專利名稱：一種改進(jìn)的培養(yǎng)海藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的藻類培養(yǎng)方法，本發(fā)明涉及大型植物多細(xì)胞海藻(seaweed)領(lǐng)域，尤其是海上養(yǎng)殖海藻。
G.C.Trono，(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley，(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)已經(jīng)講述了麒麟菜和Kappaphycus的分類與培養(yǎng)，并說(shuō)明栽培者確實(shí)在野外的農(nóng)田環(huán)境下進(jìn)行了初選，即從收獲中篩選出最優(yōu)等的植物作為原材料來(lái)種植下一季作物。培養(yǎng)這種菌株最主要的缺點(diǎn)是由于它缺乏對(duì)農(nóng)田環(huán)境下季節(jié)變化的適應(yīng)性導(dǎo)致的產(chǎn)量不穩(wěn)定。
C.J Dawes和E.W.Koch(J.Appl.Phycology，3，247-257，1991)以及C.J.Dawes，G..C.Trono和A.0.Lluisma(Hydrobiologia，260/261，379-383，1993)嘗試通過(guò)微量繁殖和組織培養(yǎng)找到一種合適的方法來(lái)維持和繁殖所選擇出的麒麟菜各種培育品種克隆，他們的研究重點(diǎn)在于建立合適的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)微小的植物碎片來(lái)克隆繁殖種植的麒麟菜。這種使用小插條的繁殖主要缺點(diǎn)是后代只具備親本的特征，而在目的特征的表達(dá)上并沒(méi)有明顯優(yōu)于親本。
D.P.Cheney，Wang和Le Zhong在美國(guó)專利No.5,585,544，1996中公開(kāi)了一種使耳突麒麟菜和刺麒麟菜體細(xì)胞雜交的方法，通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)兩個(gè)非常相近種的海藻體細(xì)胞，然后分離出具有更可取終產(chǎn)物特征的雜交體細(xì)胞苗。這種藻類體細(xì)胞雜交的主要不足在于目前該方法只能使后代從親本中繼承已有的特性而不能導(dǎo)入新的特性。
已有幾篇關(guān)于商業(yè)種植和培養(yǎng)Kappaphycus和麒麟菜的文章發(fā)表(J.R.Lim和J.Porse.Proc.of the Intl.Seaweed Symp.10，601-606，1981；H.Adnan和H.Porse，Hydrobiologia，151/152，355-358，1987；R.Azanza-Corrales and P.Sa-a，Hydrobiologia，204/205，521-525，1990；G.P.B.Samonte，A.Q.Hurtado-ponce and R.Caturao，Aquaculture，110，1-11，1993)。G.C.Trono(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)，其中公開(kāi)了兩種類型培養(yǎng)方法，例如固定離底單線方法和漂浮筏或長(zhǎng)線方法，該方法已在全球范圍內(nèi)被接受為麒麟菜的培養(yǎng)方法，在這兩種方法中，挑選出的帶有豐富分枝的麒麟菜尖端插條(5-100g)以25-30cm的間隔使用軟塑料材料系在培養(yǎng)繩上使其生長(zhǎng)(在菲律賓被稱為節(jié)-節(jié)方法)，等生長(zhǎng)到一千克或更多時(shí)收獲海藻。根據(jù)其生長(zhǎng)率每60-90天收獲一次作物。不論單線方法還是流動(dòng)閥或長(zhǎng)線方法都存在幾個(gè)局限和不足，分別是(i)無(wú)性芽/種子物質(zhì)被食草動(dòng)物所食，這些食草動(dòng)物可能吃掉全部的材料，這樣就影響了后續(xù)的作物收成，(ii)由于植物未加保護(hù)，它們可能因?yàn)閻毫拥暮Ｑ髼l件從培養(yǎng)繩上被沖走，(iii)在惡劣海洋環(huán)境生長(zhǎng)過(guò)程中，附生植物和外來(lái)顆粒的沉積需要累贅又費(fèi)時(shí)的清洗工作以確保終產(chǎn)物的質(zhì)量。
O.P.Mairh等人(Indian J.Marine Sciences，24，24-31，1995)成功的表明養(yǎng)殖場(chǎng)條件下在實(shí)驗(yàn)規(guī)模袋裝培養(yǎng)異枝麒麟菜的可行性。但是，該方法的主要不足在于，與在沒(méi)有聚乙烯袋子的開(kāi)放性水環(huán)境中生長(zhǎng)相比，該方法的日生長(zhǎng)率有所降低。本發(fā)明克服了在袋子中生長(zhǎng)微弱的不足，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)的海藻進(jìn)行體外組織培養(yǎng)技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了一種快速生長(zhǎng)的菌株，該菌株在袋中展現(xiàn)出與親本植物在開(kāi)放的水環(huán)境中差不多相同的生長(zhǎng)潛力。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種改進(jìn)的培養(yǎng)藻類的方法，尤其是麒麟菜，該方法克服了上述的不足。
本發(fā)明的另一目的是通過(guò)組織培養(yǎng)形成一種麒麟菜快速生長(zhǎng)品種。
本發(fā)明還提供一種方法，該方法使克隆生產(chǎn)大量繁殖體(幼苗材料)用于大規(guī)模培養(yǎng)重要的海藻成為可能。
圖2是外植體分離出的麒麟菜愈傷組織再次培養(yǎng)中旺盛的生長(zhǎng)。
圖3顯示分離出的愈傷組織上球形或橢圓形微小無(wú)性芽。
圖4是本發(fā)明培養(yǎng)快速生長(zhǎng)菌株方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中所述由微小無(wú)性芽生長(zhǎng)得到的幼無(wú)性芽。
圖5是從無(wú)性芽傳代得到的麒麟菜多分枝幼胚。
圖6是本發(fā)明生產(chǎn)大量種子方法的一個(gè)實(shí)施方案中所述愈傷組織體細(xì)胞胚胎在體外的發(fā)育。
圖7是改進(jìn)的培養(yǎng)方法一個(gè)實(shí)施例中聚乙烯袋中的麒麟菜漂浮長(zhǎng)線培養(yǎng)體系。
圖8顯示對(duì)照親本植株和組織培養(yǎng)得到的海藻生長(zhǎng)比較。
發(fā)明詳述相應(yīng)的，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)海藻的組織培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟a)建立用于組織培養(yǎng)的無(wú)污染可生長(zhǎng)海藻材料，依次用帶有家用液體去污劑，聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的無(wú)菌海水處理海藻材料，最后在含有廣譜抗生素混合物和殺真菌劑的Provasoli濃縮海水培養(yǎng)基(PES)中溫育處理過(guò)的材料24到96個(gè)小時(shí)，然后用無(wú)菌海水徹底清洗，去除痕量的抗生素和殺真菌劑，再與無(wú)菌濾紙印記，得到無(wú)菌的外植體；b)在溫度20-25℃，20-50μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下和12∶12黑白循環(huán)，PES加強(qiáng)的瓊脂板上培養(yǎng)無(wú)菌的外植體，誘導(dǎo)愈傷組織；c)至少40天后，從外植體分離出愈傷組織，在40-60μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光和12∶12黑白循環(huán)下在新鮮瓊脂板上傳代培養(yǎng)愈傷組織，得到分化的深著色的橢圓形或球形小無(wú)性芽；d)在PES培養(yǎng)基瓊脂板中在40-60μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光和12∶12黑白循環(huán)下，傳代培養(yǎng)著色愈傷組織薄片約20-40天，使得著色絲狀愈傷組織中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和小無(wú)性芽的形成都得到了提高；e)將帶有體細(xì)胞胚胎的絲狀愈傷組織轉(zhuǎn)入液體PES培養(yǎng)基在振動(dòng)條件下培養(yǎng)，使其進(jìn)行形態(tài)發(fā)生并從無(wú)性芽發(fā)展成帶有多枝的幼胚；以及f)在封裝的穿孔聚乙烯袋中培養(yǎng)幼胚，大規(guī)模培養(yǎng)海藻。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所用外植體是從海藻上部取下的長(zhǎng)1-6mm，直徑3-4mm的插條。
在另一實(shí)施方案中，海藻用1-5％含青霉素，鏈霉素硫酸鹽，卡那霉素，制霉菌素和新霉素在100ml蒸餾水中的抗生素混合物的PES培養(yǎng)基處理。
在另一實(shí)施方案中，無(wú)菌的外植體在20-25℃，20-30μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光和12∶12黑白循環(huán)下，在PES加強(qiáng)的含有0.8-3％瓊脂的瓊脂板中培養(yǎng)。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)培養(yǎng)在20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光和12∶12黑白循環(huán)下，在PES培養(yǎng)基制成的且以包埋培養(yǎng)物形式存在于含有0.3-0.6％瓊脂的瓊脂板中的著色愈傷組織的薄片，傳代培養(yǎng)愈傷組織，在每個(gè)包埋塊上得到豐富分枝的絲狀著色愈傷組織。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子選自0.1-1.0mg/l萘乙酸和0.1mg l-1萘乙酸和6-芐氨基嘌呤。
在另一實(shí)施方案中，無(wú)菌的外植體是在瓊脂板上培養(yǎng)約40-45天。
在另一實(shí)施方案中，頂部的插條在附著到海中長(zhǎng)漂浮線上的聚乙烯袋中生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)大約60天將其收獲。
在另一實(shí)施方案中，幼胚在穿孔的袋中培養(yǎng)，年海水溫度范圍22.5℃-28.5℃，pH范圍7.81-8.26，鹽度范圍24.0％-34.0％，溶解氧范圍7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸鹽范圍0.02μmol-3.23μmol，硝酸鹽范圍0.15μmol-2.58μmol，亞硝酸鹽范圍0.01μmol-0.85μmol。
在另一實(shí)施方案中，小無(wú)性芽是通過(guò)著色絲狀愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生克隆繁殖。
在另一實(shí)施方案中，在海中幼胚在附著在漂浮長(zhǎng)線上的浸沒(méi)的帶孔透明聚乙烯袋中保護(hù)性培養(yǎng)物中生長(zhǎng)至少60天。
在另一實(shí)施方案中，著色愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生得到的體細(xì)胞胚胎形成方法通過(guò)加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，如a-萘乙酸和6-芐氨基嘌呤，進(jìn)一步得到提高。
在另一實(shí)施方案中，至少60天的收獲期可得到更高生物量，或者縮短培養(yǎng)期而生物產(chǎn)量仍可如常得到。
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的海藻培養(yǎng)方法，包括一種培育麒麟菜種植后代的快速生長(zhǎng)變種的方法，通過(guò)組織培養(yǎng)，克服在袋中微弱生長(zhǎng)的不足，其中組織培養(yǎng)所用無(wú)菌可生長(zhǎng)海藻材料是這樣得到的用0.1-1％家用液體去污劑處理選出的植物材料(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)(0.5％重量/體積有效碘)處理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，鏈霉素硫酸鹽-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸餾水中)的PES培養(yǎng)基中處理24-96小時(shí)，在20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光和12∶12黑白循環(huán)下在PES培養(yǎng)基加強(qiáng)的瓊脂板上(0.8-3％瓊脂)培養(yǎng)的無(wú)菌的麒麟菜外植體(5-6mm長(zhǎng)，優(yōu)選植物末梢插條)顯示愈傷組織的誘導(dǎo)，該愈傷組織在沒(méi)有外植體的傳代培養(yǎng)中得到深著色橢圓形或球形小無(wú)性芽，通過(guò)培養(yǎng)作為3mm厚度PES培養(yǎng)基瓊脂板(0.3-0.6％瓊脂)中包埋培養(yǎng)物的著色愈傷組織(2mm×3mm×2mm)薄片其產(chǎn)量被進(jìn)一步提高，但是，在瓊脂培養(yǎng)基中加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-芐氨基嘌呤，進(jìn)一步提高了著色絲狀愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和小無(wú)性芽的形成，并且將這些帶有體細(xì)胞胚胎的愈傷組織物質(zhì)轉(zhuǎn)入液體PES培養(yǎng)基，在振動(dòng)條件下促進(jìn)形態(tài)發(fā)生和無(wú)性芽發(fā)展成幼胚的過(guò)程，幼胚在野外培養(yǎng)中展示出優(yōu)等的生長(zhǎng)，較對(duì)照親本植物增長(zhǎng)2倍多生物量，并且兼顧了海藻提煉到角叉菜膠的產(chǎn)量與質(zhì)量，而且同時(shí)提出了改善的漂浮長(zhǎng)線培養(yǎng)方法，其中100g鮮重麒麟菜頂端的插條(優(yōu)選帶有分枝的)在封閉的兩面都帶有3排(每排帶有等距的12個(gè)孔)，間隔14cm的4mm直徑孔的透明聚乙烯袋(450guage；60cm×45cm)中培養(yǎng)，在海中60天生長(zhǎng)期后，組織培養(yǎng)后代得到1590°37.4g.鮮重(4.6％日生長(zhǎng)率)，對(duì)照親本植物得到846.66°37.9g.鮮重(3.5％日生長(zhǎng)率)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)所用無(wú)菌可生長(zhǎng)植物材料的制備工藝是這樣建立的用0.1-1％家用液體去污劑處理選出的植物材料(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(0.5％重量/體積有效碘)處理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，鏈霉素硫酸鹽-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸餾水中)的PES培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-96h。為確定上述材料無(wú)菌，將其轉(zhuǎn)入Zobell 2216E瓊脂板，22-23℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2星期。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)組織培養(yǎng)培育種植麒麟菜快速生長(zhǎng)變種。20-25℃，20-50m mole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下和12∶12黑白循環(huán)，生長(zhǎng)于Provasoli濃縮海水(PES)培養(yǎng)基增強(qiáng)的瓊脂板(0.8-3.0％瓊脂)上的無(wú)菌外植體中，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)是可生長(zhǎng)的。經(jīng)過(guò)40天，從外植體分離出增殖的愈傷組織，分別在新鮮的瓊脂培養(yǎng)基上如上所述傳代培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)40天的生長(zhǎng)，有些瓊脂板上傳代培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行分化，并產(chǎn)生了深著色的球形或橢圓形小無(wú)性芽(2-5mm直徑)，這些小無(wú)性芽轉(zhuǎn)至液體PES培養(yǎng)基后長(zhǎng)成麒麟菜幼胚。對(duì)土壤培養(yǎng)的許多克隆植物進(jìn)行重復(fù)的檢測(cè)，顯示這些植物中有相當(dāng)大的比例(＞90％)不僅存活而且展示了高于對(duì)照親本植物的生長(zhǎng)能力。
在另一實(shí)施方案中，說(shuō)明了通過(guò)著色愈傷組織細(xì)胞的體細(xì)胞胚胎發(fā)生在體外克隆生產(chǎn)并繁殖小無(wú)性芽。為提高小無(wú)性芽的產(chǎn)量，傳代培養(yǎng)的著色愈傷組織被分割成若干薄塊(2mm×3mm×2mm)，20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下和12∶12黑白循環(huán)，在瓊脂板(0.3-0.6％)中作為包埋培養(yǎng)物生長(zhǎng)，在第一個(gè)三周時(shí)間內(nèi)，每個(gè)包埋塊都可看到旺盛的分枝絲狀著色愈傷組織，然后，在一些絲上分枝的暗灰色部分可觀察到與體細(xì)胞胚胎相似的深著色小菌落的再生。將帶有體細(xì)胞胚胎的這種絲狀愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體濃縮海水培養(yǎng)基(PES)，促進(jìn)小無(wú)性芽的快速生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)向瓊脂培養(yǎng)基中加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤，著色絲狀愈傷組織上體細(xì)胞胚胎的形成過(guò)程被進(jìn)一步提高。
在另一實(shí)施方案中，起始植株，優(yōu)選大約100g鮮重的多分枝的頂部插條，套在穿孔的透明聚乙烯袋(450gauge，60cm×45cm)中，將袋子附著于海中漂浮長(zhǎng)線上，使植株生長(zhǎng)。在一年中插條如上所述，在保護(hù)性袋中生長(zhǎng)，每60-75天收獲一次。30天內(nèi)插條可達(dá)到394.6°20.8g.鮮重(4.7％日生長(zhǎng)率)產(chǎn)量，60天的培養(yǎng)期可達(dá)到846.66°37.9g.鮮重(3.5％日生長(zhǎng)率)的產(chǎn)量。
在另一實(shí)施方案中，采用袋培養(yǎng)方法比較本發(fā)明中快速生長(zhǎng)菌株和對(duì)照親本植株在野外條件下的產(chǎn)量。60天內(nèi)快速生長(zhǎng)的變種產(chǎn)量達(dá)到了1590°37g(4.6％日生長(zhǎng)率)，對(duì)照親本植株產(chǎn)量為846°38g.(3.6％日生長(zhǎng)率)，而其在開(kāi)放的水環(huán)境下培養(yǎng)產(chǎn)量1726g.(4.7％日生長(zhǎng)率)。
以下詳述一種改進(jìn)的海藻培養(yǎng)方法中的創(chuàng)造性技術(shù)，包括培育組織培養(yǎng)所用的快速生長(zhǎng)變種，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生大量生產(chǎn)和繁殖小無(wú)性芽(種子)，以用一種海洋大型海藻的改進(jìn)培養(yǎng)方法。目的海藻生物應(yīng)該是光合的并且對(duì)不同的海洋環(huán)境條件具有耐受性。適用于本發(fā)明的藻類是非絲狀的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的海洋紅藻和褐藻，它們是具有直立或倒伏習(xí)性的軟骨菌體，并且由圓柱形的或扁平的枝條構(gòu)成且產(chǎn)量很大。合適的海藻可以從紅藻中選擇，優(yōu)選gigartinales目，其中更優(yōu)選麒麟菜屬，例如異枝麒麟菜，耳突麒麟菜，E.denticulatum，刺麒麟菜，E.alvarazii和E.procrusteanum；杉藻屬，例如小杉藻，G..exasparata；和角叉菜屬，例如皺波角叉菜。褐藻門合適的屬為海帶屬，裙帶菜屬，昆布屬，羽葉藻屬，巨藻屬，馬尾藻屬和喇叭藻屬。
為得到無(wú)菌的材料，選出的植物材料在高壓滅菌過(guò)的含有0.1-1％家用液體去污劑的過(guò)濾海水(無(wú)菌海水)處理(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(0.5％重量/體積有效碘)處理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，鏈霉素硫酸鹽-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸餾水中)的PES培養(yǎng)基中，20-25℃，25-30μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)培養(yǎng)24-96h。但是，經(jīng)過(guò)了0.1％液體去污劑，1％聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)和3％廣譜抗生素兩天時(shí)間的處理后，植物材料已經(jīng)無(wú)菌，在Zobell培養(yǎng)基上即使經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng)，也未顯示出有細(xì)菌生長(zhǎng)。
建立了無(wú)菌材料的制備過(guò)程后，20-25℃，在20-50μmole光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，在PES培養(yǎng)基加強(qiáng)的瓊脂板(0.8-3％瓊脂)上培養(yǎng)麒麟菜外植體(長(zhǎng)5mm插條，優(yōu)選植株的末端部分)一個(gè)月。在培養(yǎng)的最初兩周內(nèi)可以觀察到愈傷組織的誘導(dǎo)。40天后，增殖的絲狀分枝愈傷組織從外植體中分割出來(lái)，分別在新鮮的瓊脂板上，除光照增加到50μmol光量子m-2s-1輻射量外，其它條件相似，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生和分化。經(jīng)過(guò)約40-50天瓊脂板培養(yǎng)后，一些傳代培養(yǎng)的愈傷組織的確經(jīng)過(guò)形態(tài)發(fā)生而產(chǎn)生了深著色的球形或橢圓形小無(wú)性芽(2-5mm直徑)，將其轉(zhuǎn)移至液體PES培養(yǎng)基中發(fā)育成麒麟菜幼胚。將其轉(zhuǎn)移至Thoniturai(Gulf of Mannar，India)的試驗(yàn)培養(yǎng)區(qū)，重復(fù)檢測(cè)這些植物在野外的可生長(zhǎng)性及成長(zhǎng)表現(xiàn)。上述所有被檢測(cè)植物在野外始終如一的顯示出低死亡率，還有幾株在相同的培養(yǎng)期內(nèi)，鮮重高于對(duì)照親本植物2倍多。這種趨勢(shì)甚至以可忽略的變化持續(xù)到第三代海藻。
通過(guò)著色愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生克隆產(chǎn)生小無(wú)性芽的方法已經(jīng)建立。體細(xì)胞胚胎發(fā)生和小無(wú)性芽產(chǎn)量可以，通過(guò)在3mm厚度PES培養(yǎng)基瓊脂板(0.3-0.6％瓊脂)中作為包埋培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)著色絲狀愈傷組織薄塊(2mm×3mm×2mm)進(jìn)一步被提高。植入到瓊脂培養(yǎng)基中的愈傷組織塊在一個(gè)月內(nèi)快速生長(zhǎng)，在瓊脂培養(yǎng)基中形成了帶有大量生長(zhǎng)分枝絲狀著色愈傷組織的色斑。外植塊上新再生的絲狀愈傷組織最后轉(zhuǎn)化發(fā)展成深著色(暗灰色)小菌落，與一些絲上分枝的體細(xì)胞胚胎相似。在瓊脂培養(yǎng)基中加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤，進(jìn)一步提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生。將這種帶有體細(xì)胞胚胎的絲狀愈傷組織從固體(瓊脂板)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到液體PES培養(yǎng)基中，促進(jìn)其快速生長(zhǎng)和小無(wú)性芽的形態(tài)發(fā)生。
在本發(fā)明中，選出的麒麟菜插條，優(yōu)選帶有分枝的，作為種子材料，在完全封閉的保護(hù)袋中生長(zhǎng)，優(yōu)選帶孔(直徑4mm)透明袋，這些透明袋允許光線滲透以及維持生長(zhǎng)所需的海水循環(huán)，同時(shí)，排除了這些材料被進(jìn)食以及沉積外來(lái)顆粒的可能性。而袋子的表面沉積了外來(lái)顆粒，可以每周或必要時(shí)清洗。在培養(yǎng)過(guò)程中，種植區(qū)的年海水溫度范圍22.5℃-28.5℃，pH范圍7.81-8.26，鹽度范圍24.0％-34.0％，溶解氧范圍7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸鹽范圍0.02μmol-3.23μmol，硝酸鹽范圍0.15μmol-2.58μmol，亞硝酸鹽范圍0.01μmol-0.85μmol。經(jīng)過(guò)60天的培養(yǎng)期，100g鮮重起始種子材料，組織培養(yǎng)培育植株可達(dá)到1590°37.4g.鮮重產(chǎn)量，對(duì)照親本得到846.66°37.9g.鮮重的產(chǎn)量。
本發(fā)明首次揭示在體外條件下快速生長(zhǎng)菌株的制備方法，以及通過(guò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紅藻著色愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生來(lái)大規(guī)模克隆得到小無(wú)性芽的方法。早期對(duì)海藻的組織培養(yǎng)研究顯示通過(guò)轉(zhuǎn)移愈傷組織到液體培養(yǎng)基中得到整株的從頭再生。但是在本發(fā)明中，首次成功地在瓊脂板上生產(chǎn)了由少至3個(gè)多至幾百個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的像著色小菌落一樣的體細(xì)胞胚胎。我們發(fā)現(xiàn)在昏暗光條件下的瓊脂板上著色小菌落可理想地經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)的期限直到需要時(shí)仍保持存活。在相似的條件下，組織培養(yǎng)的植株日生長(zhǎng)量已幾次顯示高于對(duì)照親本植株40％的增長(zhǎng)，60天期限末時(shí)，這種增長(zhǎng)已達(dá)到較于對(duì)照2倍的生物量，而對(duì)照的產(chǎn)量與在開(kāi)放的水環(huán)境條件下所得相似。這種從干燥的組織培養(yǎng)培育植株中半提純的角叉菜膠產(chǎn)量為43％，凝膠力為540g.cm-2，而對(duì)照的產(chǎn)量為43％，角叉菜膠凝膠力為550g.cm-2。本發(fā)明中改進(jìn)的步驟為(i)發(fā)展一種制備潔凈無(wú)菌的組織培養(yǎng)所用植物材料的方法，(ii)發(fā)展一種通過(guò)著色愈傷組織的小無(wú)性芽制備快速生長(zhǎng)變種的方法，使其具有2倍增加的生長(zhǎng)量而不影響角叉菜膠的產(chǎn)量和質(zhì)量，(iii)在體外克隆繁殖小無(wú)性芽，通過(guò)將著色愈傷組織作為包埋培養(yǎng)物在瓊脂板中培養(yǎng)，使其進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生，(iv)利用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子如萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤促進(jìn)著色愈傷組織中體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形成過(guò)程，以及(v)在放入封套的帶孔透明塑料袋中培養(yǎng)海藻，袋子可以防止海藻被進(jìn)食以及得到純凈的原材料，沒(méi)有污染物影響終產(chǎn)物。
下述實(shí)施例是具體說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明保護(hù)范圍并不局限于下述實(shí)施例。
更明確地，本改進(jìn)了的培養(yǎng)方法包括一種具有改進(jìn)特性--即快速生長(zhǎng)--的克隆方法，通過(guò)組織培養(yǎng)和使用帶小孔的透明聚乙烯袋長(zhǎng)線流動(dòng)培養(yǎng)方法，袋子防止海藻被食草動(dòng)物所食以及得到純凈的原材料，沒(méi)有污染物影響終產(chǎn)物kappa角叉菜膠。
這種改進(jìn)的培養(yǎng)方法主要用法/用途包括以下(i)通過(guò)組織培養(yǎng)制備具有快速生長(zhǎng)的改進(jìn)特性的體細(xì)胞克隆方法，(ii)通過(guò)愈傷組織細(xì)胞的體細(xì)胞胚胎發(fā)生在體外克隆繁殖海藻，(iii)通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)物在體外的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，大規(guī)模的生產(chǎn)和提供統(tǒng)一的實(shí)用性種植海藻所用種子(小無(wú)性芽)，(iv)開(kāi)發(fā)愈傷組織作為長(zhǎng)期種質(zhì)儲(chǔ)存來(lái)源，以及(v)使用帶小孔的透明聚乙烯袋進(jìn)行培養(yǎng)，防止海藻被食草動(dòng)物所食以及得到純凈的原材料，沒(méi)有污染物影響終產(chǎn)物k--角叉菜膠。
實(shí)施例1無(wú)菌外植體的制備為得到用于組織培養(yǎng)所用無(wú)菌的，可生長(zhǎng)的，單種藻的海藻材料，從培養(yǎng)區(qū)選擇出異枝麒麟菜(＝kappaphycus alvarezii)菌體，從其上選出大約5cm長(zhǎng)度的片段(靠近頂部，4-5mm直徑的莖)。實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)在在充氣燒瓶中PES濃縮海水培養(yǎng)基中，在20μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，生長(zhǎng)10天，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件。在適應(yīng)期間，燒瓶中的培養(yǎng)基以5天間隔共補(bǔ)充兩次。適應(yīng)后，首先，在高壓滅菌的過(guò)濾海水(無(wú)菌海水)中，在顯微鏡下用刷子徹底清洗片段，去除表面的污染物，然后依次在滅菌過(guò)的含有0.1％家用液體去污劑的海水中處理10min，1％聚乙烯吡咯酮碘(有效碘0.5％w/v)處理2min，最后在含有3％的過(guò)濾無(wú)菌廣譜抗生素混合物(青霉素G-1g，鏈霉素硫酸鹽-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸餾水中)的PES培養(yǎng)基中，23℃，在25μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，培養(yǎng)48h。每一步驟中，在將要進(jìn)行的處理之前，海藻塊用無(wú)菌海水沖洗以避免化合物的交叉污染。上述所有的操作，除材料在抗生素中的培育外，都在Bioclean工作臺(tái)上進(jìn)行。經(jīng)過(guò)上述處理的植物材料成為無(wú)污染的，即使在Zobell瓊脂板上生長(zhǎng)2周也沒(méi)有顯示微生物生長(zhǎng)。
實(shí)施例2無(wú)菌外植體的愈傷組織誘導(dǎo)在經(jīng)過(guò)實(shí)施例1中所述方法得到的無(wú)菌材料中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。首先，愈傷組織誘導(dǎo)所用植株材料用滅菌的海水徹底清洗，去除痕量的抗生素，然后切割成長(zhǎng)度為5mm的外植體，與無(wú)菌濾紙印記去掉水份和切口處流出的粘液，因?yàn)榧词菇?jīng)過(guò)一個(gè)月的外植體培養(yǎng)這種粘液仍可能成為微生物污染源。在PES培養(yǎng)基制備的1.5％瓊脂板上，23℃，在25μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，培養(yǎng)外植體一個(gè)月。在最初的2周培養(yǎng)期內(nèi)可以觀察到愈傷組織的誘導(dǎo)。50天后，從植株上分離出繁殖的絲狀分枝愈傷組織(


圖1)，分別在新鮮瓊脂板上在相似條件下傳代培養(yǎng)，除光照增加到50μmol光量子m-2s-1輻射量，以提高愈傷組織的生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)50天瓊脂板培養(yǎng)的一些再次傳代的愈傷組織(圖2)的確經(jīng)過(guò)形態(tài)發(fā)生，并在愈傷組織各處產(chǎn)生了深著色的直徑2-5mm球形或橢圓形小無(wú)性芽(圖3)，進(jìn)一步地，在振蕩條件下在液體PES培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)這些無(wú)性芽，使其成長(zhǎng)為幼無(wú)性芽(圖4)，這些幼芽在3周內(nèi)成長(zhǎng)為帶有多枝的幼苗(圖5)。
實(shí)施例3體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆繁殖通過(guò)麒麟菜著色愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生來(lái)克隆制備小無(wú)性芽。體細(xì)胞胚胎發(fā)生和小無(wú)性芽的產(chǎn)生可以通過(guò)傳代培養(yǎng)著色絲狀愈傷組織塊(2mm×3mm×2mm)薄片得到提高，這些薄片在23℃，50μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，在PES培養(yǎng)基的3mm厚瓊脂板中(0.4％瓊脂)作為包埋培養(yǎng)物培養(yǎng)。種植在瓊脂培養(yǎng)基中的愈傷組織塊在一個(gè)月內(nèi)快速生長(zhǎng)，在瓊脂培養(yǎng)基中形成了帶有大量生長(zhǎng)分枝絲狀著色愈傷組織的色斑。外植塊上新再生的絲狀愈傷組織最后轉(zhuǎn)化發(fā)展成深著色(暗灰色)小菌落，與一些著色絲狀愈傷組織分枝上的體細(xì)胞胚胎(圖6)相似。
實(shí)施例4利用植物生長(zhǎng)因子提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生通過(guò)向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子如萘乙酸(植物生長(zhǎng)素)和6-苯甲基氨基嘌呤(細(xì)胞分裂素)提高從麒麟菜著色絲狀愈傷組織生產(chǎn)小無(wú)性芽的產(chǎn)量。著色愈傷組織塊薄片(2mm×3mm×2mm)作為包埋塊在含有0.1，1.0mg l-1萘乙酸或0.1mgl-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤的PES培養(yǎng)基制備的3mm厚瓊脂板中(0.4％瓊脂)培養(yǎng)。所有帶有包埋愈傷組織的陪氏培養(yǎng)皿保持在23℃，在50μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)。種植在瓊脂培養(yǎng)基中的愈傷組織塊在一個(gè)月內(nèi)快速生長(zhǎng)，形成深著色的小菌落，與瓊脂培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚胎相似。將這些著色愈傷組織從固體(瓊脂板)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入液體PES培養(yǎng)基，促進(jìn)其快速生長(zhǎng)以及小無(wú)性芽的形態(tài)發(fā)生。為加速小無(wú)性芽的形態(tài)發(fā)生，優(yōu)選進(jìn)行攪拌培養(yǎng)。
實(shí)施例5采用漂浮長(zhǎng)線方法培養(yǎng)麒麟菜首先先建立傳統(tǒng)的在開(kāi)放水環(huán)境下漂浮長(zhǎng)線方法培養(yǎng)麒麟菜得到的產(chǎn)量數(shù)據(jù)。在這種方法中，選出的麒麟菜插條，優(yōu)選帶有多分枝的頂尖部分，取約100g鮮重，作為種植用起始種子，以30cm間隔將10份插條直接系在聚丙烯繩(直徑8mm長(zhǎng)度30米)上，繩子懸掛在底部固定的兩根竹竿(約5米長(zhǎng))上。竹竿以1m間隔等距形成點(diǎn)陣。在海水低潮時(shí)繩子離地約0.5米，高潮時(shí)1.0-1.5。每30天分別稱量新鮮植株以檢測(cè)植株的生長(zhǎng)情況，然后根據(jù)公式r＝(Wt/Wo)1/1-1×100計(jì)算日生長(zhǎng)率，其中r代表以百分比表示的日生長(zhǎng)率，Wt是在t天的濕重，Wo是起始濕重。植株在開(kāi)放性水環(huán)境中30天的平均生物量和日生長(zhǎng)率分別為450g鮮重和7.3％，60天的主產(chǎn)量和日生長(zhǎng)率分別為1726g鮮重和4.7％。
實(shí)施例6采用漂浮長(zhǎng)線方法在聚乙烯袋中培養(yǎng)麒麟菜在這種方法中，選出的麒麟菜插條，優(yōu)選帶有多分枝的頂尖部分，取10份約100g鮮重，作為種植用起始種子，在帶孔(海水循環(huán)所需)的封閉透明聚乙烯袋(450guage，60cm×45cm)中生長(zhǎng)至收獲。從袋子開(kāi)口端留出18cm，以14cm間隔，共3排(每排有等距的12個(gè)孔)在兩面打孔，每孔直徑4mm。這樣每個(gè)袋子兩面共有72個(gè)孔(即每面有36個(gè))。袋子用尼龍線縫紉，然后系在漂浮繩上(圖7)?？偣?0個(gè)袋子以10cm間隔系在上述繩子上。60天后收獲，稱重，用實(shí)施例5中所述公式計(jì)算日生長(zhǎng)率。
實(shí)施例7比較研究組織培養(yǎng)后代和親本植株的生長(zhǎng)，角叉菜膠的產(chǎn)率和膠的特性對(duì)組織培養(yǎng)后代長(zhǎng)出的野外生長(zhǎng)植株和對(duì)照親本植株進(jìn)行研究，比較其生長(zhǎng)(圖8)，干海藻重量基礎(chǔ)上角叉菜膠(半提純的)產(chǎn)量，以及角叉菜膠凝膠強(qiáng)度。兩種植株各10份實(shí)驗(yàn)材料如實(shí)施例6中所述，以漂浮長(zhǎng)線方法，在封閉透明聚乙烯袋中培養(yǎng)。30天的平均生物量為394.58±20.8g鮮重(4.7％日生長(zhǎng)率)，60天的平均生物量為846.6±38g鮮重(3.5％日生長(zhǎng)率)，而組織培養(yǎng)植株30天的平均生物量為711.6±13g鮮重(6.8％日生長(zhǎng)率)，60的平均生物量為1590±37g鮮重(4.6％日生長(zhǎng)率)。半提純的角叉菜膠含量是這樣得到10g預(yù)清洗過(guò)的海藻在200ml 8％ KOH溶液中處理1.5h，輕輕倒出濾出液，中和剩余物質(zhì)，用蒸餾水清洗。然后在40℃使其徹底干燥，稱重，計(jì)算其產(chǎn)量。凝膠強(qiáng)度通過(guò)凝膠強(qiáng)度測(cè)試計(jì)(Nikkansui，Co.Japan)進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)在1％KCl溶液中煮沸，制備1％角叉菜膠凝膠。在43％干海藻的基礎(chǔ)上，對(duì)照親本植株的產(chǎn)量和小無(wú)性芽發(fā)育成的植株產(chǎn)量相近。相應(yīng)的凝膠強(qiáng)度分別為550gcm-2和540gcm-2。
優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1.一種改進(jìn)親本植株以得到改進(jìn)特性如快速生長(zhǎng)的新方法。
2.一種大規(guī)模從目的菌株快速生產(chǎn)小無(wú)性芽(種子材料)的方法。
3.一種在瓊脂板上以可生長(zhǎng)形式，也就是作為體細(xì)胞胚胎儲(chǔ)存生殖質(zhì)的方法。
4.一種改進(jìn)的培養(yǎng)海藻方法，減少了自然界惡劣條件如強(qiáng)大水流的不良影響，降低了食草動(dòng)物和附生植物造成的損失，并得到等于或高于親本植株在開(kāi)放水中的生長(zhǎng)率。
5.一種改進(jìn)的培養(yǎng)方法，提供了最高純度材料，沒(méi)有任何影響終產(chǎn)物質(zhì)量的污染物。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)海藻的組織培養(yǎng)方法，該方法包括步驟a)通過(guò)下述步驟建立組織培養(yǎng)所用無(wú)菌的可生長(zhǎng)海藻材料依次用含有家用液體去污劑和含有聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的無(wú)菌海水處理海藻材料，最后在含有廣譜抗生素混合物和殺真菌素的Provasoli濃縮海水(PES)培養(yǎng)基中培育24到96小時(shí)，再用無(wú)菌海水徹底清洗，去除痕量的抗生素和殺真菌素，再與無(wú)菌的濾紙印記，得到無(wú)菌的外植體；b)在PES培養(yǎng)基增強(qiáng)的瓊脂板上培養(yǎng)無(wú)菌外植體，溫度范圍為20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，誘導(dǎo)愈傷組織；c)至少40天后，從外植體上分割出愈傷組織，在40-60μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，在新鮮瓊脂板上傳代培養(yǎng)愈傷組織，得到分化的深著色橢圓形或球形小無(wú)性芽；d)在40-60μmol光量子m-2s-1輻射量的冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)，在含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的PES培養(yǎng)基制成的瓊脂板上傳代培養(yǎng)深著色愈傷組織薄片約20到40天，在著色絲狀愈傷組織中得到增多的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和小無(wú)性芽形成；e)將帶有體細(xì)胞胚胎的絲狀愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體PES培養(yǎng)基，振蕩條件下培養(yǎng)，使其進(jìn)行形態(tài)發(fā)生以及從無(wú)性芽發(fā)育成帶有多枝的幼苗；和f)通過(guò)在封裝的帶孔聚乙烯袋中培養(yǎng)幼苗大規(guī)模培養(yǎng)海藻生物量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中組織培養(yǎng)所用材料選自海洋紅藻和褐藻，包括麒麟菜屬、杉藻屬、角叉菜屬、海帶屬、裙帶菜屬、昆布屬、羽葉藻屬、巨藻屬、馬尾藻屬和喇叭藻屬。
3.權(quán)利要求1的方法，其中組織培養(yǎng)所用材料選自異枝麒麟菜、Kappaphycus alvarezzi、耳突麒麟菜、E.denticulatum、刺麒麟菜、E.alvarazii、E.procrusteanum、小杉藻、G.exasparata和皺波角叉菜。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所用外植體包含取自海藻頂部、且直徑為3-4mm，長(zhǎng)度為1-6mm的插條。
5.權(quán)利要求1的方法，其中海藻材料首先用0.1-1％家用液體去污劑處理5-20分鐘，接著用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘處理2-7分鐘，最后在含有1-5％抗生素混合物的provasoli濃縮海水中處理04-96小時(shí)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該抗生素混合物包括青霉素，鏈霉素硫酸鹽，卡那霉素，制霉菌素和新霉素在100ml蒸餾水中。
7.權(quán)利要求1的方法，其中無(wú)菌外植體在PES培養(yǎng)基增強(qiáng)的含有0.8-3％瓊脂的瓊脂板上培養(yǎng)，20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)的輻射量。
8.權(quán)利要求1的方法，其中愈傷組織的傳代培養(yǎng)是通過(guò)將著色愈傷組織的薄片作為包埋培養(yǎng)物在含有0.3-0.6％瓊脂的由PES培養(yǎng)基制成的瓊脂板中生長(zhǎng)，20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1冷白熒光下，12∶12黑白循環(huán)的輻射量，在每個(gè)包埋塊上得到多分枝的絲狀著色愈傷組織。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子選自0.1-1.0mg/l萘乙酸以及各0.1mg l-1的萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤。
10.權(quán)利要求1的方法，其中無(wú)菌外植體在瓊脂板上培養(yǎng)約40-45天。
11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(f)的海藻生物量在附著在海中長(zhǎng)漂浮線上的60×45cm聚乙烯袋中培養(yǎng)，并在約60天后收獲。
12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(f)的幼苗在穿孔聚乙烯袋中培養(yǎng)，年海水溫度范圍22.5℃-28.5℃，pH范圍7.81-8.26，鹽度范圍24.0％-34.0％，溶解氧范圍7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸鹽范圍0.02μmol-3.23μmol，硝酸鹽范圍0.15μmol-2.58μmol，亞硝酸鹽范圍0.01μmol-0.85μmol。
13.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)的小無(wú)性芽通過(guò)著色絲狀愈傷組織經(jīng)過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生克隆繁殖。
14.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(f)的幼苗在附著到漂浮長(zhǎng)線上的浸沒(méi)的帶孔透明聚乙烯袋中，在海中保護(hù)性的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)至少60天。
15.權(quán)利要求1的方法，其中著色愈傷組織通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成體細(xì)胞胚胎的過(guò)程通過(guò)加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子進(jìn)一步提高，如a-萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤。
16.權(quán)利要求1的方法，其中至少60天的收獲期可產(chǎn)生更高的生物量，或其中縮短培養(yǎng)期仍可維持原生物量。
17.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)由著色愈傷組織形成小無(wú)性芽，使得在不改變產(chǎn)物產(chǎn)率(角叉菜膠)和凝膠強(qiáng)度的情況下與對(duì)照親本植物相比生長(zhǎng)增長(zhǎng)兩倍(鮮重)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的培養(yǎng)海藻的方法,包括培育一種快速生長(zhǎng)的變種,該變種克服了在聚乙烯袋中產(chǎn)量降低的不足,并且得到的生物量與在無(wú)袋的開(kāi)放培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得到的生物量相近。而且,從組織培養(yǎng)發(fā)育的植株中得到的半提純角叉菜膠產(chǎn)量和質(zhì)量與對(duì)照親本植株相似。還提供了通過(guò)著色愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生大規(guī)模克隆繁殖小無(wú)性芽的方法。
文檔編號(hào)C12N1/12GK1373633SQ00812730
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月31日
發(fā)明者C·R·瑞蒂, O·P·梅瑞, G·R·庫(kù)瑪, K·埃斯娃安, P·V·蘇巴瑞奧, K·H·穆蒂, P·K·戈施 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)