專利名稱：：肌醇六磷酸酶、編碼肌醇六磷酸酶的核酸及包含有此核酸的載體和宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶、編碼肌醇六磷酸酶的核酸、以及肌醇六磷酸酶的制備和其用途。參考文獻(xiàn)Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)″Basiclocalalignmentsearchtool.″J.Mol.Biol.215403-410.Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)″GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.″NucleicAcidsRes.253389-3402.Ausubeletal.(eds.)，CurrentProtocolsInMolecularBiology，vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.1987.Benton，W.andDavis，R.，1977，Science196180.BergerandKimmel，1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，Vol152，AcademicPress，SanDiegoCA.Birnboim，H.C.andDoly，J.(1979).NucleicAcidsResearch71513-23.Botstein，D.andShortle，D.，1985，Science2291193-1201.Brissonetal(1984)Nature310511-514.Broglieetal(1984)Science224838-843).Cadwell，R.C.andJoyce，G.F.，1992，PCRMethodsApplic.228-33.Coruzzietal(1984)EMBOJ31671-1680.Cromwell，G.L.T.，T.S.Stahly，R.D.Coffey，H.J.Monegue，andJ.H.Randolph.1993.Efficacyofphytaseinimprovingbioavailabilityofphosphorusinsoybeanandcorn-soybeanmealdietsforpigs.J.Anim.Sci.711831.Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.&Orcutt，B.C.(1978)″Amodelofevolutionarychangeinproteins.″In″AtlasofProteinSequenceandStructure，vol.5，suppl.3.″M.O.Dayhoff(ed.)，pp.345-352，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC.Deutscher，MethodsinEnzymology，182(1990).DieffenbachCWandDvekslerGS，1995，PCRPrimer，aLaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，PlainviewNY.Eckert，K.A.andKunkel，T.A.，1991，PCRMethodsApplic.117-24.Ehrlich，K.C.，Montalbano，B.G.，Mullaney，E.J.，DischingerJnr.，H.C.&Ullah，A.H.J.(1993).Identificationandcloningofasecondphytasegene(phyB)fromAspergillusniger(ficuum).BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications195，53-57.Elander，R.P.，Microbialscreening，SelectionandStrainImprovement，inBasicBiotechnology，J.BullockandB.KristiansenEds.，AcademicPress，NewYork，1987，217.Finkelstein，DB1992Transformation.InBiotechnologyofFilamentousFungi.TechnologyandProducts(edsbyFinkelstein&Bill)113-156.Fiske，C.H.andSubbaRow，Y.(1925).JournalofBiologicalChemistry66375-392.Fungaroetal.(1995)TransformationofAspergillusnidulansbymicroprojectionbombardmentonintactconidia，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters125293-298.Gish，W.&States，D.J.(1993)″Identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch.″NatureGenet.3266-272.Glover，DMandHames，BD(Eds.)，DNACloningAPracticalApproach，Vols1and2，SecondEdition.Grootetal.(1998)Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi，NatureBiotechnology16839-842.Grunstein，M.andHogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961.Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991).Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989).HigginsD.G.，BleasbyA.J.，F(xiàn)uchsR.(1992)CLUSTALVimprovedsoftwareformultiplesequencealignment.Comput.Appl.Biosci.8189-191.HobbsSorMurryLE(1992)inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology，McGrawHill，NewYork，N.Y.，pp191-196.Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA905873-5787(1993).Kerovuo，J.，Lauraeus，M.，Nurminen，P.，Kalkkinen，N.，Apajalahti，J.(1988)Isolation，characterizationandmoleculargenecloning，andsequencingofanovelphytasefromBacillussubtilis.Appl.Environ.Micro.，64，6，2079-2085.Komegay，E.T.，D.M.Denbow，Z.Yi.，andV.Ravindran.1996.ResponseofbroilerstogradedlevelsofNatuphosphytaseaddedtocorn-soybeanmeal-baseddietscontainingthreeIevelsofnonphytatephosphorus.Br.J.Nutr.Leung，D.W.，Chen，E.，andGoeddel，D.V.，1989，Technique111-15.Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)″ApplicationsofnetworkBLASTserver″Meth.Enzymol.266131-141.Myers，R.M.，Lerman，L.S.，andManiatis，T.，1985，Science229242-247.Mitchell，D.B.，Vogel，K.，Weimann，B.J.，Pasamontes，L.andvanLoon，A.P.，Thephytasesubfamilyofhistidineacidphosphatases；isolationofgenesfortwonovelphytasesfromthefungiAspergillusterreusandMyceliophfhorathermophila，Microbiology143(Pt1)，245-252(1997)).Mullis，KaryB.，U.S.PatentNo.4,683,202(1990).Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970).Pasamontes，L.，Haiker，M.，Henriquez-Huecas，M.，Mitchell，D.B.andvanLoon，A.P.，CloningofthephytasesfromEmericellanidulansandthethermophilicfungusTalaromycesthermophilus，Biochim.Biophys.Acta1353(3)，217-223(1997).Pasamontes，L.，Haiker，M.，Wyss，M.，Tessier，M.andvanLoon，A.P.，Genecloning，purification，andcharacterizationofaheat-stablephytasefromthefungusAspergillusfumigatus，Appl.Environ.Microbiol.63(5)，1696-1700(1997).Pearson&Lipman，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA852444(1988).Piddington，C.S.，Houston，C.S.，Paloheimo，M.，Cantrell，M.，Miettinen-Oinonen，A.，Nevalainen，H.&Rambosek，J.(1993).Thecloningandsequencingofthegenesencodingphytase(phy)andpH2.5-optimumacidphosphatase(aph)fromAspergillusnigervar.awamori.Gene133，55-62.Powar，V.K.andJagannathanV.，(1982)J.Bacteriology，151(3)，1102-1108.Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.(1989).MolecularCloning-ALaboratoryManual，2ndEd.ColdSpringHarbourPress.Sanchez，O.andJ.Aguirre.1996.EfficienttransformationofAspergillusnidulansbyelectroporationofgerminatedconidia.FungalGeneticsNewsletter4348-51.Sanger，F(xiàn).，Nilken，S.andCoulson，A.R.(1977).ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA，745463-5467.Schwartz，R.M.&Dayhoff，M.O.(1978)″Matricesfordetectingdistantrelation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背景技術(shù)：
：磷(P)是生長(zhǎng)所必需的元素。常規(guī)家畜飼料(如谷粒、油籽粉、和來源于種子的副產(chǎn)品)中存在的磷相當(dāng)大部分采取了共價(jià)結(jié)合在稱作植酸(肌醇六磷酸)的分子中的磷酸形式。對(duì)于非反芻動(dòng)物如家禽和豬，由于它們?nèi)鄙儆糜趶脑摷〈剂姿岱肿又蟹蛛x出磷的消化酶，這種形式的磷的生物利用率一般很低。非反芻動(dòng)物不能利用肌醇六磷酸的幾個(gè)重要后果可能是值得注意的。例如，當(dāng)為了滿足這些動(dòng)物對(duì)磷的營(yíng)養(yǎng)需求而加入無機(jī)磷(例如磷酸二鈣、脫氟磷酸鹽)或動(dòng)物產(chǎn)品(例如肉和骨粉、魚粉)時(shí)，會(huì)造成開支。此外，肌醇六磷酸還可以在胃腸道內(nèi)結(jié)合或螯合許多礦物質(zhì)(例如鈣、鋅、鐵、鎂、銅)，由此使得它們無法被吸收。再有，飼料中存在的大多數(shù)肌醇六磷酸會(huì)通過胃腸道，引起糞便中磷量的增高。而這將增加環(huán)境的生態(tài)磷負(fù)擔(dān)。相反地，反芻動(dòng)物如牛能容易地利用肌醇六磷酸，這要感謝瘤胃微生物產(chǎn)生的一種稱作肌醇六磷酸酶的酶。肌醇六磷酸酶催化肌醇六磷酸水解為(1)肌醇和/或(2)其單、二、三、四和/或五磷酸酯和(3)無機(jī)磷酸。已知兩種不同類型的肌醇六磷酸酶(1)通常所說的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)和(2)通常所說的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。3-肌醇六磷酸酶首先水解3位的酯鍵，而6-肌醇六磷酸酶首先水解6位的酯健。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將微生物肌醇六磷酸酶作為飼料添加劑可以提高典型非反芻動(dòng)物食物中肌醇六磷酸磷的生物利用率(見例如Cromwell等，1993)。結(jié)果是降低了在動(dòng)物飼料中加入無機(jī)磷的需要，并降低了排出的糞便中磷的水平(見例如Kornegay等，1996)。盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但在飼料工業(yè)中贏得廣泛接受的已知肌醇六磷酸酶幾乎就沒有。其原因因酶而異。典型的有關(guān)問題涉及高生產(chǎn)成本、和/或該酶在期望的施用環(huán)境(例如在飼料加工中、或在動(dòng)物消化道中遇到的pH/溫度)中的低穩(wěn)定性/活性。因此，普遍期望發(fā)現(xiàn)和開發(fā)對(duì)于動(dòng)物飼喂有關(guān)的應(yīng)用而言具有良好穩(wěn)定性和肌醇六磷酸酶活性的新酶，并將發(fā)酵技術(shù)方面的進(jìn)展應(yīng)用于這些酶的生產(chǎn)以便使它們具有商業(yè)可行性。還期望確定能夠用于產(chǎn)生如下更有效的遺傳工程生物的核苷酸序列，所述生物能夠大量地表達(dá)這些肌醇六磷酸酶以適合工業(yè)生產(chǎn)。再有，期望通過遺傳工程開發(fā)使得純化和利用工作量的相對(duì)純酶成為可能的肌醇六磷酸酶表達(dá)系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供來自微生物來源、優(yōu)選來自真菌來源例如青霉屬的種如P.hordei(以前稱多毛青霉(P.hirsutum)；ATCC號(hào)22053)、檜狀青霉(P.piceum)(ATCC號(hào)10519)、或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC號(hào)48944)的、具有肌醇六磷酸酶活性的純化酶。本發(fā)明還提供編碼該酶并含有圖1A-1C之任一個(gè)中所示DNA的多核苷酸序列；編碼圖2所示氨基酸序列的多核苷酸；編碼含有不同于圖2中序列的氨基酸區(qū)段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，條件是該多核苷酸編碼這里所具體描述的肌醇六磷酸酶的衍生物；以及編碼含有不同于圖2中序列的氨基酸區(qū)段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，條件是該多核苷酸可與含有圖1A-1C之任一個(gè)中的全部或部分DNA的DNA在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交。本發(fā)明還提供編碼具有肌醇六磷酸水解活性的酶、并包含圖17所示核苷酸序列的多核苷酸；編碼圖17所示氨基酸序列的多核苷酸；編碼含有與圖17中序列不同的氨基酸區(qū)段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，條件是該多核苷酸編碼這里所具體描述的肌醇六磷酸酶的衍生物；以及編碼含有與圖17中序列不同的氨基酸區(qū)段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，條件是該多核苷酸可與圖17所示核苷酸序列在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交。此外，本發(fā)明還包括含有上述多核苷酸序列的載體、轉(zhuǎn)化了這些多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞、含有這些宿主細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液、以及由這些宿主細(xì)胞表達(dá)的、該多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明多核苷酸采取純化的或分離的形式，并被用于制備能夠產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。此外，作為上述多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物的多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供來自青霉屬真菌來源的、分離的或純化的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核苷酸序列。該真菌來源可以選自例如檜狀青霉(Penicilliumpiceum)和Penicilliumhordei。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該多核苷酸編碼含有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸水解酶，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO4所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或約100％的一致性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供含有如下核苷酸序列的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或約100％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的另一方面提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的分離多核苷酸，其中該酶來自青霉屬(Penicillium)來源。該來源可以選自例如檜狀青霉和Penicilliumhordei。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多核苷酸編碼如下肌醇六磷酸水解酶，其中該酶含有與SEQIDNO4所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，該多核苷酸與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或約100％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的再一方面提供含有如下多核苷酸序列的表達(dá)結(jié)構(gòu)，該多核苷酸序列(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或約100％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。還提供含有該表達(dá)結(jié)構(gòu)的載體(例如質(zhì)粒)，和轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細(xì)胞(例如曲霉屬(Aspergillus)，如黑曲霉(Aspergillusniger)或構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans))。再一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)編碼來自微生物來源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探針，該探針含有(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所公開序列的多核苷酸在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物來源是真菌來源，例如青霉屬的種，如Penicillumhordei或檜狀青霉。此外，本發(fā)明還提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中該酶含有與SEQIDNO4所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或約100％一致性的氨基酸序列。本發(fā)明提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中該酶來自選自Penicilliumhordei和檜狀青霉的真菌來源。本發(fā)明的一個(gè)方面提供分離的肌醇六磷酸酶，其中該酶是從選自檜狀青霉和P.hordei的真菌中獲得的，并具有以下理化性質(zhì)(1)分子量約45-55kDa(未糖基化的)；和(2)專一性肌醇六磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供來源于真菌物種(例如青霉屬，如檜狀青霉和P.hordei)、或由能夠與SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、或圖17的多核苷酸序列在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列編碼的、具有一或多個(gè)以下理化性質(zhì)的酶(1)分子量約45-60kDa(未糖基化的)(基于具有489個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))；(2)對(duì)植酸鹽、植酸或肌醇六磷酸、和/或其低級(jí)磷酸衍生物專一的活性；(3)理論pI為約7-7.6；例如7.3；(4)最適pH處于約4.5-5.5范圍內(nèi)，例如約5；和/或(5)最適環(huán)境溫度為40-45℃，例如42-44℃。本發(fā)明的另一方面提供制備具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供轉(zhuǎn)化了含有本文所述多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；(b)在適于該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生該肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和(c)回收該肌醇六磷酸酶。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該宿主細(xì)胞是曲霉屬種，如黑曲霉或構(gòu)巢曲霉。在另一方面，本發(fā)明提供從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括步驟用含有與SEQIDNO4所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列的酶處理該肌醇六磷酸。本發(fā)明還提供從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括步驟用上文定義的酶處理該肌醇六磷酸。本發(fā)明的另一方面提供含有與圖17所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列的肌醇六磷酸水解酶。本發(fā)明的再一方面提供含有以下核苷酸序列的分離的多核苷酸，該核苷酸序列(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％的一致性，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分離多核苷酸編碼來源于檜狀青霉或Penicilliumhordei的肌醇六磷酸水解酶。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該酶包含與圖17所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，該多核苷酸包含如下核苷酸序列，該核苷酸序列(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％的一致性，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的另一方面提供含有如下多核苷酸的表達(dá)結(jié)構(gòu)，該多核苷酸包含(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供包含該表達(dá)結(jié)構(gòu)的載體(例如質(zhì)粒)，以及轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細(xì)胞(例如黑曲霉或構(gòu)巢曲霉)。此外，本發(fā)明提供用于檢測(cè)編碼來自微生物來源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探針，該探針含有(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與包含圖17中所公開序列的多核苷酸在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物來源是真菌來源，例如青霉屬的種，如P.hordei或檜狀青霉。本發(fā)明還提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中該酶包含與圖17所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列。再有，本發(fā)明提供從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括步驟用(i)具有肌醇六磷酸水解活性并(ii)包含與圖17中所公開氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大約100％一致性的氨基酸序列的酶處理該肌醇六磷酸鹽。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于已分離出多核苷酸，這使得能夠分離其它編碼具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)在于，通過提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，可以利用重組手段制備能夠以相對(duì)大的量產(chǎn)生具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一優(yōu)點(diǎn)是，使具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的商業(yè)應(yīng)用成為可行。例如，本發(fā)明提供摻有本文所述肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料。本發(fā)明的再一優(yōu)點(diǎn)是，提供具有肌醇六磷酸水解酶活性的酶，而且該活性在約40-45℃的溫度下最佳，這使得該酶十分適合在動(dòng)物飼料中使用(即，該酶在作用位置(動(dòng)物的胃中)有高活性)。從以下的詳細(xì)說明，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。附圖簡(jiǎn)述圖1A描述了相應(yīng)于編碼來自Penicilliumhordei的肌醇六磷酸水解酶的基因的核酸序列(SEQIDNO1)，其中突出顯示了以下特征編碼Met的肌醇六磷酸酶ATG起始密碼子(粗體)；內(nèi)含子(小寫字母)；和TAG終止密碼子(粗體)。值得注意的是，該圖顯示了兩個(gè)由120bp長(zhǎng)的5’內(nèi)含子分隔開的外顯子(120bp和1347bp)。圖1B顯示了圖1A中序列起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)之間的連續(xù)區(qū)域(SEQIDNO2)。圖1C以連續(xù)序列的形式顯示了圖1A中序列位于起始密碼子和終止密碼子之間的、除去該120bp內(nèi)含子的區(qū)域(SEQIDNO3)。圖2描述了由圖1核酸序列編碼的氨基酸序列(SEQIDNO4)。圖3和4分別是檜狀青霉和P.hordei的生長(zhǎng)曲線，顯示了隨著時(shí)間的過去培養(yǎng)基中可利用的P對(duì)生長(zhǎng)的影響。圖5A顯示了對(duì)4個(gè)發(fā)表的真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列進(jìn)行的比對(duì)，并指出了用于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物的保守區(qū)域(以黑色邊框突出顯示)。圖5B顯示了對(duì)圖5A的4個(gè)發(fā)表真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列和本發(fā)明P.hordei和檜狀青霉序列(分別是SEQIDNO_和SEQIDNO_)中的序列進(jìn)行的比對(duì)。圖6顯示了發(fā)表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列之間的比對(duì)，由此比對(duì)設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物CS1和CS2。圖中顯示了用于設(shè)計(jì)引物CS1、CS2的保守序列。圖7顯示了與如下氨基酸序列一起進(jìn)行比對(duì)的4個(gè)發(fā)表真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列(i)從采用引物CS1和CS2獲得的PCR產(chǎn)物翻譯的氨基酸序列(第2行，表示為“P.hordei3D”)，和(ii)從獲自第一P.hordei基因組文庫的P.hordei肌醇六磷酸酶基因大約80％(即缺少N端部分)翻譯的氨基酸序列(第1行，表示為“P.hordei”)。圖8給出了一Southern印跡凝膠，該凝膠顯示了含有采用簡(jiǎn)并引物CS1和CS2獲得的PCR產(chǎn)物的探針與各種真菌基因組DNA消化產(chǎn)物之間的雜交；泳道1-大小標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道2-黑曲霉-EcoRI；泳道3-檜狀青霉-EcoRI；泳道4-Penicilliumhordei-EcoRI；泳道5-Penicilliumhordei-BamHI；泳道6-Penicilliumhordei-SalI；泳道7-Penicilliumhordi-KpnI；和泳道8-Penicilliumhordei-SacI。圖9描述了通過構(gòu)建和篩選P.hordei基因組文庫獲得的、稱作CS101的克隆的核酸序列(SEQIDNO_)。CS101在商業(yè)克隆載體pSKII+Bluescript(Stratagene；LaJolla，California)中含有一段來自P.hordei的4.8kb片段。該插入序列中的1.7kb是P.hordei的phyA肌醇六磷酸酶序列，代表了該基因的80％編碼區(qū)(包括3’末端在內(nèi))和下游調(diào)節(jié)區(qū)。圖10顯示了稱作CS158的克隆的5’/N-端核酸序列(SEQIDNO_)和3’/C-端序列(SEQIDNO_)。還顯示了相應(yīng)于每個(gè)核酸序列的推導(dǎo)氨基酸序列(分別是SEQIDNO_和SEQIDNO_)?？寺S158是通過PCR從引物CS201-204的組合制備的。產(chǎn)生了具有適合大小的條帶(圖12)并作了克隆和測(cè)序。推導(dǎo)的氨基酸序列列在下方。粗體顯示初步推導(dǎo)的肌醇六磷酸酶氨基酸序列。CS158的測(cè)序是不完全的，因?yàn)槿鄙僭摶蛑虚g的大約70個(gè)氨基酸。采用重新設(shè)計(jì)的引物重新擴(kuò)增(圖13)，產(chǎn)生了完整序列，該序列經(jīng)分析是肌醇六磷酸酶。CS158的C末端表現(xiàn)出與CS101的C末端100％同源。圖11提供了pGAPT-PG載體的圖解，該載體可以用于在曲霉屬中表達(dá)P.hordei肌醇六磷酸水解酶。圖12顯示了采用如下引物對(duì)推測(cè)的肌醇六磷酸酶基因的PCR擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)分離自P.hordei的基因組肌醇六磷酸酶克隆的序列設(shè)計(jì)的。圖13顯示了采用如下引物對(duì)推測(cè)的肌醇六磷酸酶基因的PCR擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)克隆CS158的肌醇六磷酸酶基因序列設(shè)計(jì)的。圖14顯示了對(duì)轉(zhuǎn)化了P.hordei肌醇六磷酸酶基因的構(gòu)巢曲霉進(jìn)行的Southern印跡分析。圖15顯示了來自P.hordei的肌醇六磷酸酶的pH曲線。圖16顯示了來自P.hordei的肌醇六磷酸酶的溫度-活性曲線。圖17顯示了來自稱作CS142的克隆的檜狀青霉肌醇六磷酸酶853bp片段的完整序列(5’-3’)(SEQIDNO_)、以及推導(dǎo)的氨基酸序列(283個(gè)氨基酸)(SEQIDNO_)。該序列中對(duì)于肌醇六磷酸酶結(jié)構(gòu)和功能重要的基序以及對(duì)于結(jié)構(gòu)重要的Cys殘基以粗體顯示。發(fā)明詳述1.定義除非本文另行定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義。Singleton等，微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典(DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY)，第2版，JohnWileyandSons，紐約(1994)；和Hale和Marham，HarperCollins生物學(xué)詞典(THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY)，HarperPerennial，NY(1991)，為普通技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用許多術(shù)語的一般解釋。盡管與本文所述方法和材料類似或等同的任何方法和材料都可以用于實(shí)施和測(cè)試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選方法和材料。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字本身。除非另行指出，否則分別地核酸按5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列按氨基至羧基方向從左向右書寫。本文給出的標(biāo)題并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明各方面或?qū)嵤┓桨傅南拗疲@些標(biāo)題可以通過完整地參考本說明書產(chǎn)生。因此，以下緊接定義的術(shù)語可以通過完整地參考本說明書獲得更為全面的定義。本文所用術(shù)語“肌醇六磷酸酶”或“肌醇六磷酸酶活性”是指能夠催化肌醇六磷酸水解成(1)肌醇和/或(2)其單、二、三、四和/或五磷酸酯以及(3)無機(jī)磷酸的蛋白質(zhì)或多肽。例如，具有酶學(xué)委員會(huì)EC號(hào)3.1.3.8或EC號(hào)3.1.3.26中定義的催化活性的酶。對(duì)于兩個(gè)核酸或多肽序列，術(shù)語“一致”是指當(dāng)為了獲得最大對(duì)應(yīng)而進(jìn)行比對(duì)時(shí)這兩個(gè)序列中的相同殘基，這可以采用以下序列比較或分析算法之一來測(cè)量?！白罴驯葘?duì)”定義為給出最高百分比一致性分?jǐn)?shù)的比對(duì)。該比對(duì)可以采用多種商業(yè)可獲得序列分析程序進(jìn)行，這些程序有例如采用1的ktup、默認(rèn)參數(shù)和默認(rèn)PAM的局部比對(duì)程序LALIGN。一種優(yōu)選比對(duì)是采用MACVECTOR中的CLUSTAL-W程序進(jìn)行的成對(duì)比對(duì)，該程序利用默認(rèn)參數(shù)，包括10.0的開放斷缺區(qū)罰分(opengappenalty)、0.1的延伸斷缺區(qū)罰分(extendgappenalty)、和BLOSUM30相似性矩陣(similaritymatrix)，以“慢”比對(duì)模式運(yùn)行。如果為了使第一序列與第二序列最佳對(duì)齊而需要在第一序列中插入斷缺區(qū)(gap)時(shí)，則僅采用與相應(yīng)氨基酸殘基配對(duì)的殘基來計(jì)算百分比一致性(即，該計(jì)算不考慮第二序列中位于該第一序列的“斷缺區(qū)”內(nèi)的殘基)。為了進(jìn)行比較，還可以通過例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法(J.Mol.Biol.48443(1970))、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988))、這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA(GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI))、或目測(cè)，進(jìn)行序列的最佳比對(duì)。對(duì)于兩個(gè)氨基酸或多核苷酸序列，“百分比序列一致性”是指當(dāng)這兩個(gè)序列最佳比對(duì)時(shí)這兩個(gè)序列中一致殘基的百分?jǐn)?shù)。因此，80％氨基酸序列一致性意味著在兩個(gè)最佳比對(duì)的多肽序列中有80％的氨基酸是一致的。例如，可以通過以下方式來確定百分比一致性通過比對(duì)序列直接比較兩個(gè)分子之間的序列信息，計(jì)數(shù)這兩個(gè)比對(duì)序列之間匹配殘基的確切數(shù)目，除以較短序列的長(zhǎng)度，然后將此結(jié)果乘以100?？梢圆捎靡子讷@得的計(jì)算機(jī)程序幫助分析，例如ALIGN(Dayhoff，M.O.，《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)匯編》(AtlasofProteinSequenceandStructure)M.O.Dayhoff編，*5Suppl.3353-358，NationalbiomedicalResearchFoundation，Washington，DC)，該程序?qū)mith和Waterman的局部同源性算法(1981)(AdvancesinAppl.Math.2482-489)進(jìn)行了變通以適應(yīng)肽的分析。在Wisconsin序列分析軟件包第8版(可從GeneticsComputerGroup，Madison，WI獲得)中有確定核苷酸序列一致性的程序，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴于Smith和Waterman算法。采用廠家推薦和在以上提及的Wisconsin序列分析軟件包中描述的默認(rèn)參數(shù)，可以容易地利用這些程序。適于確定序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。實(shí)施BLAST分析的軟件可從國(guó)家生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該算法涉及首先通過在查詢序列中確定當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長(zhǎng)度的字進(jìn)行比對(duì)時(shí)符合或滿足某個(gè)正閾值分?jǐn)?shù)T的W長(zhǎng)短字，鑒定出高評(píng)分序列對(duì)(HSP)。這些最初的相鄰匹配字被作為起始點(diǎn)尋找含有它們的更長(zhǎng)HSP。讓這些匹配字沿著正在比較的這兩個(gè)序列的每一個(gè)向兩頭延伸，只要累積比對(duì)分?jǐn)?shù)能夠增加即可。當(dāng)累積比對(duì)分?jǐn)?shù)從獲得的最大值減少量X；累積分達(dá)到零或以下；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)，終止匹配字的延伸。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的敏感度和速度。BLAST程序采用11的字長(zhǎng)(W)、BLOSUM62評(píng)分矩陣(見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))、50的配對(duì)位置顯示(alignments)(B)、10的期望值、M’5、N’-4、和雙鏈比較作為默認(rèn)值。然后BLAST算法進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)分析(見例如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性量度標(biāo)準(zhǔn)是最小總和概率(P(N))，該概率指示了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)發(fā)生匹配的概率。例如，當(dāng)一個(gè)核酸與一個(gè)本發(fā)明肌醇六磷酸酶核酸比較的最小總和概率小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001時(shí)，該測(cè)試核酸被認(rèn)為與本發(fā)明肌醇六磷酸酶核酸相似。在該測(cè)試核酸編碼肌醇六磷酸酶多肽的情況下，如果該比較產(chǎn)生小于約0.5、更優(yōu)選小于約0.2的最小總和概率，則該測(cè)試核酸被認(rèn)為與指定肌醇六磷酸酶核酸相似。因此，對(duì)于兩個(gè)核酸或多肽，短語“基本一致”典型地是指一個(gè)多核苷酸或多肽含有如下序列，當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)在以上描述的程序(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)中與參考序列比較時(shí)，該序列有至少60％的序列一致性、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％。兩個(gè)多肽基本一致的一個(gè)指征是第一多肽與第二多肽有免疫學(xué)交叉反應(yīng)。典型地，由于保守氨基酸替代而有差別的多肽之間有免疫學(xué)交叉反應(yīng)。因此，例如當(dāng)一個(gè)多肽與另一個(gè)多肽僅相差在保守替代時(shí)，這兩個(gè)多肽基本一致。兩個(gè)核酸序列基本一致的另一個(gè)指征是這兩個(gè)分子可在嚴(yán)緊條件(例如中等至高嚴(yán)緊性范圍內(nèi)的條件)下相互雜交?！半s交”包括任何能使核酸的一條鏈通過堿基配對(duì)與一條互補(bǔ)核酸鏈結(jié)合的過程。因此，嚴(yán)格地說，該術(shù)語是指靶序列的互補(bǔ)序列與測(cè)試序列結(jié)合的能力，反之亦然。典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5℃(低于探針Tm5℃)；“高嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者此外，雜交條件可以以雜交和/或一或多次嚴(yán)緊性洗滌的鹽或離子強(qiáng)度條件為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)格一致或近嚴(yán)格一致的核酸序列；而采用高嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列一致性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等的書(并入本文作為參考)中提供了包括中等嚴(yán)緊性和高嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。術(shù)語“分離的”或“純化的”是指一種材料自其最初的環(huán)境(當(dāng)它是天然存在的材料時(shí)例如它的自然環(huán)境)中被分離出來。例如，當(dāng)該材料以比其在天然或野生型生物中存在的濃度高或低的濃度存在于某種組合物中，或是與天然或野生型生物正常不表達(dá)的成分聯(lián)合存在時(shí)，則該材料被認(rèn)為是“純化的”。例如，存在于活動(dòng)物中的天然多核苷酸或多肽不是分離的，但同樣的多核苷酸或多肽當(dāng)它與該自然系統(tǒng)中的部分或全部共存物質(zhì)分開時(shí)則是分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這些多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，而且也是分離的，因?yàn)樵撦d體或組合物并非其自然環(huán)境的組成部分。例如，如果一種核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中基本上只給出一條帶，則該核酸或蛋白質(zhì)被認(rèn)為是純化的。當(dāng)涉及肌醇六磷酸水解酶(肌醇六磷酸酶)時(shí)本文所用術(shù)語“來自”意在不僅指由所討論生物的株系產(chǎn)生的或可產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶，也指由分離自該株系的DNA序列編碼的、在含有該DNA序列的宿主生物體中產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶。此外，該術(shù)語還旨在指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼的、具有所討論肌醇六磷酸酶的辯別性特征的肌醇六磷酸酶。例如，“來自青霉屬的肌醇六磷酸酶”是指由青霉屬天然產(chǎn)生的那些具有肌醇六磷酸酶活性的酶，以及與青霉屬來源產(chǎn)生的那些肌醇六磷酸酶相似、但通過采用遺傳工程技術(shù)由轉(zhuǎn)化了編碼所述肌醇六磷酸酶的核酸的非青霉屬生物產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶。本發(fā)明包括與來自提及的具體微生物菌株的那些肌醇六磷酸水解酶等同的肌醇六磷酸水解酶。文中“等同”是指該肌醇六磷酸水解酶是由能夠與具有圖1A-1C任一個(gè)中所示序列的多核苷酸在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的多核苷酸編碼的。等同意味著該肌醇六磷酸水解酶與具有圖2所公開氨基酸序列(SEQIDNO4)的肌醇六磷酸水解酶相比含有至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的一致性。本發(fā)明還包括本發(fā)明肌醇六磷酸水解酶的突變體、變體和衍生物，只要該突變、變體或衍生肌醇六磷酸水解酶能夠保持天然存在的肌醇六磷酸水解酶的至少一種特征性活性即可。當(dāng)涉及肌醇六磷酸水解酶時(shí)，本文所用術(shù)語“突變體和變體”是指通過改變肌醇六磷酸水解酶的天然氨基酸序列和或結(jié)構(gòu)，例如通過改變?cè)摻Y(jié)構(gòu)基因的DNA核苷酸序列和/或通過直接替代和/或改變?cè)摷〈剂姿崴饷傅陌被嵝蛄泻?或結(jié)構(gòu)，獲得的肌醇六磷酸水解酶。當(dāng)涉及肌醇六磷酸酶時(shí)，術(shù)語“衍生物”或“功能性衍生物”在本文中用于指具有本發(fā)明肌醇六磷酸酶功能性特征的肌醇六磷酸酶衍生物。肌醇六磷酸酶的功能性衍生物包括天然存在的、通過合成或重組產(chǎn)生的如下肽或肽片段、突變體或變體，它們可以含有一或多個(gè)的氨基酸缺失、替代或添加并具有本發(fā)明肌醇六磷酸酶的一般特性。當(dāng)涉及編碼肌醇六磷酸酶的核酸時(shí)，術(shù)語“功能性衍生物”在整個(gè)說明書中用于指具有編碼肌醇六磷酸酶的核酸的功能性特征的核酸衍生物。編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、通過合成或重組產(chǎn)生的如下核酸或其片段、突變體或變體，它們可以含有一或多個(gè)核酸缺失、替代或添加并編碼本發(fā)明特征性的肌醇六磷酸酶。編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶的核酸變體包括等位基因和基于本領(lǐng)域已知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性的變體。編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶的核酸突變體包括通過定點(diǎn)誘變技術(shù)(見例如，Botstein，D.和Shortle，D.，1985，科學(xué)(Science)2291193-1201；和Myers，R.M.，Lerman，L.S.，和Maniatis，T.，1985，科學(xué)229242-247)、易出錯(cuò)PCR(error-pronePCR)(見例如Leung，D.W.，Chen，E.，和Goeddel，D.V.，1989，技術(shù)(Technique)111-15；Eckert，K.A.和Kunkel，T.A.，1991，PCR方法應(yīng)用(PCRMethodsApplic.)117-24；和Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，1992，PCR方法應(yīng)用228-33)和/或本領(lǐng)域已知的化學(xué)誘導(dǎo)的誘變技術(shù)(見例如Elander，R.P.，微生物鑒別、篩選和菌株改良，《基礎(chǔ)生物技術(shù)》(BasicBiotechnology)，J.Bullock和B.Kristiansen編，AcademicPress，紐約，1987，217)產(chǎn)生的突變體。“表達(dá)載體”指含有如下DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)，該DNA序列被可操作地與能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在適合宿主中表達(dá)的適合控制序列連接在一起。這些控制序列可以包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、可選擇的控制該轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列、編碼mRNA上的適合核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。對(duì)于不同的表達(dá)載體優(yōu)選與不同的細(xì)胞類型一起使用。對(duì)于在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中使用的載體，優(yōu)選的啟動(dòng)子是AprE啟動(dòng)子；在大腸桿菌(E.coli)中使用的優(yōu)選啟動(dòng)子是Lac啟動(dòng)子，而在黑曲霉中使用的優(yōu)選啟動(dòng)子是glaA。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒、或僅是一個(gè)潛在的基因組插入片段。一旦通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入適合宿主后，載體可以獨(dú)立于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和發(fā)揮功能，或可以在適當(dāng)條件下自身整合入基因組中。在本說明書中，質(zhì)粒和載體有時(shí)可互換使用。然而，本發(fā)明旨在包括本領(lǐng)域已知的或正在為本領(lǐng)域已知的、起著同等功能的其它形式表達(dá)載體。因此，可以采用多種宿主/表達(dá)載體組合來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。例如，有用的表達(dá)載體可以由染色體的、非染色體的和合成的DNA序列片段組成，例如各種已知的SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒(如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括colE1、pCR1、pBR332、pMb9、pUC19和它們的衍生物)、宿主范圍較寬的質(zhì)粒(例如RP4)、噬菌體DNA(例如λ噬菌體的多種衍生物如NM989，和其它DNA噬菌體如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體)、酵母質(zhì)粒(例如2μ質(zhì)粒或其衍生物)、真核細(xì)胞中使用的載體(例如動(dòng)物細(xì)胞中使用的載體)、和來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體(例如經(jīng)修飾采用了噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒)。使用本發(fā)明表達(dá)載體的表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，一般描述于例如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloningALaboratoryManual)，第2版，ColdSpringHarborPress(1989)。通常，含有本發(fā)明DNA序列的這些表達(dá)載體通過借助整合事件直接插入特定物種的基因組中來轉(zhuǎn)化單細(xì)胞宿主(見例如Bennett和Lasure，更多的真菌基因操作(MoreGeneManipulationsinFungi)，AcademicPress，SanDiego，第70-76頁(1991)，以及其中引用的描述在真菌宿主中進(jìn)行定向基因組插入的文章，這些均被并入本文作為參考)?！八拗髦辍被颉八拗骷?xì)胞”是指對(duì)含有本發(fā)明DNA的表達(dá)載體適合的宿主。在本發(fā)明中有用的宿主細(xì)胞一般是可以在其中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的原核或真核宿主，包括任何可轉(zhuǎn)化微生物。例如，宿主株可以是枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)、Trichodermalongibrachiatum、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉。采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不僅能夠復(fù)制編碼肌醇六磷酸酶和其變體(突變體)的載體，而且能夠表達(dá)該目的肽產(chǎn)物。適合表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞、如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyces)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)；真菌細(xì)胞，如曲霉屬和青霉屬；昆蟲細(xì)胞例如果蠅(Drosophila)和粘蟲(Spodoptera)Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS、HEK293或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞，等。從本文的敘述，適合宿主的選擇被認(rèn)為屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明并不受所用具體宿主細(xì)胞的限制。II.肌醇六磷酸酶和編碼肌醇六磷酸酶的核酸本發(fā)明的一個(gè)方面提供能夠催化肌醇六磷酸水解并釋放出無機(jī)磷酸的蛋白質(zhì)或多肽；例如具有酶學(xué)委員會(huì)EC3.1.3.8或EC3.1.3.26中所定義的催化活性的酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通常所說的3-肌醇六磷酸酶。此外，本發(fā)明還包括編碼這些肌醇六磷酸水解蛋白或多肽的多核苷酸(例如DNA)。優(yōu)選地，本發(fā)明肌醇六磷酸酶和/或編碼該肌醇六磷酸酶的多核苷酸來自真菌，更優(yōu)選來自厭氧真菌、更優(yōu)選來自青霉屬的種，例如Penicilliumhordei或檜狀青霉。因此，我們考慮，本發(fā)明肌醇六磷酸酶和/或編碼該肌醇六磷酸酶的DNA可以來自犁頭霉屬的種(Absidiaspp.)；支頂孢屬的種(Acremoniumspp.)；放線菌屬的種(Actinomycetesspp.)；蘑菇屬的種(Agaricusspp.)；Anaeromycesspp.；曲霉屬的種(Aspergillusspp.)，包括A.auculeatus、泡盛曲霉(A.awamori)、黃色曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、丁烯二酸曲霉(A.fumaricus)、煙曲霉(A.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)和雜色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；頭孢屬的種(Cephalosporumspp.)；毛殼霉屬的種(Chaetomiumspp.)；鬼傘屬的種(Coprinusspp.)；Dactyllumspp.；鐮孢霉屬(Fusariumspp)，包括F.conglomerans、多隔鐮孢(F.decemcellulare)、爪哇鐮孢(F.javanicum)、亞麻鐮孢(F.lini)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)和茄病鐮孢(F.solani)；膠霉屬的種(Gliocladiumspp.)；腐質(zhì)霉屬的種(Humicolaspp.)，包括H.insolens和H.lanuginosa；毛霉屬的種(Mucorspp.)；鏈孢霉屬的種(Neurosporaspp.)，包括粗糙鏈孢霉(N.crassa)和嗜食鏈孢霉(N.sitophila)；Neocallimastixspp.；Orpinomycesspp.；青霉屬的種(Penicilliumspp.)；Phanerochaetespp.；射脈菌屬的種(Phlebiaspp.)；Piromycesspp.；假單胞菌屬的種(Pseudomonasspp.)；根霉屬的種(Rhizopusspp.)；裂褶菌屬的種(Schizophyllumspp.)；鏈霉菌屬的種(Streptomycesspp.)；栓菌屬的種(Trametesspp.)；和木霉屬的種(Trichodermaspp.)，包括T.reesei、T.longibrachiatum和綠色木霉(T.viride)；和接霉屬的種(Zygorhynchusspp.)。類似地，我們預(yù)料本文所述肌醇六磷酸酶和/或編碼肌醇六磷酸酶的DNA可以來源于細(xì)菌例如鏈霉菌屬的種(Streptomycesspp.)，包括橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(S.olivochromogenes)；尤其是纖維降解瘤胃細(xì)菌(fiberdegradingruminalbacteria)例如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)；和酵母包括Candidatorresii、近平滑假絲酵母(C.parapsllosis)、清酒假絲酵母(C.sake)、涎沫假絲酵母(C.zeylanoides)、Pichiaminuta、膠粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、粘性紅酵母(R.mucilaginosa)、和不對(duì)稱擲孢酵母(Sporobolomycesholsaticus)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明肌醇六磷酸酶和/或編碼該肌醇六磷酸酶的多核苷酸來源于(i)谷物變質(zhì)真菌(grain-spoilagefungal)，例如Penicilliumhordei、檜狀青霉或短密青霉；或(ii)與樹根相關(guān)的外生菌根真菌(ectomycorrhizalfungus)，例如漆蠟?zāi)?Laccarialaccata)、Laccariarufus、卷邊樁菇(Paxillusinvolutus)、大毒粘滑菇(Hebelomacrustuliniforme)、赭蓋鵝膏(Amanitarubescens)、或哈蟆菌(Amanitamuscaria)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明肌醇六磷酸酶和/或編碼該肌醇六磷酸酶的多核苷酸以純化形式存在，即以比其在天然或野生型生物中的濃度高或低的濃度存在于某種組合物中，或是與天然或野生型生物中正常不表達(dá)產(chǎn)生的成分聯(lián)合存在。本發(fā)明包括與具有圖2所公開氨基酸序列(SEQIDNO4)的肌醇六磷酸水解酶相比較含有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％一致性的肌醇六磷酸水解蛋白和肽。本發(fā)明還包括編碼來自真菌來源如青霉屬種的肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸如DNA，這些多核苷酸包含與圖1A-1C之任一個(gè)中所公開多核苷酸序列有至少65％一致性、至少70％一致性、至少75％一致性、至少80％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、和至少95％一致性的序列，只要該多核苷酸編碼的酶能夠催化肌醇六磷酸水解并釋放無機(jī)磷酸即可。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸具有圖1A-1C之任一個(gè)中所示的多核苷酸序列，或能夠與圖1A-1C之任一個(gè)中所示的多核苷酸序列雜交，或與它們互補(bǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有多種多核苷酸可以編碼圖2所公開的肌醇六磷酸水解酶(SEQIDNO4)。本發(fā)明包括所有這些多核苷酸。III.獲得編碼肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸編碼肌醇六磷酸水解酶的核酸可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序從例如克隆化DNA(例如DNA“文庫)獲得，或通過化學(xué)合成、cDNA克隆、PCR、或基因組DNA或其片段的克隆獲得、或從期望細(xì)胞如真菌物種中純化(見例如Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarobr，紐約；Glover，DM和Hames，BD(編)，《DNA克隆實(shí)踐方法》(DNACloningAPracticalAprroach)，第1和2卷，第2版)。來源于基因組DNA的核酸序列可以含有編碼區(qū)以及調(diào)節(jié)區(qū)。當(dāng)從基因組DNA分子克隆該基因時(shí)，制備其中一些將含有該目的基因至少一部分的DNA片段?？梢圆捎酶鞣N限制性酶在特異位點(diǎn)切割DNA?；蛘?，可以采用DNA酶在錳存在時(shí)使DNA片段化，或可以通過物理方法例如超聲剪切DNA。然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR和柱層析，根據(jù)大小分離這些線性DNA片段。一旦核酸片段產(chǎn)生后，可以按多種方式確定編碼肌醇六磷酸水解酶的具體DNA片段。例如，可以對(duì)本發(fā)明的肌醇六磷酸水解酶編碼基因或其特定RNA、或它們的片段如探針或引物，進(jìn)行分離和標(biāo)記，然后用于雜交試驗(yàn)中以鑒定產(chǎn)生的基因。(Benton，W.和Davis，R.，1977，科學(xué)196180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961)。與探針具有大體序列相似性的那些DNA片段將在中等至高嚴(yán)緊性條件下發(fā)生雜交。本發(fā)明包括通過核酸雜交技術(shù)采用SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3、或它們的合適部分或片段(例如至少約10-15個(gè)連續(xù)核苷酸)作為探針或引物篩選基因組或cDNA來源的核酸而鑒定出的、來源于真菌物種(尤其是青霉屬種)的肌醇六磷酸水解酶。編碼來自青霉屬種的肌醇六磷酸水解酶、并與SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3、或它們的部分或片段有至少65％一致性的核酸，可以通過采用探針，即SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的部分或片段，進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供檢測(cè)編碼本發(fā)明肌醇六磷酸水解酶的核酸的方法，該方法包括用基因組或cDNA來源的青霉屬核酸與SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的全部或部分核酸序列進(jìn)行雜交。能夠與SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的多核苷酸序列，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交條件以Berger和Kimmel所教授的核酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)為基礎(chǔ)(1987，分子克隆技術(shù)指導(dǎo)，《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)，第152卷，AcademicPress，SanDiegoCA)(該文獻(xiàn)并入本文作為參考)，并給予了確定的嚴(yán)緊性。在該實(shí)施方案中，典型地，“最大嚴(yán)緊性”發(fā)生在約Tm-5℃(探針Tm以下5℃)；“高嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等”或“中間嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。最大嚴(yán)緊性雜交可以用于確定或檢測(cè)一致或近一致的多核苷酸序列，而中間或低嚴(yán)緊性雜交可以用于確定或檢測(cè)多核苷酸序列同源物。在另一實(shí)施方案中，嚴(yán)緊性由雜交后采用的洗滌條件來確定。對(duì)于此實(shí)施方案，“低嚴(yán)緊性”條件包括采用0.2×SSC/0.1％SDS溶液于20℃洗滌15分鐘?！皹?biāo)準(zhǔn)嚴(yán)緊性”條件包括再一個(gè)洗滌步驟采用0.2×SSC/0.1％SDS溶液于37℃洗滌30分鐘。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中采用的擴(kuò)增方法描述于DieffenbachCW和GSDveksler(1995，《PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(PCRPrime，aLaboratoryManual)，ColdSpringHarborPress，Plainview，NY)。具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3的至少約10個(gè)核苷酸以及多達(dá)約60個(gè)核苷酸，優(yōu)選約12-30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選約25個(gè)核苷酸的核酸序列可以被用作探針或PCR引物。從cDNA或基因組文庫中分離本發(fā)明核酸結(jié)構(gòu)的一個(gè)優(yōu)選方法是利用根據(jù)具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列制備的簡(jiǎn)并性寡核苷酸探針進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。例如，可以采用美國(guó)專利4,683,202中所述技術(shù)進(jìn)行此PCR。鑒于上述描述，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于從其它物種，尤其是從真菌(例如谷物變質(zhì)真菌，或外生菌根真菌)中獲得編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的多核苷酸的一致性或同源性片段，圖1A-1C中提供的多核苷酸序列是有用的。IV.肌醇六磷酸水解酶的表達(dá)和回收本發(fā)明多核苷酸序列可以通過可操作地與適當(dāng)表達(dá)載體中的表達(dá)控制序列相連來實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并且可以在該表達(dá)載體中用于根據(jù)本領(lǐng)域的成熟技術(shù)轉(zhuǎn)化適合宿主。由本發(fā)明DNA序列表達(dá)產(chǎn)生的多肽可以從發(fā)酵細(xì)胞培養(yǎng)物中分離，并根據(jù)本領(lǐng)域成熟技術(shù)以多種途徑進(jìn)行純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇最為適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化技術(shù)。更具體地，本發(fā)明提供用于制備微生物(例如青霉屬種)來源的肌醇六磷酸水解酶的宿主細(xì)胞、表達(dá)方法和系統(tǒng)。一旦獲得編碼本發(fā)明肌醇六磷酸水解酶的核酸后，即可采用本領(lǐng)域熟知技術(shù)構(gòu)建含有該核酸的重組宿主細(xì)胞。分子生物學(xué)技術(shù)公開于Sambrook等，《分子生物學(xué)克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得與圖1A-1C之任一個(gè)的核酸或其功能性衍生物有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、和至少95％的一致性、或能夠在中間至高嚴(yán)緊性條件下與圖1A-1C之任一個(gè)的核酸雜交、或與圖1A-1C之任一個(gè)的核酸互補(bǔ)的、編碼來自青霉屬種的肌醇六磷酸水解酶的核酸，并經(jīng)采用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中。編碼肌醇六磷酸水解酶的核酸可以含有能夠使該編碼肌醇六磷酸酶獲得分泌的前導(dǎo)序列。根據(jù)該肌醇六磷酸酶是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)還是進(jìn)行分泌，可以改造本發(fā)明的DNA序列或表達(dá)載體，以便表達(dá)帶有或不帶有信號(hào)序列的肌醇六磷酸酶成熟形式，其中所述信號(hào)序列是天然肌醇六磷酸酶信號(hào)序列、或是在真菌(如黑曲霉)、其它原核或真核生物中起作用的信號(hào)序列。還可以通過除去或部分除去所述信號(hào)序列來進(jìn)行表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種適合于在真菌、酵母、細(xì)菌、昆蟲和植物細(xì)胞中進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化和表達(dá)的載體以及轉(zhuǎn)化和表達(dá)盒。典型地，載體或盒含有指導(dǎo)該核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選擇標(biāo)記、以及允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體含有包含轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5’區(qū)、和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3’區(qū)。這些控制區(qū)可以來源于與宿主同源或異源的基因，只要所選控制區(qū)能夠在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能即可。用于驅(qū)動(dòng)肌醇六磷酸水解酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。將編碼肌醇六磷酸水解酶的核酸可操作地通過起始密碼子與為了有效表達(dá)該酶而選擇的表達(dá)控制區(qū)連接。一旦構(gòu)建了適合的盒，就可以使用它們轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。當(dāng)采用植物表達(dá)載體時(shí)，編碼肌醇六磷酸酶的序列可以由多種啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)表達(dá)。例如，可以單獨(dú)或聯(lián)合TMV的ω前導(dǎo)序列(Takamatsu等(1987)EMBOJ6307-311)使用病毒啟動(dòng)子如CaMV的35S和19S啟動(dòng)子(Brisson等(1984)自然(Nature)310511-514)?；蛘撸梢圆捎弥参飭?dòng)子例如核酮糖二磷酸羧化加氧酶小亞基的啟動(dòng)子(Coruzzi等(1984)EMBOJ31671-1680；Broglie等(1984)科學(xué)224838-843)；或熱休克啟動(dòng)子(WinterJ和SinibaldiRM(1991)ResultsProblCellDiffer1785-105)。這些結(jié)構(gòu)可以通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染進(jìn)入植物細(xì)胞中。關(guān)于這些技術(shù)的綜述，見HobbsS或MurryLE(1992)《McGrawHill科學(xué)和技術(shù)年鑒》(McGrawHillYearbookofScienceandTechnology)，McGrawHill，紐約，N.Y.，第191-196頁；或Weissbach和Weissbach(1988)植物分子生物學(xué)方法(MethodsforPlantMolecularBiology)，AcademicPress，紐約，N.Y.，第421-463頁。一般轉(zhuǎn)化方法參見《當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(第1卷，Ausubel等編，JohnWiley&Sons，Inc.1987，第9章)，它們包括磷酸鈣法、采用PEG和電穿孔進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。對(duì)于曲霉屬和木霉屬(Trichoderma)，可以采用PEG和鈣介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Finkelstein，DB1992轉(zhuǎn)化，《絲狀真菌的生物技術(shù)，技術(shù)和產(chǎn)品》(BiotechnologyofFilamentousFungi.TechnologyandProducts)(Finkelstein和Bill編)113-156)。原生質(zhì)體的電穿孔公開于Finkelestein，DB1992轉(zhuǎn)化，《絲狀真菌的生物技術(shù)，技術(shù)和產(chǎn)品》(Finkelstein和Bill編)113-156。對(duì)分生孢子的微粒轟擊公開于Fungaro等(1995)通過微粒轟擊完整分生孢子轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters125293-298。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化公開于Groot等(1998)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)16839-842。對(duì)于酵母屬的轉(zhuǎn)化，乙酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和PEG及鈣介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及電穿孔技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。含有本發(fā)明肌醇六磷酸水解酶的編碼序列并表達(dá)該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來鑒定。這些方法包括，但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白質(zhì)生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)，這些技術(shù)包括了用于檢測(cè)和/或定量核酸或蛋白質(zhì)的基于膜的、基于溶液的、或基于芯片的技術(shù)。還應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明考慮了本文所述肌醇六磷酸酶的體外表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分離并在黑曲霉中表達(dá)編碼來自Penicilliumhordei(ATCC22053)的肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸序列，而另一個(gè)實(shí)施方案中該多核苷酸序列在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)的肌醇六磷酸酶然后可以按例如以下所述回收。本發(fā)明肌醇六磷酸酶可以從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物中回收。如果是膜結(jié)合形式的，可以采用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┤芤?例如Triton-X100)或酶學(xué)切割使其從膜中釋放出來。用于表達(dá)肌醇六磷酸酶的細(xì)胞可以通過多種物理或化學(xué)手段，例如凍融循環(huán)、超聲、機(jī)械破碎、或細(xì)胞裂解試劑，進(jìn)行破碎?？赡芷谕麖闹亟M細(xì)胞的蛋白質(zhì)或多肽中純化該肌醇六磷酸酶。以下方法是適當(dāng)純化方法的例子離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀；反向HPLC；在硅或陽離子交換樹脂如DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；采用如SephadexG-75進(jìn)行的凝膠過濾；去除雜質(zhì)的A蛋白Sepharose柱；以及結(jié)合帶表位標(biāo)志的肌醇六磷酸酶形式的金屬螯合柱。可以采用多種蛋白純化方法，這些方法是本領(lǐng)域已知的，描述于例如Deutscher，酶學(xué)方法，182(1990)；Scopes，蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐(ProteinPurificationPrinciplesandPractice)，Springer-Verlag，紐約(1982)。所用純化步驟將取決于例如所用制備方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶的具體形式。V.肌醇六磷酸水解酶的應(yīng)用本文所述肌醇六磷酸酶和其衍生物可以在期望從肌醇六磷酸中分離出磷的多種應(yīng)用中使用。以下給出了幾個(gè)應(yīng)用的例子。例如，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明肌醇六磷酸酶的細(xì)菌細(xì)胞或孢子用作益生菌或直接飼喂的微生物產(chǎn)品的應(yīng)用。所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案是本發(fā)明的產(chǎn)肌醇六磷酸酶曲霉屬種。此外，本發(fā)明還考慮到本文所述肌醇六磷酸酶在食物或動(dòng)物飼料中的用途。本發(fā)明提供含有本文所述肌醇六磷酸酶的食物或動(dòng)物飼料。優(yōu)選地，所述食物或動(dòng)物飼料含有在家畜如家禽和豬、以及飼養(yǎng)的水生動(dòng)物包括魚和蝦的消化道中、優(yōu)選嗉囊和/或小腸中有活性的肌醇六磷酸酶作為添加劑。優(yōu)選地，所述添加劑在食物或飼料的加工中也有活性。此外，本發(fā)明還提供含有能夠表達(dá)本文所述肌醇六磷酸酶的細(xì)胞或孢子的食物或動(dòng)物飼料。而且，本發(fā)明考慮到制備食物或動(dòng)物飼料的方法，其特征在于將根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與所述食物或動(dòng)物飼料混合。所述肌醇六磷酸酶以干品形式在加工前，或以液體形式在加工前或后加入。根據(jù)一個(gè)采用了干粉的實(shí)施方案，該酶以液體形式被稀釋在干載體如碾碎的顆粒上。本發(fā)明還提供制備食物或動(dòng)物飼料的方法，其特征在于向所述食物或動(dòng)物飼料中加入能夠表達(dá)本發(fā)明肌醇六磷酸酶的細(xì)胞和/或孢子。而且，本發(fā)明提供帶有或不帶有附加磷酸酶的本文所述肌醇六磷酸酶用于產(chǎn)生肌醇和無機(jī)磷酸，以及肌醇六磷酸的中間物的用途。本發(fā)明還提供降低動(dòng)物糞肥中磷水平的方法，其特征在于按能有效轉(zhuǎn)化動(dòng)物飼料中所含肌醇六磷酸的量給動(dòng)物飼喂根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料。還可以將本發(fā)明肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸來源的中間物用于谷粒濕磨、清潔和個(gè)人保護(hù)品、及紡織品加工中。我們提供以下實(shí)施例僅是為了舉例說明，而無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本說明書中引用的所有參考專利和文獻(xiàn)均特此完整地并入本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1液體培養(yǎng)物中肌醇六磷酸水解活性的證據(jù)在含有各種濃度無機(jī)磷酸鹽的指定培養(yǎng)基中培養(yǎng)檜狀青霉(ATCC10519)和P.hordei(ATCC22053)，然后測(cè)定和比較生長(zhǎng)特征和肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生。采用孢子懸浮液(2×106個(gè)孢子/ml的終濃度)接種極限培養(yǎng)基(Vogels)，對(duì)該培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度進(jìn)行改變以觀察這將如何影響生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生。培養(yǎng)物于25℃(P.hordei)或30℃(檜狀青霉)在50ml培養(yǎng)基中通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)。在24、48、72和96小時(shí)收獲培養(yǎng)物。采用Fiske和SubbaRow的方法測(cè)定培養(yǎng)物上清液的肌醇六磷酸酶活性。通過干重(P.hordei)或OD讀數(shù)(檜狀青霉)確定生長(zhǎng)情況。1A.不同培養(yǎng)基條件對(duì)生長(zhǎng)和形態(tài)的影響制備一系列青霉屬生長(zhǎng)曲線，例如圖3的檜狀青霉生長(zhǎng)曲線和圖4的P.hordei生長(zhǎng)曲線，觀察培養(yǎng)基中可利用P對(duì)生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶產(chǎn)生的影響。當(dāng)P水平降低至0.57mM(生長(zhǎng)曲線的1/64P[圖3])時(shí)，尤其是對(duì)于檜狀青霉，可觀察到在真菌生長(zhǎng)中出現(xiàn)與壓力條件相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變(例如菌絲體片段化、形成沉淀、異質(zhì)生長(zhǎng)(heterogeneousgrowth)和整體出現(xiàn)蒼白的黃色)。此生理學(xué)菌株與生長(zhǎng)曲線中接近晚指數(shù)期時(shí)(48小時(shí)；見下表1)肌醇六磷酸酶活性的出現(xiàn)有關(guān)。在培養(yǎng)24小時(shí)后補(bǔ)加1mM肌醇六磷酸作為磷源的同一低P(0.57mM)培養(yǎng)物中也觀察到肌醇六磷酸利用的形態(tài)學(xué)證據(jù)。在沒有加入肌醇六磷酸時(shí)觀察到的形態(tài)學(xué)改變并不明顯，事實(shí)上這些補(bǔ)加了肌醇六磷酸的樣品與P不受限制的較高P培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物類似。這清楚地表明產(chǎn)生了肌醇六磷酸特異性水解活性以致能夠給正在生長(zhǎng)的真菌提供P。然而，當(dāng)補(bǔ)加5mM肌醇六磷酸鹽時(shí)，培養(yǎng)物不生長(zhǎng)，這提示培養(yǎng)基中此水平的肌醇六磷酸會(huì)與必需礦物質(zhì)螯合從而導(dǎo)致培養(yǎng)基不能支持真菌的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)。在示例性的P.hordei研究中，培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基中含有·高磷酸鹽(1.14mM)·低磷酸鹽(0.57mM)·低磷酸鹽加上1mM的補(bǔ)加肌醇六磷酸在0、24、48、72和96小時(shí)內(nèi)通過于重測(cè)量監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)，并觀察響應(yīng)不同培養(yǎng)基條件出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)特征。以下為主要的觀察結(jié)果和結(jié)論1.高磷酸鹽中有預(yù)期的良好生長(zhǎng)，一致的真菌形態(tài)指示是健康培養(yǎng)物。2.在低磷酸鹽條件下生長(zhǎng)明顯較差，真菌形態(tài)不均一，有聚集和菌絲體片段化的跡象。培養(yǎng)物表現(xiàn)出病態(tài)黃色。3.與(2)類似的培養(yǎng)物當(dāng)補(bǔ)加肌醇六磷酸(底物)后看上去不再象處于同樣的生理壓力下。生物量的生長(zhǎng)與條件(1)相似，并且真菌的形態(tài)與高磷酸鹽條件下的真菌相同。4.這些培養(yǎng)物的生長(zhǎng)曲線和攝像證據(jù)支持了這些觀察，整體而言的主要結(jié)論是我們?cè)跅l件(3)中觀察到肌醇六磷酸鹽水解活性，該活性使得真菌可以從肌醇六磷酸中獲得磷酸鹽并由此防止該培養(yǎng)物正遭受的磷酸鹽饑餓壓力。1B.培養(yǎng)物上清液中的肌醇六磷酸酶活性下表1顯示了檜狀青霉培養(yǎng)物上清液中的肌醇六磷酸酶活性。表1還顯示了在同樣條件下于Vogels1/64P(0.57mM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、作為肌醇六磷酸酶活性對(duì)照的黑曲霉培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)。我們可以觀察到，黑曲霉培養(yǎng)物表現(xiàn)出與檜狀青霉培養(yǎng)物類似的水平。表1.在含有不同水平無機(jī)P的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真菌培養(yǎng)物上清液的肌醇六磷酸酶活性對(duì)這些樣品在接種后48小時(shí)檢測(cè)到的活性作比較。肌醇六磷酸酶活性表示為每ml培養(yǎng)物上清液每分鐘釋放的μmolP量。樣品的活性根據(jù)三份相同的培養(yǎng)瓶計(jì)算，培養(yǎng)瓶中的上清液進(jìn)行了重復(fù)兩次的肌醇六磷酸酶測(cè)定?；钚燥@示為平均值±SD，n＝6。檜狀青霉*和檜狀青霉**是指來自兩個(gè)獨(dú)立時(shí)程實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。因此，明顯的生理壓力與磷酸鹽受限的培養(yǎng)物相關(guān)，這對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響，并且該生理壓力與肌醇六磷酸酶活性的出現(xiàn)聯(lián)系在一起。1C.培養(yǎng)物上清液的濃縮肌醇六磷酸酶活性的另一證據(jù)可以指望從濃縮的上清液(濃縮的蛋白質(zhì))中得到。例如，可以從以下物質(zhì)中獲得濃縮的蛋白樣品1.壓力和低磷酸鹽條件下的青霉屬培養(yǎng)物(此處預(yù)期將表達(dá)肌醇六磷酸酶)，2.高磷酸鹽和無壓力條件下的青霉屬培養(yǎng)物，此處預(yù)期將不產(chǎn)生肌醇六磷酸酶，和3.補(bǔ)加低磷酸鹽和補(bǔ)充的肌醇六磷酸的培養(yǎng)物。這些濃縮蛋白樣品的銀染SDS-PAGE凝膠預(yù)期將顯示一個(gè)蛋白質(zhì)分布圖，其中在來自條件1(上面)的濃縮蛋白中會(huì)出現(xiàn)一條蛋白帶(推測(cè)的肌醇六磷酸酶條帶)，而此條帶在條件2中不存在。預(yù)期條件3中也會(huì)出現(xiàn)類似的該條帶，盡管水平較低。基于P.hordei肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，并基于其表現(xiàn)為是一種細(xì)胞外酶的這一事實(shí)，該蛋白質(zhì)的預(yù)期大小為約50kDa。然而，應(yīng)當(dāng)注意，在該細(xì)胞外酶上的糖基化修飾可以使該MW增加至60-90kDa。實(shí)施例2肌醇六磷酸酶基因片段的PCR擴(kuò)增2A.簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)基于發(fā)表的肌醇六磷酸酶氨基酸序列的比對(duì)，設(shè)計(jì)了許多針對(duì)保守的結(jié)構(gòu)和催化區(qū)的簡(jiǎn)并引物。這些區(qū)域包括在肌醇六磷酸酶中高度保守的那些區(qū)域，以及已知對(duì)于酶的結(jié)構(gòu)和功能重要的那些區(qū)域。在一項(xiàng)研究中，對(duì)4個(gè)發(fā)表的肌醇六磷酸酶氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)。這些肌醇六磷酸酶序列來自(i)黑曲霉(定義黑曲霉phyA基因；ACCESSIONZ16414；vanHartingsveldt，W.等，1992)；(ii)煙曲霉(定義煙曲霉肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59804；Pasamontes，L.等1997)；(iii)土曲霉(定義土曲霉9A1肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59805；Mitchell，D.B.等1997)；和(iv)Myceliophtorathermophilus(定義Myceliophthorathermophila肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59806；Mitchell，D.B.等1997)。應(yīng)當(dāng)注意，所有這些序列均可從GENbank公開獲得，每個(gè)都被并入本文作為參考。選擇了符合以上標(biāo)準(zhǔn)的5個(gè)特定區(qū)域，然后從這些氨基酸序列設(shè)計(jì)了一些正向和反向引物。用于設(shè)計(jì)這些引物的具體氨基酸區(qū)域在圖5的蛋白序列比對(duì)中以黑框標(biāo)明。根據(jù)密碼子選擇使用遺傳密碼，由MWG-Biotech公司合成簡(jiǎn)并核苷酸PCR引物。在另一研究中，僅從發(fā)表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列設(shè)計(jì)了稱作CS1和CS2的一對(duì)引物。這些引物的設(shè)計(jì)如下·引物CS1正向(5’-3’)引物，來自RHGARYPT區(qū)(見圖5，第約110-120位氨基酸)，該區(qū)是phyA肌醇六磷酸酶的磷酸結(jié)合域，是催化活性所必需的?！ひ顲S2反向引物，來自FT(H/Q)DEW(I/V)區(qū)(見圖5，第約335-345位氨基酸)，該區(qū)是肌醇六磷酸酶的中央?yún)^(qū)域，似乎具有相對(duì)好的保守性。這些引物的序列見下CS15’CGICAT/CGGIGCICGITAT/CCC3’CS23’AAA/GTGIGTICTA/GCTT/CACCT/CAI5’CS25’AC/TCCAC/TTCG/ATCITGIGTG/AAA3’由于所有引物均按5’-3’方向合成，故反向引物按粗體表示的CS2制備。采用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼將氨基酸改為三聯(lián)密碼子，對(duì)于混合的堿基位置采用標(biāo)準(zhǔn)IUB密碼(例如將A/C/T/G命名為I)。關(guān)于引物CS1和CS2設(shè)計(jì)的其它細(xì)節(jié)，我們現(xiàn)在將參考圖6進(jìn)行描述。圖6顯示了發(fā)表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列，引物CS1和CS2即是從這些序列設(shè)計(jì)的。具體地，進(jìn)行比對(duì)的序列來自1Piddington等，1993(A.nigervar.awamori的Phya和Phyb)、2vanHartingsveldt等，1993(黑曲霉的Phya)、3Erlich等，1993(黑曲霉的PhyB)。圖1的比對(duì)采用3.5版PHYLIP軟件包的CLUSTALV(HigginsD.G.等，1992)進(jìn)行。圖中顯示了用于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CS1和CS2的保守序列。我們可以從圖6的比對(duì)中觀察到，PhyA和PhyB的磷酸結(jié)合域十分保守，在PhyA(RHGARYP；vanHartingsveldt等，1993)和PhyB(RHGERYP；Piddington等，1993)之間僅有單個(gè)氨基酸的差異。簡(jiǎn)并引物CS1被設(shè)計(jì)僅與phyA版本序列中的此區(qū)域互補(bǔ)，即采用RHGARYPT作為引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。在這種情況下會(huì)由此使該引物偏向phyA型的磷酸結(jié)合域。作為引物CS2基礎(chǔ)的第二個(gè)保守區(qū)位于PhyA和PhyB氨基酸序列的中間。該保守的中央肌醇六磷酸酶特異性域在PhyA(FTHDEWI)中相應(yīng)于第285-291位氨基酸。在PhyB中，該氨基酸序列(FTQDEWV)相應(yīng)于第280-286位氨基酸。簡(jiǎn)并引物CS1和CS2成功地從P.hordei通過PCR擴(kuò)增了一段650bp的區(qū)域，描述如下。2B.肌醇六磷酸酶基因片段的PCR擴(kuò)增采用青霉屬菌種的基因組DNA作為模板，并采用上述引物的組合，PCR擴(kuò)增推測(cè)的肌醇六磷酸酶基因片段。PCR采用AmershamPharmacia的PCRReady-to-goBeads進(jìn)行。由單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)確定條件，但典型地在Techne熱循環(huán)儀中運(yùn)行30個(gè)循環(huán)。通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應(yīng)產(chǎn)物驗(yàn)證成功的擴(kuò)增。采用Qiagen的QiaquickSpin凝膠提取試劑盒通過凝膠提取純化通過引物CS1和CS2從P.hordei擴(kuò)增的具有正確期望大小(650bp)的PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物連接至商業(yè)pGEM-TEasy載體系統(tǒng)(Promega公司)中以便于克隆。連接反應(yīng)在4℃孵育過夜，總共10μl體積中含有0.1體積的10×連接酶緩沖液和1μl(1U.μl-1)的T4DNA連接酶。典型地在該反應(yīng)中按插入片段與載體DNA之間1-4∶1的摩爾比使用插入DNA片段。從-80℃儲(chǔ)存處取出100μl小份的CaCl2感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞，冰上融化后用于轉(zhuǎn)化。向細(xì)胞中加入3μl連接混合物，并在冰上孵育該混合物20分鐘。然后42℃熱休克細(xì)胞1分鐘，之后將細(xì)胞返回冰上放置5分鐘。在轉(zhuǎn)化混合物中加入0.9mLL-液體培養(yǎng)基，在未進(jìn)行選擇的情況下振搖孵育細(xì)胞，以便使氨芐青霉素抗性基因產(chǎn)物能夠在應(yīng)用篩選前表達(dá)(37℃，1h)。然后直接將200、300和400μl試樣的該培養(yǎng)物涂布在選擇性瓊脂平板上。平板在37℃孵育過夜。采用藍(lán)/白斑篩選觀察含有重組質(zhì)粒的菌落。為了快速甄別重組轉(zhuǎn)化體，從推測(cè)的陽性(白色)菌落的培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。根據(jù)Sambrook等的程序(1989)采用Birnboim和Doly的方法分離DNA。通過限制性分析證實(shí)重組質(zhì)粒中正確插入片段(650bp)的存在。用Not1-pPstI限制性酶37℃消化DNA過夜，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察消化產(chǎn)物。許多克隆含有正確大小的插入片段，選出一些用于手工測(cè)序以觀察該插入片段是否是肌醇六磷酸酶基因片段。采用Sanger等的雙脫氧鏈終止法(1977)和修飾形式的T7DNA聚合酶(2.0版的測(cè)序酶)進(jìn)行插入片段測(cè)序。反應(yīng)采用2.0版測(cè)序酶試劑盒(AmershamLifeScience-UnitedStatesBiochemical公司)中提供的試劑，按廠家操作指南進(jìn)行。來自兩個(gè)克隆(命名為3D和3G)的末端的部分序列說明，已克隆了肌醇六磷酸酶基因片段。來自這兩個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA被送到MWG-Biotech公司進(jìn)行雙鏈插入片段的全長(zhǎng)測(cè)序。2C.序列分析通過BLAST和蛋白質(zhì)翻譯序列工具分析這些序列。在核苷酸水平上的BLAST比較顯示與發(fā)表的phyA肌醇六磷酸酶序列有各種水平的同源性。最初，通過訪問環(huán)球網(wǎng)上的BLAST數(shù)據(jù)庫向BLAST(2.0版基礎(chǔ)BLAST)提交核苷酸序列。所用網(wǎng)值是http//ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。所選程序是blastn，所選數(shù)據(jù)庫是nr。使用了標(biāo)準(zhǔn)/默認(rèn)參數(shù)值。推測(cè)的P.hordei基因片段的序列數(shù)據(jù)以FASTA格式的序列形式輸入，然后該查詢被提交給BLAST，以便對(duì)本發(fā)明序列和數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比較。對(duì)于此650bp片段和來自第一文庫篩選的EcoRI基因片段(討論如下)，返回的結(jié)果顯示與黑曲霉、E.nidulans、煙曲霉和嗜熱放線菌(T.thermophilus)的肌醇六磷酸酶基因有大量的匹配位置。然后采用稱作蛋白質(zhì)機(jī)器的DNA至蛋白質(zhì)翻譯工具處理這些序列。該工具也可以在網(wǎng)上(http//medkem.gu.se/edu/translat.html)獲得。另一個(gè)適合的翻譯工具被作為翻譯機(jī)器，可從網(wǎng)上http//www2.ebi.ac.uk/translate/獲得。將來自P.hordei的推測(cè)肌醇六磷酸酶基因片段的DNA序列插入分析塊中，采用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼作為翻譯的基礎(chǔ)。在所有三種讀碼框中對(duì)正向和反向鏈進(jìn)行翻譯。該分析工具將翻譯的氨基酸序列以單字母密碼氨基酸序列的形式傳送到屏幕上。當(dāng)翻譯成氨基酸序列后，這些克隆表現(xiàn)出含有212個(gè)氨基酸(636bp是基因片段的實(shí)際大小)，沒有終止密碼子。氨基酸序列的分析表明，該片段含有兩個(gè)正確末端(用于設(shè)計(jì)引物CS1和CS2的)，含有必需的P結(jié)合基序(RHGARYP)和同樣出現(xiàn)在發(fā)表的phyA肌醇六磷酸酶序列中的3個(gè)半胱氨酸。我們推論，克隆的此636bp片段是P.hordei的phyA肌醇六磷酸酶基因片段。采用ALIGN程序(AlignmentEditorVersion4/97；DominickHepperie，F(xiàn)ontanestr.9c，D016775，Neuglobsow，德國(guó))在核苷酸和氨基酸水平上進(jìn)行序列比對(duì)和這些比對(duì)的分析。在進(jìn)行分析時(shí)，貼入主題序列，并采用PHYLIP交錯(cuò)格式。同源性分析采用該程序的“分析”部分進(jìn)行，具體是題為“距離分析”的選項(xiàng)。采用最少兩個(gè)氨基酸序列(即兩個(gè)“物種”)，這可計(jì)算出物種間的％同源性和不同位點(diǎn)的數(shù)目。最小和最大同源性按％計(jì)算。同源性分析的基礎(chǔ)是％一致性，即基于“一致氨基酸(或堿基)的數(shù)目除于總的氨基酸(或堿基)數(shù)目然后乘以100”，這一計(jì)算產(chǎn)生百分?jǐn)?shù)值。將P.hordei的氨基酸序列和發(fā)表的肌醇六磷酸酶序列放入ALIGN程序中，在氨基酸水平上進(jìn)行手工比對(duì)。圖7中顯示了示范性結(jié)果。圖7中，稱作“P.hordei3D”(SEQIDNO)的序列是采用簡(jiǎn)并引物CS1和CS2獲得的PCR產(chǎn)物的推導(dǎo)翻譯物。實(shí)施例3用于文庫制備的Southern分析用一組限制性酶37℃過夜消化P.hordei、檜狀青霉和黑曲霉的基因組DNA。在1％瓊脂糖凝膠上電泳成功消化的DNA以便向尼龍膜轉(zhuǎn)移。電泳結(jié)束后，將該瓊脂糖凝膠浸泡在0.2MHCl中10分鐘以使DNA脫嘌呤，然后在ddH2O中短暫洗滌。通過堿性毛細(xì)管印跡將DNA轉(zhuǎn)移至HybondTM-N+膜(AmershamInternationalPLC)上。安裝印跡系統(tǒng)，以便尼龍濾膜夾在凝膠和一摞吸水性紙巾中間。在橫跨轉(zhuǎn)移緩沖液(0.4MNaOH)槽的玻璃板上預(yù)備一個(gè)Whatman3MM紙(Schleicher和Schuell，Dassel，德國(guó))芯。將凝膠倒置在紙芯上，小心避免氣泡形成，并用Nescofilm帶環(huán)繞凝膠邊緣以防止紙巾的印跡活動(dòng)繞過凝膠。用一張等大小的HybondTM-N+膜覆蓋凝膠，該膜在之前切去了一角以和凝膠匹配并在3×SSC中預(yù)濕。接著，將3-5張3MM紙放置在濾膜頂上，加上一摞10cm印跡紙，然后是0.5kg的重物，以完成印跡系統(tǒng)安裝。將此印跡系統(tǒng)保持8-24小時(shí)以轉(zhuǎn)移DNA。然后RT下在2×SSC中短暫洗滌該膜，并于80℃真空烤箱中干烤以將DNA固定在膜上。采用來自P.hordei的636bp片段探測(cè)此Southern印跡。首先用32P同位素借助HighPrimeDNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim)標(biāo)記該片段。在隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記反應(yīng)中加入變性片段，以摻入放射性標(biāo)記的腺嘌呤。Southern印跡于雜交管中42℃在12mlEasy-Hyb緩沖液(BoehringerMannheim)中預(yù)雜交1小時(shí)。使放射性標(biāo)記的探針變性后加入5mlEasy-Hyb雜交緩沖液中，然后42℃雜交過夜。雜交后，通過在40ml3×SSC、0.1％SDS中42℃孵育15分鐘，洗滌此印跡。用新鮮洗滌溶液重復(fù)此低嚴(yán)緊性洗滌。嚴(yán)緊性洗滌后，將此印跡在3×SSC中漂洗以下，然后密封在干凈的塑料中并對(duì)x光片曝光。曝光持續(xù)2小時(shí)后，對(duì)該x光片進(jìn)行顯影。正如圖8所示，P.hordei消化物中觀察到強(qiáng)雜交條帶。具體地，圖8描述了Southern印跡凝膠，該凝膠顯示了含有采用簡(jiǎn)并引物CS1和CS2獲得的PCR產(chǎn)物的探針與各種真菌基因組DNA消化產(chǎn)物之間的雜交情況；泳道1-大小標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道2-黑曲霉-EcoRI；泳道3-檜狀青霉-EcoRI；泳道4-Penicilliumhordei-EcoRI；泳道5-Penicilliumhordei-BamHI；泳道6-Penicilliumhordei-Sall；泳道7-Penicilliumhordei-KpnI；泳道8-Penicilliumhordei-SacI。這些結(jié)果說明636bp片段可以用作探針進(jìn)行文庫篩選。實(shí)施例4從P.hordei基因組中分離編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列4A.P.hordei基因組文庫的制備和篩選在Southern雜交分析后，我們決定制備P.hordei的部分基因組文庫，以便嘗試克隆全長(zhǎng)肌醇六磷酸酶基因。制備靶向4.4KbEcoRI片段(從Southern分析估計(jì)的)的大小受限質(zhì)粒文庫。在1.25％瓊脂糖凝膠上電泳EcoRI消化的P.hordei基因組DNA。從凝膠中提取約4.4Kb的消化片段，通過Glass-Max(Gibco-BRL，Scotland)進(jìn)行純化。將純化的基因組片段和EcoRI線性化的pSKIIBluescript載體(Stratagene)用于鳥槍連接反應(yīng)中。在連接前首先對(duì)載體進(jìn)行脫磷酸，然后在14℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)產(chǎn)生文庫。從-80℃儲(chǔ)存處取出100μl份額的細(xì)胞，冰上融化用于轉(zhuǎn)化。于冰上向細(xì)胞中加入4μlβ-巰基乙醇。在該混合物中加入3μl連接混合物，并在冰上孵育20分鐘。然后42℃熱休克細(xì)胞30秒，之后重新置于冰上2分鐘。在此轉(zhuǎn)化混合物中加入0.9mlNZY液體培養(yǎng)基，在無選擇的情況下振搖孵育細(xì)胞以使氨芐青霉素抗性基因得到表達(dá)。將這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪在具有藍(lán)/白斑篩選的LB瓊脂平板上，37℃孵育過夜。平板上觀察到總共728個(gè)菌落，其中450個(gè)是白色的。按Maniatis的方法(10％SDS-裂解，3min；1.5MNaOH-變性，5min；1.5MTricHCl-中和，5分鐘；3×SSC-沖洗，5分鐘)，將菌落轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上。然后80℃真空干烤濾膜2小時(shí)，以固定DNA。按與Southern雜交相同的方式采用32P放射性標(biāo)記的636bp探針篩選文庫。雜交后，在3×SSC、0.1％SDS中42℃洗滌濾膜15分鐘。然后在3×SSC中沖洗濾膜，將之密封在塑料中并于-80℃對(duì)x光片曝光過夜。在此片上觀察到5個(gè)陽性雜交點(diǎn)。將這些點(diǎn)與含有轉(zhuǎn)化體的瓊脂平板進(jìn)行對(duì)比。這些雜交點(diǎn)與瓊脂平板上的一個(gè)以上單菌落對(duì)上。用無菌環(huán)挑取位于雜交點(diǎn)半徑中的所有菌落，然后接種2mlLuria液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋，從10-1至10-5，然后將每個(gè)樣品各100μl鋪在LB-amp瓊脂平板上，并于37℃孵育過夜。選擇之上有10-150個(gè)菌落的平板進(jìn)行二次篩選。按前述轉(zhuǎn)移菌落，并采用相同程序加工濾膜。制備新鮮的32P標(biāo)記探針，然后按前述相同方式篩選濾膜。采用2×SSC、0.1％SDS于42℃15分鐘進(jìn)行嚴(yán)緊性洗滌。然后在2×SSC中漂洗濾膜，將之密封在塑料中并對(duì)x光片曝光2小時(shí)。經(jīng)顯影的片子顯示出極高數(shù)量的強(qiáng)雜交點(diǎn)，符合從第一次篩選得到的陽性菌落的擴(kuò)增。然后將此片與平板作對(duì)比，調(diào)整這些點(diǎn)以觀察它們是否與單個(gè)分離的菌落相應(yīng)。挑取與單菌落匹配的最好12個(gè)陽性點(diǎn)，用于接種Luria液體培養(yǎng)基以制備質(zhì)粒DNA。利用QiaspinMini-Prep試劑盒(Qiagen)純化質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行限制性分析以估計(jì)插入片段的大小。所有12個(gè)克隆均給出相同的限制性圖譜，提示插入片段的大小為3-4Kb。其中6個(gè)克隆被送往MWG-Biotech公司作部分測(cè)序，以確定它們是否是正確的基因/基因片段。序列分析顯示，其中3個(gè)克隆含有phyA肌醇六磷酸酶的基因片段，但這僅是對(duì)一端而言。之后將這3個(gè)克隆送出以對(duì)插入片段作完全測(cè)序。對(duì)這些克隆全序列的序列分析表明，所有三個(gè)克隆均相同，而且它們編碼相應(yīng)于約80％phyA肌醇六磷酸酶基因的355個(gè)氨基酸(見圖7，第1行，稱作“Phordei”)。明顯地，在該基因中有一個(gè)內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)，位于該基因起始位點(diǎn)下游300-400bp的位置。4B.真菌肌醇六磷酸酶間的百分比一致性比較采用該克隆的肌醇六磷酸酶基因片段的推導(dǎo)多肽產(chǎn)物與發(fā)表的肌醇六磷酸酶作同源性比較。分析顯示約42-56％的一致性(見下表2)，聯(lián)合該翻譯序列的分析一起證明該克隆基因片段是phyA肌醇六磷酸酶。表2.真菌肌醇六磷酸酶間百分比一致性的比較(ALIGN編輯程序)注基于大約80％的推導(dǎo)P.hordei肌醇六磷酸酶氨基酸序列(即缺少N端部分[約140個(gè)氨基酸])進(jìn)行的比較4C.制備和篩選基于SalI的大小受限基因組文庫以分離肌醇六磷酸酶基因的剩余部分為了分離估計(jì)的剩余20％P.hordei肌醇六磷酸酶基因，我們決定使用第二種限制性酶制備第二個(gè)部分基因組文庫，以分離該基因的5’端，然后嘗試將這兩個(gè)片段亞克隆在一起。采用Webcutter確定該克隆肌醇六磷酸酶序列中存在的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。尤其有意義的是在圖8所示Southern分析中使用的酶的位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，所有這些酶(KpnI、SacI、BamI和SalI)在該肌醇六磷酸酶序列內(nèi)均有切點(diǎn)，分別距離該克隆片段5’末端48bp、75bp、486bp和660bp。P.hordei基因組DNA消化物的Southern分析(圖8)顯示了，BamHI片段極大(約8Kb)，將難于克隆在基于質(zhì)粒的文庫中。與KpnI條帶雜交的程度對(duì)于文庫篩選而言不足夠強(qiáng)，而SacI泳道上存在的兩條帶可能會(huì)使該篩選過程復(fù)雜化。我們決定按前述相同方式制備基于SalI的大小受限文庫，以分離1.8kb的SalI帶。由于在探針序列末端下游約120bp的位置存在一個(gè)已知的SalI位點(diǎn)，因此有可能在該肌醇六磷酸酶基因起始位置上游的某個(gè)位置還有一個(gè)SaII位點(diǎn)。按前述方法在pBluescriptSKII中制備文庫，并采用相同的636bp探針進(jìn)行篩選。對(duì)選出的陽性雜交菌落進(jìn)行選擇并與平板上的菌落對(duì)比。所有12個(gè)菌落均與單個(gè)分離的菌落對(duì)上，提取這些菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA制備。限制性分析顯示，僅3個(gè)克隆含有插入片段，而且所有均為約1.8kb。然后將兩個(gè)克隆(CS112，CS114)送至MWG-Biotech作完全測(cè)序。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示，這些克隆包含具有屬于phyA肌醇六磷酸酶的基序的序列，但CS112有大量的測(cè)序錯(cuò)誤。克隆CS114的分析顯示，在該肌醇六磷酸酶基因的這兩個(gè)基因組片段之間有一個(gè)450bp的重疊。除確定了推測(cè)的起始密碼子外，在CS114上還確定了5’內(nèi)含子和上游調(diào)節(jié)元件。4D.擴(kuò)增連續(xù)肌醇六磷酸酶基因用于異源表達(dá)從兩個(gè)基因組克隆CS114和CS101產(chǎn)生一個(gè)合并的肌醇六磷酸酶序列(圖9)，我們采用此序列設(shè)計(jì)了許多能夠用來擴(kuò)增連續(xù)肌醇六磷酸酶基因序列的上游和下游引物。我們還對(duì)PCR擴(kuò)增進(jìn)行了設(shè)計(jì)以利于完整肌醇六磷酸酶基因在異源表達(dá)載體pGAPT-PG中的克隆和表達(dá)，該載體是Genencorinternational公司提供的一個(gè)5.1kb結(jié)構(gòu)(見圖11)。在pGAPT-PG的多克隆位點(diǎn)中有兩個(gè)限制性酶位點(diǎn)(EcoRV和Agel)，它們并不存在于此肌醇六磷酸酶基因序列中。我們采用此肌醇六磷酸酶基因序列設(shè)計(jì)了許多5’和3’側(cè)翼引物，并對(duì)它們進(jìn)行修飾以包含這些酶的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(表3)。表3.根據(jù)克隆CS101和CS114組合的phyA基因序列設(shè)計(jì)的肌醇六磷酸酶特異性引物的序列F指正鏈上的正向引物(5’→3’)；R指負(fù)鏈上的反向引物。設(shè)計(jì)在引物序列中以利于克隆入表達(dá)載體pGAPT-PG的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)帶有下劃線并以粗體標(biāo)出。用于設(shè)計(jì)引物的上游和下游側(cè)翼區(qū)是主觀選擇的，分別位于ATG(起始)密碼子上游和TAG(終止)密碼子下游約100bp處。所用基因序列也經(jīng)過選擇以盡可能含有等量平衡的堿基。采用P.hordei的基因組DNA以及這些引物組合，我們嘗試通過PCR擴(kuò)增該肌醇六磷酸酶基因。PCR應(yīng)擴(kuò)增相應(yīng)于全長(zhǎng)肌醇六磷酸酶基因的大約1.7kb區(qū)域。圖12顯示了采用引物CS201或CS202和CS203進(jìn)行的PCR的結(jié)果。對(duì)于CS201-CS203組合可以觀察到一條具有正確大小的帶，但也可以看到存在多條較低分子量帶。采用CS202-CS203在這些條件下未觀察到擴(kuò)增，但當(dāng)退火溫度為50℃可以觀察到在約1.7kb處有極其微弱的條帶(未顯示)。對(duì)于CS201/CS202和CS204在約700bp處產(chǎn)生一條強(qiáng)帶(未顯示)。將圖12中觀察到的由CS201-CS203擴(kuò)增產(chǎn)生的期望產(chǎn)物克隆至載體pTT中，選擇含有正確大小插入片段的幾個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序(CS158和CS167)。圖10描述了克隆CS158的5’/N-端核酸序列和3’/C-端序列。初步推導(dǎo)的肌醇六磷酸酶氨基酸序列以粗體顯示。克隆CS167的序列在分析后被認(rèn)為不是肌醇六磷酸酶?？寺S158的分析揭示了一些有趣的性質(zhì)。從CS158克隆的3’末端推導(dǎo)的CS158氨基酸序列表現(xiàn)出與CS101肌醇六磷酸酶有高度同源性。然而，從5’末端產(chǎn)生的序列與CS114基本不同。對(duì)于磷酸結(jié)合域基序(RHGARY)上游的序列，這尤其如此。值得注意的是，來自CS1585’末端的序列與發(fā)表的肌醇六磷酸酶序列更為相似，并含有大量的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)基序和保守氨基酸，而這些在CS114的N端氨基酸序列中并不存在。我們推論，克隆CS101和CS114來源于2個(gè)不同的基因，而CS158是正確的全長(zhǎng)肌醇六磷酸酶。在CS158序列中有許多明顯的測(cè)序錯(cuò)誤。這可能是由采用Taq聚合酶擴(kuò)增圖12所示1.7kb條帶這一事實(shí)造成的。從此新序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)新的5’引物以重新擴(kuò)增該肌醇六磷酸酶基因用于表達(dá)。選擇位于來自CS158的此新肌醇六磷酸酶序列中推測(cè)起始密碼子上游的兩個(gè)區(qū)，對(duì)它們進(jìn)行修飾以包括利于克隆至pGAPT-PG中的EcoRv識(shí)別位點(diǎn)(表4)。表4根據(jù)來自克隆CS158的Taq聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)生之phyA基因序列設(shè)計(jì)的肌醇六磷酸酶特異性引物序列F指正鏈上的正向引物(5’→3’)。設(shè)計(jì)在引物序列中以利于克隆至表達(dá)載體pGAPT-PG中的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)帶有下劃線并以粗體標(biāo)出。用于設(shè)計(jì)引物的上游側(cè)翼區(qū)是主觀選擇的，位于推測(cè)的ATG(起始)密碼子上游約50-70bp的位置。所用基因序列也經(jīng)過選擇以盡可能含有等量平衡的堿基。采用這些5’引物與從CS101設(shè)計(jì)的3’引物(表3)的組合，利用高保真性DNA聚合酶PfuPCR擴(kuò)增P.hordei基因組DNA，以使該肌醇六磷酸酶基因的表達(dá)錯(cuò)誤最小化(圖13)。該聚合酶是PfuDNA聚合酶(Stratagene)，是用于PCR的PfuDNA聚合酶試劑盒的一部分。對(duì)于這些反應(yīng)，將反應(yīng)緩沖液、dNTPs、靶DNA和引物混合在一起，然后在50μl的終反應(yīng)體積中加入2.5單位Pfu聚合酶。擴(kuò)增后，通過凝膠電泳分析5μl試樣的反應(yīng)混合物。從新序列設(shè)計(jì)的引物和引物CS204的組合在預(yù)期大小的位置(1.7kb)產(chǎn)生了單一強(qiáng)產(chǎn)物。將該片段直接克隆在載體pCR-BluntIITOPO(Invitrogen)中，分析選出數(shù)量的克隆以證實(shí)正確插入片段的存在。(將PfuDNA聚合酶產(chǎn)生的平端PCR產(chǎn)物克隆至ZeroBluntTMTOPOTMPCR克隆試劑盒(Invitrogen)中。該載體含有一個(gè)MCS位點(diǎn)和產(chǎn)生抗生素抗性的卡那霉素基因，該載體還允許采用不同于藍(lán)/白斑篩選的基于致死性大腸桿菌基因ccdb的破壞進(jìn)行的篩選。向純化的PCR產(chǎn)物(50-200ng)中加入1μlpCR-BluntII-TOPO載體，用無菌水將反應(yīng)體積補(bǔ)加至5μl。溫和混勻后室溫孵育5分鐘。加入1μl6×TOPO克隆終止溶液，將反應(yīng)置于冰上或于-20℃冰凍達(dá)24小時(shí)以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。)通過此分析也驗(yàn)證了改造的EcoRV和AgeI位點(diǎn)的完整性。制備并測(cè)序了一些克隆，CS212和CS213。序列分析證實(shí)存在完整的phyA肌醇六磷酸酶基因。進(jìn)一步采用此基因在異源系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，并隨后對(duì)該酶作生物化學(xué)性質(zhì)分析。4E.P.hordei肌醇六磷酸酶序列的分析CS213代表了P.hordei的全長(zhǎng)肌醇六磷酸酶序列。圖1A中可以看到此克隆的基因組序列。圖2中可見P.hordei肌醇六磷酸酶的推導(dǎo)氨基酸序列。對(duì)此P.hordei序列和發(fā)表的肌醇六磷酸酶進(jìn)行比對(duì)，并以％一致性為基礎(chǔ)進(jìn)行了同源性分析。結(jié)果可見于下表4中。表4.肌醇六磷酸酶間的％一致性比較在左/下區(qū)域中的數(shù)字表示了兩個(gè)物種間不同位點(diǎn)的數(shù)目。最小同源性44.0％，最大同源性68.3％實(shí)施例5克隆、表達(dá)和表征P.hordei的肌醇六磷酸酶我們決定嘗試在異源宿主中超量表達(dá)該肌醇六磷酸酶基因以制備足夠的蛋白質(zhì)用于該酶的性質(zhì)分析。5A.在表達(dá)載體中克隆肌醇六磷酸酶基因并轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉采用高保真性DNA聚合酶擴(kuò)增的全長(zhǎng)肌醇六磷酸酶基因用經(jīng)改造含有兩個(gè)限制性酶位點(diǎn)(EcoRV、AgeI)的引物來產(chǎn)生。采用這些位點(diǎn)是為了利于在表達(dá)載體pGAPT-PG(圖11)中的克隆。用這些酶消化肌醇六磷酸酶克隆CS212和CS213，產(chǎn)生1.7kb的單一插入片段。同樣用這些酶消化pGAPT-PG并使之線性化。將肌醇六磷酸酶基因片段與此表達(dá)載體相連，產(chǎn)生許多轉(zhuǎn)化體。分析選出的克隆以驗(yàn)證插入片段的存在。然后采用這些肌醇六磷酸酶克隆通過電穿孔轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉的溶脹孢子(Swollenspores)。通過電穿孔轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株FGSCA767和構(gòu)巢曲霉FGSCA1032的方法是O.Sanchez和J.Aguirre針對(duì)構(gòu)巢曲霉開發(fā)的實(shí)驗(yàn)程序的變通。用適當(dāng)?shù)逆咦討腋∫喊?07個(gè)孢子/ml接種50mlYG培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖、補(bǔ)加10mM尿苷和10mM尿嘧啶)。培養(yǎng)物于25℃在300rp的旋轉(zhuǎn)搖床上生長(zhǎng)4小時(shí)。通過4℃以4000rpm離心5分鐘收集溶脹孢子。將孢子重懸在200ml冰冷無菌水中，并4℃以4000rpm離心5分鐘。傾去上清液，將孢子重懸在12.5mlpH8.0YED培養(yǎng)基(1％酵母提取物、1％葡萄糖、20mMHEPES)中，并于30℃在旋轉(zhuǎn)搖床上以100rpm孵育60分鐘。4000rpm離心5分鐘收集孢子，然后按109個(gè)分生孢子.ml-1的濃度重懸在1ml冰冷EB緩沖液(10mMtris-HCl，pH7,5，270mM蔗糖，1mM乙酸鋰)中，并置于冰上。在無菌Eppendorf管中將50μl溶脹孢子懸浮液與1-2μgDNA混合，總體積60μl，然后置于冰上15分鐘。將此懸浮液轉(zhuǎn)移至0.2cm的電穿孔杯中。在BioRad電穿孔裝置(設(shè)定為1kv，400W，25μF)中進(jìn)行電穿孔。電穿孔后在懸浮液中加入1ml冰冷YED，然后將合并的混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的15ml無菌Falcon管中，置于冰上15分鐘。之后將管子以水平位置放置在旋轉(zhuǎn)搖床上，以100rpm30℃孵育90分鐘。將孢子鋪在平板上，并在36-48小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)化體。在所有情況下均采用環(huán)狀質(zhì)粒DNA，對(duì)于來源于CS213的克隆產(chǎn)生了15個(gè)轉(zhuǎn)化體，而對(duì)于來源于CS212的那些克隆僅產(chǎn)生了2個(gè)轉(zhuǎn)化體。黑曲霉菌株FGSCA767和構(gòu)巢曲霉菌株FGSCA1032獲自真菌遺傳學(xué)貯存中心，UniversityofKansasMedicalCenter，3901RainbowBoulevard，Kansas城，Kansas，USA。5B.構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的初步性質(zhì)分析總共選擇了10個(gè)構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體作進(jìn)一步分析(CS212-1、CS213-1至9)。采用分別來自這些轉(zhuǎn)化體的孢子接種選擇性培養(yǎng)基，并制備各個(gè)克隆的孢子懸浮液。采用這些孢子懸浮液接種轉(zhuǎn)化體的液體培養(yǎng)基，然后用于肌醇六磷酸酶活性的篩選。培養(yǎng)物生長(zhǎng)72小時(shí)后，收集上清液。樣品在PD-10柱上脫鹽，然后將這些蛋白質(zhì)樣品稀釋在0.25M乙酸鈉中。肌醇六磷酸酶的測(cè)定在標(biāo)準(zhǔn)條件(pH5.5，37℃，30min)下進(jìn)行。其中兩個(gè)克隆(CS213-2，CS213-4)在培養(yǎng)物上清液中表現(xiàn)出肌醇六磷酸酶活性。記錄的CS231-2的肌醇六磷酸酶活性為每ml培養(yǎng)物上清液每分鐘釋放0.12mmolesPi，而轉(zhuǎn)化體CS213-4具有每ml每分鐘釋放0.08mmolesPi的活性。將這些轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步的分析。5C.液體培養(yǎng)中肌醇六磷酸酶最大表達(dá)的時(shí)間為了評(píng)價(jià)肌醇六磷酸酶產(chǎn)生水平什么時(shí)候達(dá)到最高峰以便進(jìn)行隨后的生化性質(zhì)分析，在一個(gè)2天至7天的期限內(nèi)制備了CS213-2和CS213-4的一系列液體培養(yǎng)物。用適當(dāng)轉(zhuǎn)化體的孢子懸浮液接種培養(yǎng)基，并在此期限內(nèi)每天進(jìn)行收獲。按標(biāo)準(zhǔn)方法加工培養(yǎng)物上清液，在標(biāo)準(zhǔn)肌醇六磷酸酶條件下測(cè)定脫鹽的培養(yǎng)物上清液。表5總結(jié)了這些測(cè)定的結(jié)果。在整個(gè)時(shí)間內(nèi)均觀察到肌醇六磷酸酶活性，但其表達(dá)在第三天達(dá)到最大。表5.隨著時(shí)間的過去轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)上清液中肌醇六磷酸酶的活性在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均進(jìn)行液體培養(yǎng)物的收獲，脫鹽后洗脫在0.25mM乙酸鈉(pH5.5)中。肌醇六磷酸酶測(cè)定在標(biāo)準(zhǔn)條件(pH5.5，37℃，30min)下重復(fù)進(jìn)行兩次。活性表示為每ml培養(yǎng)物上清液中肌醇六磷酸酶的單位數(shù)(釋放的Piμmoles.min-1.ml-1)。還測(cè)定了這些時(shí)間點(diǎn)的未能轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉作為對(duì)照。沒有檢測(cè)到肌醇六磷酸酶活性。通過SDS-PAGE分析所選上清液樣品(第4天和第6天)在脫鹽前和脫鹽后的蛋白質(zhì)樣品。所有使用樣品的考馬斯染色凝膠都未顯示條帶。這提示，分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)總水平較低。銀染凝膠也未顯示有任何蛋白條帶的跡象。5D.轉(zhuǎn)化體的Southern分析盡管有證據(jù)證明P.hordei肌醇六磷酸酶基因已被成功地克隆入表達(dá)載體pGAPT-PG中，并且實(shí)現(xiàn)了活性酶的表達(dá)，但至今仍缺少分子證據(jù)。從轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉CS213-2和CS213-4、以及初始的未轉(zhuǎn)化宿主中制備基因組DNA。由于P.hordei肌醇六磷酸酶基因中沒有內(nèi)部EcoRV位點(diǎn)，故用EcoRV消化DNA，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的Southern雜交分析。采用來自P.hordei的650bp肌醇六磷酸酶探針分析這些Southern印跡(圖14)。在中等至高嚴(yán)緊性條件(3×SSC)下，對(duì)于轉(zhuǎn)化體CS213-2和CS213-4均可觀察到單條的強(qiáng)雜交帶。沒有跡象存在任何其它雜交帶，由此可以推斷這顯示了轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉中的單拷貝肌醇六磷酸酶基因。在未轉(zhuǎn)化樣品中未能觀察到雜交條帶，這說明P.hordei肌醇六磷酸酶和構(gòu)巢曲霉基因組存在的任何肌醇六磷酸酶之間沒有同源性。5E.P.hordei肌醇六磷酸酶的生物化學(xué)特性分析為了證實(shí)該克隆基因具有特異的肌醇六磷酸酶活性，并對(duì)此活性進(jìn)行表征，在超量表達(dá)的酶上進(jìn)行了一組生化分析。初步的性質(zhì)分析顯示，該基因產(chǎn)生肌醇六磷酸水解活性。對(duì)該分析進(jìn)行擴(kuò)展，以檢測(cè)在不同pH、溫度和針對(duì)不同底物時(shí)的活性。轉(zhuǎn)化體CS213-4被用于這些分析。培養(yǎng)物在第3天收獲。當(dāng)采用肌醇六磷酸作為底物時(shí)，該酶在pH3.0和pH7.0之間表現(xiàn)出活性(圖15)。將來自培養(yǎng)物上清液的純化酶樣品脫鹽，并洗脫在0.025mM乙酸鈉(pH5.0)中。然后將其加入在如下緩沖液中制備的底物pH3.0∶0.4M鹽酸甘氨酸、pH4.0∶0.4M乙酸鈉、pH5.0∶0.4M乙酸鈉、pH6.0∶0.4M鹽酸咪唑、pH7.0∶0.4MTris-HCl、pH8.0∶0.4MTris-HCl、pH9.0∶0.4MTris-HCl。在pH5.0有一個(gè)明顯的最適值(240單位/ml上清液)，從5.0直到6.0有一個(gè)寬范圍的側(cè)翼活性。當(dāng)采用磷酸4-硝基苯基酯作為底物時(shí)，幾乎觀察不到活性，這說明該酶對(duì)肌醇六磷酸底物有高水平的特異性。針對(duì)該底物的最高活性出現(xiàn)在pH3.0處，但甚至這也僅是該酶在此pH時(shí)針對(duì)肌醇六磷酸的活性的25％。采用pH5.0緩沖液，就一系列溫度，對(duì)該酶的溫度曲線進(jìn)行表征，這次僅采用了肌醇六磷酸作為底物(圖16)。P.hordei肌醇六磷酸酶在30℃-85℃表現(xiàn)出活性，但在44℃有一明顯的最適溫度。越接近周圍溫度該酶的活性越高，在44℃和37℃之間僅喪失22％的相對(duì)活性。由于產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的總水平很低，而且這些測(cè)定是針對(duì)全部上清液蛋白進(jìn)行的，所以難于確定該肌醇六磷酸酶的比活性。這些樣品的平均總蛋白量為8μg/ml，預(yù)計(jì)這將給出每mg蛋白質(zhì)240000個(gè)單位的比活性。我們還對(duì)此肌醇六磷酸酶進(jìn)行了初步的穩(wěn)定性研究。將第3天蛋白質(zhì)的樣品置于-20℃、4℃和37℃過夜，然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。沒有測(cè)量到殘余活性。我們還將樣品暴露在85℃20分鐘，和100℃10分鐘以確定該肌醇六磷酸酶活性的熱穩(wěn)定性。在暴露于這些溫度后當(dāng)于37℃、pH5.0進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在殘余酶活性方面有一個(gè)相當(dāng)大的降低(表6)。表6殘余活性是基于與暴露于每個(gè)條件前獲自樣品的肌醇六磷酸酶活性測(cè)定值進(jìn)行比較得出的(100％活性相應(yīng)于每ml培養(yǎng)物上清液112單位)。盡管樣品僅重復(fù)測(cè)定了兩次，但這些是標(biāo)準(zhǔn)肌醇六磷酸酶測(cè)定條件，即pH5.0、37℃、30分鐘。之后樣品均在同樣的測(cè)定條件下測(cè)定。實(shí)施例6從檜狀青霉中克隆和分析肌醇六磷酸酶基因片段我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)引物以從該真菌靶標(biāo)中擴(kuò)增肌醇六磷酸酶基因片段(表7)。根據(jù)已克隆的肌醇六磷酸酶基因(黑曲霉、煙曲霉、E.nidulans和嗜熱放線菌)的DNA序列、克隆的P.hordei肌醇六磷酸酶的基因序列、以及設(shè)計(jì)的引物CS1和N1的序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了CS11。對(duì)于該引物，每個(gè)密碼子的頭兩個(gè)堿基均十分保守。第三個(gè)堿基基于發(fā)表的DNA序列中顯示的偏倚性，尤其是基于P.hordei序列中處于第三位的堿基來選擇。CS12根據(jù)發(fā)表的肌醇六磷酸酶序列中的保守氨基酸基序YADF/SHDN、以及P.hordei肌醇六磷酸酶基因的推導(dǎo)氨基酸序列來設(shè)計(jì)。表7.根據(jù)真菌肌醇六磷酸酶中保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物的序列F指正鏈上的正向引物(5’→3’)；R指負(fù)鏈上的反向引物。對(duì)檜狀青霉DNA的基因組樣品進(jìn)行PCR，并擴(kuò)增產(chǎn)生一段具有預(yù)期大小即約800bp的片段。將該片段克隆在pTT載體中，并按標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞。對(duì)選出的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選，并分離質(zhì)粒DNA。將選出的具有正確大小插入片段的克隆送至MWG-Biotech作測(cè)序。一個(gè)克隆即CS142含有與肌醇六磷酸酶有高度同源性的序列。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示，克隆的此片段(853bp)來自肌醇六磷酸酶基因。圖17描述了此檜狀青霉片段的基因組序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。它在此區(qū)域有預(yù)期數(shù)目的Cys殘基(3)，它還含有對(duì)于肌醇六磷酸酶結(jié)構(gòu)和功能關(guān)鍵的所有基序，值得注意的有·RHGARYP·3×Cys·HD(位于YADFTHDN中)此處還存在許多十分保守的其它區(qū)域(見圖5的比對(duì))，采用此比對(duì)進(jìn)行的％一致性分析顯示，檜狀青霉與P.hordei肌醇六磷酸酶有約51％的一致性。此檜狀青霉肌醇六磷酸酶片段(283個(gè)氨基酸)占整個(gè)肌醇六磷酸酶的約65％。在中等嚴(yán)緊性條件(3×SSC)下，此檜狀青霉片段對(duì)黑曲霉、P.hordei、檜狀青霉和短密青霉的消化物作的Southern分析顯示，僅與檜狀青霉消化物產(chǎn)生雜交。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)上述優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行各種修改和改變。因此，以上的詳細(xì)說明應(yīng)在以下旨在定義本發(fā)明范圍的權(quán)利要求書(包括所有的等同權(quán)利要求)中進(jìn)行理解。權(quán)利要求1.來自青霉屬真菌來源的分離的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述真菌來源選自檜狀青霉和Penicilliumhordei。3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述酶含有與SEQIDNO4中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。4.分離的多核苷酸，其含有如下核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％的一致性、任選地至少65％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。5.權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述核苷酸序列與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少75％的一致性、任選地至少85％的一致性。6.編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的分離多核苷酸，其中該酶來自青霉屬來源。7.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述酶包含與SEQIDNO4中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。8.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％的一致性、任選地至少65％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。9.表達(dá)結(jié)構(gòu)，其含有如下多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％的一致性、任選地至少65％的一致性，或(ii)能夠與來源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。10.包含權(quán)利要求9的表達(dá)結(jié)構(gòu)的載體。11.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求10的載體的宿主細(xì)胞。12.用于檢測(cè)編碼來自微生物來源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探針，其含有(i)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列有至少55％一致性、任選地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與包含SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開序列的多核苷酸在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。13.權(quán)利要求12的探針，其中所述微生物來源是真菌來源。14.權(quán)利要求13的探針，其中所述真菌來源是青霉屬的種。15.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中所述酶含有與SEQIDNO4中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。16.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中所述酶來自選自Penicilliumhordei和檜狀青霉的真菌來源。17.分離的肌醇六磷酸酶，其中所述酶是從選自檜狀青霉和P.hordei的真菌中獲得的，并具有以下理化性質(zhì)(1)分子量約45-55kDa(未糖基化的)；和(2)專一性肌醇六磷酸。18.制備具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供轉(zhuǎn)化了含有權(quán)利要求4所定義多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；(b)在適于所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(c)回收所述肌醇六磷酸酶。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬的種。20.從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括用含有與SEQIDNO4中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選至少80％一致性的氨基酸序列的酶處理所述肌醇六磷酸。21.從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括用權(quán)利要求17所定義的酶處理所述肌醇六磷酸。22.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述酶包含與圖17中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。23.分離的多核苷酸，其包含如下核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％的一致性、任選地至少65％的一致性，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)。24.權(quán)利要求23的多核苷酸，其中所述核苷酸序列與圖17中所公開核苷酸序列有至少85％的一致性。25.權(quán)利要求6的分離的多核苷酸，其中該酶來源于檜狀青霉或Penicilliumhordei。26.權(quán)利要求25的多核苷酸，其中所述酶包含與圖17中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。27.權(quán)利要求25的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％一致性、任選地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。28.含有多核苷酸的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其中所述多核苷酸包含(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％一致性、任選地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與來源于圖17中所公開核苷酸序列的探針在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。29.包含權(quán)利要求28的表達(dá)結(jié)構(gòu)在內(nèi)的載體。30.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求29的載體的宿主細(xì)胞。31.用于檢測(cè)編碼來自微生物來源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探針，其含有(i)與圖17中所公開核苷酸序列有至少55％一致性、任選地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能夠與包含圖17中所公開序列的多核苷酸在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列，或(iii)與圖17中所公開核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。32.權(quán)利要求31的探針，其中所述微生物來源是真菌來源。33.權(quán)利要求32的探針，其中所述真菌來源是青霉屬的種。34.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在內(nèi)的食物或動(dòng)物飼料，其中所述酶包含與圖17中所公開氨基酸序列有至少70％一致性、任選地至少80％一致性的氨基酸序列。35.制備具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供轉(zhuǎn)化了含有權(quán)利要求23所定義多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；(b)在適于所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(c)回收所述肌醇六磷酸酶。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬的種。37.從肌醇六磷酸中分離磷的方法，包括用(i)具有肌醇六磷酸水解酶活性并(ii)包含與圖17中所公開氨基酸序列有至少65％一致性、任選至少70％一致性的氨基酸序列的酶處理所述肌醇六磷酸。38.來源于青霉屬種，任選地檜狀青霉或P.hordei的酶；所述酶由能夠與SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、或圖17中所示多核苷酸序列在中等至高嚴(yán)緊性條件下雜交的核苷酸序列編碼；所述酶具有一或多個(gè)以下理化性質(zhì)(1)分子量約45-60kDa(未糖基化的)；(2)對(duì)植酸鹽、植酸或肌醇六磷酸、和/或其低級(jí)磷酸衍生物專一的活性；(3)理論pI為約7-7.6；任選地，約7.3；(4)最適pH處于約4.5-5.5范圍內(nèi)，任選地約5；和/或(5)最適環(huán)境溫度處于約40-約45℃范圍內(nèi)；任選地，42-44℃。全文摘要本發(fā)明提供分離自青霉屬、編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的新DNA。還提供從含有編碼具有肌醇六磷酸酶活性的酶的DNA的生物中分離該DNA、將該DNA轉(zhuǎn)化至適合宿主生物中、表達(dá)該轉(zhuǎn)化DNA、和在飼料中將該表達(dá)的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)用作添加劑的方法。文檔編號(hào)C12N15/55GK1451039SQ00812822公開日2003年10月22日申請(qǐng)日期2000年8月11日優(yōu)先權(quán)日1999年8月13日發(fā)明者C·F·斯塔福德,A·P·J·特林茨,J·L·布盧克曼申請(qǐng)人:曼徹斯特維多利亞大學(xué),綠地及環(huán)境研究學(xué)院