Ile Met Glu Trp Ala His Lys Thr Lys Gln325 330 335Val Leu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Pro Lys Val Lys Phe Tyr Asn Ile340 345 350Tyr Gly Thr Asn Leu Glu Thr Pro His Ser Val Cys Tyr Gly Asn Glu355 360 365Lys Met Pro Val Lys Asp Leu Thr Asn Leu Arg Tyr Phe Gln Pro Thr370 375 380Tyr Ile Cys Val Asp Gly Asp Gly Thr Val Pro Met Glu Ser Ala Met385 390 395 400Ala Asp Gly Leu Glu Ala Val Ala Arg Val Gly Val Pro Gly Glu His405 410 415Arg Gly Ile Leu Asn Asp His Arg Val Phe Arg Met Leu Lys Lys Trp420 425 430Leu Asn Val Gly Glu Pro Asp Pro Phe Tyr Asn Pro Val Asn Asp Tyr435 440 445Val Ile Leu Pro Thr Thr Tyr Glu Phe Glu Lys Phe His Glu Asn Gly450 455 460Leu Glu Val Ala Ser Val Lys Glu Ser Trp Asp Ile Ile Ser Asp Asp465 470 475 480Asn Asn Ile Gly Thr Thr Gly Ser Thr Val Asn Ser Ile Ser Val Ser485 490 495Gln Pro Gly Asp Asp Gln Asn Pro Gln Ala Glu Ala Arg Ala Thr Leu500 505 510Thr Val Gln Pro Gln Ser Asp Gly Arg Gln His Val Glu Leu Asn Ala515 520 525Val Ser Val Ser Val Asp Ala530 535<210>8<211>1344<212>DNA<213>擬南芥<400>8atgggctgga ttccgtgtcc gtgctgggga accaacgacg atgaaaacgc cggcgaggtg 60gcggatcgtg atccggtgct tctagtatct ggaattggag gctctattct gcattctaag 120aagaagaatt caaagtctga aattcgggtt tgggtccgaa tatttctagc taaccttgcc 180tttaagcaga gcctctggtc tctctataat cccaaaactg gttatacaga gccgttggat 240gataatattg aagtattggt ccctgatgat gaccatggac tctatgcaat tgacattcta 300gatccctctt ggtttgtaaa gctttgtcac ttgacggagg tttatcactt tcacgatatg 360atagaaatgc tggttggatg cggttataag aaggggacta cattattcgg ttatggttac 420gatttccgtc aaagcaatag gatcgatcta cttatactag gtctgaagaa gaagctggaa 480actgcatata aacgttcagg ggggagaaaa gtcactatca tctcccattc aatgggagga 540cttatggttt catgtttcat gtatctccat ccggaggcat tttccaagta tgtaaataaa 600tggattacaa ttgcaacacc tttccaagga gcaccagggt gcatcaatga ttcaatcttg 660actggagtgc aatttgtgga agggttagaa agtttctttt ttgtgtcacg ttggacgatg 720caccaactgt tggtcgaatg cccatctata tatgagatga tggcaaatcc agactttaag 780tggaaaaagc aaccagagat tcgagtttgg cgtaagaaat ctgaaaacga cgttgatact 840tctgtagaac tggaatcatt tggcttaatc gagagtattg atctattcaa cgatgcatta 900aaaaataacg agctaagcta tggtgggaat aaaatagctt tgccctttaa ctttgctatc 960ctcgactggg ctgctaagac aagagaaatt ctcaacaaag cgcaacttcc tgatggagtg 1020tccttctata acatatatgg agtgtcactt aatacaccct ttgatgtttg 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120atgagttatg tgttgctgtt ccctgccaca tactcaagtt ctgggctttt tttaggaatc 180atgcttcaga ttcccctcat catattgaca tcatacctca aaaataaatt cagtgacaca 240atggttggca ata253<210>48<211>254<212>DNA<213>玉蜀黍<400>48tgaagtatgg cttattaata agatctggct tttggtttaa tgctacatca ttgcgagact 60ggccactgct aatgtgttgc cttagtctac ccatatttcc ccttggtgca tttgcagtcg 120aaaagttggc attcaacaat ctcattagtg atcctgctac tacctgtttt cacatccttt 180ttacaacatt tgaaattgta tatccagtgc tcgtgattct taagtgtgat tctgcagttt 240tatcaggctt tgtg 254<210>49<211>262<212>DNA<213>玉蜀黍<400>49gaagtatggc ttattaataa gatctggctt ttggtttaat gctacatcat tgcgagactg 60gccactgcta atgtgttgcc ttagtctacc catatttccc cttggtgcat ttgcagtcga 120aaagttggca ttcaacaatc tcattagtga tcctgctact acctgttttc acatcctttt 180tacaacattt gaaattgtat atccagtgct cgtgattctt aagtgtgatt ctgcagtttt 240acaggctttg tgttgatgtt ta 262<210>50<211>325<212>DNA<213>玉蜀黍<220><221>不確定<222>(1)..(325)<223>n＝未知<400>50taatcnaacc tcgntncngg ttcagctgta tnccatgaga tatgtaatgc ggtgccgtgc 60cacatantca natctnggca tnncngggat catngttcag ataccgntgg nattcttgac 120aagatatctc catgctacgt tcaagcatgt aatggtgggc aacatgatan tttggntctn 180cagtatagtc ggacagccga tgtnnnnnna tctatactac catgacgtca tgaacaggca 240ggcccaggca agtagatagt ncggcagaga catgtacttc aacatcganc atcagnagca 300nacngagcga gcggcangaa ncagc 325<210>51<211>519<212>DNA<213>高山被孢霉(Mortierrella alpina)<220><221>不確定<222>(1)..(519)<223>n＝未知<400>51gagnnnngna acgtttagcc tnccgtagcc gccaaaatcc aagggncnac cnaccctncg 60ttanactnaa ttngaaaatn cnnncccaac ttnaggnact tnnagncccc ccnacttgac 120aacggagcac tatatttacc ccgtggtngt tcaacccagc catctcaccc ttgcgagcat 180tggtgctgct cttgataccc ttcatgctta actatctcat gatcttttac atcattttcg 240agtgcatctg caacgccttt gcggaactaa gttgctttgc ggatcgcaac ttttacgagg 300attggtggaa ctgcgtcagc tttgatgagt gggcacgcaa atggaacaag cctgtgcaac 360acttcttgct ccgccacgtg tacgactcga gcatccgagt ccttccactt gtccgaaatc 420caatgccgcn aattgcaaac gttccttccc ggtcgtcaat gcgttcaacg aacctgggtg 480aagaatgggt ggtgacaacg ttaaagtgcg cccggtatc519<210>52<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>52ggatccgcgg ccgcacaatg aaaaaaatat cttcacatta ttcgg 45<210>53<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>53ggatcccctg caggtcattc attgacggca ttaacattgg 40<210>54<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>54ggatccgcgg ccgcacaatg ggagcgaatt cgaaatcagt aacg 44<210>55<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>55ggatcccctg caggttaata cccactttta tcaagctccc 40<210>56<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>56ggatccgcgg ccgcacaatg tctctattac tggaagagat c 41<210>57<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>57ggatcccctg caggttatgc atcaacagag acacttacag c 41<210>58<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>58ggatccgcgg ccgcacaatg ggctggattc cgtgtccgtg c 41<210>59<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>59ggatcccctg caggttaacc agaatcaact actttgtg 38<210>60<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>60tcgacctgca ggaagcttag aaatggcgat 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36<210>70<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述連接的寡核苷酸<400>70ggatccgcgg ccgcaagctt cctgcagg28<210>71<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述連接的寡核苷酸<400>71gatcacctgc aggaagcttg cggccgcgga tccaatgca39<210>72<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述連接的寡核苷酸<400>72ttggatccgc ggccgcaagc ttcctgcagg t31<210>73<211>2013<212>DNA<213>擬南芥<400>73atgcccctta ttcatcggaa aaagccgacg gagaaaccat cgacgccgcc atctgaagag 60gtggtgcacg atgaggattc gcaaaagaaa ccacacgaat cttccaaatc ccaccataag 120aaatcgaacg gaggagggaa gtggtcgtgc atcgattctt gttgttggtt cattgggtgt 180gtgtgtgtaa cctggtggtt tcttctcttc ctttacaacg caatgcctgc gagcttccct 240cagtatgtaa cggagcgaat cacgggtcct ttgcctgacc cgcccggtgt taagctcaaa 300aaagaaggtc ttaaggcgaa acatcctgtt gtcttcattc ctgggattgt caccggtggg 360ctcgagcttt gggaaggcaa acaatgcgct gatggtttat ttagaaaacg tttgtggggt 420ggaacttttg gtgaagtcta caaaaggcct ctatgttggg tggaacacat gtcacttgac 480aatgaaactg ggttggatcc agctggtatt agagttcgag ctgtatcagg actcgtggct 540gctgactact ttgctcctgg ctactttgtc tgggcagtgc tgattgctaa ccttgcacat 600attggatatg aagagaaaaa tatgtacatg gctgcatatg actggcggct ttcgtttcag 660aacacagagg tacgtgatca gactcttagc cgtatgaaaa gtaatataga gttgatggtt 720tctaccaacg gtggaaaaaa agcagttata gttccgcatt ccatgggggt cttgtatttt 780ctacatttta tgaagtgggt tgaggcacca gctcctctgg gtggcggggg tgggccagat 840tggtgtgcaa agtatattaa ggcggtgatg aacattggtg gaccatttct tggtgttcca 900aaagctgttg cagggctttt ctctgctgaa gcaaaggatg ttgcagttgc cagagcgatt 960gccccaggat tcttagacac cgatatattt agacttcaga ccttgcagca tgtaatgaga 1020atgacacgca catgggactc aacaatgtct atgttaccga agggaggtga cacgatatgg 1080ggcgggcttg attggtcacc ggagaaaggc cacacctgtt gtgggaaaaa gcaaaagaac 1140aacgaaactt gtggtgaagc aggtgaaaac ggagtttcca agaaaagtcc tgttaactat 1200ggaaggatga tatcttttgg gaaagaagta gcagaggctg cgccatctga gattaataat 1260attgattttc gaggtgctgt caaaggtcag agtatcccaa atcacacctg tcgtgacgtg 1320tggacagagt accatgacat gggaattgct gggatcaaag ctatcgctga gtataaggtc 1380tacactgctg gtgaagctat agatctacta cattatgttg ctcctaagat gatggcgcgt 1440ggtgccgctc atttctctta tggaattgct gatgatttgg atgacaccaa gtatcaagat 1500cccaaatact ggtcaaatcc gttagagaca aaattaccga atgctcctga gatggaaatc 1560tactcattat acggagtggg gataccaacg gaacgagcat acgtatacaa gcttaaccag 1620tctcccgaca gttgcatccc ctttcagata ttcacttctg ctcacgagga ggacgaagat 1680agctgtctga aagcaggagt ttacaatgtg gatggggatg aaacagtacc cgtcctaagt 1740gccgggtaca tgtgtgcaaa agcgtggcgt ggcaagacaa gattcaaccc ttccggaatc 1800aagacttata taagagaata caatcactct ccgccggcta acctgttgga agggcgcggg 1860acgcagagtg gtgcccatgt tgatatcatg ggaaactttg ctttgatcga agatatcatg 1920agggttgccg ccggaggtaa cgggtctgat ataggacatg accaggtcca ctctggcata 1980tttgaatggt cggagcgtat tgacctgaag ctg 2013<210>74<211>671<212>PRT<213>擬南芥<400>74Met Pro Leu Ile His Arg Lys Lys Pro Thr Glu Lys Pro Ser Thr Pro1 5 10 15Pro Ser Glu Glu Val Val His Asp Glu Asp Ser Gln Lys Lys Pro His20 25 30Glu Ser Ser Lys Ser His His Lys Lys Ser Asn Gly Gly Gly Lys Trp35 40 45Ser Cys Ile Asp Ser Cys Cys Trp Phe Ile Gly Cys Val Cys Val Thr50 55 60Trp Trp Phe Leu Leu Phe Leu Tyr Asn Ala Met Pro Ala Ser Phe Pro65 70 75 80Gln Tyr Val Thr Glu Arg Ile Thr Gly Pro Leu Pro Asp Pro Pro Gly85 90 95Val Lys Leu Lys Lys Glu Gly Leu Lys Ala Lys His Pro Val Val Phe100 105 110Ile Pro Gly Ile Val Thr Gly Gly Leu Glu Leu Trp Glu Gly Lys Gln115 120 125Cys Ala Asp Gly Leu Phe Arg Lys Arg Leu Trp Gly Gly Thr Phe Gly130 135 140Glu Val Tyr Lys Arg Pro Leu Cys Trp Val Glu His Met Ser Leu Asp145 150 155 160Asn Glu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Ile Arg Val Arg Ala Val Ser165 170 175Gly Leu Val Ala Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Tyr Phe Val Trp Ala180 185 190Val Leu Ile Ala Asn Leu Ala His Ile Gly Tyr Glu Glu Lys Asn Met195 200 205Tyr Met Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu Ser Phe Gln Asn Thr Glu Val210 215 220Arg Asp Gln Thr Leu Ser Arg Met Lys Ser Asn Ile Glu Leu Met Val225 230 235 240Ser Thr Asn Gly Gly Lys Lys Ala Val Ile Val Pro His Ser Met Gly245 250 255Val Leu Tyr Phe Leu His Phe Met Lys Trp Val Glu Ala Pro Ala Pro260 265 270Leu Gly Gly Gly Gly Gly Pro Asp Trp Cys Ala Lys Tyr Ile Lys Ala275 280 285Val Met Asn Ile Gly Gly Pro Phe Leu Gly Val Pro Lys Ala Val Ala290 295 300Gly Leu Phe Ser Ala Glu Ala Lys Asp Val Ala Val Ala Arg Ala Ile305 310 315 320Ala Pro Gly Phe Leu Asp Thr Asp Ile Phe Arg Leu Gln Thr Leu Gln325 330 335His Val Met Arg Met Thr Arg Thr Trp Asp Ser Thr Met Ser Met Leu340 345 350Pro Lys Gly Gly Asp Thr Ile Trp Gly Gly Leu Asp Trp Ser Pro Glu355 360 365Lys Gly His Thr Cys Cys Gly Lys Lys Gln Lys Asn Asn Glu Thr Cys370 375 380Gly Glu Ala Gly Glu Asn Gly Val Ser Lys Lys Ser Pro Val Asn Tyr385 390 395 400Gly Arg Met Ile Ser Phe Gly Lys Glu Val Ala Glu Ala Ala Pro Ser405 410 415Glu Ile Asn Asn Ile Asp Phe Arg Gly Ala Val Lys Gly Gln Ser Ile420 425 430Pro Asn His Thr Cys Arg Asp Val Trp Thr Glu Tyr His Asp Met Gly435 440 445Ile Ala Gly Ile Lys Ala Ile Ala Glu Tyr Lys Val Tyr Thr Ala Gly450 455 460Glu Ala Ile Asp Leu Leu His Tyr Val Ala Pro Lys Met Met Ala Arg465 470 475 480Gly Ala Ala His Phe Ser Tyr Gly Ile Ala Asp Asp Leu Asp Asp Thr485 490 495Lys Tyr Gln Asp Pro Lys Tyr Trp Ser Asn Pro Leu Glu Thr Lys Leu500 505 510Pro Asn Ala Pro Glu Met Glu Ile Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Gly Ile515 520 525Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Leu Asn Gln Ser Pro Asp Ser530 535 540Cys Ile Pro Phe Gln Ile Phe Thr Ser Ala His Glu Glu Asp Glu Asp545 550 555 560Ser Cys Leu Lys Ala Gly Val Tyr Asn Val Asp Gly Asp Glu Thr Val565 570 575Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Ala Trp Arg Gly Lys580 585 590Thr Arg Phe Asn Pro Ser Gly Ile Lys Thr Tyr Ile Arg Glu Tyr Asn595 600 605His Ser Pro Pro Ala Asn Leu Leu Glu Gly Arg Gly Thr Gln Ser Gly610 615 620Ala His Val Asp Ile Met Gly Asn Phe Ala Leu Ile Glu Asp Ile Met625 630 635 640Arg Val Ala Ala Gly Gly Asn Gly Ser Asp Ile Gly His Asp Gln Val645 650 655His Ser Gly Ile Phe Glu Trp Ser Glu Arg Ile Asp Leu Lys Leu660 665 670<210>75<211>1986<212>DNA<213>釀酒酵母<400>75atgggcacac tgtttcgaag aaatgtccag aaccaaaaga gtgattctga tgaaaacaat 60aaagggggtt ctgttcataa caagcgagag agcagaaacc acattcatca tcaacaggga 120ttaggccata agagaagaag gggtattagt ggcagtgcaa aaagaaatga gcgtggcaaa 180gatttcgaca ggaaaagaga cgggaacggt agaaaacgtt ggagagattc cagaagactg 240attttcattc ttggtgcatt cttaggtgta cttttgccgt ttagctttgg cgcttatcat 300gttcataata gcgatagcga cttgtttgac aactttgtaa attttgattc acttaaagtg 360tatttggatg attggaaaga tgttctccca caaggtataa gttcgtttat tgatgatatt 420caggctggta actactccac atcttcttta gatgatctca gtgaaaattt tgccgttggt 480aaacaactct tacgtgatta taatatcgag gccaaacatc ctgttgtaat ggttcctggt 540gtcatttcta cgggaattga aagctgggga gttattggag acgatgagtg cgatagttct 600gcgcattttc gtaaacggct gtggggaagt ttttacatgc tgagaacaat ggttatggat 660aaagtttgtt ggttgaaaca tgtaatgtta gatcctgaaa caggtctgga cccaccgaac 720tttacgctac gtgcagcaca gggcttcgaa tcaactgatt atttcatcgc agggtattgg 780atttggaaca aagttttcca aaatctggga gtaattggct atgaacccaa taaaatgacg 840agtgctgcgt atgattggag gcttgcatat ttagatctag aaagacgcga taggtacttt 900acgaagctaa aggaacaaat cgaactgttt catcaattga gtggtgaaaa agtttgttta 960attggacatt ctatgggttc tcagattatc ttttacttta tgaaatgggt cgaggctgaa 1020ggccctcttt acggtaatgg tggtcgtggc tgggttaacg aacacataga ttcattcatt 1080aatgcagcag ggacgcttct gggcgctcca aaggcagttc cagctctaat tagtggtgaa 1140atgaaagata ccattcaatt aaatacgtta gccatgtatg gtttggaaaa gttcttctca 1200agaattgaga gagtaaaaat gttacaaacg tggggtggta taccatcaat gctaccaaag 1260ggagaagagg tcatttgggg ggatatgaag tcatcttcag aggatgcatt gaataacaac 1320actgacacat acggcaattt cattcgattt gaaaggaata cgagcgatgc tttcaacaaa 1380aatttgacaa tgaaagacgc cattaacatg acattatcga tatcacctga atggctccaa 1440agaagagtac atgagcagta ctcgttcggc tattccaaga atgaagaaga gttaagaaaa 1500aatgagctac accacaagca ctggtcgaat ccaatggaag taccacttcc agaagctccc 1560cacatgaaaa tctattgtat atacggggtg aacaacccaa ctgaaagggc atatgtatat 1620aaggaagagg atgactcctc tgctctgaat ttgaccatcg actacgaaag caagcaacct 1680gtattcctca ccgaggggga cggaaccgtt ccgctcgtgg cgcattcaat gtgtcacaaa 1740tgggcccagg gtgcttcacc gtacaaccct gccggaatta acgttactat tgtggaaatg 1800aaacaccagc cagatcgatt tgatatacgt ggtggagcaa aaagcgccga acacgtagac 1860atcctcggca gcgcggagtt gaacgattac atcttgaaaa ttgcaagcgg taatggcgat 1920ctcgtcgagc cacgccaatt gtctaatttg agccagtggg tttctcagat gcccttccca 1980atgtaa1986<210>76<211>661<212>PRT<213>釀酒酵母<400>76Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gln Asn Gln Lys Ser Asp Ser1 5 10 15Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg20 25 30Asn His Ile His His Gln Gln Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly35 40 45Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg50 55 60Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu65 70 75 80Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe85 90 95Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe100 105 110Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val115 120 125Leu Pro Gln Gly Ile Ser Ser Phe Ile Asp Asp Ile Gln Ala Gly Asn130 135 140Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly145 150 155 160Lys Gln Leu Leu Arg Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val165 170 175Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile180 185 190Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp195 200 205Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp210 215 220Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn225 230 235 240Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gln Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile245 250 255Ala Gly Tyr Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gln Asn Leu Gly Val Ile260 265 270Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu275 280 285Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys290 295 300Glu Gln Ile Glu Leu Phe His Gln Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu305 310 315 320Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gln Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp325 330 335Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val340 345 350Asn Glu His Ile Asp Ser Phe Ile Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly355 360 365Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu Ile Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr370 375 380Ile Gln Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser385 390 395 400Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu Gln Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser405 410 415Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser420 425 430Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile435 440 445Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met450 455 460Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr Leu Ser Ile Ser Pro Glu Trp Leu Gln465 470 475 480Arg Arg Val His Glu Gln Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu485 490 495Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met500 505 510Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr515 520 525Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp530 535 540Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gln Pro545 550 555 560Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser565 570 575Met Cys His Lys Trp Ala Gln Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly580 585 590Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gln Pro Asp Arg Phe Asp595600 605Ile Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp Ile Leu Gly Ser610 615 620Ala Glu Leu Asn Asp Tyr Ile Leu Lys Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp625 630 635 640Leu Val Glu Pro Arg Gln Leu Ser Asn Leu Ser Gln Trp Val Ser Gln645 650 655Met Pro Phe Pro Met660<210>77<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>77ggatccgcgg ccgcacaatg ccccttattc atcgg35<210>78<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>78ggatcccctg caggtcacag cttcaggtca atacg35<210>79<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>79ggatccgcgg ccgcacaatg ggcacactct ttcgaag 37<210>80<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸引物<400>80ggatcccctg caggttacat tgggcacact gtttcgaag39
權(quán)利要求
1.包含編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或其片段的多核苷酸的分離核酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽選自擬南芥、大豆、和玉米。
3.包含編碼植物酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸的分離核酸序列。
4.權(quán)利要求3的分離核酸序列，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO42或其簡并變體。
5.權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、43、44、45、46、47、48、49、50、51、73、和75或其簡并變體。
6.基本上由SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、73、或75組成的分離核酸序列。
7.由SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、73、或75組成的分離核酸序列。
8.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO3中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO2；c)與SEQ ID NO2具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO2具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO2具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO2具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
9.基本上由多核苷酸通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO3中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO2；c)與SEQ ID NO2具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO2具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO2具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO2具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO2發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
10.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO5或SEQ ID NO5中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO4；c)與SEQ ID NO4具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO4具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO4具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO4具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
11.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO5或SEQ ID NO5中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO4；c)與SEQ ID NO4具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO4具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO4具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO4具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO4發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
12.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO7或SEQ ID NO7中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO6；c)與SEQ ID NO6具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO6具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO6具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO6具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
13.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO7或SEQ ID NO7中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO6；c)與SEQ ID NO6具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO6具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO6具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO6具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO6發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
14.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO9或SEQ ID NO9中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO8；c)與SEQ ID NO8具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO8具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO8具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO8具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
15.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO9或SEQ ID NO9中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO8；c)與SEQ ID NO8具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO8具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO8具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO8具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO8發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
16.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO74或SEQ ID NO74中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO73；c)與SEQ ID NO73具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO73具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO73具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO73具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
17.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO74或SEQ ID NO74中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO73；c)與SEQ ID NO73具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO73具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO73具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO73具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO73發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
18.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)編碼SEQ ID NO76或SEQ ID NO76中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO75；c)與SEQ ID NO75具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO75具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO75具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO75具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
19.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)編碼SEQ ID NO76或SEQ ID NO76中含至少一個保守氨基酸替代的多肽的分離多核苷酸；b)SEQ ID NO75；c)與SEQ ID NO75具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO75具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO75具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；f)與SEQ ID NO75具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；g)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；h)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、或(g)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和i)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO75發(fā)生雜交且編碼植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
20.包含選自下組的多核苷酸的分離核酸序列a)SEQ ID NO42或其簡并變體；b)與SEQ ID NO42具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；c)與SEQ ID NO42具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO42具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO42具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；f)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(f)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和h)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交且編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
21.基本上由通式5’X-(R1)n-(R2)n-(R3)n-Y 3’的多核苷酸組成的分離核酸序列，其中X是氫，Y是氫或金屬，R1和R3是任意核酸，n是0-3000之間的整數(shù)，R2選自a)SEQ ID NO42或其簡并變體；b)與SEQ ID NO42具有至少70％序列同一性的分離多核苷酸；c)與SEQ ID NO42具有至少80％序列同一性的分離多核苷酸；d)與SEQ ID NO42具有至少90％序列同一性的分離多核苷酸；e)與SEQ ID NO42具有至少95％序列同一性的分離多核苷酸；f)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交的至少10個核苷酸的分離多核苷酸；g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(f)的多核苷酸互補(bǔ)的分離多核苷酸；和h)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO42發(fā)生雜交且編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的分離多核苷酸。
22.包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或其片段的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組核酸構(gòu)建物。
23.權(quán)利要求22的重組核酸構(gòu)建物，其中所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
24.包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組核酸構(gòu)建物。
25.權(quán)利要求24的重組核酸構(gòu)建物，其中所述?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
26.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含異源調(diào)控序列。
27.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含異源調(diào)控序列。
28.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列在植物細(xì)胞中有功能。
29.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列在植物細(xì)胞中有功能。
30.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中還包含終止序列。
31.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中還包含終止序列。
32.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、43、44、45、46、47、48、49、50、51、73、和75。
33.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述多核苷酸選自SEQ ID NO33和42。
34.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含組成性啟動子。
35.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含組成性啟動子。
36.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含可誘導(dǎo)啟動子。
37.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列包含可誘導(dǎo)啟動子。
38.權(quán)利要求22的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列選自組織特異性啟動子、發(fā)育調(diào)控啟動子、細(xì)胞器特異性啟動子、和種子特異性啟動子。
39.權(quán)利要求24的重組構(gòu)建物，其中所述調(diào)控序列選自組織特異性啟動子、發(fā)育調(diào)控啟動子、細(xì)胞器特異性啟動子、和種子特異性啟動子。
40.包含權(quán)利要求22或24的重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母、細(xì)菌、噬菌體、和病毒。
42.權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
43.權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
44.權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，其中所述膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
45.包含權(quán)利要求40的至少一種宿主細(xì)胞的植物。
46.權(quán)利要求45的植物的后代。
47.權(quán)利要求45的植物的種子。
48.包含權(quán)利要求22或24的重組構(gòu)建物的植物。
49.權(quán)利要求48的植物的后代。
50.權(quán)利要求48的植物的種子。
51.包含選自下組的氨基酸序列的純化多肽SEQ ID NO3及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO5及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO7及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO9及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO74及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，以及SEQID NO76及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體。
52.包含選自下組的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸的純化免疫原性多肽SEQ ID NO3及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO5及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO7及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO9及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，SEQ ID NO74及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體，以及SEQ ID NO76及其包含至少一個保守氨基酸替代的變體。
53.可特異結(jié)合權(quán)利要求52的免疫原性多肽的抗體。
54.用于生成卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的方法，包括在允許表達(dá)所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽或?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54的方法，還包括由宿主細(xì)胞或由培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基分離膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
56.用于修飾宿主細(xì)胞甾醇含量的方法，包括用包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
58.用于修飾宿主細(xì)胞甾醇含量的方法，包括用包含與編碼酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
60.權(quán)利要求56的方法，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的增加。
61.權(quán)利要求58的方法，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的增加。
62.權(quán)利要求56的方法，其中編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、73、和75。
63.權(quán)利要求58的方法，其中編碼酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO33或42。
64.權(quán)利要求56的方法，其中所述調(diào)控序列包含組成性啟動子。
65.權(quán)利要求58的方法，其中所述調(diào)控序列包含組成性啟動子。
66.權(quán)利要求56的方法，其中所述調(diào)控序列包含可誘導(dǎo)啟動子。
67.權(quán)利要求58的方法，其中所述調(diào)控序列包含可誘導(dǎo)啟動子。
68.權(quán)利要求56的方法，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
69.權(quán)利要求58的方法，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
70.權(quán)利要求56的方法，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
71.權(quán)利要求58的方法，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
72.權(quán)利要求56的方法，其中編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸處于反義取向。
73.權(quán)利要求58的方法，其中編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸處于反義取向。
74.權(quán)利要求72的方法，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的減少。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的減少。
76.包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
77.權(quán)利要求76的植物，其中所述卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽是植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
78.權(quán)利要求76的植物，其中編碼卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、73、和75。
79.包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)修飾的甾醇組成。
80.權(quán)利要求79的植物，其中所述酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
81.權(quán)利要求79的植物，其中編碼酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO33或42。
82.權(quán)利要求76的植物，其中所述調(diào)控序列包含組織特異性啟動子。
83.權(quán)利要求79的植物，其中所述調(diào)控序列包含組織特異性啟動子。
84.權(quán)利要求76的植物，其中所述調(diào)控序列包含種子特異性啟動子。
85.權(quán)利要求79的植物，其中所述調(diào)控序列包含種子特異性啟動子。
86.權(quán)利要求76的植物，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的增加。
87.權(quán)利要求79的植物，其中所述經(jīng)修飾的甾醇組成是甾醇酯的增加。
88.權(quán)利要求76的植物，其中編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸處于反義取向。
89.權(quán)利要求79的植物，其中編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸處于反義取向。
90.由權(quán)利要求76或79的植物獲得的油。
91.用于生成具有經(jīng)修飾甾醇組成的油的方法，包括提供權(quán)利要求76或79的植物并由所述植物提取油。
92.由權(quán)利要求91的方法生成的油。
93.用于改變宿主細(xì)胞油產(chǎn)量的方法，包括用包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
95.用于改變宿主細(xì)胞油產(chǎn)量的方法，包括用包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列的重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在所述宿主細(xì)胞得以表達(dá)?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，由此所述宿主細(xì)胞與不含該重組構(gòu)建物的宿主細(xì)胞相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽。
97.權(quán)利要求93的方法，其中所述油產(chǎn)量增加。
98.權(quán)利要求95的方法，其中所述油產(chǎn)量增加。
99.權(quán)利要求93的方法，其中宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
100.權(quán)利要求95的方法，其中宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
101.權(quán)利要求93的方法，其中編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、73、和75。
102.權(quán)利要求95的方法，其中編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO33或42。
103.權(quán)利要求93的方法，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
104.權(quán)利要求95的方法，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
105.權(quán)利要求93的方法，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
106.權(quán)利要求95的方法，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
107.包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
108.權(quán)利要求107的植物，其中所述卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
109.包含重組構(gòu)建物的植物，其中所述重組構(gòu)建物包含與編碼?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸可操作連接的調(diào)控序列，且所述重組構(gòu)建物的表達(dá)導(dǎo)致所述植物與不含該重組構(gòu)建物的相同植物相比具有經(jīng)改變的油產(chǎn)量。
110.權(quán)利要求109的植物，其中所述酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽是植物?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽。
111.權(quán)利要求107的植物，其中所述油產(chǎn)量增加。
112.權(quán)利要求109的植物，其中所述油產(chǎn)量增加。
113.權(quán)利要求107的植物，其中編碼卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO2、4、6、8、10、11、73、和75。
114.權(quán)利要求109的植物，其中編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽的所述多核苷酸選自SEQ ID NO33或42。
115.權(quán)利要求107的植物，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
116.權(quán)利要求109的植物，其中所述調(diào)控序列是組織特異性啟動子。
117.權(quán)利要求107的植物，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
118.權(quán)利要求109的植物，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。
119.包含權(quán)利要求90或92的油的食品產(chǎn)品。
120.包含權(quán)利要求107或109的植物的食品產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及卵磷脂:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶樣多肽(LCAT)和?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶樣多肽(ACAT)。本發(fā)明提供了編碼這些膽固醇:?；D(zhuǎn)移酶樣多肽的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、以及這些多核苷酸用于改變植物和宿主細(xì)胞中甾醇組成和油產(chǎn)量的用途。本發(fā)明還提供了由包含這些多核苷酸的植物和宿主細(xì)胞生成的油,以及包含本發(fā)明植物或油的食品產(chǎn)品、營養(yǎng)補(bǔ)充物、和藥用組合物。本發(fā)明的多核苷酸包括由植物來源衍生的多核苷酸。
文檔編號C12N15/09GK1372599SQ00812150
公開日2002年10月2日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月30日
發(fā)明者M·拉斯納, A·范伊尼納姆 申請人:孟山都技術(shù)有限責(zé)任公司