專(zhuān)利名稱(chēng)：鑲嵌傳染性腔上囊病病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染性腔上囊病病毒(IBDV)疫苗。
傳染性腔上囊病(IBD)，一種幼雞的傳染性疾病，是在1957年首先在美國(guó)特拉華州Gumboro識(shí)別的，并由Cosgrove正式報(bào)道(Cosgrove，1962；Lasher和Shane，1994)。因此這種疾病通常稱(chēng)為Gumboro。在第一次報(bào)道IBD之后不久，在世界范圍內(nèi)家禽中識(shí)別了這種疾病(Lasher和Shane，1994)。IBD是一種由分類(lèi)為雙RNA病毒的病毒(IBDV)引起的疾病(Dobos等，1979)。有兩種不同的IBDV血清型血清型I和血清型II(Jackwood等，1982；McFerran等，1980)。屬于血清型I的分離株對(duì)雞而言是高致病性的。血清型II分離株，主要是從火雞中收集的，還未報(bào)道在雞中誘導(dǎo)臨床跡象并被認(rèn)為是非致病性的(apathogenic)(Ismail等，1988)。傳染性腔上囊病或Gumboro對(duì)幼雞而言是一種高度傳染性疾病，并可導(dǎo)致家禽業(yè)中的重大損失。在患有急性感染的禽類(lèi)中，腔上囊中的淋巴細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致B細(xì)胞依賴(lài)型免疫缺陷。這導(dǎo)致對(duì)由其它方面無(wú)害因子導(dǎo)致的疾病的易感性提高。Gumboro的病理學(xué)方面的主要作用是通過(guò)囊行使的，其是病毒的靶器官。
IBDV感染開(kāi)始是通過(guò)白色或水性便，厭食，消沉，戰(zhàn)栗，虛弱和死亡等癥狀識(shí)別的。臨床IBD通常見(jiàn)于3或8周齡的禽類(lèi)中。疾病的病程在禽群中接近10天。死亡率通常為0-30％。野外報(bào)道推測(cè)來(lái)亨雞比broiler型小雞對(duì)IBDV更易感。亞臨床IBD是較后識(shí)別的，并通常認(rèn)為比臨床疾病在商業(yè)家禽中導(dǎo)致更嚴(yán)重的問(wèn)題。這種疾病通常見(jiàn)于3周齡以下的禽類(lèi)中。這一早期感染導(dǎo)致腔上囊的B淋巴細(xì)胞損耗。禽類(lèi)是無(wú)免疫性的，且不能充分應(yīng)答免疫接種或野外感染。在易感的小雞中，由IBDV導(dǎo)致的損害可在暴露于存在病毒的環(huán)境后2-3天內(nèi)見(jiàn)到。開(kāi)始，囊水腫性及出血性膨脹(暴露后3天)，然后表現(xiàn)為萎縮(7-10天)。IBD病毒對(duì)一些B淋巴細(xì)胞是致細(xì)胞病變的。最高濃度的這些特異性B淋巴細(xì)胞是在囊中發(fā)現(xiàn)的。IBD野生病毒對(duì)B淋巴細(xì)胞的破壞可導(dǎo)致這些細(xì)胞在二級(jí)淋巴組織中不完全性種植。由于B淋巴細(xì)胞損耗，存活的禽類(lèi)在其所剩的生存期間是無(wú)免疫應(yīng)答的。
IBDV在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)，且IBDV特異性抗體已經(jīng)在南極企鵝中發(fā)現(xiàn)(Gardner等，1997)。臨床IBD的流行與亞臨床IBD的流行相比相對(duì)較低。IBDV對(duì)一般的消毒劑非常有抗性，且已經(jīng)在較小的粉蟲(chóng)，螨蟲(chóng)，和蚊蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。盡管作了消滅的嘗試，這些事實(shí)仍與在農(nóng)場(chǎng)再現(xiàn)IBD問(wèn)題的野外實(shí)驗(yàn)相關(guān)。IBDV感染產(chǎn)生抗IBD的強(qiáng)抗體應(yīng)答，其能中和病毒。可能是接種的結(jié)果，血清型I抗原性變體分離株在美國(guó)特拉華州區(qū)域分離。這些分離株已經(jīng)示出在少如感染后3天導(dǎo)致囊萎縮而無(wú)囊炎癥。盡管其抗原性發(fā)生變化，但這些抗原性變體未形成獨(dú)特的血清型。在抗原性變體IBDV在美國(guó)分離之后，歐洲國(guó)家的家禽業(yè)遭遇了由極烈性血清型IIBDV(vvIBDV)所致的IBD爆發(fā)(Berg等，1991；Chettle等，1989；Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。這些極烈性的野外分離株在面對(duì)通常產(chǎn)生保護(hù)性的高水平的母體抗體時(shí)，仍能存活。這些vvIBDV在疾病爆發(fā)期間導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床跡象，且目前在全球均有發(fā)現(xiàn)(例如歐洲，日本，以色列和亞洲)。
IBDV屬于雙RNA病毒科，該科包括分離自雞的傳染性腔上囊病病毒(IBDV)，分離自魚(yú)的傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)，分離自果蠅的果蠅X病毒(DXV)，及均分離自雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物的Tellina病毒和牡蠣病毒(OV)(Dobos等，1979)。雙RNA病毒具有dsRNA基因組，其分為兩個(gè)基因組節(jié)段(A和B節(jié)段)。A節(jié)段(3.3kDa)含有兩個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框(ORFs)。第一個(gè)是最小的ORF，其編碼非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白5(VP5，17kDa)。第二個(gè)ORF編碼一個(gè)多蛋白(1012個(gè)氨基酸，110kDa)，其是自動(dòng)催化裂解的。這些裂解位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置還未知。從體外翻譯的IBDV RNA的SDS-Page分析得知，多蛋白迅速裂解為3個(gè)蛋白pVP2(48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在體外病毒成熟期間，pVP2加工為VP2(38kDa)，或許是由于宿主細(xì)胞編碼的蛋白酶對(duì)pVP2進(jìn)行位點(diǎn)特異性切割所致(Kibenge等，1997)。VP2和VP3是組成病毒體的單殼的兩個(gè)蛋白。B節(jié)段(2.9kbp)含有一個(gè)編碼91kDa VP1蛋白的大ORF。這個(gè)蛋白質(zhì)含有一個(gè)共有RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基序(Bruenn，1991)。另外，已報(bào)道此蛋白與基因組RNA節(jié)段的5’末端連接(病毒蛋白基因組連接的，VPg)。經(jīng)典抗原性變體或極烈性起源的大量IBDV的內(nèi)部部分的核苷酸序列已經(jīng)確定，并保存在一些數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank中。另外Mundt和Muller(Mundt和Muller，1995)已經(jīng)確定一些IBDV分離株(CU-1，CU-1M，P-2和23/82)的5’和3’末端，并通過(guò)組合內(nèi)部和末端序列，Mundt和Muller確立了血清型IA節(jié)段(3261bp)和B節(jié)段(2827bp)的完整核苷酸序列。這提供了通過(guò)了解IBDV基因組的完整dsRNA序列，及使用已知產(chǎn)生感染性拷貝病毒幾種方法之一，產(chǎn)生IBDV血清型I的感染性(重組的)拷貝(rIBDV)的方法(見(jiàn)例如Boyer等，病毒學(xué)198415-426，1994)，Mundt和Vakharia確實(shí)從cDNA中產(chǎn)生了感染性rIBDV血清型I(Mundt和Vakharia，1996)。由T7啟動(dòng)子引導(dǎo)的血清型IIBDV的全長(zhǎng)cDNA，因此用作T7 RNA聚合酶的模板，使用Weiland和Dreher所述的方法(Weiland和Dreher，1989)。在其5’末端含有帽結(jié)構(gòu)的在體外產(chǎn)生的mRNA，通過(guò)脂質(zhì)體形成(Lipofectin，GibcoBRL)隨后轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中。在37℃在CO2溫箱中溫育36小時(shí)后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清中包含感染性rIBDV(Mundt和Vakharia，1996；(WO98/09646))。另外，Lim等將兩種氨基酸突變體(D279N和A284T)導(dǎo)入vvIBDV分離株HK46的cDNA中(Lim等，1999)。這些突變體最可能基于Yamaguchi等的數(shù)據(jù)(Yamaguchi等，1996)，其示出這些特異性突變體在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其中極烈性IBDV分離株通過(guò)在原代CEF細(xì)胞上適應(yīng)和生長(zhǎng)喪失其極烈性。Lim等獲得一種rIBDV分離株，其具有CEF培養(yǎng)物適應(yīng)的分離株即rIBDV分離株的表型，所述分離株能在vvIBDV非允許細(xì)胞如CEF細(xì)胞中增殖，即能感染，繁殖及釋放以進(jìn)一步復(fù)制。值得注意的是，Lim等用HK46分離株的未修飾的cDNA不能產(chǎn)生感染性vvIBDV分離株(Lim等，1999)。另外，盡管IBDV的cDNA可用于產(chǎn)生感染性IBDV，但仍未闡明準(zhǔn)確的復(fù)制機(jī)制?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)支持雙RNA病毒的半保守性基因組復(fù)制模式(Bernard，1980；Mertens等，1982)。
IBDV變體不時(shí)在野外被檢測(cè)到或在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生(Muller，1987)，它們是IBDV的血清型I和II毒株的遺傳重排列，因?yàn)樗鼈兒醒苌砸粋€(gè)血清型的一個(gè)基因組節(jié)段，和衍生自另一個(gè)血清型的另一個(gè)基因組節(jié)段。這種節(jié)段重排列的毒株(srIBDV)(也稱(chēng)為嵌合IBDV)，不僅是天然發(fā)生的，最近已經(jīng)由Vahkaria和Mundt從cDNA中產(chǎn)生(WO98/09646)。用減毒的野外分離株接種一直是良好的，直至1985年開(kāi)始在美國(guó)特拉華州發(fā)現(xiàn)抗原性衍生物(分離株Del A，D，G和E)(Snyder，1990)。這些野外分離株缺少重要的病毒中和表位。此表位的變化特征在于喪失病毒中和單克隆抗體(Mab)B69的結(jié)合(Snyder等，1988a)。通過(guò)用經(jīng)典IBDV疫苗接種誘導(dǎo)的抗體表現(xiàn)為對(duì)這些抗原性IBDV變體的保護(hù)性較差。隨后生產(chǎn)基于抗原性IBDV變體的滅活的疫苗，并發(fā)現(xiàn)其有效保護(hù)抗IBDV的這些抗原性變體。在特拉華變體之后，分離了另一種抗原性變體IBDV。此變體得自美國(guó)Delmarva區(qū)，并稱(chēng)為GLS變體。此GLS變體特征在于沒(méi)有針對(duì)病毒中和Mab B69和R63的表位(Snyder等，1988b)。在鑒別這些抗原性變體之后，在美國(guó)通過(guò)使用一組9個(gè)抗IBDV的Mabs進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查。此調(diào)查產(chǎn)生一個(gè)另外的抗原性變體DS326變體。此抗原性變體特征在于除了Mabs B69和R63之外，也沒(méi)有Mab179和BK44的表位(Snyder，1990)。在美國(guó)和世界的其它國(guó)家沒(méi)有關(guān)于抗原性變體的進(jìn)一步報(bào)道。還不清楚這是否由于不存在新的變體IBDV分離株，或由于缺乏大規(guī)模調(diào)查或沒(méi)有具有識(shí)別能力的單克隆抗體，新的抗原性變體還未檢測(cè)到所致。
編碼Del，GLS和DS326抗原性變體IBDV分離株的部分A節(jié)段的多蛋白的核苷酸序列已經(jīng)確定(Vakharia等，1994)。大多數(shù)氨基酸變化在VP2蛋白的特異性區(qū)域中發(fā)現(xiàn)，此區(qū)因此稱(chēng)為高變區(qū)。另外發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)中和抗體的表位是依賴(lài)于構(gòu)象的，并在高變區(qū)中成簇。此區(qū)域由具有高疏水指數(shù)的結(jié)構(gòu)域(pVP2的224-314位氨基酸，相當(dāng)于多蛋白的224-314位氨基酸)組成，該結(jié)構(gòu)域兩側(cè)為兩個(gè)小親水區(qū)域，每個(gè)小親水區(qū)跨越大約14個(gè)氨基酸(Vakharia等，1994；Heine等，1991)。在疏水區(qū)和親水區(qū)內(nèi)的氨基酸取代可參與這些分離株的抗原性變體的特性。
在美國(guó)由于IBDV分離株的抗原性變體導(dǎo)致問(wèn)題之后，歐洲的家禽業(yè)受到極烈性IBDV(vvIBDV)分離株的影響(Berg等，1991；Chettle等，1989)。此vvIBDV分離株在疾病流行期間導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床跡象，且能突破保護(hù)性抗經(jīng)典IBDV分離株的抗體水平。與經(jīng)典IBDV分離株有區(qū)別的vvIBDV的分子決定簇還不十分清楚。然而已知細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的極烈性IBDV分離株，與未適應(yīng)的親代分離株相比，其致病性明顯降低(Yamaguchi等，1996)。CEF適應(yīng)性和喪失極烈性表型之間的相關(guān)性，似乎是由于適應(yīng)的病毒的靶細(xì)胞嗜性變化所致。細(xì)胞嗜性的這種變化可以是由于細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的極烈性IBDV分離株的囊細(xì)胞受體結(jié)合能力喪失所致。另一種可能是細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的極烈性IBDV分離株能感染非囊細(xì)胞，導(dǎo)致原始靶細(xì)胞(囊細(xì)胞)中IBDV大量縮減。從公布的結(jié)果中(Yamagauchi等，1996)，很清楚基于細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的極烈性分離株的cDNA的重組IBDV(rIBDV)從未產(chǎn)生符合如下需要的疫苗，該疫苗需能在高水平母體抗體下幸免并誘導(dǎo)足夠高的免疫應(yīng)答。
目前還未闡述僅識(shí)別vvIBDV分離株的特異性抗體(Eterradossi等，(1997))。缺少區(qū)別的抗體使直接診斷存在難度。最受關(guān)注的是對(duì)比經(jīng)典分離株的VP2高變區(qū)和極烈性分離株的高變區(qū)之間的序列。對(duì)vvIBDV分離株UK661的序列分析示出，在VP2蛋白的高變區(qū)內(nèi)只存在3個(gè)獨(dú)特的(即在非vvIBDV分離株未發(fā)現(xiàn)的)氨基酸取代。在pVP2蛋白的其余部分內(nèi)有一個(gè)氨基酸取代，同時(shí)在多蛋白的VP4編碼部分內(nèi)有5個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變，在VP3編碼部分有6個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變。(Brown和Skinner，1996)。編碼VP5蛋白的UK661分離株A節(jié)段的較小ORF，含有2個(gè)獨(dú)特的氨基酸取代。在由此vvIBDV分離株的B節(jié)段編碼的VP1蛋白中，發(fā)現(xiàn)另外16個(gè)獨(dú)特的氨基酸取代。vvIBDV的毒性表型可以被每個(gè)發(fā)現(xiàn)的氨基酸取代影響，甚至在A或B節(jié)段的編碼或非編碼部分內(nèi)的(沉默型)核苷酸取代也可以導(dǎo)致與經(jīng)典或抗原性變體分離株相比，vvIBDV分離株的表型改變。vvIBDV分離株(OKYM)在含胚卵上的連續(xù)傳代導(dǎo)致衍生的分離株(OKYMT)出現(xiàn)，其能在雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞上生長(zhǎng)，并已經(jīng)喪失其極毒力。據(jù)報(bào)道這種適應(yīng)性是在基因組的多蛋白編碼部分中有7個(gè)核苷酸取代所導(dǎo)致的。在A或B節(jié)段的剩余部分(例如非翻譯區(qū)，VP1編碼區(qū)，和VP5編碼區(qū))中是否存在另外的核苷酸取代還未確定(Yamaguchi等，1996)。報(bào)道的核苷酸取代產(chǎn)生5個(gè)氨基酸取代。這些氨基酸取代中有三個(gè)位于VP2高變區(qū)的疏水部分(I256T，D279N，A284T)，一個(gè)位于VP2高變區(qū)下游的親水部分(S315F)，一個(gè)位于VP3內(nèi)(A805T)(Yamaguchi等，1996)。在一獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，Yamaguchi等發(fā)現(xiàn)vvIBDV分離株TKSM適應(yīng)成為T(mén)KSM也導(dǎo)致A284T和D279N取代。在這些分析中相關(guān)的A284T取代在CEF細(xì)胞上完全適應(yīng)，并喪失毒力。D279N取代在兩種CEF適應(yīng)的vvIBDV分離株(OKYMT和TKSMT)中均存在，及對(duì)在CEF細(xì)胞上生長(zhǎng)和喪失毒力也具有潛在的重要性。另一方面，非CEF適應(yīng)的經(jīng)典IBDV分離株GBF-1在279位具有天冬酰胺，在284位具有丙氨酸，并且不能在CEF細(xì)胞上生長(zhǎng)，因此D279N的單一取代不能使其喪失毒力及在CEF細(xì)胞上生長(zhǎng)。VP2中的氨基酸變化顯然能使修飾的IBDV在不具有野生型IBDV的受體的細(xì)胞上增殖。具有野生型受體的細(xì)胞如囊細(xì)胞對(duì)經(jīng)典和vvIBDV分離株易感。最近研究表明A284T和D279N氨基酸取代組合確實(shí)足以將非CEF適應(yīng)的極烈性IBDV分離株轉(zhuǎn)變?yōu)镃EF適應(yīng)的分離株。Lim等將這兩個(gè)氨基酸取代導(dǎo)入vvIBDV分離株HK46的A節(jié)段cDNA(Lim等，1999)。在轉(zhuǎn)染此cDNA后，Lim等獲得一種具有CEF培養(yǎng)適應(yīng)的分離株表型的rIBDV分離株，即此rIBDV分離株在CEF細(xì)胞中能感染及繁殖。此rIBDV分離株在雞中的毒力沒(méi)有測(cè)定。值得注意的是，Lim等用HK46分離株的未修飾的cDNA不能產(chǎn)生重組感染性vvIBDV分離株(Lim等，1999)。
抗IBD免疫接種的目的是預(yù)防臨床和亞臨床IBD，及經(jīng)濟(jì)學(xué)的各個(gè)方面。針對(duì)IBD的有效接種可分為以下類(lèi)別在broiler，種禽和蛋禽中保護(hù)囊發(fā)育。
在broiler，種禽和蛋禽中預(yù)防臨床疾病。
種禽引發(fā)和加強(qiáng)。
為使IBDV的免疫抑制作用最小化，必須將幼雞進(jìn)行保護(hù)。對(duì)極幼雞進(jìn)行保護(hù)可通過(guò)將足夠高水平的母體抗體經(jīng)過(guò)種雞傳遞至其子代。對(duì)極幼雞自身進(jìn)行接種可能會(huì)不成功，因?yàn)榻臃N后的保護(hù)在3-5天之間出現(xiàn)。而當(dāng)缺乏抗IBDV的母體抗體的禽類(lèi)暴露于病原性IBDV野毒株時(shí)，在24-48小時(shí)內(nèi)將發(fā)生損害。
通常對(duì)種禽的早期接種是作為引發(fā)。在大多數(shù)情況下，此單次接種被認(rèn)為是不夠的。加強(qiáng)通常指在產(chǎn)卵發(fā)生之前最后施用的IBDV接種。由此提高母雞體內(nèi)的循環(huán)抗體及因此提高子代中的母體抗體。滅活的(油乳狀液疫苗)和活疫苗(IBDV)均已經(jīng)用于此目的。在較老的禽類(lèi)中使用活疫苗將使抗體增加；然而，通常可見(jiàn)抗體效價(jià)有較大變異。這些變異導(dǎo)致早至孵化后幾天至孵化后21天的子代變得對(duì)野外攻擊易感。使用滅活的IBDV疫苗提供更高的抗體效價(jià)，并降低屬于同種群的禽類(lèi)的抗體效價(jià)之間的變異。中和IBD所需的母體抗體的水平隨野外毒株的侵襲力和致病性而變化。在實(shí)踐中，如果存在極烈性IBDV分離株，需要較高水平的母體抗體(見(jiàn)表1關(guān)于野外分離株毒力和疫苗強(qiáng)度總結(jié))。就有效接種而言，必需避免母體抗體的干擾以誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答。臨床IBD在3-6周齡典型可見(jiàn)。因?yàn)楸粍?dòng)保護(hù)下降，必須刺激小雞的免疫應(yīng)答?；钚越臃N的時(shí)間可通過(guò)種禽或小雞在接近3.5天的抗體的效價(jià)和半衰期加以評(píng)估(De Wit和Van Loon，1998；Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。母體抗體的水平在群體中趨于變化。此變異可以是種禽母雞的抗體水平變異的結(jié)果。來(lái)自幾種種禽群體(例如不同年齡的種禽組合；用活疫苗和油乳化疫苗接種的種禽)的子代混合，導(dǎo)致屬于同種群小雞之間的IBDV抗體水平發(fā)生變異。如果在平均母體抗體效價(jià)中的變異系數(shù)(CV)太寬，可推薦接種兩次(間隔10天)，或用熱疫苗早期接種(在存在高抗原性壓力的情況下)。
在群體中抗IBDV的抗體的平均效價(jià)將隨時(shí)間而下降(圖1)。平均抗體效價(jià)降低，導(dǎo)致免疫缺口(immunity gap)發(fā)生。如果免疫缺口盡可能短及盡可能早，最短在孵化后2周，則可獲得最佳結(jié)果。在4周齡活性接種后應(yīng)至少有足夠的免疫性，因?yàn)樵S多處理是從該時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始在室內(nèi)進(jìn)行的，此時(shí)有導(dǎo)入野生病毒的危險(xiǎn)。因此農(nóng)場(chǎng)主喜歡在2周或更早接種。中度疫苗通常不能突破在孵化后2周的小雞的平均抗體效價(jià)下(圖1)。如果平均母體抗體效價(jià)存在高度變異，可用中度疫苗有效接種一些小雞，否則不能。為解決這些問(wèn)題，使用熱(hot)疫苗。使用熱疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是具有低至中等母體抗體效價(jià)的雞的囊將被(部分)破壞。
目前有許多IBDV疫苗可供應(yīng)。接種策略的重要方面是病毒在面對(duì)母體抗體(疫苗的侵襲力)和抗原性?xún)?nèi)容物譜(包括抗原性變體)時(shí)能復(fù)制。根據(jù)疫苗病毒在面對(duì)母體抗體時(shí)的復(fù)制能力，可將活疫苗主要分為3組輕度，中度，和中度加或熱疫苗(見(jiàn)表1)。IBD的初始疫苗衍生自經(jīng)典IBD分離株。這些疫苗是中等致病性IBDV毒株，在含胚卵中傳代數(shù)較低。這些疫苗通常用于種禽計(jì)劃中，以誘導(dǎo)高水平的循環(huán)抗體。然而，當(dāng)將其給予具有中等或低水平的母體抗體的幼禽時(shí)，這些疫苗可導(dǎo)致廣泛的囊萎縮，引起免疫抑制。隨后開(kāi)發(fā)了輕度疫苗用于這些幼禽中。在組織培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行傳統(tǒng)的IBDV的減毒。傳統(tǒng)的，減毒疫苗株是通過(guò)經(jīng)連續(xù)傳代將IBDV毒株適應(yīng)雞成胚(CEF)細(xì)胞或其它適當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞系而產(chǎn)生的。這些疫苗即使用于無(wú)母體抗體的禽類(lèi)中也不是免疫抑制性的。然而中等和高度水平的抗體易于中和它們。隨著種禽計(jì)劃(包括使用佐劑，滅活的疫苗)的發(fā)展，在子代中產(chǎn)生了較高水平的母體抗體。這降低了這些輕度疫苗的效力。
中等強(qiáng)度的疫苗克服了輕度疫苗的不足之處。一些中度疫苗是通過(guò)在雞細(xì)胞培養(yǎng)基上克隆野外分離株產(chǎn)生的。中等強(qiáng)度的疫苗能在具有中等水平母體抗體的禽類(lèi)中建立免疫性。這些疫苗將導(dǎo)致無(wú)母體抗體的禽類(lèi)中一些囊萎縮，但認(rèn)為不是免疫抑制性的。
熱(強(qiáng))或中度加疫苗是在vvIBDV第一次爆發(fā)后產(chǎn)生的。這些vvIBDV分離株可比在該時(shí)市售的疫苗突破更高水平的母體免疫性。在具有vvIBDV高度感染壓力的情況下，用中度疫苗接種起效太晚。熱疫苗由在含胚卵中低至中等傳代的vvIBDV毒株或用vvIBDV分離株感染的雞的囊產(chǎn)生的IBDV組成。在通常用于產(chǎn)生疫苗的細(xì)胞上適應(yīng)vvIBDV的嘗試失敗了，因?yàn)檫@些細(xì)胞對(duì)vvIBDV是非允許細(xì)胞，或當(dāng)適應(yīng)所述細(xì)胞時(shí)，vvIBDV喪失其極烈性，使其不能用于熱或中度加疫苗。熱或中度加疫苗需要能在比中度疫苗更早年齡克服母體免疫性，但在群體中更廣泛傳播。如果中度加和熱疫苗用于具有中等至高水平母體抗體的雞中，對(duì)囊沒(méi)有陰性副作用(Kouwenhoven和Van den Bos，1995)。如果這些疫苗用于具有低至中等水平母體免疫性的雞中，導(dǎo)致囊中淋巴細(xì)胞損耗，并發(fā)現(xiàn)周?chē)蠦細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p耗(Ducatelle等，1995)。盡管已經(jīng)觀測(cè)到囊功能恢復(fù)，但這些疫苗應(yīng)慎用。
活疫苗必須以這樣一種方式給予，其中病毒優(yōu)選到達(dá)囊，在此迅速繁殖并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。應(yīng)用活疫苗的可能途徑包括飲用水，噴霧，皮下和卵內(nèi)(in ovo)。滅活的IBD疫苗用于broiler種禽。它們的應(yīng)用途徑在與活疫苗相同方式中有一些不同。它們的效力依賴(lài)于其含有的抗原譜?？勺⑸涞挠腿橐褐破房善は禄蚣?nèi)注射給予。
用整體質(zhì)量控制方案包括血清學(xué)持續(xù)監(jiān)測(cè)野外情況，可以是持續(xù)適應(yīng)預(yù)防性接種方法以改變流行病學(xué)條件的有利手段。持續(xù)探究流行病學(xué)條件可預(yù)見(jiàn)重大流行病的發(fā)生(Ducatelle等，1995)。然而，診斷實(shí)驗(yàn)室難以用有意義的確定數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)IBD。血清學(xué)是重要的，但當(dāng)從商購(gòu)的broiler群體中監(jiān)測(cè)的所有雞具有高水平的相同循環(huán)抗體譜時(shí)，其可能令人困惑。監(jiān)測(cè)broiler的IBD情況的野外評(píng)價(jià)是高度主觀的難以區(qū)別在接種后獲得的抗體效價(jià)和通過(guò)IBDV野外感染誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。如果可以區(qū)別對(duì)野外病毒和IBDV接種之間的IBDV抗體應(yīng)答，則可能具有“早期警報(bào)”系統(tǒng)，且如果需要?jiǎng)t啟動(dòng)IBDV根除計(jì)劃。只有當(dāng)已知對(duì)所用IBDV疫苗和IBDV野外分離株的抗體應(yīng)答的差異時(shí)，才可作出關(guān)于IBDV的(亞)臨床跡象是否是由于接種活I(lǐng)BDV或IBDV野外分離株所致的結(jié)果和推斷。
本發(fā)明提供了感染性重組傳染性腔上囊病病毒(rIBDV)，其基本上不能在非衍生自囊細(xì)胞的細(xì)胞中或其它包含野生型IBDV受體的細(xì)胞(非囊細(xì)胞)中生長(zhǎng)。囊是一個(gè)淋巴器官，主要包含與免疫系統(tǒng)相關(guān)的細(xì)胞。尤其的，其包含有時(shí)是T細(xì)胞型但主要是B細(xì)胞型淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，或其衍生的細(xì)胞，其與單核細(xì)胞或單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞密切相關(guān)，并與小結(jié)樹(shù)突細(xì)胞和呈遞抗原細(xì)胞也密切相關(guān)。特別地，本發(fā)明提供了rIBDV，其基本上不能在以上未列出的囊細(xì)胞或其衍生的細(xì)胞中生長(zhǎng)，如樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或其衍生的細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種保留重要特性的rIBDV，即與普通減毒的IBDV毒株相比，其在非囊細(xì)胞或其它通常用于增殖IBDV減毒毒株的細(xì)胞中不能生長(zhǎng)只微弱生長(zhǎng)，所述非囊細(xì)胞如熟知的CEF，QM5或VERO細(xì)胞。特別地，本發(fā)明提供了一種基本上在非B細(xì)胞衍生的細(xì)胞中不能生長(zhǎng)的rIBDV?；静荒苌L(zhǎng)在本文是指所述分離株不能或很少能感染，繁殖或被釋放以進(jìn)一步復(fù)制。在本發(fā)明之前沒(méi)有這種rIBDV分離株，以前的所有分離株已知在非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞如CEF細(xì)胞中生長(zhǎng)(WO98/09646；Lim等，1999)，從而例如喪失那些極烈性特征，此極烈性是在設(shè)計(jì)面對(duì)上述問(wèn)題的疫苗毒株中必需保留的。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了感染性rIBDV，其保留了極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的提供抗vvIBDV的保護(hù)性所需的極烈性特征的至少一部分。特別地，所提供的vvIBDV基本不能在非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞中生長(zhǎng)。特別地，如詳細(xì)論述中所例證的，本發(fā)明提供一種rIBDV，其基本上不能在CEF細(xì)胞，VERO細(xì)胞或QM5細(xì)胞中生長(zhǎng)，當(dāng)然除了這些CEF，VERO，QM5或相關(guān)細(xì)胞具有復(fù)制經(jīng)典或極烈性IBDV所需的必需手段(如衍生自囊細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因受體或復(fù)制系統(tǒng)，或支持IBDV在非淋巴細(xì)胞中增殖的B淋巴細(xì)胞其它特性，如果這種特性存在于這種非B淋巴細(xì)胞中)。
另外，本發(fā)明提供了一種rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位氨基酸不是天冬酰胺，但例如為極烈性毒株所特有的氨基酸，如在279氨基酸位具有天冬氨酸。本發(fā)明提供的這種rIBDV毒株保留了vvIBDV極烈性的至少一部分，以及本發(fā)明還包括一種rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位不是蘇氨酸，但例如為極烈性毒株所特有的氨基酸，如在第284位是丙氨酸。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列至少包含vvIBDV分離株中發(fā)現(xiàn)的279-289，優(yōu)選229-314，更優(yōu)選214-328位氨基酸的一段序列，如表8所示。
本發(fā)明還提供了一種獲得感染性重組拷貝傳染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，此rIBDV在非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞中基本不能生長(zhǎng)或具有極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分極烈性，該方法包括用核酸如cDNA或RNA轉(zhuǎn)染至少一個(gè)第一種細(xì)胞，所述核酸包含至少一部分衍生自vvIBDV的IBDV基因組，將所述第一種細(xì)胞在培養(yǎng)基中溫育，從所述轉(zhuǎn)染的第一種細(xì)胞中或所述培養(yǎng)基中回收rIBDV，將所述回收的rIBDV在至少一個(gè)第二種細(xì)胞中增殖，所述第二種細(xì)胞是所述vvIBDV的允許細(xì)胞。衍生自所述重組病毒的疫苗也是本發(fā)明的一部分。包含經(jīng)化學(xué)或物理滅活的重組病毒或其一部分的疫苗也是本發(fā)明的一部分。
初始產(chǎn)生的重組極烈性IBDV的減毒衍生物也是本發(fā)明的一部分。這種病毒可以通過(guò)已知方法減毒，包括連續(xù)傳代，除去特異性核酸序列，或通過(guò)定點(diǎn)誘變。本領(lǐng)域已知適于家禽疫苗的生理可接受載體，不需再進(jìn)一步闡述。疫苗中也可包含本領(lǐng)域已知其它添加劑如佐劑和穩(wěn)定劑等。優(yōu)選地，佐劑如氫氧化鋁，磷酸鋁，植物和動(dòng)物油等，以足以增強(qiáng)對(duì)IBDV的免疫應(yīng)答的量與疫苗一起投藥。本發(fā)明的疫苗也可含有各種穩(wěn)定劑。可使用任何適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，包括碳水化合物如山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，糊精，葡萄糖；蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白；和緩沖液如堿金屬磷酸鹽等。當(dāng)通過(guò)冷凍干燥制備干態(tài)疫苗制品時(shí)，使用穩(wěn)定劑是特別有利的。疫苗可通過(guò)任何已知接種家禽的方法施用，包括鼻內(nèi)，眼部，注射，在飲用水中，在食物中，接觸等方法施用。優(yōu)選地，疫苗是通過(guò)大量施用方法施用的，如in ovo接種，通過(guò)將疫苗置于飲用水中，或通過(guò)噴霧于動(dòng)物的周?chē)h(huán)境中。當(dāng)通過(guò)注射施用時(shí)，疫苗優(yōu)選經(jīng)非腸道施用。將本發(fā)明的疫苗施用于家禽以在孵化之前或之后的任何時(shí)候預(yù)防IBD。家禽包括但非限于小雞，公雞，母雞，broilers，roasters，種雞，產(chǎn)蛋雞，火雞和鴨。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體例如是稀釋劑，本領(lǐng)域已知惰性的藥物載體。優(yōu)選地，載體或稀釋劑是與通過(guò)大量施用方法施用的疫苗兼容的制劑。然而，載體或稀釋劑也可以是與其它施用方法兼容的，如注射，滴眼液，滴鼻劑等。
如上所述，需要一種IBDV疫苗，其具有抗野外IBDV感染的保護(hù)作用，優(yōu)選抗極烈性IBDV(vvIBDV)?，F(xiàn)已清楚衍生自減毒經(jīng)典毒株而不是極烈性毒株的疫苗不具備充分的保護(hù)作用。然而如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員首先會(huì)將vvIBDV毒株在細(xì)胞或細(xì)胞系如VERO，CEF或QM5上簡(jiǎn)單適應(yīng)或培養(yǎng)，以從vvIBDV毒株中獲得疫苗毒株，但這會(huì)降低其極烈性表型，這樣預(yù)期不會(huì)有充分的保護(hù)作用。因此，需要一種疫苗毒株，其至少部分保留了極烈或熱特性，以提供充分的保護(hù)作用，然而，相矛盾的是，這種所需的疫苗毒株很可能在被認(rèn)為獲得所述疫苗所需的適當(dāng)?shù)募?xì)胞上不能充分或?qū)嶋H增殖，所述細(xì)胞如非囊細(xì)胞衍生的VERO，CEF或QM5細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述第一種細(xì)胞是非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞，即是所述vvIBDV的非允許細(xì)胞，優(yōu)選地其中所述第一種細(xì)胞另外具有輔助病毒或其衍生的病毒蛋白(本文使用T7聚合酶)。借助于包含適當(dāng)選擇的輔助病毒例如表達(dá)獨(dú)特的IBDV或雙RNA病毒蛋白的輔助病毒的這種細(xì)胞，或表達(dá)所述IBDV或雙RNA病毒蛋白的細(xì)胞(也稱(chēng)為互補(bǔ)細(xì)胞)，目前也可產(chǎn)生缺陷或缺損的rIBDV。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生感染性IBDV的方法，通過(guò)將衍生自極烈性IBDV(vvIBDV)分離株的cDNA序列，與衍生自血清型I經(jīng)典減毒IBDV分離株、血清型IIBDV的抗原性變體、或血清型IIIBDV分離株的cDNA序列組合，其中保留極烈性IBDV的至少一部分極烈性的所述的感染性拷貝重組IBDV，至少保留了在vvIBDV非允許細(xì)胞如QM5或CEF細(xì)胞上不能實(shí)質(zhì)增殖的能力。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供的方法提供了一種包含IBDV基因組的疫苗，其中衍生自vvIBDV的A節(jié)段和/或B節(jié)段部分，與衍生自減毒的IBDV如減毒的血清型I或IIIBDV的A和/或B節(jié)段部分組合使用。這種rIBDV在本文也稱(chēng)為鑲嵌(mosaic)IBDV(mIBDV)。在此我們示出(鑲嵌)vvIBDV可從cDNA中產(chǎn)生，其是通過(guò)轉(zhuǎn)染不易感細(xì)胞隨后在易感細(xì)胞上擴(kuò)增cDNA衍生的rIBDV進(jìn)行。此方法提供了一種從vvIBDV分離株的克隆的全長(zhǎng)cDNA中產(chǎn)生vvIBDV的方法(見(jiàn)表5和表6)。在用vvIBDV的cDNA轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞后，產(chǎn)生的vvIBDV病毒在vvIBDV允許細(xì)胞上發(fā)生增殖是重要的。這些允許細(xì)胞例如是囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞，如在雞胚細(xì)胞，雞胚或幼雞中的原始囊細(xì)胞。使用本文所述方法，我們例如用衍生自極烈性D698IBDV分離株的cDNA產(chǎn)生了重組D6948(rD6948)。此rD6948分離株與親代D6948分離株具有相同毒力(表6)。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種方法，其中第二種允許細(xì)胞是原始囊細(xì)胞，從而使所需的疫苗病毒開(kāi)始增殖。如上所述，需要一種疫苗，其能在早期突破幼雞的母體免疫性。所需的疫苗應(yīng)優(yōu)選在接種的幼雞中能誘導(dǎo)高水平的保護(hù)作用，并應(yīng)因此其免疫原性與極烈性病毒相同，或幾乎相同。
本發(fā)明還提供了一種工程化重組鑲嵌IBDV(mIBDV)疫苗的方法，該疫苗具有一或多個(gè)所需表型，即i)能突破幼雞中高水平母體抗體并是高免疫原性的，ii)與野生型極烈性IBDV分離株相比致病性降低。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含rIBDV的感染性鑲嵌IBDV(mIBDV)，其中至少一個(gè)基因組節(jié)段包含衍生自至少兩個(gè)不同雙RNA病毒分離株的核酸，優(yōu)選地，其中至少一個(gè)所述分離株是vvIBDV，特征在于其在vvIBDV非允許細(xì)胞如VERO，QM5或CEF細(xì)胞上不能充分增殖，和/或特征在于在vvIBDV允許細(xì)胞如原始囊細(xì)胞上能充分增殖。例如，本發(fā)明提供了mIBDV，其由衍生自經(jīng)典減毒分離株(如CEF94)的部分基因組，和衍生自vvIBDV分離株(如D6948)的部分基因組組成。在衍生自極烈性IBDV分離株(D6948)的感染性cDNA的基礎(chǔ)上制備的并組合衍生自細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的血清型I經(jīng)典IBDV分離株(CEF94)的已知部分cDNA的重組鑲嵌IBDV(mIBDV)產(chǎn)生一種mIBDV分離株，其與在非B淋巴細(xì)胞衍生的細(xì)胞上基本不復(fù)制的野生型vvIBDV相比致病性降低。
另外，引起或不引起氨基酸突變的特異性核苷酸取代，或IBDV基因組的特異部分缺失，同樣導(dǎo)致產(chǎn)生的mIBDV的表型改變。例如，用D6948的cDNA的相應(yīng)區(qū)域置換CEF-94 cDNA的pVP2編碼區(qū)，產(chǎn)生質(zhì)粒pHB36-vvVP2。此質(zhì)粒隨后組合pHB-34Z轉(zhuǎn)染入FPT7(Britton等，1996)感染的QM5細(xì)胞中。接著將這些轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞的上清移至新鮮QM5細(xì)胞中。在使用IBDV的VP3蛋白的特異性抗體的IPMA中，這些QM5細(xì)胞無(wú)一呈陽(yáng)性反應(yīng)。另一方面，用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清覆蓋后的原始囊細(xì)胞，在相同IPMA中呈陽(yáng)性反應(yīng)。能進(jìn)入允許細(xì)胞如QM5細(xì)胞的功能特征明顯位于A節(jié)段的pVP2編碼區(qū)內(nèi)。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組vvIBDV(如rD6948)的方法，該重組vvIBDV具有在野生型vvIBDV(在此為D6948)中發(fā)現(xiàn)的pVP2序列。目前pVP2序列已經(jīng)闡述的所有極烈性分離株在第284氨基酸位還具有丙氨酸，其不能或略微能在CEF細(xì)胞上增殖(見(jiàn)表7和8)。另一方面，當(dāng)在第284位存在蘇氨酸時(shí)，可在CEF細(xì)胞上增殖，但這與喪失極烈性表型相關(guān)(見(jiàn)表7和8)。在此我們闡述了一種產(chǎn)生感染性重組IBDV(rIBDV)的方法，該rIBDV具有野生型IBDV分離株的核苷酸序列，包括第284位的丙氨酸密碼子，其不能在CEF細(xì)胞上增殖。另外，在我們的rD6948分離株中，在第279位存在天冬氨酸代替通常在可在CEF細(xì)胞上增殖的無(wú)毒的IBDV分離株中發(fā)現(xiàn)的天冬酰胺(表7和8)。rD6948是一種極烈性rIBDV，其不能在CEF細(xì)胞上生長(zhǎng)(表5)，并誘導(dǎo)與野生型極烈性D6948分離株所誘導(dǎo)的相似的臨床跡象和死亡率(表6)。與D6948，rD6948和srIBDV-DACB分離株(也具有衍生自vvIBDV的功能性VP2蛋白，見(jiàn)表6)相反，盡管mIBDV分離株(mCEF94-vvVP2)在9天時(shí)間內(nèi)不引起任何死亡率，或體重減輕，但其在感染9天后所引起的腔上囊重量減輕與野生型極烈性D6948分離株相同。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑲嵌IBDV，其中至少一種所述的分離株是血清型II IBDV。這種mIBDV，優(yōu)選也缺失至少一個(gè)特異于血清型I IBDV的優(yōu)勢(shì)免疫表位，其是(r)D6948衍生的疫苗病毒如mD6948-s2VP3C1，其還具有衍生自vvIBDV的功能性VP2蛋白，使得可以用標(biāo)記疫苗接種。用IBDV標(biāo)記疫苗接種及隨后用相應(yīng)的診斷試驗(yàn)測(cè)試，可區(qū)分由疫苗誘導(dǎo)的和由IBDV野外分離株感染誘導(dǎo)的抗體。此mIBDV可與屬于血清型I或II的所有其它已知野生型IBDV分離株區(qū)分，例如通過(guò)使用特異性單克隆抗體。從血清型I和II cDNA中產(chǎn)生mIBDV提供了這樣一種mIBDV標(biāo)記疫苗，其誘導(dǎo)雞體內(nèi)血清學(xué)應(yīng)答，該應(yīng)答可與由IBDV野外毒株誘導(dǎo)的血清學(xué)應(yīng)答區(qū)分。本發(fā)明提供的缺失至少一個(gè)優(yōu)勢(shì)免疫表位，優(yōu)選血清型I表位的標(biāo)記疫苗，能通過(guò)診斷性血清學(xué)試驗(yàn)區(qū)分接種的和感染的動(dòng)物。這種mIBDV標(biāo)記疫苗優(yōu)選基于vvIBDV，及含有源自經(jīng)典血清型I或血清型IIIBDV的特異性序列。這種mIBDV標(biāo)記疫苗具有一或多種以下特性i)盡管有高水平的母體抗體存在，其誘導(dǎo)抗vvIBDV野外病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。ii)與基于野生型vvIBDV的疫苗相比，其致病性降低。iii)其例如缺失至少一個(gè)血清型I特異性抗原，使得能從所有血清型I IBDV分離株中血清學(xué)區(qū)分mIBDV標(biāo)記疫苗。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)或產(chǎn)生抗IBDV的特異性抗原性變體的特制疫苗的方法，其通過(guò)在mIBDV疫苗病毒中摻入特異性氨基酸變化而進(jìn)行。根據(jù)組成，這些鑲嵌的IBD病毒(mIBDV)具有不同的表型和不同的抗原性。在一個(gè)病毒蛋白中的一個(gè)特異性突變可對(duì)IBDV存活性有深刻影響。我們發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)致在VP4中單氨基酸突變(V582A)的單核苷酸取代的情況中就是這樣。當(dāng)存在此特殊的核苷酸取代時(shí)，沒(méi)有rIBDV可從cDNA中拯救。不僅是在VP4自身編碼區(qū)內(nèi)的突變，而且在切割位點(diǎn)(pVP2-VP4和VP4-VP3)區(qū)域中的突變或缺失，可對(duì)rIBDV的復(fù)制有負(fù)面影響。在其它病毒蛋白中的突變，或者甚至一完整病毒蛋白(即VP5)缺失，也影響復(fù)制和或毒性。通過(guò)在CEF適應(yīng)的D78 IBDV分離株的cDNA中導(dǎo)入突變，已經(jīng)構(gòu)建了兩組去除VP5的rIBDV分離株(Mundt等，1997；Yao等，1998)。明顯的，VP5蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，也是一種非必需蛋白質(zhì)。Yao等報(bào)道了失活VP5的ORF(用終止密碼子代替起始密碼子)，產(chǎn)生感染性rIBDV(rD78NS，其與rD78相比在體外生長(zhǎng)至略較低效價(jià))，而Mundt等報(bào)道了失活VP5的ORF(用精氨酸密碼子置換起始密碼子)產(chǎn)生rIBDV(IBDV/VP5-)，其在體外能生長(zhǎng)至與親代分離株相同效價(jià)。另外Yao等報(bào)道了rD78NS在細(xì)胞培養(yǎng)物中胞毒性和細(xì)胞程序死亡作用降低，及與親代分離株(體內(nèi))相比復(fù)制延遲(體外)，且在感染的雞中不能誘導(dǎo)任何病理?yè)p害或疾病臨床跡象。
mIBDV cDNA中的突變或缺失產(chǎn)生一種具有所需表型的mIBDV，即基于極烈性分離株，但復(fù)制能力降低，因此致病原性降低的mIBDV。將來(lái)自血清型II的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的IBDV分離株(TY89)的cDNA序列導(dǎo)入鑲嵌病毒中，給我們提供了另一種產(chǎn)生標(biāo)記mIBDV疫苗的機(jī)會(huì)，該疫苗可與野生型血清型I IBDV區(qū)分，例如通過(guò)使用特異性單克隆抗體。這種mIBDV可用于誘導(dǎo)抗體譜。其不同于由IBDV野外分離株誘導(dǎo)的抗體譜。這使得可以進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)以確定IBDV抗體是否是接種活mIBDV或用IBDV野外分離株感染的結(jié)果。例如，mCEF94-s2VP3C病毒被血清型II特異性VP3抗體(Mab T75)識(shí)別，其也可以由血清型I特異性VP2抗體(Mab1.4)識(shí)別。另一方面，此特定rIBDV不被血清型I特異性VP3抗體(MabB10)識(shí)別。在mCEF94-s2VP3C和rCEF94的復(fù)制之間沒(méi)有明顯不同，表明VP3C末端部分的交換不引起在QM5細(xì)胞中復(fù)制能力有主要變化，另一方面，當(dāng)完整的VP3編碼區(qū)被交換時(shí)，我們觀測(cè)到所得病毒(mCEF94-s2VP3)的復(fù)制能力嚴(yán)重降低。另一方面，mCEF94-s2VP3N與Mab C3(VP3，血清型I)不反應(yīng)，而其與Mab B10(VP3，血清型I)充分反應(yīng)，及與Mab T75(VP3，血清型II)只部分反應(yīng)。此鑲嵌IBDV在CEF細(xì)胞上的復(fù)制與rCEF94相比降低。從基于衍生自血清型I(CEF94)和血清型II(TY89)的cDNA產(chǎn)生的mIBDV中，清楚的是基于VP3的血清學(xué)標(biāo)記已經(jīng)鑒別。用血清學(xué)I的(部分)VP3的cDNA置換血清學(xué)II的相應(yīng)部分，導(dǎo)致在一個(gè)mIBDV分離株中獨(dú)特的IBDV抗原組合。基于此抗原組合的一個(gè)mIBDV分離株可用作IBDV標(biāo)記疫苗。
將TY89(血清型II)的VP3的C末端部分導(dǎo)入D6948的cDNA中，產(chǎn)生鑲嵌IBDV(mD6948-s2VP3C1)，其與D6948或rD6948相比毒性降低(無(wú)死亡率，無(wú)體重降低)(表6)。此mIBDV，或更多或更少毒性的可比分離株，在用作IBDV標(biāo)記疫苗方面也是有利的，可預(yù)防極烈性IBDV野外分離株的感染。
另外，本發(fā)明提供了用位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)，在mIBDV完整基因組內(nèi)導(dǎo)入任何所需的核苷酸突變的方法。使用這種方法，可適應(yīng)mIBDV疫苗以進(jìn)行進(jìn)一步抗原性改變，這通過(guò)將在IBDV野外分離株的抗原性變體中發(fā)現(xiàn)的任何突變包括進(jìn)來(lái)而進(jìn)行。另外，本發(fā)明可用屬于另一屬的雙RNA病毒(例如DXV，IPNV，OV，TV)的相應(yīng)部分交換部分IBDV基因組序列。另外，本發(fā)明提供了新的鑲嵌雙RNA(mBima)病毒，其具有新的特性產(chǎn)生新的IBDV或其它雙RNA病毒的重組疫苗。使用其它雙RNA病毒(例如DXV，IPNV，OV或TV)的cDNA也產(chǎn)生新的IBDV疫苗。在此方法中，一或多個(gè)IBDV優(yōu)勢(shì)免疫表位或中和表位用另一種雙RNA病毒蛋白的相應(yīng)部分交換。
當(dāng)然，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明rIBDV的方法，所述載體包含衍生自另一種病毒或(微)生物的異源核酸序列，從而rIBDV或mIBDV用作載體。例如，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生IBDV感染性拷貝的方法，其表達(dá)一或多個(gè)來(lái)自其它病原的抗原，并可用于接種以抗多種疾病。這種IBDV感染性拷貝例如包含編碼得自病原體的異源蛋白的異源cDNA，例如得自家禽病原體。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生IBDV的條件致死缺失突變體的方法，其可用作自身限制性非傳染性(載體)疫苗。這種IBDV缺失突變體不能表達(dá)IBDV蛋白，其通過(guò)其它方法補(bǔ)充丟失的蛋白而表型互補(bǔ)。
在詳細(xì)描述部分進(jìn)一步解釋了本發(fā)明，而無(wú)限制之意。
詳細(xì)描述材料和方法病毒和細(xì)胞
IBDV分離株CEF 94是PV1的衍生物(Petek等，1973)。在1973年在我們的實(shí)驗(yàn)室得到PV1分離株后，我們通過(guò)重復(fù)傳代(＞25次)將此分離株適應(yīng)原始雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞或囊細(xì)胞。極烈性IBDV分離株D6948最初是在1989年由家禽健康服務(wù)機(jī)構(gòu)(Doorn，荷蘭)分離的，其通過(guò)在含胚卵中經(jīng)5次傳代和在SPF來(lái)亨雞中接著進(jìn)行1次傳代純化。IBDV血清型II分離株TY89(McFerran等，1980)通過(guò)在CEF細(xì)胞上限量傳代，保存在我們的實(shí)驗(yàn)室中。擴(kuò)增IBDV的CEF適應(yīng)的分離株(CEF94和TY89)，是通過(guò)將新鮮制備的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)直至接近鋪滿(mǎn)而進(jìn)行的。將此細(xì)胞培養(yǎng)物用CEF94或TY89感染(moi＝0.1)，并在37℃在5％CO2的溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)物上清在6000g離心15分鐘(沉淀碎片)，將上清移至干凈的試管中并接著在33000g離心3小時(shí)。將病毒沉淀再懸浮于PBS中(1％起始培養(yǎng)體積)。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，將極烈性IBDV分離株D6948增殖，通過(guò)在21天齡的雞中，以每只雞經(jīng)滴鼻劑或滴眼劑接種200 ELD50(卵死亡劑量)進(jìn)行。從感染3天后的雞中收集腔上囊，并加入兩體積的胰蛋白 磷酸鹽緩沖液。將此混合物在Sorval Omnimixer中均質(zhì)(3×10秒，最大速度)，并接著離心澄清(6000g，10分鐘)。將上清移至干凈試管中，用氟利昂提取3次，用氯仿提取1次。將病毒制品貯存在-70℃直至進(jìn)一步使用。QM5細(xì)胞(Antin和Ordahl，1991)得自R.Duncan實(shí)驗(yàn)室(Dalhouse大學(xué)，Halifax，Nova Scotia，加拿大)，并用QT35培養(yǎng)基(Fort Dodge)在CO2溫箱(37℃)中維持。分離病毒dsRNA基因組dsRNA純化自IBDV顆粒，是通過(guò)用蛋白酶K(Amresco，1.0mg/ml)，在存在0.5％SDS的情況下，在50℃在2小時(shí)期間內(nèi)消化病毒蛋白而得的。將病毒dsRNA通過(guò)苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取(兩次)，并用乙醇(2.5v)/NaCl(0.1v，5M，pH4.8)或用2M氯化鋰(Diaz-Ruiz和Kaper，1978)沉淀。將RNA溶解于DEPC處理的水(10％初始體積)中，并貯存于-20℃直至進(jìn)一步使用。在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)病毒RNA的完整性和純度。快速擴(kuò)增cDNA末端測(cè)定CEF94分離株的所有基因組RNA鏈(A和B節(jié)段的編碼鏈和非編碼鏈)的5’末端。每次測(cè)定我們使用2ug基因組dsRNA和10pmol鏈和節(jié)段特異性引物，總體積為12ul。在95℃溫育5分鐘后，將此混合物移至冰上，并加入4ul Superscript II第一鏈合成緩沖液(Gibco/BRL)，2ul的100mM DTT和2ul的dNTP’s(各10mM)。將此混合物在52℃溫育2分鐘，之后加入1ul逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII，Gibco/BRL)，并在52℃持續(xù)溫育1小時(shí)。將逆轉(zhuǎn)錄酶通過(guò)加入1ul的0.5M EDTA滅活。基因組dsRNA通過(guò)加入2ul的6M NaOH及在65℃溫育30分鐘而破壞。為進(jìn)行中和，加入2ul的6M乙酸，通過(guò)用Qiaex DNA提取試劑盒(Qiagen)回收cDNA，并最后溶解于6ul水中。在錨連接反應(yīng)中，我們使用2.5ul的cDNA制備物，4pmol錨，5ul T4連接緩沖液和0.5ul T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)。在室溫溫育16小時(shí)，將反應(yīng)物貯存在-20℃。為擴(kuò)增連接于錨的單鏈cDNA，我們使用與錨引物組合的嵌套引物。根據(jù)以下條件進(jìn)行PCR10pmol每種特異性引物，10pmol錨引物，4.5或5.5mM MgCl2，1*Taq緩沖液(Perkin Elmer)，50uM每種dNTP，3單位Taq聚合酶(Perkin/Elmer)，和4ul RNA連接混合物作模板，總體積50ul。將擴(kuò)增在92℃(45秒)，57或65℃(45秒)，和72℃(90秒)溫度水平循環(huán)35次。將所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化并用EcoRI和XbaI消化，并與預(yù)先用相同限制酶消化的pUC18載體連接(T4 DNA連接酶，Pharmacia)。所得質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增，并通過(guò)用M13F和M13R引物進(jìn)行核苷酸序列分析。產(chǎn)生A和B節(jié)段全長(zhǎng)單鏈cDNA為產(chǎn)生CEF94和D6948的A和B節(jié)段的全長(zhǎng)單鏈cDNA，我們?cè)谀孓D(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用一種特異于編碼鏈3’末端的引物，以開(kāi)始合成cDNA。我們用1ug基因組RNA和2.5pmol的ANC1(A節(jié)段特異性引物，表2)或BNC1(B節(jié)段特異性引物，表2)作模板，總體積為10ul。在98℃溫育2分鐘后，將此混合物立即移至冰上，并加入含有2*Superscript II第一鏈合成緩沖液(Gibco/BRL)，20mMDTT，2mM每種dNTP和100單位Superscript II(Gibco/BRL)的10ulRT混合物。在陰性對(duì)照反應(yīng)中，不加入Superscript II酶。將所有試管在50℃溫育30分鐘，之后加入0.5單位的RNase H，并在37℃持續(xù)溫育15分鐘。在每個(gè)試管中加入水(80ul)，通過(guò)苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取，及用標(biāo)準(zhǔn)乙醇(2.5v)/NaAc沉淀方法沉淀。將所得沉淀溶解于20ul水中并貯存于-20℃。用基于PCR的方法擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA將A和B節(jié)段的全長(zhǎng)單鏈cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增。雜交于A節(jié)段(T7AC0，表2)和B節(jié)段(T7BC1，表2)的非編碼鏈3’末端的引物，均具有含有T7啟動(dòng)子序列和一個(gè)EcoRI位點(diǎn)的24nt的非雜交5’延伸。雜交于A節(jié)段(ANC0，表2)和B節(jié)段(BNC1，表2)的編碼鏈5’末端的引物精確匹配。我們使用5ul上述RT反應(yīng)物作模板，在存在1*Expand HiGH Fidelity緩沖液，50uM每種dNTP，0.2pmol每種引物，1.5單位Expand High Fidelity酶，和2.0mM MgCl2(A節(jié)段)或4.0mM MgCl2(B節(jié)段)的情況下進(jìn)行PCR。在A節(jié)段擴(kuò)增的情況中(A程序)，擴(kuò)增在94℃(15秒)，58℃(15秒)和72℃(5分鐘)溫度條件下循環(huán)35次，在B節(jié)段擴(kuò)增的情況中(B程序)，擴(kuò)增在94℃(15秒)，54℃(15秒)和72℃(5分鐘)溫度條件下循環(huán)35次，使用Biometra T3熱循環(huán)儀。在1.0％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。克隆和分析產(chǎn)生的PCR片段將從基因組dsRNA中經(jīng)3次獨(dú)立的反應(yīng)產(chǎn)生的全長(zhǎng)PCR片段，通過(guò)用Qiaex凝膠純化試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離，并根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)連接在pGEM-Teasy(Promega)載體中。將連接的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α細(xì)胞，將該細(xì)胞接著在氨芐青霉素(100ug/ml)選擇下，在存在IPTG(0.8mg/培養(yǎng)皿)和Bluo-gal(0.8mg/培養(yǎng)皿)的情況下生長(zhǎng)。制備白色菌落的質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制酶消化和瓊脂糖凝膠分離進(jìn)行分析。將克隆的cDNA的核苷酸序列通過(guò)用ABI310自動(dòng)測(cè)序儀和A和B節(jié)段特異性引物測(cè)定。測(cè)定CEF94的兩個(gè)節(jié)段和D6948的兩個(gè)節(jié)段的共有核苷酸序列(圖2)，并推導(dǎo)開(kāi)放讀框的相應(yīng)氨基酸序列(圖3)。通過(guò)使用兩個(gè)獨(dú)立克隆的cDNA，我們恢復(fù)了在A節(jié)段克隆中存在的一個(gè)氨基酸突變(V542A)，產(chǎn)生pHB-36W，在D6948的A節(jié)段克隆中的一個(gè)氨基酸突變(P677L)，產(chǎn)生pHB-60，及在D6948的B節(jié)段中的一個(gè)氨基酸突變(Q291X)，產(chǎn)生pHB-55。在CEF94的B節(jié)段cDNA克隆(pHB-34Z)中不存在氨基酸突變。導(dǎo)入丁型肝炎病毒核酶通過(guò)用限制酶XbaI和SmaI消化轉(zhuǎn)錄載體2.0(Pattnaik等，1992)將丁型肝炎病毒核酶首先導(dǎo)入大腸桿菌高拷貝數(shù)質(zhì)粒pUC-18中。將含有丁型肝炎病毒核酶和T7 RNA聚合酶終止子的所得236bp的片段，連接于預(yù)先用XbaI和SmaI消化的pUC18中，產(chǎn)生pUC-Ribo。將含有CEF94和D6948的A和B節(jié)段的質(zhì)粒在全長(zhǎng)PCR中用作模板，使用上述條件和特異于A節(jié)段(T7AC0和ANC0)和B節(jié)段(T7BC1和BNC1)的引物。將PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠(Qiaex)純化，用T4 DNA聚合酶平端化，接著用EcoRI消化。將所得DNA片段直接克隆入pUC-Ribo載體中，該載體預(yù)先用SmaI和EcoRI消化。將所得質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄一翻譯反應(yīng)中用作模板(TnT-T7Quick，Promega)。當(dāng)pHB-36A(CEF94的A節(jié)段)或pHB-60(D6948的A節(jié)段)用作模板時(shí)，翻譯產(chǎn)物的SDS-PAGE分析的放射自顯影圖顯示3個(gè)主要條帶pVP2(48-49kDa)，VP3(32-33kDa)，和VP4(28-29kDa)。當(dāng)質(zhì)粒pHB-34Z(CEF94的B節(jié)段)或pHB-55(D6948的B節(jié)段)用作模板時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)主要條帶(VP1(91kDa))(數(shù)據(jù)未示出)。導(dǎo)入遺傳標(biāo)記為區(qū)別產(chǎn)生自野生型病毒或克隆的cDNA的感染性病毒，我們?cè)贗BDV-A分離株的A節(jié)段的3’-UTR中導(dǎo)入遺傳標(biāo)記。突變pHB-36A的兩個(gè)核苷酸(C3172T和T3173A)，從而導(dǎo)入一個(gè)單一的KpnI限制位點(diǎn)(GGTAAC)。這些突變通過(guò)Higuchi(1990)所述方法導(dǎo)入。將所得PCR片段的一個(gè)383bp的片段，通過(guò)使用兩個(gè)單一的限制位點(diǎn)(BglII和BlpI)，連接于全長(zhǎng)A節(jié)段克隆(pHB-36A)中(快速連接試劑盒，Boehringer Mannheim)。將所得質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增。在此全長(zhǎng)CEF94 A節(jié)段克隆中存在遺傳標(biāo)記，這可從序列分析和用限制酶KpnI消化證實(shí)(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中用pHB-36A或pHB-36W作為模板時(shí)，在所得蛋白質(zhì)模式中未觀測(cè)到不同(數(shù)據(jù)未示出)。構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段cDNA我們構(gòu)建了含有鑲嵌IBDV A節(jié)段的質(zhì)粒，其由一個(gè)分離株(CEF94)的部分cDNA和另一個(gè)分離株(D6948)的部分cDNA組成。為構(gòu)建這些質(zhì)粒，我們已經(jīng)用適當(dāng)?shù)腎BDV特異性或選擇性引物擴(kuò)增了cDNA的特異部分。隨后將D6948的cDNA的擴(kuò)增的PCR片段用于置換質(zhì)粒pHB-36W中的相應(yīng)部分，使用限制內(nèi)切酶和T4DNA連接酶進(jìn)行(快速DNA連接，Boehringher Mannheim)。
為構(gòu)建pHB36-vvVP2(交換pVP2編碼部分，表4)，我們用IBDV特異性引物產(chǎn)生嵌合PCR-VP2D片段(2256bp，見(jiàn)圖5a)。此PCR片段的內(nèi)部部分用于交換pHB-36W的相應(yīng)部分，使用限制酶EcoRI和SacII的單一位點(diǎn)。為構(gòu)建質(zhì)粒pHB36-vvVP3(表4)，我們使用IBDV特異性引物產(chǎn)生嵌合PCR-VP3c片段(2154bp，見(jiàn)圖5b)。此PCR片段的內(nèi)部部分用于交換pHB-36W的相應(yīng)部分，使用限制酶EagI和KpnI的單一位點(diǎn)(遺傳標(biāo)記位點(diǎn))。
為構(gòu)建質(zhì)粒pHB36-vvVP4(表4)，我們使用IBDV特異性引物產(chǎn)生嵌合PCR-VP4d片段(2154bp，見(jiàn)圖5c)。此PCR片段的內(nèi)部部分用于交換pHB-36W的相應(yīng)部分，使用限制酶EagI和DraIII的單一位點(diǎn)(遺傳標(biāo)記位點(diǎn))。
通過(guò)確定核苷酸序列對(duì)質(zhì)粒pHB36-vvVP2，-vvVP3，和-vvVP4進(jìn)行部分分析，以證實(shí)在所述操作期間未導(dǎo)入非有意的突變。導(dǎo)入血清學(xué)標(biāo)記為獲得血清型IIIBDV分離株A節(jié)段的cDNA，我們通過(guò)使用ANC1引物，如上述產(chǎn)生了TY89的單鏈cDNA。接著將VP3蛋白的編碼區(qū)在PCR中進(jìn)行3次獨(dú)立擴(kuò)增，使用2ml RT材料，1*Taq緩沖液，50uM每種dNTP，兩個(gè)IBDV血清型II特異性引物(每個(gè)0.2pmol)，1.5單位酶，和3.0mM MgCl2，反應(yīng)體積0.1ml。擴(kuò)增在94℃(15秒)，52℃(15秒)和72℃(1分鐘)的溫度條件下循環(huán)35次。將所得956bp的片段克隆入pGEM-TEasy載體中，并確定共有的核苷酸序列(圖2a)。分離的質(zhì)粒中有一個(gè)含有TY89 VP3共有序列(pSV-VP3-TY89，圖4)，并用作模板以產(chǎn)生一個(gè)893bp的PCR片段(見(jiàn)圖5d)。接著通過(guò)使用在質(zhì)粒pSV-VP3-TY89和pHB36W-vvVP3中人工導(dǎo)入的KpnI(nt3175)和SacII(nt1760)限制位點(diǎn)將此PCR片段用于置換質(zhì)粒pHB36W-vvVP3的相應(yīng)部分。所得質(zhì)粒(pHB36-vvVP3，見(jiàn)圖5d)編碼CEF94多蛋白N末端的722個(gè)氨基酸和TY89多蛋白C末端的290個(gè)氨基酸。所述交換通過(guò)核苷酸序列分析證實(shí)。
使用相同方法交換VP3蛋白編碼序列的C末端部分。我們使用天然存在于TY89和CEF94的A節(jié)段cDNA中的ScaI(nt2799)位點(diǎn)，而非人工導(dǎo)入的SacII位點(diǎn)，組合人工導(dǎo)入的KpnI位點(diǎn)(nt3172)。所得質(zhì)粒(pHB36-s2VP3C，表4)編碼一種多蛋白，該多蛋白由CEF94多蛋白N末端的890個(gè)氨基酸，和TY89多蛋白C末端的122個(gè)氨基酸組成。
為構(gòu)建質(zhì)粒pHB36-s2VP3N(見(jiàn)表4)，我們將質(zhì)粒pHB36-s2VP3的ScaI(nt2799)-KpnI(nt3172)部分，用質(zhì)粒pHB-36W的相應(yīng)部分置換。使用特異限制性?xún)?nèi)切酶ScaI和KpnI，及T4連接酶。質(zhì)粒pHB36-s2VP3N的核苷酸序列通過(guò)序列分析證實(shí)。
為將IBDV分離株TY89的VP3蛋白的C末端編碼部分導(dǎo)入分離株D6948的cDNA中，我們將質(zhì)粒pHB-60的一部分(nt1760-nt3260)用質(zhì)粒pHB36-s2VP3C的相應(yīng)部分交換。將質(zhì)粒pHB36-s2VP3C用限制酶SacII和XbaI消化，并通過(guò)Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiaex)從瓊脂糖凝膠中回收1735bp片段。將此DNA片段連接于4440bp的pHB-60的載體片段中，該載體預(yù)先用相同的限制酶消化。所得質(zhì)粒(pHB60-s2VP3C1，表4)含有衍生自IBDV分離株D6948(nt1-1760)，CEF94(ntl760-2799和nt3175-3260)和TY89(nt2799-3175)的cDNA。轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞將在60mm平皿中生長(zhǎng)至80％鋪滿(mǎn)的QM5細(xì)胞，用Foml Pox T7(FPT7)(Britton等，1996)感染1小時(shí)，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。FPT7感染的QM5細(xì)胞接著用5ml QT-35培養(yǎng)基沖洗一次，及用2ml新鮮Optimem1(Gibco/BRL)在15分鐘內(nèi)溫育2次。同時(shí)，將DNA(2.0-4.0ug)在補(bǔ)加25ul LipofectAMINE(Gibco/BRL)的0.5ml Optimem1中溫育，并在室溫至少保持30分鐘。將沖洗的QM5細(xì)胞用4mlOptimem 1覆蓋，加入DNA/LipofectAMINE轉(zhuǎn)染混合物，并將細(xì)胞在5.0％CO2溫箱中在37℃貯存18小時(shí)。在轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞后檢測(cè)重組的IBDV將轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后用PBS沖洗一次。自轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞中回收感染性重組IBDV(rIBDV)，通過(guò)將它們用4ml QT-35培養(yǎng)基覆蓋，并在37℃(5.0％CO2)溫育24小時(shí)而得，所述QT-35培養(yǎng)基補(bǔ)加了5％小牛血清和2％抗生素混合物(1000U/ml青霉素，1000ug/ml鏈霉素，20ug/ml兩性霉素B，500ug/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)。將上清通過(guò)200mM濾膜(Acrodisc)過(guò)濾以除去FPT7病毒，接著貯存在-70℃或直接用于定量rIBDV。至少含有來(lái)自vvIBDV分離株D6948的pVP2的重組鑲嵌IBDV(mIBDV)，不能再感染QM5細(xì)胞(見(jiàn)表5)。因此，將含有D6948 pVP2編碼cDNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的上清，通過(guò)尿囊絨膜(CAM)途徑用于感染11天齡含胚卵。為確定感染性IBDV的存在情況，在感染5天后收集胚，用Sorval Omnimixer均質(zhì)(3×10秒，最大速度)，并在IBDV蛋白質(zhì)特異性ELISA中分析IBDV蛋白的存在情況。重組鑲嵌IBDV(mIBDV)的血清學(xué)鑒別將不同的單克隆抗體用于檢測(cè)含有部分TY89 VP3或完整TY89VP3的重組鑲嵌IBDV(mIBDV)。將mIBDV用于感染QM5或原始囊細(xì)胞，并分別在37℃或39℃在5％CO2溫箱中溫育24小時(shí)(QM5細(xì)胞)或48小時(shí)(原始囊細(xì)胞)。接著將感染的細(xì)胞固定，通過(guò)用單克隆抗體進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)，所述單克隆抗體特異于血清型IIBDV的VP2(Mab1.4)，或特異于血清型II的VP3(Mab T75)，或特異于血清型I的VP3(Mab B-10或C-3)rIBDV在SPF幼雞中的毒力為評(píng)價(jià)產(chǎn)生的rIBDV，srIBDV和mIBDV分離株的毒力程度，我們用這些病毒接種了12組(10個(gè)21天齡SPF雞)。每只雞通過(guò)滴鼻劑和滴眼劑給予1000 ELD50的IBDV，陰性對(duì)照組只給予PBS。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的臨床跡象，每天除去死亡的雞。在感染9天后，將陰性對(duì)照組的所有雞和其中發(fā)生死亡的組中所有存活的雞放血(5ml)，并進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢。在其它的組中，在感染后第9天對(duì)6只雞放血(5ml)并尸檢，而另外4只在感染后第15天放血(5ml)并尸檢。對(duì)在感染后第9天進(jìn)行安死術(shù)的所有雞確定其腔上囊重和體重。結(jié)果確定5’末端的核苷酸序列一個(gè)小組已經(jīng)報(bào)道了IBDV的分節(jié)段dsRNA基因組的5’和3’末端序列(Mundt和Muller，1995)。為核實(shí)IBDV基因組的末端序列，及能產(chǎn)生單一IBDV分離株的準(zhǔn)確cDNA序列，我們用RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)方法(Frohman等，1988)，確定了CEF94(這是一種適應(yīng)雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞的經(jīng)典IBDV分離株)的兩個(gè)基因組節(jié)段的編碼鏈和非編碼鏈的5’末端序列。RACE分析是以雙份重復(fù)對(duì)CEF94基因組的4個(gè)5’末端的每一個(gè)進(jìn)行分析。所得序列數(shù)據(jù)(表3)示出編碼鏈的5’末端長(zhǎng)度在所有情況中均相同。另外我們發(fā)現(xiàn)核苷酸序列是相同的，除了最后的核苷酸在少數(shù)克隆中有變化。這與非編碼鏈的5’末端的序列數(shù)據(jù)相反，非編碼鏈的5’末端序列長(zhǎng)度顯著變化。我們還發(fā)現(xiàn)最后的核苷酸，盡管優(yōu)選是胞嘧啶，在一些克隆中是變化的，與我們?cè)诰幋a鏈的5’末端中發(fā)現(xiàn)的相類(lèi)似。CEF94的A節(jié)段編碼鏈的3’末端核苷酸的共有序列，與Mundt和Muller(Mundt和Muller，1995)報(bào)道的核苷酸序列不同，即是胞嘧啶而非胸腺嘧啶。產(chǎn)生含有全長(zhǎng)IBDV cDNA的質(zhì)粒使用5’末端的序列數(shù)據(jù)，我們通過(guò)RT-PCR，克隆了經(jīng)典分離株CEF94的A節(jié)段和B節(jié)段的完整的編碼和非編碼cDNA序列。使用相同方法和相同引物，我們還產(chǎn)生了非CEF適應(yīng)的極烈性IBDV分離株D6948的A節(jié)段和B節(jié)段的完整的編碼和非編碼cDNA序列。對(duì)這兩種分離株的全部基因組的核苷酸序列獨(dú)立測(cè)定3次。此序列信息使我們能產(chǎn)生IBDV分離株CEF94和D6948的A節(jié)段和B節(jié)段的共有核苷酸序列(圖2A)。禽痘病毒T7聚合酶表達(dá)系統(tǒng)先前已經(jīng)闡述了一種用衍生自CEF適應(yīng)的IBDV分離株的cDNA的體外合成的mRNA產(chǎn)生感染性IBDV病毒的系統(tǒng)(Mundt和Vakharia，1996)。此系統(tǒng)基于從T7啟動(dòng)子在體外進(jìn)行失控轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子是經(jīng)人工導(dǎo)入在A和B節(jié)段cDNA序列之前。此RNA接著轉(zhuǎn)染入VERO細(xì)胞中，之后從這些細(xì)胞中可收獲感染性IBDV病毒。此系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是在體外產(chǎn)生的RNA在其5’末端要含有3’-G-ppp5’-(帽序列)，才能將導(dǎo)入的RNA翻譯成病毒蛋白，并因此復(fù)制病毒RNA。因?yàn)樵?’末端要存在帽結(jié)構(gòu)，因此體外產(chǎn)生高品質(zhì)的mRNA效率低且昂貴。另外，轉(zhuǎn)染的RNA的表達(dá)水平通常較低，因?yàn)镽NA的半衰期較短所致。為解決在體外產(chǎn)生加帽的RNA及其低水平表達(dá)的缺點(diǎn)，我們嘗試用體內(nèi)基礎(chǔ)的T7表達(dá)系統(tǒng)(禽痘病毒T7聚合酶表達(dá)系統(tǒng)，(Britton等，1996))，從含有全長(zhǎng)IBDV cDNA的質(zhì)粒中產(chǎn)生病毒RNA。用禽痘病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生感染性IBDV為能從具有真末端序列的克隆的cDNA中產(chǎn)生IBDV，我們將順式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶(Chowrira等，1994)導(dǎo)入A和B節(jié)段cDNA序列的下游(圖4)。另外，我們?cè)贑EF94的A節(jié)段的3’未翻譯區(qū)中導(dǎo)入另外一個(gè)修飾。通過(guò)交換2個(gè)核苷酸，我們?cè)诖薱DNA中導(dǎo)入了一個(gè)單一的KpnI內(nèi)切酶限制位點(diǎn)。導(dǎo)入此單一限制位點(diǎn)能使我們區(qū)別野生型IBDV和產(chǎn)生自克隆的cDNA的感染性IBDV病毒(遺傳標(biāo)記的rIBDV)。與預(yù)期一致，此質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)中，與沒(méi)有遺傳標(biāo)記的A節(jié)段克隆產(chǎn)生同樣的病毒蛋白(數(shù)據(jù)未示出)。
如在材料與方法章節(jié)所述，將質(zhì)粒pHB-36W(A節(jié)段CEF94)，pHB-60(A節(jié)段D6948)，pHB-34Z(B節(jié)段CEF94)，和pHB-55(B節(jié)段D6948)，各自用于轉(zhuǎn)染FPT7感染的QM5細(xì)胞。為分析轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞是否表達(dá)IBDV蛋白，在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行IPMA。在此分析中我們使用多克隆抗血清，該抗血清抗VP3(pHB-36W和pHB-60轉(zhuǎn)染)或VP1(pHB-34Z和pHB-55轉(zhuǎn)染)。在用pHB-36W或pHB-60轉(zhuǎn)染后，大約10-50％的QM5細(xì)胞表達(dá)VP3(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)使用B節(jié)段編碼質(zhì)粒時(shí)(pHB-34Z或pHB-55)，我們發(fā)現(xiàn)相同百分率(10-50％)的細(xì)胞表達(dá)VP1(數(shù)據(jù)未示出)。接著，我們將含有A和B節(jié)段cDNA的質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)染入FPT7感染的QM5細(xì)胞中。為在轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞的上清中篩選感染性重組IBDV(rIBDV)，我們?cè)?8小時(shí)后將部分上清(10％體積)移至新鮮QM5細(xì)胞或原始囊細(xì)胞上。當(dāng)A節(jié)段質(zhì)粒與B節(jié)段質(zhì)粒組合用于轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞時(shí)，我們只能檢測(cè)到rIBDV。當(dāng)用D6948(rD6948)的A節(jié)段(pHB-60)和B節(jié)段(pHB-55)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清移至QM5細(xì)胞上時(shí)，不能檢測(cè)到rIBDV。然而，當(dāng)將pHB-60和pHB-55的共轉(zhuǎn)染上清移至原始囊細(xì)胞或含胚卵上時(shí)，我們能示出在原始囊細(xì)胞中(48小時(shí)后)和含胚卵(5天后)中存在感染性IBDV(rD6948)。在第一次傳代中存在rIBDV是通過(guò)用IPMA(QM5細(xì)胞或原始囊細(xì)胞)，或IBDV特異性ELISA(含胚卵)確定的。將產(chǎn)生的rCEF94和rD6948分離株在10天齡SPF含胚卵中擴(kuò)增，并接著用于感染21天齡的SPF雞(每種IBDV分離株感染10只雞)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所得數(shù)據(jù)示出(表6)，由rD6948所致的死亡率，體重，腔上囊重，和腔上囊重-體重比值，與親代極烈性D6948分離株所致相同。在尸檢中，rD6948所致的囊的總損害與親代D6948所致的同樣嚴(yán)重(數(shù)據(jù)未示出)。從此雞實(shí)驗(yàn)中，認(rèn)為rD6948保留了極烈性IBDV分離株的性質(zhì)，實(shí)際是一種極烈性rIBDV。檢測(cè)遺傳標(biāo)記收集rCEF94感染的QM5細(xì)胞的上清，并通過(guò)離心分離IBDV，如材料章節(jié)所述。提取dsRNA基因組，并通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶將A節(jié)段特異性引物用于產(chǎn)生單鏈cDNA。接著將此cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增。將產(chǎn)生的PCR片段克隆入高拷貝數(shù)大腸桿菌質(zhì)粒(pGEM-Teasy，Promega)中，并用KpnI消化或用于核苷酸序列確定。在兩個(gè)分析中證實(shí)rCEF94中存在遺傳標(biāo)記鑒別VP4中致死氨基酸突變與共有CEF94 A節(jié)段序列相比，質(zhì)粒pHB-36(A節(jié)段CEF94，表4)在1875位具有單一核苷酸取代(胸腺嘧啶代替胞嘧啶)(圖2A)。此核苷酸取代導(dǎo)致在多蛋白582位由纈氨酸代替由共有序列編碼的丙氨酸(V582A，圖3A)。由于此氨基酸突變存在于病毒蛋白酶(VP4)中，我們接著檢測(cè)此蛋白酶是否仍然能從多蛋白中自動(dòng)催化性釋出病毒蛋白(pVP2，VP3，和VP4)。當(dāng)質(zhì)粒pHB-36在存在35S標(biāo)記的甲硫氨酸時(shí)在偶聯(lián)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中用作模板時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)多蛋白剪接延遲(數(shù)據(jù)未示出)。除了在正常剪接的多蛋白中發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白(pVP2，VP3和VP4)之外，我們發(fā)現(xiàn)中間體剪接的產(chǎn)物(60kDaVP4+VP3)，和未剪接的多蛋白(數(shù)據(jù)未示出)。盡管pHB-36克隆的病毒蛋白酶(VP4)能從多蛋白中釋放結(jié)構(gòu)病毒蛋白(pVP2和VP3)，但當(dāng)使用如上所述基于FPT7的轉(zhuǎn)染方法時(shí)，此克隆不產(chǎn)生rIBDV?？焖僮詣?dòng)催化裂解多蛋白明顯是產(chǎn)生感染性rIBDV所需的。我們預(yù)期改變自動(dòng)催化裂解多蛋白的速率和特異性的VP4內(nèi)的其它突變，對(duì)產(chǎn)生的rIBDV的存活性也具有負(fù)面作用。裂解位點(diǎn)區(qū)域(pVP2-VP4，和VP4-VP3)內(nèi)的另外突變也可對(duì)rIBDV的復(fù)制有負(fù)面作用。通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法導(dǎo)入極烈性IBDV cDNA中的任何突變，可使我們產(chǎn)生存活性降低及可用作活的或滅活的IBDV疫苗的rIBDV。產(chǎn)生節(jié)段重排列IBDV當(dāng)將QM5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清移至新鮮QM5細(xì)胞上時(shí)，CEF94 A節(jié)段cDNA(pHB-36W)組合D6948 B節(jié)段cDNA(pHB-55)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生節(jié)段重排列的IBDV(srIBDV-CADB)。(表5)。當(dāng)組合使用D6948 A節(jié)段cDNA(pHB-60)和CEF94 B節(jié)段cDNA(pHB-34Z)時(shí)，在QM5細(xì)胞上無(wú)感染性srIBDV(srIBDV-DACB)可檢測(cè)到(表5)。然而，當(dāng)使用原始囊細(xì)胞分析感染性IBDV的存在情況時(shí)，在這兩種情況中(srIBDV-CADB和srIBDV-DACB)，在溫育24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)感染的細(xì)胞。在原始囊細(xì)胞群之外，只有淋巴細(xì)胞被srIBDV-DACB感染，而在srIBDV-CADB情況中，淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均被感染。srIBDV-DACB分離株與D6948誘導(dǎo)的臨床跡象相同，而srIBDV-CADB分離株與CEF94的毒力相當(dāng)(表6)。構(gòu)建鑲嵌IBDV通過(guò)使用上述的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，我們產(chǎn)生了鑲嵌重組IBDV(mIBDV)，其具有衍生自CEF94的部分cDNA，和衍生自D6948(vvIBDV)或TY89(血清型II IBDV分離株)的部分cDNA。當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清移至正常條件下對(duì)非CEF適應(yīng)的vvIBDV敏感的細(xì)胞(即原始囊細(xì)胞或含胚卵)上時(shí)，CEF94的pVP2蛋白編碼序列用D6948的相應(yīng)部分置換，產(chǎn)生病毒(mCEF94-vvVP2)(表5)。在第一次傳代中用QM5細(xì)胞作受體，將CEF94的VP3或VP4蛋白編碼序列用D6948的相應(yīng)部分置換，產(chǎn)生mIBDV(分別為mCEF-vvVP3和mCEF-vvVP4)。
將CEF94的完整VP3 cDNA(290個(gè)氨基酸)，用TY89 cDNA的相應(yīng)部分置換，產(chǎn)生一種編碼一種多蛋白的質(zhì)粒，該多蛋白由衍生自CEF94的pVP2和VP4及衍生自TY89的VP3組成。當(dāng)將此質(zhì)粒(pHB36-s2VP3)用于體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)時(shí)，存在所有期望的蛋白質(zhì)，pVP2，VP4和VP3(數(shù)據(jù)未示出)。將此質(zhì)粒組合含有CEF94的B節(jié)段cDNA的質(zhì)粒(pHB-34)轉(zhuǎn)染時(shí)，產(chǎn)生鑲嵌IBDV(mCEF94-s2VP3)。特異于血清型I VP3的兩種單克隆抗體(Mab B10和C3)，不能識(shí)別此mCEF94-s2VP3，而特異于血清型II VP3的一個(gè)抗體(Mab T75)識(shí)別此鑲嵌病毒(表5)。如所期望的，mCEF94-s2VP3也由抗CEF94分離株的VP2的血清型I特異性中和單克隆抗體(Mab1.4)識(shí)別。在mCEF94-s2VP3的情況中，在轉(zhuǎn)染18小時(shí)后在QM5細(xì)胞上確定的TCID50與rCEF94相比較低(3logs)。另外我們發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)后，只有單一的QM5細(xì)胞被mCEF94-s2VP3感染。這與在感染24小時(shí)后在QM5細(xì)胞上CEF94和rCEF94的噬斑形成表型相反。為產(chǎn)生與rCEF94具有相同復(fù)制和噬斑形成特性但抗原性與其不同的mIBDV，我們接著只將CEF94的VP3的N末端部分(168個(gè)氨基酸)或C末端部分(122個(gè)氨基酸)，用TY89的相應(yīng)部分交換。當(dāng)這些鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒(pHB36-s2VP3N或pHB36-s2VP3C)與pHB-34Z(CEF94 B節(jié)段)組合轉(zhuǎn)染時(shí)，我們獲得鑲嵌IBDV(mCEF94-s2VP3N，或mCEF94-s2VP3C)，其在QM5細(xì)胞中的復(fù)制能力與rCEF94 IBDV的復(fù)制能力相同(mCEF94-s2VP3C)或略低(mCEF94-s2VP3N)(數(shù)據(jù)未示出)。
接著我們?cè)赒M5感染的細(xì)胞上，用IPMA檢測(cè)一些單克隆抗體對(duì)mCEF94-s2VP3N和mCEF94-s2VP3C病毒的識(shí)別情況(表5)。特異于血清型II的VP3的Mab T75也識(shí)別mCEF94-s2VP3C，而識(shí)別mCEF94-s2VP3N的能力略低。特異于血清型I的VP3的Mab B10，不識(shí)別rCEF94-s2VP3C，但其仍識(shí)別mCEF94-s2VP3N。另一種與mCEF94-s2VP3感染的細(xì)胞不反應(yīng)的Mab(C3)，與mCEF94-s2VP3C感染的細(xì)胞反應(yīng)，盡管此反應(yīng)與用rCEF94感染的QM5細(xì)胞反應(yīng)相比降低(表5)。識(shí)別VP2的血清型I特異性中和抗體Mab1.4如所期望的識(shí)別mCEF94-s2VP3N和mCEF94-s2VP3C。
血清型II VP3的C末端部分(122個(gè)氨基酸)的編碼序列也用于置換D6948的cDNA相應(yīng)部分。在交換期間，我們用CEF94的相應(yīng)序列置換了一些D6948 cDNA序列(編碼VP4的C末端部分，和VP3的N末端部分和3’-UTR)(見(jiàn)圖5g)。將所得質(zhì)粒(pHB60-s2VP3C1)與pHB-55(B節(jié)段D6948)一起，轉(zhuǎn)染入FPT7感染的QM5細(xì)胞中。在24小時(shí)后收集這些轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞的上清，并移至含胚卵和原始囊細(xì)胞中。通過(guò)使用單克隆抗體，我們能在原始囊衍生的細(xì)胞單層中檢測(cè)到感染的細(xì)胞(見(jiàn)表5)。mD6948-s2VP3C1和mCEF94-s2VP3C與單克隆抗體的反應(yīng)模式相同。分離株mD6948-s2VP3C1(1000 ELD50/雞)也用于感染10只SPF雞(21天齡)，以評(píng)價(jià)其毒力。與D6948，rD6948和srIBDV-DACB分離株相反，此mIBDV分離株在9天期間不引起任何死亡率(表6)。然而，此mIBDV嚴(yán)重?fù)p害囊，此組的腔上囊重-體重比值與在接受D6948或rD6948的組中發(fā)現(xiàn)的相同。這表明mD6948-s2VP3C1在腔上囊中仍然能復(fù)制和誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡。
實(shí)施例1傳染性腔上囊病病毒(IBDV)是一種商購(gòu)雞群中發(fā)生的最嚴(yán)重的和廣泛傳播的傳染性疾病的致病因子。IBDV導(dǎo)致腔上囊中淋巴細(xì)胞損耗，誘導(dǎo)免疫抑制，發(fā)病，或甚至急性死亡。因?yàn)橥ㄓ玫幕領(lǐng)BDV疫苗是衍生自野外分離株，在野外分離株和活疫苗之間不能進(jìn)行血清學(xué)區(qū)分。近年來(lái)針對(duì)IBDV研制的反向遺傳技術(shù)使人們可產(chǎn)生遺傳修飾的IBDV，其生物學(xué)和抗原性性質(zhì)可改變。在此，我們闡述了拯救鑲嵌血清型I IBDV的方法，其中多蛋白編碼區(qū)部分由血清型II毒株的相應(yīng)區(qū)域部分置換。一種含有血清型II VP3的C末端部分的鑲嵌病毒，與未修飾的血清型I病毒相比示出子代病毒的釋放略延遲，而在感染25小時(shí)后的最大病毒效價(jià)相同。由于血清型特異性表位存在于VP3的C末端部分，我們能將此拯救的病毒與血清型I和II IBDV毒株區(qū)分。這些發(fā)現(xiàn)可有希望使用嵌合VP3研制IBDV標(biāo)記疫苗。
傳染性腔上囊病病毒(IBDV)，雙RNA病毒科的一個(gè)成員，是雞的高度傳染性疾病的致病因子。這種疾病也已知根據(jù)發(fā)生地稱(chēng)為Gumboro，在該地報(bào)道了IBDV的第一次爆發(fā)(Cosgrove，1962)。雙鏈RNA(dsRNA)基因組可分為兩個(gè)節(jié)段(Dobos等，1979)，其包裝在衣殼中，由兩個(gè)病毒蛋白組成(VP2和VP3)。所得單殼裸病毒顆粒直徑為60nm，二十面體對(duì)稱(chēng)(T＝13)(Bottcher等，1997)。
最大的dsRNA節(jié)段(A節(jié)段，3260bp)含有兩個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框(ORF)。首先，最小的ORF編碼非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白VP5(145-149個(gè)氨基酸，17kDa)。第二個(gè)ORF編碼一種多蛋白(1012個(gè)氨基酸，110kDa)，其通過(guò)VP4的自動(dòng)催化活性，迅速裂解為三個(gè)蛋白pVP2(48kDa)，VP4(29kDa)和VP3(33kDa)，在體內(nèi)(Dobos等，1979)和體外(Hudson等，1986)均可進(jìn)行。在病毒成熟期間，pVP2進(jìn)一步加工為VP2(41-38kDa)，可能通過(guò)宿主細(xì)胞編碼的蛋白酶位點(diǎn)特異性裂解pVP2而得(Kibenge等，1997)。B節(jié)段(2827bp)含有一個(gè)大ORF，編碼VP1(877-881個(gè)氨基酸，91kDa)。此RNA依賴(lài)型RNA聚合酶也是結(jié)構(gòu)性蛋白，因?yàn)樗窃诓《绢w粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其作為游離蛋白，也共價(jià)連接于基因組RNA鏈的5’末端(基因組連接的蛋白，VPg)(Dobos，1993；Spies和Muller，1990)。
已經(jīng)闡述了兩種不同血清型的IBDV(血清型I和血清型II)(McFerran等，1980)。野生型血清型I IBVD毒株對(duì)腔上囊中的發(fā)育淋巴細(xì)胞具有特異的嗜性。血清型I病毒亞分為經(jīng)典毒株，抗原性變體毒株和極烈性毒株。抗原性變體IBDV毒株只在美國(guó)有報(bào)道(自1985年(Snyder，1990))，并發(fā)現(xiàn)具有不同致病性表型。這些抗原性變體呈現(xiàn)在VP2蛋白的特異性區(qū)域(高變區(qū))中具有單氨基酸改變，這可能與表型的不同有關(guān)。自1988年，已經(jīng)闡述了毒力增強(qiáng)的歐洲IBDV分離株(極烈性IBDV，vvIBDV)，而抗原性結(jié)構(gòu)與經(jīng)典分離株相同(Chettle，Stuart，和Wyeth，1989)。盡管在經(jīng)典和極烈性IBDV毒株之間的大多數(shù)核苷酸差異發(fā)現(xiàn)在B節(jié)段，但我們近來(lái)示出與vvIBDV毒株毒力增強(qiáng)相關(guān)的決定簇位于A節(jié)段。
與血清型I毒株不同，野生型血清型II毒株對(duì)B淋巴細(xì)胞沒(méi)有特異性嗜性。血清型II毒株天然地能在不同組織中復(fù)制，甚至能在細(xì)胞系上繁殖。血清型II毒株通?；厥兆曰痣u，其對(duì)火雞(Jackwood等，1984)或雞(Ismail，Saif，和Moorhead，1988)沒(méi)有致病性。依賴(lài)構(gòu)象的中和表位在血清型I和II毒株的衣殼蛋白VP2的高變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)。除了VP2，病毒顆粒含有另一種豐富的衣殼表位VP3。盡管在接種和感染后均發(fā)現(xiàn)抗線(xiàn)性VP3表位的快速免疫應(yīng)答，但此蛋白質(zhì)不含有病毒中和表位(Fahey，IJ，和Bagust，1985)?，F(xiàn)已示出血清型I和II毒株的VP3中存在的一些表位由相同的單克隆抗體識(shí)別(組特異性表位)，而其它VP3表位是血清型特異性的(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。
區(qū)分活的血清型I IBDV疫苗和在野外爆發(fā)期間收集的野外分離株，是困難及艱苦的，因?yàn)樾璐_定分離株的遺傳結(jié)構(gòu)。通常對(duì)A節(jié)段dsRNA進(jìn)行RT-PCR，隨后進(jìn)行序列分析(Eterradossi等，1999)或RFLP(Jackwood和Sommer，1999)。在探索通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)可易于從IBDV野外分離株中區(qū)分IBDV疫苗的研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)改變血清型I IBDV毒株的抗原性結(jié)構(gòu)。在最近幾年中關(guān)于從克隆的cDNA中拯救IBDV的一些報(bào)道已經(jīng)公布(Boot等，1999；Lim等，1999；Mundt和Vakharia，1996)。使用我們的反向遺傳系統(tǒng)，我們已示出能從衍生自不同毒株(即經(jīng)典適應(yīng)的和極烈性毒株)的dsRNA的A節(jié)段的cDNA克隆中產(chǎn)生病毒。在此報(bào)道中，我們闡述了拯救鑲嵌IBDV的方法，其中血清型I毒株(CEF94)的VP3(部分)被血清型II毒株(TY89)的相應(yīng)部分置換。另外，通過(guò)使用一系列血清型特異性單克隆抗體，我們示出能從血清型I和II IBDV毒株中區(qū)分兩個(gè)拯救的鑲嵌IBDV。方法病毒，細(xì)胞和抗體經(jīng)典IBDV血清型I毒株CEF94是一種已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物上適應(yīng)生長(zhǎng)的PV1的衍生物。(Boot等，1999；Petek，D’Aprile和Cancellotti，1973)。IBDV毒株TY89是原型血清型II IBDV毒株(McFerran等，1980)，并可在細(xì)胞系上自然生長(zhǎng)。含有T7聚合酶基因的重組禽痘病毒(FPV-T7)(Britton等，1996)得自M.Skinner實(shí)驗(yàn)室(Compton實(shí)驗(yàn)室，Berks，United Kingdom)。將對(duì)TY89和CEF94和對(duì)FPV-T7易感的QM5細(xì)胞，在37℃在CO2(5％)溫箱中，生長(zhǎng)于補(bǔ)加5％小牛血清(FCS)和2％抗生素溶液ABII(1000U/ml青霉素，1000mg/ml鏈霉素，20mg/ml兩性霉素B，500mg/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)的QT35培養(yǎng)基上?？筕P3/4的多克隆抗血清是通過(guò)用純化的蛋白質(zhì)注射兔而產(chǎn)生的，純化的蛋白質(zhì)源自用含有CEF94多蛋白的722-1018位氨基酸的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。單克隆抗體IV，VII(Mahardika和Becht，1995)，和I/G4(Oppling，Muller，和Brecht，1991)由Leipzing大學(xué)(德國(guó))Dr.Muller惠贈(zèng)。Mab17/80(Azad等，1986)由Fort Dodge(CastleHill，澳大利亞)的Dr.Lehrbach惠贈(zèng)。單克隆抗體1.4，9.7和9.8是在我們的實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，和用純化的血清型I(CEF94)IBDV作抗原制備的。
產(chǎn)生和克隆IBDVcDNA序列先前已經(jīng)闡述了產(chǎn)生基于pUC19的含有CEF94的兩個(gè)基因組dsRNA節(jié)段的全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒。在這些質(zhì)粒中的cDNA位于T7啟動(dòng)子序列之前，后接反原基因組丁型肝炎病毒核酶(Been，Perrotta，和Rosenstein，1992)和T7終止子序列。通過(guò)在TY89的dsDNA上進(jìn)行RT-PCR而克隆血清型II毒株TY89的完整VP3編碼部分。用引物ANC1(GGGGACCCGCGAACGG)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用引物RTAM(AATTGGTGTCCACACCTG)和RTAP(ATACAGGACCTAACTGGG)，和35次擴(kuò)增循環(huán)(退火溫度52℃，Taq聚合酶)，進(jìn)行3次獨(dú)立的PCR。將所得片段(956bp)分別克隆入pGEM-T Easy載體(Promega)中。核苷酸序列是用特異性引物在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)(BigDye終止子試劑盒，PE應(yīng)用生物系統(tǒng))和ABI310 DNA測(cè)序儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng))中，在兩個(gè)鏈上進(jìn)行確定的。確定TY89的VP3 cDNA的共有核苷酸序列，并推導(dǎo)氨基酸序列(圖6)?？寺SV-VP3-TY89(1)含有共有序列，并用于產(chǎn)生鑲嵌A節(jié)段cDNA克隆(如下)。
構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒pHB36-s2VP3為在CEF94的全長(zhǎng)A節(jié)段克隆中，用TY89的VP3置換CEF94的VP3，我們通過(guò)PCR擴(kuò)增TY89 VP3編碼部分，使用引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCgCGgGACTGGG，非雜交核苷酸以小寫(xiě)字母示出)，退火溫度58℃，Pwo聚合酶，30次循環(huán)。將此PCR片段(893bp)用SacI(2316)和KpnI(nt3172)消化，產(chǎn)生一個(gè)856bp的片段，該片段經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠純化(Qiaex凝膠提取試劑盒，Qiagen)。將此片段隨后用于置換質(zhì)粒pHB36-vvVP3的相應(yīng)部分，所述質(zhì)粒已經(jīng)用SacII(nt2316)和KpnI(nt3172)消化。在將該P(yáng)CR片段連接于載體中之后(快速連接試劑盒，Roche分子生物化學(xué)公司)，用此混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。對(duì)得自一些獨(dú)立的菌落的質(zhì)粒進(jìn)行分析，并選擇通過(guò)測(cè)序分析確定具有所述序列的一個(gè)質(zhì)粒(pHB36-s2VP3，見(jiàn)圖7)。
構(gòu)建鑲嵌VP3 cDNA為置換血清型IVP3的N末端部分，我們使用上述相同PCR(pHB36-s2VP3)，只是這次使用pHB-36W(A節(jié)段CEF94)作模板，產(chǎn)生編碼CEF94的VP3序列的PCR片段。將此PCR片段用ScaI(nt2799)和KpnI(nt3172)消化，產(chǎn)生一個(gè)373bp的片段。將經(jīng)瓊脂糖凝膠純化的該片段隨后用于置換已用ScaI(nt2799)和KpnI(nt3172)部分消化的pHB36-s2VP3的相應(yīng)部分，產(chǎn)生pHB36-s2VP3N(見(jiàn)表9)。
為置換血清型IVP3的C末端部分，我們使用與產(chǎn)生pHB36-s2VP3N相同的方法，只是這次在PCR中使用TY89 cDNA作模板，及使用pHB-36W作373bpPCR片段的受體，產(chǎn)生pHB36-s2VP3C(見(jiàn)表9)。
蛋白質(zhì)分析為進(jìn)行Western印跡，我們從感染的QM5細(xì)胞中通過(guò)前述差異離心方法純化CEF94和TY89 IBDV(Boot等，1999)。將病毒蛋白在12％SDS-PAGE凝膠中分離，并印跡于硝酸纖維素上(ProteanBA85，Schleicher和Schuell)。為檢測(cè)VP3，我們使用ECL檢測(cè)方法(Amersham)，使用一種VP3特異性單克隆抗體，及用過(guò)氧化氫酶綴合的兔抗小鼠血清(Dako)作為第二抗體。
為進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，我們?cè)诖嬖?5S-甲硫氨酸的2.5mlTnT-T7Quick反應(yīng)(Promega)中，使用含有全長(zhǎng)A或B節(jié)段的環(huán)形質(zhì)粒(0.4ug)(見(jiàn)圖7)。將所得病毒蛋白直接分離或在SDS-PAGE凝膠(12％)中免疫沉淀后分離，并通過(guò)放射自顯影檢測(cè)。為免疫沉淀在體外產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，我們使用多克隆(PaVP3/4)或單克隆抗體，所述單克隆抗體抗血清型IIBDV(Mab IVSI)或血清型II(MabVIISII)的VP3。在所有溫育和沖洗步驟期間使用RIPA緩沖液(Sambrook，F(xiàn)ritrsch，和Maniatis，1989)。通過(guò)加入蛋白A瓊脂糖CL-4B(AmershamParmacia，Sweden)，及進(jìn)行3次沖洗步驟，從混合物中純化抗原-抗體復(fù)合物。
感染和轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞將QM5細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至80％鋪滿(mǎn)，并用FPV-T7感染(moi.＝3)。在1小時(shí)之后，將細(xì)胞用3ml的QT-35培養(yǎng)基沖洗兩次，并用3ml Optimem 1(Gibco/BRL)覆蓋。同時(shí)，將DNA(1.0ug)與12.5ul LipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ul Optimem 1中混合，并在室溫下保持至少30分鐘。接著將QM5細(xì)胞用2ml新鮮Optimem 1覆蓋，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在溫育過(guò)夜后(18小時(shí)，在37℃在5.0％CO2中)，將轉(zhuǎn)染的單層用PBS漂洗一次，加入新鮮的QM5培養(yǎng)基(補(bǔ)加5％FCS和2％ABII)，并將平板在37℃進(jìn)一步溫育(5.0％CO2)。在溫育24小時(shí)后，將平板凍/融一次，將上清用200nm濾膜過(guò)濾(Acrodisc，GelmanSciences)以除去禽痘病毒(FPV-T7)和細(xì)胞碎片。將澄清的上清貯存在-70℃或直接用于檢測(cè)rIBDV，通過(guò)用部分澄清的轉(zhuǎn)染上清接種接近鋪滿(mǎn)單層的QM5細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在24或48小時(shí)后，在免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)中，使用多克隆VP3/4或單克隆VP3特異性抗體作為第一抗體，辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔或抗小鼠抗體作為第二抗體，顯示IBDV特異性蛋白質(zhì)。
最大效價(jià)和單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)為確定最大病毒效價(jià)，我們使用初始拯救的病毒感染新鮮QM5細(xì)胞。將細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(37℃，5.0％CO2)中溫育5天(或直至可見(jiàn)完全CPE)，凍-融1次，及通過(guò)200nm濾膜(Acrodisc)過(guò)濾。將此步驟重復(fù)3次(3次連續(xù)傳代)。確定在最后過(guò)濾后IBDV的數(shù)量(TCID50)，通過(guò)用10倍稀釋的IBDV樣品感染含有接近鋪滿(mǎn)的QM5細(xì)胞的96孔組織培養(yǎng)平板而進(jìn)行確定。將此96孔平板溫育48小時(shí)，并通過(guò)IPMA檢測(cè)其中存在IBDV抗原的孔。
為對(duì)比mCEF94-s2VP3C與未修飾的血清型I IBDV的復(fù)制能力，我們確定了rCEF94和mCEF94-s2VP3C的單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。將QM5細(xì)胞(2×106)在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)過(guò)夜(16小時(shí))。接著除去此培養(yǎng)基，并用1ml含有IBDV(TCID50＝7.0)的PBS覆蓋細(xì)胞。在1小時(shí)后，除去上清，將細(xì)胞用8ml PBS漂洗4次，加入5ml完全培養(yǎng)基。在不同時(shí)間點(diǎn)(在感染后1小時(shí)，5小時(shí)，10小時(shí)，15小時(shí)，25小時(shí)和50小時(shí))，從上清中取樣品并貯存于-20℃。在IPMA中確定每個(gè)樣品的病毒效價(jià)(TCID50)(如上述)。進(jìn)行兩次(mCEF94-s2VP3C)或三次(rCEF94)非依賴(lài)型生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并確定在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)效價(jià)之間的標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果克隆和分析血清型II毒株的VP3編碼區(qū)為構(gòu)建含有血清型II的VP3蛋白的血清型I重組IBDV病毒，我們克隆了血清型II毒株的相應(yīng)cDNA。首先，我們嘗試克隆TY89的全長(zhǎng)A和B節(jié)段cDNA，TY89是原型血清型II IBDV毒株(McFerran等，1980)。為產(chǎn)生這些cDNA，我們使用用于克隆血清型I毒株的A節(jié)段的全長(zhǎng)RT-PCR方法。盡管我們?cè)诳寺Y89的全長(zhǎng)B節(jié)段cDNA中重復(fù)成功(數(shù)據(jù)未示出)，但用此方法不能獲得A節(jié)段的全長(zhǎng)cDNA。因此，我們只擴(kuò)增TY89 A節(jié)段的VP3編碼部分。通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得一個(gè)含有TY89的VP3的RT-PCR片段，并將其克隆入pGEM-T Easy載體中。確定此部分TY89基因組的共有序列，并將推導(dǎo)的氨基酸序列與CEF94的相應(yīng)序列對(duì)比，CEF94是一種細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的血清型I毒株(圖6)。編碼TY89 VP3的cDNA接著用于產(chǎn)生鑲嵌A節(jié)段cDNA質(zhì)粒，其編碼TY89的完整VP3(pHB36-s2VP3)或N末端部分(101個(gè)氨基酸，pHB36-s2VP3N)，或C末端部分(155個(gè)氨基酸，pHB36-s2VP3C)，(圖7)。
在證實(shí)所得質(zhì)粒具有正確的序列后，將它們?cè)隗w外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中用作模板，隨后進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影分析(圖8a)。在所有情況中均存在通過(guò)多蛋白自動(dòng)催化裂解產(chǎn)生的三個(gè)蛋白，pVP2，VP3和VP4。發(fā)現(xiàn)衍生自質(zhì)粒pHB36-s2VP3和pHB36-s2VP3N的VP3蛋白在SDS-PAGE中的位置，比衍生自pHB-36W和pHB36-s2VP3C的VP3蛋白的位置高。在Western印跡分析中，也發(fā)現(xiàn)在得自純化的CEF94和TY89病毒的病毒VP3之間，在SDS-PAGE期間的遷移不同(圖8b)。這表明在來(lái)自鑲嵌全長(zhǎng)A節(jié)段質(zhì)粒的VP3的遷移中所觀測(cè)的不同不是實(shí)驗(yàn)假象，是由于VP3的N末端部分中氨基酸不同所致。
在pHB-36W-s2VP3和pHB36W-s2VP3N的病毒蛋白酶(VP4)中存在3個(gè)氨基酸變化(圖6)，這是由于假設(shè)的多蛋白的裂解位點(diǎn)(Hudson等，1986)似乎不是如最近示出的真正裂解位點(diǎn)(Sanchez和Rodriguez，1999)。這些不同在SDS-PAGE分析中不明顯改變VP4的遷移行為，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)此VP4與血清型I VP4的位置相同(圖8a)。
在VP3上定位血清型特異性表位由非中和抗體識(shí)別的優(yōu)勢(shì)免疫表位位于VP3上。一些研究人員已經(jīng)報(bào)道這些表位中至少一個(gè)是血清型特異性的(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。為定位血清型特異性表位的位置，及確定其區(qū)分拯救自鑲嵌A節(jié)段cDNA的病毒的用途，我們對(duì)體外翻譯的和35S-Met標(biāo)記的VP3蛋白進(jìn)行了放射免疫沉淀(RIP)，在RIP中使用多克隆(PaVP3/4)或單克隆(Mab IVSI或Mab VIISII)抗體，我們通過(guò)SDS-PAGE，隨后通過(guò)放射自顯影分析沉淀的蛋白(圖8c)。如由高水平的同源性所預(yù)期的，衍生自血清型I和II的VP3通過(guò)多克隆PaVP3/4血清沉淀。然而，單克隆抗體IVSI只沉淀含有血清型IVP3的C末端部分的VP3，而Mab VIISII只沉淀含有血清型II VP3的C末端部分的VP3。這些結(jié)果表明血清型特異性表位存在于VP3的C末端的155個(gè)氨基酸中。
拯救鑲嵌IBDV將全長(zhǎng)鑲嵌A節(jié)段cDNA質(zhì)粒用于拯救鑲嵌IBDV(mIBDV)，通過(guò)將這些質(zhì)粒和一個(gè)含有CEF94的B節(jié)段cDNA的質(zhì)粒(pHB-52，(Boot等，1999))，共轉(zhuǎn)染入QM5細(xì)胞中進(jìn)行。為通過(guò)使用T7啟動(dòng)子指導(dǎo)病毒DNA合成，我們用攜帶T7聚合酶基因的重組禽痘病毒在轉(zhuǎn)染之前感染QM5細(xì)胞(FPV-T7，moi＝3)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在IPMA中測(cè)試多蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在所有使用的A節(jié)段質(zhì)粒中此表達(dá)均相似(大約30％的細(xì)胞表達(dá)的IBDV抗原，數(shù)據(jù)未示出)。將轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞的澄清上清，使用新鮮的QM5細(xì)胞用于確定IBDV效價(jià)。盡管在轉(zhuǎn)染后病毒蛋白的表達(dá)水平相似，所得TCID50有較大不同(表10)?；厥站哂醒逍虸I VP3的C末端部分的鑲嵌病毒與回收野生型的效率相同(平均TCID50＝4.8及5.1)。然而，從質(zhì)粒pHB36-s2VP3中回收鑲嵌病毒的效率與未修飾的rCEF94(平均TCID50＝5.1)相比明顯降低(平均TCID50＝1.1)。從質(zhì)粒pHB36-s2VP3N(平均TCID50＝3.1)中拯救鑲嵌病毒發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果，在拯救后其效價(jià)大約比未修飾的rCEF94低100倍(表10)。
復(fù)制鑲嵌IBDV為確定交換多蛋白的一部分對(duì)復(fù)制的作用，我們確定了在3次連續(xù)傳代后每個(gè)病毒的最大效價(jià)。盡管在VP4中含有3個(gè)氨基酸變化并組合血清型II VP3的鑲嵌病毒在3次連續(xù)傳代后示出病毒效價(jià)提高，但所得TCID50的最大值(6.0)比未修飾的rCEF94和含有血清型II VP3的C末端部分的鑲嵌病毒大約低10倍(表10)。為評(píng)價(jià)用相同效率拯救的rCEF94和mCEF94-s2VP3C在細(xì)胞培養(yǎng)中是否具有相同復(fù)制動(dòng)力學(xué)，我們用QM5細(xì)胞對(duì)這兩個(gè)病毒進(jìn)行單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。盡管在感染后(p.i.)25小時(shí)所得最大效價(jià)是相同的，但在mCEF94-s2VP3C中的病毒釋放比在未修飾的rCEF94中延遲(圖9)。在用未修飾的rCEF94感染后第一個(gè)病毒釋放是在感染后10小時(shí)，而在此時(shí)間點(diǎn)用mCEF94-s2VP3C感染未發(fā)現(xiàn)有病毒釋放。
在用鑲嵌CEF94病毒感染后檢測(cè)抗原在拯救鑲嵌IBDV后，我們通過(guò)使用一系列VP3特異性單克隆抗體評(píng)定區(qū)分這些IBDV的可能性。將新鮮QM5細(xì)胞用拯救的病毒rCEF94，mCEF94-s2VP3，mCEF94-s2VP3N，mCEF94-s2VP3C感染，在感染后48小時(shí)通過(guò)使用IBDV特異性單克隆抗體檢測(cè)病毒抗原。當(dāng)使用血清型I特異性中和VP2抗體(1.4或9.8，見(jiàn)表11)，或非中和非血清型特異性VP3抗體(9.7或17/80，見(jiàn)表11)時(shí)，將源自所有四種不同的拯救病毒的病毒抗原在感染的QM5細(xì)胞中檢測(cè)。另一方面，血清型特異性的VP3單克隆抗體與4種拯救的病毒不同地反應(yīng)。血清型I特異性抗體(IVSI或I/G4SI，見(jiàn)圖10)只與rCEF94和mCEF94-s2VP3N反應(yīng)，而血清型II特異性抗體(VIISII，見(jiàn)圖10)只與mCEF94-s2VP3和mCEF94-s2VP3C反應(yīng)。當(dāng)在RIP中對(duì)在體外合成的IBDV蛋白進(jìn)行測(cè)試(圖8c)，和通過(guò)IPMA對(duì)感染的QM5單層細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所用的單克隆抗體的反應(yīng)模式是相同的。
用所謂的缺失(或標(biāo)記)疫苗接種已經(jīng)示出是控制和根除一些動(dòng)物的病毒性疾病的有利手段(Oirschot，1999)。這些疫苗是基于缺失非必需的結(jié)構(gòu)蛋白的活(減毒的)毒株可血清學(xué)區(qū)分接種的和野外病毒感染的動(dòng)物。血清學(xué)區(qū)分用活I(lǐng)BDV疫苗毒株接種的雞和用野生型IBDV野外分離株感染的雞目前是不可能的，因?yàn)樗谢畹腎BDV疫苗直接衍生自IBDV野外分離株，或從IBDV野外分離株中經(jīng)連續(xù)傳代后產(chǎn)生的。IBDV是一種沒(méi)有包膜的病毒，只含有均是必需的3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1，VP2和VP3)。因?yàn)樘蕹齀BDV的結(jié)構(gòu)蛋白之一是不可行的，我們使用另一種方法導(dǎo)入血清學(xué)標(biāo)記。代替缺失病毒蛋白的是，我們將部分結(jié)構(gòu)蛋白用血清型II蛋白的相應(yīng)部分交換。
一些IBDV血清型特異性性質(zhì)，如中和表位和受體識(shí)別位于VP2的高變區(qū)內(nèi)。在VP2的血清型特異性性質(zhì)中的這一差異，通過(guò)VP2內(nèi)存在的高變區(qū)的一級(jí)序列的差異而反映。兩個(gè)血清型的VP2高變區(qū)之間的相同性?xún)H為67％，而VP2的剩余部分的相同性為93％。其它病毒蛋白也具有90％以上的相同性(VP1＝99％，VP3＝95％，VP4＝92％)，除了VP5的相同性?xún)H為80％。病毒蛋白3，與VP2類(lèi)似，是病毒衣殼的一種主要成分?；赩P3具有堿性C末端尾，其能與包裝的dsRNA相互作用，因此已經(jīng)有VP3組成了病毒顆粒的內(nèi)部部分的提示(Bottcher等，1997)。此假設(shè)由VP2而非VP3參與受體識(shí)別得以進(jìn)一步支持，這意味著至少一部分VP2需存在于病毒顆粒的表面。另外，中和抗體只通過(guò)VP2而非VP3激發(fā)，這也表明VP2暴露于表面。由于已知VP3沒(méi)有血清型特異性性質(zhì)，及至少一種線(xiàn)性的血清型特異性非中和表位存在于此蛋白質(zhì)中(見(jiàn)導(dǎo)論章節(jié))，使(部分)VP3的交換在我們看來(lái)是研制IBDV標(biāo)記疫苗的最有前途的途徑。
首先，將TY89的VP3編碼cDNA通過(guò)RT-PCR克隆，并確定其核苷酸序列(見(jiàn)圖6中推導(dǎo)的TY89的氨基酸序列)。隨后將此cDNA用于產(chǎn)生鑲嵌全長(zhǎng)A節(jié)段cDNA質(zhì)粒(見(jiàn)圖7)。在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯組合反應(yīng)中，在存在35S標(biāo)記的甲硫氨酸的情況下，分析這些全長(zhǎng)質(zhì)粒產(chǎn)生病毒蛋白的情況。VP4自動(dòng)催化性裂解多蛋白不受VP3(部分)交換的影響。在質(zhì)粒pHB36-s2VP3和pHB36-s2VP3N中的多蛋白VP4-VP3裂解位點(diǎn)之前的血清型IVP4的3個(gè)氨基酸交換，也不影響自動(dòng)催化性。另一方面，源自血清型I或血清型II cDNA的體外合成的VP3，在SDS-PAGE中的遷移明顯不同，(見(jiàn)圖8a)。盡管這些蛋白質(zhì)的預(yù)計(jì)大小是相似的(28.8kDa)，但發(fā)現(xiàn)純化的TY89和CEF94的VP3電泳遷移率存在同樣的差異(圖8b)。其它人也注意到，在衍生自血清型I和II IBDV的VP3之間遷移率也存在相同差異(Oppling，Muller，和Brecht，1991；；Reddy，Silim，和Ratcliffe，1992)。另外，我們?cè)诩兓腃EF94和TY89的Western印跡分析中，觀測(cè)到兩個(gè)VP3條帶(VP3a和VP3b)(圖8b)。還不清楚這兩個(gè)VP3條帶是否均代表功能蛋白，或較小的條帶(VP3b)是否是較大條帶(VP3a)的特異降解產(chǎn)物。我們觀測(cè)到擴(kuò)增的CEF94的細(xì)胞培養(yǎng)物中存在兩個(gè)VP3條帶，先前Fahey等(Fahey，Emy和Crooks，1989)在澳大利亞IBDV分離株002/73中觀測(cè)到相似結(jié)果，針對(duì)IPNV也已經(jīng)報(bào)道了存在兩個(gè)VP3條帶(Dobos，1977)。
在體外對(duì)由全長(zhǎng)的A節(jié)段編碼的病毒蛋白定性后，我們接著使用這些質(zhì)粒拯救鑲嵌IBDV。將編碼野生型血清型I多蛋白的質(zhì)粒(pHB-36W)，和編碼嵌合多蛋白的3個(gè)質(zhì)粒(pHB36-s2VP3，pHB36-s2VP3N和pHB36-s2VP3C)，均與血清型IB節(jié)段質(zhì)粒(pHB-52)共轉(zhuǎn)染。我們發(fā)現(xiàn)用全長(zhǎng)鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒的所有轉(zhuǎn)染均導(dǎo)致感染性IBDV出現(xiàn)。然而攜帶完整血清型II VP3或其N(xiāo)末端部分并在VP4中有3個(gè)氨基酸突變鑲嵌病毒的拯救效價(jià)，低于未修飾的rCEF94或含有血清型II VP3的C末端部分的mCEF94的拯救效價(jià)。拯救效率的差異與在3次連續(xù)傳代后獲得的最大TCID50值相關(guān)(表10)。只在VP3 N末端部分中導(dǎo)入5個(gè)氨基酸差異，或組合在VP4中導(dǎo)入3個(gè)氨基酸差異，可明顯降低復(fù)制效率?；诙嗟鞍琢呀獠皇躒P4中氨基酸改變的影響，及血清型II VP3在SDS-PAGE分析中的不同表現(xiàn)，我們認(rèn)為所觀測(cè)的mCEF94-s2VP3和pHB36-s2VP3N的復(fù)制效率降低主要是由于VP3的N末端部分的不同折疊所致。
第一個(gè)關(guān)于潛在的IBDV標(biāo)記疫苗病毒的報(bào)道涉及的是減毒的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的rD78疫苗株的一種VP5剔除突變體(Mundt，Kollner，和Kretzschmar，1997；Yao，Goodwin，和Vakharia，1998)。盡管去掉VP5的rIBDV產(chǎn)生良好的血清學(xué)標(biāo)記，但其作為疫苗的效力還未證實(shí)。去掉VP5的rIBDV的復(fù)制在體外和體內(nèi)均受到嚴(yán)重影響。Mundt等，(Mundt，Kollner，和Kretzschmar，1997)報(bào)道了去掉VP5的rD78其病毒釋放明顯降低(在p.i.24小時(shí)后，在單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)中，效價(jià)降低＞200倍)，而Yao等(Yao，Goodwin，和Vakharia，1998)報(bào)道了與未修飾的rD78相比，CEF細(xì)胞的病毒產(chǎn)量明顯降低，及存活率更高(在p.i.8天后，多步生長(zhǎng)曲線(xiàn))。盡管mCEF94-s2VP3C的病毒釋放輕度延遲(圖9)，在細(xì)胞培養(yǎng)物中的復(fù)制比VP5剔除的突變體的復(fù)制所受到的影響更小。發(fā)現(xiàn)mCEF94-s2VP3C病毒復(fù)制與未修飾的血清型I毒株幾乎一樣有效，可將此病毒與血清型I和II野生型野外分離株區(qū)分，因此使用血清型II VP3的C末端部分是研制IBDV標(biāo)記疫苗的極具前途的途徑。實(shí)施例2交換VP3的C末端部分產(chǎn)生減毒的極烈性IBDV疫苗株，其在雞體內(nèi)誘導(dǎo)獨(dú)特的血清學(xué)應(yīng)答在此實(shí)施例中，我們闡述了將編碼極烈性IBDV分離株(D6948)的VP3的C末端部分的cDNA，用血清型II(TY89)的cDNA的相應(yīng)部分置換。在轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞及將轉(zhuǎn)染上清在原始囊細(xì)胞或含胚卵中傳代后，可拯救含有血清型II C末端部分的VP3的重組病毒。用這種修飾的vvIBDV(mD6948-s2VP3C3)感染SPF雞，示出與未修飾的極烈性IBDV相比，其毒力明顯降低。正如所期望的，我們發(fā)現(xiàn)血清型I了IBDV毒株的獨(dú)特囊嗜性不受導(dǎo)入血清型II VP3 C末端部分的影響。使18天齡的broiler型小雞口服mD6948-s2VP3C3示出，盡管存在低，中等，或高水平的母體產(chǎn)生的中和IBDV抗體，但此病毒能感染雞。
另外我們示出用修飾的病毒攻擊雞產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)可與未修飾的病毒產(chǎn)生的應(yīng)答區(qū)分。由于修飾的極烈性D6948分離株具有明顯降低的毒力，及可將用mD6948-s2VP3C3感染的雞與用野生型(極烈性)IBDV野外病毒感染的雞區(qū)分，因此此鑲嵌IBDV分離株是IBDV標(biāo)記疫苗的一個(gè)有價(jià)值的候選者。導(dǎo)論傳染性腔上囊病病毒(IBDV)是雞群中一種高度傳染性疾病(Gumboro病)的致病因子(Cosgrove，1962)。IBDV是雙RNA科病毒的一個(gè)成員，具有分為兩個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)(Dobos等，1979)。最大的dsRNA(A節(jié)段，大約3260bp)含有兩個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框(ORF)。第一個(gè)最小的ORF編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白5(VP5，145-149個(gè)氨基酸，17kDa)。第二個(gè)ORF編碼一個(gè)多蛋白(1012的氨基酸，110kDa)，該多蛋白可自動(dòng)催化裂解產(chǎn)生病毒蛋白pVP2(也稱(chēng)為VPX，48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在體內(nèi)病毒成熟期間，pVP2被加工為VP2(41-38kDa)，可能是由于通過(guò)宿主細(xì)胞編碼的蛋白酶對(duì)pVP2進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解而得。較小的B節(jié)段(大約2827kDa)含有一個(gè)大ORF，編碼VP1(877-881個(gè)氨基酸，91kDa)。病毒蛋白1是RNA依賴(lài)型RNA聚合酶，共價(jià)連于基因組RNA節(jié)段的5’末端(病毒蛋白基因組連接的，VPg)(Dobos，1993)。在多蛋白(VP2-VP4-VP3)的體內(nèi)表達(dá)中，已經(jīng)產(chǎn)生病毒類(lèi)顆粒構(gòu)型，由VP2和VP3組成，與成熟毒粒具有相同直徑(60nm)。這表明游離VP1和病毒dsRNA均不是形成病毒衣殼所必需的(Fernandez-Arias等，1998)。
已經(jīng)闡述了兩個(gè)不同血清型的IBDV(血清型I和II)(McFerran等，1980)。致病性野生型血清型I IBDV分離株，對(duì)腔上囊中的淋巴細(xì)胞有特異嗜性。血清型I分離株基本分為經(jīng)典型，抗原性變體，和極烈性分離株。抗原性變體IBDV分離株在VP2蛋白的特異區(qū)域(高變區(qū))中有一個(gè)氨基酸改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)抗原性部分改變(Snyder，1990)。首先在歐洲分離的極烈性IBDV分離株與經(jīng)典毒株具有相同的抗原性結(jié)構(gòu)，但毒力增強(qiáng)(Chettle，Stuart，和Wyeth，1989)。vvIBDV和經(jīng)典IBDV分離株的病毒蛋白之間氨基酸的不同分散在所有病毒蛋白之中，盡管其中大多數(shù)發(fā)現(xiàn)在VP2的高變區(qū)內(nèi)(Brown和Skinner，1996)。VP2中的特異突變使細(xì)胞嗜性(Mundt，1999)和減毒(Yamaguchi等，1996c)均發(fā)生變化。盡管VP2是毒力的關(guān)鍵因子，我們最近示出VP2不是極烈性表型的唯一決定簇。
與血清型I分離株不同，野生型血清型II分離株不具有特異性B淋巴細(xì)胞嗜性。血清型II分離株天然能在禽類(lèi)不同組織中復(fù)制，且甚至能在細(xì)胞系上增殖。血清型II分離株通?？苫厥兆曰痣u，且對(duì)火雞(Jackwood等，1984)和雞(Ismail，Saif，和Moorhead，1988)均沒(méi)有致病性。血清型I和II分離株的構(gòu)象依賴(lài)型中和病毒表位在衣殼蛋白VP2上存在。另一種豐富的病毒衣殼蛋白(VP3)不含有中和病毒表位，盡管在接種和感染后均發(fā)現(xiàn)抗線(xiàn)性VP3表位的快速免疫應(yīng)答(Fahey，IJ，和Bagust，1985)。VP3的血清型特異性和非血清型特異性表位均已經(jīng)闡述(Mahardika和Becht，1995；Oppling，Muller，和Brecht，1991；Yamaguchi等，1996a)。
生產(chǎn)IBDV疫苗的常規(guī)方式是將野生型病毒在雞胚或用原代雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞，或源自禽或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系中適應(yīng)性增殖。野生型IBDV的適應(yīng)性通常與毒力降低(減毒)相關(guān)(Yamaguchi等，1996b；Yehuda等，1999)。區(qū)分所用的活I(lǐng)BDV疫苗和在野外爆發(fā)期間回收的野外IBDV分離株通常較困難及費(fèi)力，因?yàn)樾璐_定IBDV分離株的遺傳結(jié)構(gòu)。在探求可易于從IBDV野外分離株中區(qū)分的IBDV疫苗中，我們最近將減毒的IBDV(CEF94)分離株的完整VP3蛋白或其N(xiāo)或C末端部分，用血清型II(TY89)分離株的相應(yīng)部分置換。對(duì)拯救的重組血清型I IBDV進(jìn)行分析示出，含有血清型II VP3的C末端部分的病毒，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖時(shí)，病毒釋放略降低，而最終效價(jià)與未修飾的血清型I IBDV相同。其中全部VP3或其N(xiāo)末端部分被置換的鑲嵌病毒，與未修飾的CEF94相比產(chǎn)量降低(最終效價(jià)低10倍)，表明復(fù)制中的干擾更嚴(yán)重。材料和方法病毒，細(xì)胞和抗體經(jīng)典IBDV分離株CEF94是PV1的衍生物(意大利，1973(Petek，D’Aprile，和Cancellotti，1973))，其能在非B淋巴細(xì)胞上復(fù)制(Boot等，1999)。D6948毒株是一種極烈性野外分離株(家禽健康服務(wù)機(jī)構(gòu)，荷蘭，1989)，其只能在B淋巴細(xì)胞上生長(zhǎng)。含有T7聚合酶基因(Britton等，1996)的重組禽痘病毒(FP-T7)是由M.Skinner惠贈(zèng)的(Compton實(shí)驗(yàn)室，Berks，United Kingdom)。QM5細(xì)胞(一種鵪鶉細(xì)胞系(Antin和Ordahl，1991)通過(guò)使用補(bǔ)加5％胎牛血清(FCS)和2％抗生素溶液的QT35培養(yǎng)基(QT35FA培養(yǎng)基)(Gibco-BRL)維持。原始囊細(xì)胞分離自14天齡SPF胚，并維持在補(bǔ)加15％FCS，0.125％乳白蛋白水解產(chǎn)物，和1000U/ml青霉素和1mg/ml鏈霉素的Eagle’s改進(jìn)的極限必需基本培養(yǎng)基(EMEM)中。VP3特異性單克隆抗體B10A，IV，VII(Mahardika和Becht，1995)和I/G34(Oppling，Muller，和Brecht，1991)是由Dr.Muller惠贈(zèng)的(Leipzing大學(xué)，德國(guó))，而VP3單克隆抗體9.7是在我們的實(shí)驗(yàn)室中制備的。
構(gòu)建嵌合VP3 cDNA；先前已經(jīng)闡述了雜種CEF94和TY89質(zhì)粒的構(gòu)建。為構(gòu)建質(zhì)粒pHB60-s2VP3N，我們產(chǎn)生了5個(gè)不同的PCR片段。在所有PCR中，在20次反應(yīng)循環(huán)中我們使用Pwo聚合酶。PCR-1N是使用pHB-60作模板及引物AC3(GGTAGCCACATGTGACAG)和HY3MR(CCAGTCCCGC GGATTGTGAGG)，在56℃產(chǎn)生的，產(chǎn)生一個(gè)1614bp的片段(nt731-2346)。PCR-2N是用pHB36-s2VPN作模板及引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCGCGGGACTGGG)和M13F-17(GTAAAACGACGGCCAGT)，在56℃產(chǎn)生的，產(chǎn)生一個(gè)1251bp的片段(nt2318-3566)。PCR-3N是用凝膠純化的PCR-1N和PCR-2N片段作模板及引物AC4(ACCCAGCCAA TCACATCC)和AGTM(GAGACTCCCAGGTACCTCACTC)，在54℃產(chǎn)生的，產(chǎn)生一個(gè)2151bp的片段(nt1057-3208)，接著將其用ScaI消化，產(chǎn)生PCR-3sN(nt2799)。PCR-4N是用pHB-60作模板及引物AC9(CTCAAAGAAGATGGAGACC)和M13F-24(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)，在54℃產(chǎn)生的，產(chǎn)生一個(gè)869bp的片段(nt 2727-3593)。PCR-5是用凝膠純化的PCR-3sN和PCR-4片段作模板及引物AC5(AAGGCCTTCATGGAGGTGGCCG)和M13F-17(GTAAAACGACGGCCAGT)，在54℃產(chǎn)生的，產(chǎn)生一個(gè)2143bp的片段(nt 1423-3566)，接著將其用XhoI和XbaI消化，產(chǎn)生1889bp的PCR-5xxN片段(nt 1606-3495)。接著將PCR-5xxN片段用于置換pHB-60的相應(yīng)部分，使用快速DNA連接試劑盒，及轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。確定選擇的質(zhì)?？寺HB60-s2VP3N的DNA序列(ntl600-3325)，并表現(xiàn)為具有圖1所示的鑲嵌D6948-TY89 cDNA序列。
為構(gòu)建pHB60-s2VP3C3，我們首先使用單一的SacII(1670)和XbaI(3495)位點(diǎn)，將一個(gè)1735bp的pHB36-s2VP3C片段移至pHB-60中，產(chǎn)生pHB60-s2VP3C1。接著將CEF94的3’UTR區(qū)用D6948的相應(yīng)cDNA序列置換。使用引物AGTP(CTTGAGTGAGGTACCTGGGAG)和M13F-17(GTAAAACGAC GGCCAGT)，用pHB-60作模板，雜交溫度52℃，Pwo聚合酶，和20次反應(yīng)循環(huán)，產(chǎn)生一個(gè)PCR片段(385bp，nt3184-3566)。將此PCR片段純化，用KpnI和XbaI消化。將所得片段(315bp，nt3198-3519)經(jīng)凝膠純化，并用于置換pHB60-s2VP3Cl(用KpnI和XbaI消化)的相應(yīng)部分，使用快速連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，產(chǎn)生pHB60-s2VP3C2。接著，使用引物AC5(AAGGCCTTCA TGGAGGTGGC CG)和vvVP3CM(GAGAAAATTT CGCATCCGATG)，用pHB-60作模板，雜交溫度54℃，Pwo聚合酶，和20次反應(yīng)循環(huán)，產(chǎn)生一個(gè)PCR片段(1187bp，nt1423-2607)。將此PCR片段純化(高純度PCR純化，Boehringer Mannheim)，用SacII(nt1760)和ApoI(nt2576)消化。將所得816bp的片段用于置換pHB60-s2VP3C2(用ApoI(nt2576部分消化)和SacII(nt1760)消化)的相應(yīng)部分，使用快速連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，產(chǎn)生pHB60-s2VP3C3。確定選擇的質(zhì)?？寺HB60-s2VP3C3的DNA序列(nt1600-3275)，表現(xiàn)為具有圖1所示的鑲嵌D6948-TY89 cDNA序列。
感染和轉(zhuǎn)化QM5細(xì)胞將QM5細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿(M-6，9.6cm2/孔)中生長(zhǎng)至80％鋪滿(mǎn)，并用禽痘病毒-T7(FP-T7)(Britton等，1996)或修飾的Vaccinia Ankara(MVA-T7)(Wyatt，Moss，和Rozenblatt，1995)感染，感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)為3。在1小時(shí)后，將細(xì)胞用3ml QT-35培養(yǎng)基沖洗兩次，并用3ml Optimeml(Gibco/BRL)覆蓋。同時(shí)，將DNA(1.0mg)與12.5ml LipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ml Optimeml中混合，并在室溫下保持至少30分鐘。接著將QM5細(xì)胞用2ml新鮮Optimeml覆蓋，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在37℃溫箱中(5.0％CO2)轉(zhuǎn)染過(guò)夜(18小時(shí))。將轉(zhuǎn)染的單層細(xì)胞用PBS漂洗一次，加入新鮮QM5FA培養(yǎng)基(2.5ml)，并將平板在37℃溫箱中(5.0％CO2)進(jìn)一步溫育。溫育24小時(shí)后，將平板凍/融一次，并將上清通過(guò)孔徑為200nm的濾膜(Acrodisc，GelmanSciences)過(guò)濾，以除去禽痘病毒和細(xì)胞碎片。將澄清的上清貯存于-70℃，或直接用于進(jìn)一步分析。
檢測(cè)感染性rIBDV在轉(zhuǎn)染后，通過(guò)用澄清的轉(zhuǎn)染上清的10倍稀釋液接種接近鋪滿(mǎn)的QM5細(xì)胞單層，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的rIBDV。在24小時(shí)后，在免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)(Boot等，1999)中觀測(cè)IBDV特異性蛋白。將不能在QM5細(xì)胞上復(fù)制的拯救的IBDV(如rD6948)，用于接種單層原始囊細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)在體外在39℃在CO2(5％)溫箱中的35mm組織培養(yǎng)皿(10cm2)中生長(zhǎng)24小時(shí)。感染的B淋巴細(xì)胞中的IBDV特異性蛋白，在48小時(shí)后用Mab9.7在IPMA中檢測(cè)，Mab9.7是非血清型特異性VP3抗體。
rIBDV在SPF幼雞中的毒力拯救的IBDV分離株的毒力在SPF蛋雞型雞中評(píng)價(jià)。首先將IBDV分離株在含胚卵上增殖，通過(guò)將轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的QM5細(xì)胞上清經(jīng)尿囊絨膜途徑接種于11天齡的含胚卵中進(jìn)行。在溫育5天后回收胚(死或活的)，在Sorval Omni混合器中均質(zhì)(3×10秒，最大速度)，接著通過(guò)離心澄清(6000g，10分鐘)，并將等分貯存于-70℃。這些樣品的病毒效價(jià)(50％胚致死劑量ELD50)用11天齡含胚卵確定。將(21天齡)雞群分室隔離，并經(jīng)滴鼻和滴眼接種在PBS中的1000 ELD50，或只接種PBS(陰性對(duì)照組)。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的臨床跡象，及除去死亡的雞并進(jìn)行尸檢。在實(shí)驗(yàn)1中，將大部分存活的雞放血(5ml)，并在感染后(p.i.)9天進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢，同時(shí)將一些雞直至感染后15天放血并進(jìn)行安死術(shù)(見(jiàn)表13)。在實(shí)驗(yàn)2中，將所有存活的雞在感染后13天放血并進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢。確定所有進(jìn)行安死術(shù)的雞的腔上囊重和體重，并用100 TCID50的CEF94和鋪滿(mǎn)的QM5單層細(xì)胞確定血清中病毒中和抗體效價(jià)。將在尸檢中取自腔上囊的樣品在10％中性緩沖的福爾馬林中固定以進(jìn)行組織學(xué)分析，并也將樣品在液氮中瞬時(shí)冷凍，并保藏在-70℃以進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析(實(shí)驗(yàn)1)。
組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析將福爾馬林固定的囊樣品脫水，包埋在固體石蠟中，切片并用蘇木精-嗜紅(HE)染色。用顯微鏡分析囊確定組織病理學(xué)囊損害評(píng)分(HBLS)。根據(jù)Bayyari等(1996)所述以1-5等級(jí)確定HBLS1＝正常囊；2＝離散或部分濾泡損害；3＝50％或少于50％濾泡損害；4＝50-70％濾泡損害；5＝75-100％濾泡損害。將冷凍的囊樣品在低溫保持器上切成8um厚度并在玻片(Superfiost)上進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。將切片用丙酮固定10分鐘，在空氣中干燥并貯存于-20℃直至使用。如述進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶染色(Pol，Gielkens，和Van Oirschot，1989)。簡(jiǎn)而言之，將切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶用0.01％H2O2消除。非特異性反應(yīng)通過(guò)0.2％牛血清白蛋白阻斷。將Mab B10A或IVSI用作一級(jí)抗體，而將綴合于過(guò)氧化物酶(Dako)的山羊抗兔或兔抗小鼠抗體用作二級(jí)抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)用作底物。
感染具有母體產(chǎn)生的IBDV抗體的broiler幼雞確定孵化后(p.h)第7天和第15天衍生自種禽的broiler幼雞的血清中母體產(chǎn)生的抗體的存在情況，該種禽已經(jīng)用活的或滅活的IBDV疫苗接種。用Idexx的IBDV特異性ELISA(Idexx，Westbrook，美國(guó))，和用病毒中和實(shí)驗(yàn)確定IBDV特異性抗體的水平。在病毒中和實(shí)驗(yàn)中，我們使用100 TCID50的CEF94和鋪滿(mǎn)的QM5細(xì)胞單層?；谠诜趸?5天的Idexx IBDV ELISA結(jié)果，我們集合5個(gè)不同組的至少14只動(dòng)物(見(jiàn)表14)，并隔離分室。在孵化后18天，將每只雞在飼料中口服給予1000 ELD50的mD6948-s2VP3C3。在孵化后22，25，32和42天在每只雞中取血液樣品，并在Idexx IBDV ELISA中和在病毒中和實(shí)驗(yàn)中確定每個(gè)樣品中IBDV抗體水平。將每組5只雞在孵化后22天取血液樣品后進(jìn)行安死術(shù)，所剩的雞在孵化后42天取血液樣品后進(jìn)行安死術(shù)。確定在孵化后41天進(jìn)行安死術(shù)的每只雞的腔上囊重-體重比值。結(jié)果構(gòu)建和分析嵌合的A節(jié)段質(zhì)粒為確定含有嵌合的A節(jié)段dsDNA的IBD病毒的存活性，毒力和抗原性性質(zhì)，我們產(chǎn)生了一些含有編碼雜種多蛋白的全長(zhǎng)A節(jié)段cDNA的質(zhì)粒，在基于CEF94 cDNA，并編碼(部分)衍生自TY89血清型II分離株的VP3的A節(jié)段質(zhì)粒之后，我們構(gòu)建了3個(gè)嵌合的質(zhì)粒，它們基于D6948的A節(jié)段質(zhì)粒，D6948是一種極烈性IBDV分離株。這些質(zhì)粒其中的兩個(gè)(pHB60-s2VP3C1，pHB60-s2VP3C3，見(jiàn)圖11和表12)編碼一種多蛋白，該多蛋白中VP3的C末端部分衍生自血清型II，而其它質(zhì)粒(pHB60-s2VP3N，圖11和表12)編碼一種多蛋白，其中VP3的N末端部分源自血清型II IBDV。所有編碼雜種VP3蛋白的質(zhì)粒具有一個(gè)T7啟動(dòng)子和丁型肝炎病毒核酶。驅(qū)動(dòng)這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的T7啟動(dòng)子引導(dǎo)A節(jié)段IBDV RNA形成正鏈，其準(zhǔn)確地模擬病毒正鏈RNA的核苷酸序列。然而在天然病毒RNA和人工產(chǎn)生的的類(lèi)病毒RNA中存在差異，因?yàn)椴《镜鞍谆蚪M連接的分子(VP1)，在天然的RNA的5’末端存在，而在人工產(chǎn)生的RNA中不存在。
接著將構(gòu)建的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞，該細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前用重組痘病毒(禽痘病毒FP-T7或痘苗MVA-T7)感染，所述病毒在感染后在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)T7聚合酶。所得A節(jié)段RNA不能復(fù)制，因?yàn)橛葿節(jié)段編碼的RNA依賴(lài)型RNA聚合酶(VP1)不存在。在轉(zhuǎn)染后，沖洗細(xì)胞，并通過(guò)Western印跡分析確定總細(xì)胞提取物中(重組)VP3的存在情況(圖12)。使用已知與VP3反應(yīng)(血清型特異性)的4種不同的單克隆抗體。單克隆B10A是一種非血清型特異性單克隆抗體，并與由所有使用的質(zhì)粒編碼的VP3反應(yīng)。血清型I特異性單克隆抗體IVSI只與那些具有血清型I的C末端部分的VP3反應(yīng)，而單克隆I/G4SI只識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的經(jīng)典血清型I分離株(CEF94)的VP3 C末端部分，而不與極烈性血清型I(D6948)衍生的VP3反應(yīng)。血清型II特異性單克隆T75SII的識(shí)別模式與單克隆IVSI正相反，其只識(shí)別那些具有血清型II C末端部分的VP3。
氨基酸序列對(duì)比基于Western印跡分析，我們得出結(jié)論，即由3個(gè)血清型特異性Mab識(shí)別的VP3表位是線(xiàn)性的并存在于此蛋白質(zhì)的C末端部分(850-1012位氨基酸)。對(duì)推導(dǎo)的多蛋白VP3部分的氨基酸序列進(jìn)行的序列對(duì)比表明，在兩個(gè)血清型I分離株CEF94和D6948之間只有兩個(gè)氨基酸不同(即第981位和1005位氨基酸；見(jiàn)圖13)。單克隆I/G4SI只識(shí)別CEF94而不識(shí)別D6948，顯然是由于這些氨基酸差異之一所致。另外，I/G4SI也不能與TY89反應(yīng)。血清型II和血清型I毒株的VP3之間存在一些不同。因?yàn)镮/G4SI的表位存在于第981位氨基酸或1005位氨基酸附近(如上)，我們認(rèn)為在第981或992位的氨基酸不同(見(jiàn)圖13)與I/G4SI的反應(yīng)性的不同相關(guān)。
拯救感染性鑲嵌IBDV將全長(zhǎng)雜種A節(jié)段質(zhì)粒，組合全長(zhǎng)B節(jié)段質(zhì)粒(pHB-34Z或pHB-55)轉(zhuǎn)染入FP-T7或MVA-T7感染的QM5細(xì)胞中。感染性鑲嵌IBDV可在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)拯救，使用新鮮QM5細(xì)胞(對(duì)所有mCEF94衍生物而言)或原始囊細(xì)胞(對(duì)mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3而言)(表12)。當(dāng)將質(zhì)粒pHB60-s2VP3N與質(zhì)粒pHB-55組合轉(zhuǎn)染時(shí)，沒(méi)有病毒可拯救。這意味著此鑲嵌病毒是不可存活的，或我們拯救此病毒的方法沒(méi)有足夠效果。將拯救的病毒和親代野生型毒株均在含胚卵中擴(kuò)增，并收獲。接著用含胚卵確定每個(gè)病毒原種的病毒效價(jià)(50％胚致死劑量(ELD50))。
用鑲嵌IBDV感染SPF雞為確定拯救的鑲嵌IBDV毒株的毒力，我們用1000 ELD50的野生型或鑲嵌病毒毒株接種雞群，并在存活期間或死亡后確定一些相應(yīng)參數(shù)(表13)。在第一個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中(實(shí)驗(yàn)1)，我們觀測(cè)到死亡率只在接受D6948(野生型或拯救的)接種后的組中在第一個(gè)5天期間發(fā)生。當(dāng)用D6948衍生的mD6948-s2VP3C1接種雞群時(shí)，在此實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有死亡率發(fā)生。這與第二個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)2)相反，其中此組(15只)中有一只雞在接種后5天內(nèi)死亡。在實(shí)驗(yàn)2中，我們發(fā)現(xiàn)在用mD6948-s2VP3C3感染后沒(méi)有死亡率，mD6948-s2VP3C3是D6948的一個(gè)衍生物，其比mD6948-s2VP3C1更接近于野生型D6948(見(jiàn)圖11和表13)。在進(jìn)行安死術(shù)后確定每只雞的腔上囊重和體重(表13)。腔上囊重和體重之間的平均比值是SPF雞由于IBDV感染而導(dǎo)致囊損害的良好指征。細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的IBDV毒株(例如CEF94)，其對(duì)腔上囊中的發(fā)育B淋巴細(xì)胞不再具有特異性嗜性，其只使此比值略降低(表13)，而非細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的IBDV毒株(例如極烈性D6948，及其衍生物)，其具有特異性囊嗜性，使腔上囊重-體重比值大大降低。將血清型IIVP3的C末端編碼部分導(dǎo)入vvIBDV(mD6948-s2VP3C3)基因組中，不改變此比值，這與針對(duì)囊的嗜性與VP2的序列相關(guān)相一致。盡管極烈性VP2序列存在于mD6948-s2VP3C1中，但發(fā)現(xiàn)與野生型或拯救的D6948相比，mD6948-s2VP3C1的腔上囊重-體重比值不同。D6948，CEF94和TY89基因組這一特異性組合在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)2)中顯然影響病毒復(fù)制，及囊損害。
感染的腔上囊的免疫組織化學(xué)分析將IBDV(rIBDV或mD6948-s2VP3C1，實(shí)驗(yàn)1)感染的雞的腔上囊切片，用于顯示感染后病毒抗原的存在情況。非血清型特異性(B10A)或血清型特異性(IVSI)單克隆抗體用于顯示病毒抗原在感染的囊中的分布。使用Mab B10A，我們能檢測(cè)到在rD6948和mD6948-s2VP3C3感染的雞的囊中的病毒抗原。當(dāng)使用Mab BI0A時(shí)，在mD6948-s2VP3C3感染的雞的囊中未檢測(cè)到病毒抗原，而在rD6948感染的雞的囊中清楚地檢測(cè)到病毒抗原(數(shù)據(jù)未示出)。
感染的囊的組織病理學(xué)分析將IBDV感染的雞的腔上囊的切片(實(shí)驗(yàn)2)，在進(jìn)行安死術(shù)后進(jìn)行檢測(cè)以確定囊損害程度(組織病理學(xué)囊損害評(píng)分，HBLS)。根據(jù)Bayyari所述(Bayyari等，1996)將囊分為1級(jí)正常囊至5級(jí)75-100％濾泡損害(見(jiàn)材料與方法章節(jié))。具有CEF94的VP2的所有病毒只導(dǎo)致較小的囊損害(＜2.0)，而具有D6948的VP2的所有病毒導(dǎo)致較嚴(yán)重的囊損害(4.7-5.0)(表13)?；贖BLS，看上去在mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3感染后囊損害與未修飾的D6948相比幾乎相同。然而，仔細(xì)檢測(cè)表明在由不同的基于D6948的病毒導(dǎo)致的囊濾泡的損害之間存在差異。(圖14)。D6948和rD6948均完全破壞囊中的濾泡結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致其壞死及胞囊形成。然而mD6948-s2VP3C1和mD6948-s2VP3C3感染的雞的囊的全部濾泡結(jié)構(gòu)仍存在。在對(duì)照的囊(PBS組)中發(fā)現(xiàn)mD6948-s2VP3C1感染的囊的一些濾泡具有同樣表現(xiàn)，盡管這些濾泡的直徑與野生型濾泡相比通常降低(見(jiàn)圖14)。我們還發(fā)現(xiàn)囊絨毛的長(zhǎng)度在(m)D6948感染的雞中比在模擬感染的雞中降低。(m)D6948感染的囊中絨毛長(zhǎng)度降低與這些囊的重量(和體積)降低相關(guān)。
感染具有母體衍生的IBDV抗體的幼雞在證實(shí)mD6948-s2VP3C3與野生型D6948相比毒力降低(減毒)之后，我們確定此病毒在具有母體衍生的IBDV抗體的幼雞中，是否能感染及誘導(dǎo)IBDV中和抗體(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3)?；诜趸?p.h.)15天取的血清樣品中IBDV特異性抗體水平(IBDV Idexx ELISA)，將至少14只幼雞分為5組(見(jiàn)表14)。在感染后18天，將每只雞用mD6948-s2VP3C3(1000 ELD50)感染，并通過(guò)ELISA(Idexx，見(jiàn)表14)和通過(guò)病毒中和分析(見(jiàn)表15)確定IBDV特異性抗體的水平。通過(guò)Idexx ELISA確定的IBDV抗體水平與病毒中和分析確定的病毒中和抗體水平非常一致(表14和表15)。當(dāng)病毒中和抗體的2log效價(jià)低于8.0時(shí)，Idexx ELISA給出陰性評(píng)分(為0)。
在此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中(實(shí)驗(yàn)3)，我們發(fā)現(xiàn)mD6948-s2VP3C3能感染不具有(第1組，在感染前3天平均Idexx值為18)，或具有中等水平(第2組，在感染前3天平均Idexx值為361)，或高水平(第5組，在感染前3天平均Idexx值為1283)母體衍生的抗體平均水平的雞。(表14)。由孵化后42天進(jìn)行安死術(shù)的雞的計(jì)算平均腔上囊重-體重比值(BBR)也清楚在第1，2和5組中的雞確實(shí)已經(jīng)感染。在第1組(BBR＝0.57，SD＝0.21)，第2組(BBR＝0.69，SD＝0.25)和第5組(BBR＝0.70，SD＝0.16)中，這些數(shù)值與未感染的第3組(BBR＝2.22，SD＝0.42)和第4組(BBR＝2.17，SD＝0.68)相比降低。盡管mD6948-s2VP3C3能明顯感染具有最高水平母體衍生的抗體的第5組的禽，但不感染具有中等至高水平母體衍生的抗體的第3和第4組(第3組和第4組在感染前3天的平均BDV Idexx值分別為576和899)。顯然母體衍生的(中和)抗體水平與mD6948-s2VP3C3感染雞的能力不密切相關(guān)。
極烈性IBDV(vvIBDV)在商業(yè)雞群中的爆發(fā)首先在歐洲報(bào)道，但現(xiàn)在在世界范圍均發(fā)現(xiàn)。極烈性IBDV毒株能感染幼雞，盡管相對(duì)高效價(jià)的母體衍生的IBDV抗體(MDIA)對(duì)經(jīng)典IBDV分離株的感染有保護(hù)性。為預(yù)防vvIBDV爆發(fā)，當(dāng)幼雞仍具有高水平MDIA時(shí)，施用基于野生型(vv)IBDV分離株的疫苗(熱疫苗)。在具有MDIA高變異系數(shù)的雞群中，在低水平MDIA的雞中接種熱疫苗可導(dǎo)致嚴(yán)重囊損害。另外，將活的野生型vvIBDV作為疫苗導(dǎo)入局部，對(duì)動(dòng)物健康是有害的，因?yàn)椴荒茴A(yù)防傳播，及沒(méi)有區(qū)分試驗(yàn)適于區(qū)分疫苗和野外病毒。
在此實(shí)施例中，我們闡述了極烈性衍生的鑲嵌IBDV(mD6948-s2VP3C3)的拯救，其具有的VP3有一部分(C末端的155個(gè)氨基酸)基于血清型II TY89毒株的VP3序列。先前我們闡述了基于經(jīng)典減毒的血清型I毒株CEF94產(chǎn)生和在體外分析鑲嵌病毒(mCEF94-s2VP3C)，其與mD6948-s2VP3C3同樣具有VP3編碼序列的C末端交換(C末端的155個(gè)氨基酸)。此病毒的復(fù)制表現(xiàn)為略降低，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)在感染10小時(shí)后的QM5單層細(xì)胞中沒(méi)有病毒釋放。這與野生型CEF94相反，野生型CEF94表現(xiàn)為在感染后10小時(shí)有病毒釋放。在感染后25-50小時(shí)之間，野生型CEF94和mCEF94-s2VP3C均達(dá)到相同的最終IBDV效價(jià)(＞107)，表明mCEF94-s2VP3C的復(fù)制只受置換的TY89的VP3的C末端155個(gè)氨基酸的微弱影響。在此我們示出mD6948-s2VP3C3與野生型D6948相比毒力降低。此結(jié)論是基于i)當(dāng)將其施用于21天齡蛋雞型SPF雞時(shí)不產(chǎn)生任何死亡率，而野生型D6948在雞中產(chǎn)生大約50％的死亡率(表13)，ii)在用mD6948-s2VP3C3感染21天齡的SPF雞后產(chǎn)生的囊損害，與用D6948感染的雞相比降低(圖14)。將血清型II VP3的C末端部分導(dǎo)入血清型I分離株的背景中，在體內(nèi)和體外均產(chǎn)生小但獨(dú)特的表型。
在此實(shí)施例中，我們進(jìn)一步示出mD6948-s2VP3C3能感染具有母體衍生的IBDV特異性中和抗體的幼雞。此特殊的鑲嵌病毒感染所有3組種禽型非SPF雞，這3組雞在感染前3天的平均Idexx IBDV抗體效價(jià)為18(第1組，表14)，361(第2組，表14)或1283(第5組，表14)。在感染后4-7天之間，在屬于第1組和第2組的一些動(dòng)物中IBDV特異性抗體水平明顯提高，而這些組中的所有動(dòng)物在感染后7-14天之間均具有高IBDV特異性抗體水平。在第5組中在感染后14-24天之間發(fā)現(xiàn)IBDV特異性抗體效價(jià)提高，表明在此組中的感染發(fā)生速度比第1和2組慢。第5組的平均IBDV Idexx值(在感染前3天為1283)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第1組(在感染前3天為18)和第2組(在感染前3天為361)。第5組與第1和2組相比，母體衍生的抗體效價(jià)水平的不同更可能導(dǎo)致活性(中和)IBDV抗體水平提高緩慢。
將實(shí)驗(yàn)2的動(dòng)物血清用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，其中我們使用原核表達(dá)的CEF94多蛋白C末端部分290個(gè)氨基酸作為包被的抗原。將用D6948和mD6948-s2VP3C1感染的雞血清用于競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體IV或I/G4。在1∶500稀釋的雞血清中，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自用mD6948-s2VP3C1感染的雞的血清不能競(jìng)爭(zhēng)Mab IV和I/G4與包被的抗原的相互作用而D6948感染的雞的血清在此相互作用中可以競(jìng)爭(zhēng)(圖15)。這表明在D6948的cDNA中導(dǎo)入血清型II序列產(chǎn)生的鑲嵌病毒誘導(dǎo)獨(dú)特的抗體應(yīng)答。使用所述的競(jìng)爭(zhēng)ELISA，我們能區(qū)分用野生型血清型IvvIBDV病毒(毒株D6948)和鑲嵌血清型I-II毒株，減毒的vvIBDV病毒(毒株mD6948-s2VP3C1)感染的雞。盡管I/G4在Western印跡分析中不與衍生自pHB60的VP3反應(yīng)(圖12)，但我們發(fā)現(xiàn)由pHB60衍生的病毒(rD6948)誘導(dǎo)的抗體能競(jìng)爭(zhēng)CEF94抗原。因?yàn)殍偳稑O烈性D6948分離株(mD6948-s2VP3C3)毒力降低，及此病毒可感染具有低，中或高水平母體衍生的IBDV中和抗體幼雞，所以此病毒是有效預(yù)防vvIBDV爆發(fā)的疫苗的一個(gè)預(yù)備候選者。可區(qū)分用此病毒接種的雞及用野生型(極烈性)病毒感染的雞的能力，使此鑲嵌(vv)IBDV病毒更有利用價(jià)值，因?yàn)槠淇捎梦覀兯龅母?jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)及追蹤(亞)臨床(vv)IBDV感染。此(vv)IBDV標(biāo)記疫苗也可使Gumboro根除計(jì)劃成為可能。實(shí)施例3許多近年來(lái)在世界范圍內(nèi)商業(yè)雞群中爆發(fā)的傳染性腔上囊病，是由于傳染性腔上囊病病毒的極烈性毒株(IBDV)傳播所致。與經(jīng)典IBDV相比，vvIBDV毒性增強(qiáng)的分子決定簇還未知。缺失從其克隆的cDNA中拯救vvIBDV的反向遺傳系統(tǒng)，妨礙了鑒別和研究這些決定簇。在此報(bào)道中，我們第一次闡述了從其克隆的cDNA中拯救vvIBDV。將含有T7啟動(dòng)子和vvIBDV(D6948)的全長(zhǎng)A或B節(jié)段cDNA的兩個(gè)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入表達(dá)T7聚合酶的QM5細(xì)胞中。在將轉(zhuǎn)染上清在原始囊細(xì)胞(在體外)或含胚卵(在體內(nèi))但非QM5細(xì)胞中傳代后，可檢測(cè)vvIBDV的存在情況。拯救的vvIBDV(rD6948)表現(xiàn)為具有與親代分離株D6948相同的毒力。節(jié)段重排列的IBDV，其中兩個(gè)基因組節(jié)段之一源自經(jīng)典減毒的IBDV CEF94的cDNA，另一個(gè)源自D6948的cDNA，這種IBDV也可用此系統(tǒng)拯救。含有經(jīng)典減毒的分離株(CEF94)的A節(jié)段和極烈性分離株(D6948)的B節(jié)段的節(jié)段重排列病毒，只是在體外感染15小時(shí)后釋放。這表明復(fù)制略延遲，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)在感染后10小時(shí)CEF94首次釋放。在節(jié)段重排列后，我們產(chǎn)生和分析了鑲嵌IBDV。在這些鑲嵌IBDV中，我們將編碼病毒蛋白(pVP2，VP3或VP4)之一的CEF94區(qū)域置換為D6948的相應(yīng)區(qū)域。對(duì)這些mIBDV分離株的分析示出對(duì)非B淋巴細(xì)胞的嗜性是由病毒衣殼蛋白VP2單獨(dú)決定的。然而，極烈性表型不是僅由此蛋白質(zhì)決定的，因?yàn)楹衯vIBDV的VP2的鑲嵌病毒在幼雞中既不誘導(dǎo)發(fā)病率也不誘導(dǎo)死亡率。導(dǎo)論傳染性腔上囊病病毒(IBDV)是雞群中一種高度傳染性疾病(Gumboro病(11))的致病因子(Cosgrove，1962)。IBDV是雙RNA科的一個(gè)成員，具有分為兩個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)(14)。dsRNA基因組被兩個(gè)病毒蛋白的衣殼覆蓋，產(chǎn)生具有二十面體(T＝13)對(duì)稱(chēng)(5)的單殼裸病毒顆粒(60nm)。最大的dsRNA(A節(jié)段，大約3260bp)含有兩個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框(ORF)。第一個(gè)，最小的ORF編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白5(VP5，+/-145個(gè)氨基酸，17kDa，見(jiàn)圖16a)。第二個(gè)ORF編碼一個(gè)多蛋白(1012個(gè)氨基酸，110kDa，見(jiàn)圖1b)，該多蛋白可自動(dòng)催化裂解產(chǎn)生病毒蛋白pVP2(也稱(chēng)為VPX，48kDa)，VP4(29kDa)，和VP3(33kDa)。在體內(nèi)病毒成熟期間，pVP2被加工為VP2(41-38kDa)，可能是由于通過(guò)宿主細(xì)胞編碼的蛋白酶(19)對(duì)pVP2進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解而得。VP2和VP3是組成毒粒殼的兩種蛋白質(zhì)。僅已知VP2的中和抗體，這些抗體是構(gòu)象依賴(lài)型的。B節(jié)段(大約2827kDa)含有一個(gè)大ORF，編碼91kDa的VP1蛋白(見(jiàn)圖16c)。此蛋白含有RNA依賴(lài)型RNA聚合酶的共有基序(8)。另外，已經(jīng)報(bào)道此蛋白質(zhì)與基因組RNA節(jié)段的5’末端連接(病毒蛋白基因組連接的，VPg)(12，29)。
病原性血清型I IBDV分離株基本分為經(jīng)典型，抗原性變體，和極烈性分離株?？乖宰凅wIBDV分離株只在美國(guó)有報(bào)道(自1985年)，并發(fā)現(xiàn)在其VP2蛋白的特異區(qū)域(高變區(qū))中有一個(gè)氨基酸改變，導(dǎo)致不同的病理表型(28)。后來(lái)在歐洲(自1988年(9))報(bào)道IBDV分離株毒力增強(qiáng)(極烈性IBDV，vvIBDV)，同時(shí)與經(jīng)典毒株具有相同的抗原性結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)vvIBDV和經(jīng)典IBDV分離株的病毒蛋白之間的氨基酸不同是分散在所有病毒蛋白之間的，盡管其中大多數(shù)發(fā)現(xiàn)在VP2的高變區(qū)內(nèi)(7，24)。目前還未知是否所有或只是少數(shù)這些氨基酸突變與vvIBDV分離株毒力增強(qiáng)相關(guān)。
野生型IBDV在腔上囊中的發(fā)育淋巴細(xì)胞中特異性復(fù)制。在此復(fù)制期間，病毒蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞迅速減少(31)。生產(chǎn)IBDV疫苗的常規(guī)方式是將野生型病毒在雞胚或用原始雞胚細(xì)胞成纖維細(xì)胞(CEF)，或如鵪鶉衍生的細(xì)胞(QT35，QM5或QM7)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero細(xì)胞)的細(xì)胞系中適應(yīng)性增殖。經(jīng)常報(bào)道野生型IBDV的適應(yīng)性與減毒相關(guān)(32，34)。適應(yīng)的IBDV能感染雞的非B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致感染的雞的囊中B淋巴細(xì)胞病毒負(fù)荷降低。一些報(bào)道闡述了氨基酸突變是野生型IBDV在非B淋巴細(xì)胞上增殖期間適應(yīng)的結(jié)果(20，33，34)。另外，已經(jīng)公布了兩項(xiàng)研究，其中用反向遺傳系統(tǒng)，在IBDV的VP2區(qū)域?qū)氚被嵬蛔?20，22)。這些分析示出對(duì)在非B淋巴細(xì)胞上增殖重要的氨基酸位于VP2的高變區(qū)(即在253，279和284位的氨基酸)。還不清楚在基因組其它部分(如VP1(7，34))發(fā)現(xiàn)的突變的影響。針對(duì)確定定點(diǎn)單一或多個(gè)氨基酸突變的影響的研究，由于缺乏可產(chǎn)生極烈性IBDV的反向遺傳系統(tǒng)而受到妨礙。在此報(bào)道中，我們闡述了這種系統(tǒng)。使用野生型極烈性IBDV分離株(D6948)的全長(zhǎng)cDNA，我們成功地拯救了重組D6948(rD6948)。另外，我們拯救了用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的鑲嵌IBDV，該質(zhì)粒含有大部分源自減毒的經(jīng)典分離株(CEF94)的cDNA，和部分源自野生型vvIBDV(D6948)的cDNA。材料和方法病毒，細(xì)胞和抗體經(jīng)典IBDV分離株CEF94是PV1的衍生物，其已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物上適應(yīng)生長(zhǎng)(3，23)。野生型vvIBDV分離株D6948毒株是由荷蘭家禽健康服務(wù)公司(PHD，Doorn，1989)分離的，并通過(guò)在含胚卵中重復(fù)有限稀釋傳代而純化(5次)。接著在我們的實(shí)驗(yàn)室中在SPF雞中傳代兩次。含有T7聚合酶基因的重組禽痘病毒(FP-T7)(6)是由M.Skinner惠贈(zèng)的(Compton實(shí)驗(yàn)室，Berks，United Kingdom)。QM5細(xì)胞(1)通過(guò)在CO2(5％)溫箱中在37℃，使用補(bǔ)加5％胎牛血清(FCS)和2％抗生素溶液ABII(1000U/ml青霉素(Yamanouchi)，1mg/ml鏈霉素(Radiumfarma，意大利)，20mg/ml兩性霉素B，500mg/ml多粘菌素B，和10mg/ml卡那霉素)的QT35培養(yǎng)基(Gibco-BRL)維持。原始囊細(xì)胞分離自14天齡SPF胚，并維持在補(bǔ)加15％FCS，0.125％乳白蛋白水解產(chǎn)物(Oxiod)，和1000U/ml青霉素(Yamanouchi)和1mg/ml鏈霉素(Radiumfarma，意大利)的Eagle’s改進(jìn)的極限必需基本培養(yǎng)基(EMEM)中。多克隆兔抗VP1血清是通過(guò)用純化的重組VP1注射兔產(chǎn)生的(30)。多克隆兔抗IBDV的VP3和VP4的血清是如下產(chǎn)生的使用大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pQE-30(Qiagen)將含有CEF的A節(jié)段cDNA的(nt2297-nt3192(多蛋白的722-1018位氨基酸)的PCR片段融合于6組氨酸標(biāo)記。將表達(dá)的融合蛋白根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)用Ni-NTA樹(shù)脂(Qiagen)純化。將純化的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠中分離，并如Hardy所述(16)從凝膠中分離全長(zhǎng)融合產(chǎn)物(+/-35kDa)。接著將回收的蛋白質(zhì)用于免疫兔。在ELISA，放射免疫沉淀，和IPMA分析中證實(shí)兔血清(PaVP3/4)的特異性(識(shí)別VP4和VP3)和反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未示出)。
產(chǎn)生全長(zhǎng)A和B節(jié)段克隆為產(chǎn)生兩個(gè)IBDV分離株(CEF94和D6948)的A和B節(jié)段的全長(zhǎng)單鏈cDNA，我們使用特異于編碼鏈3’末端的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(4)。接著用特異于編碼鏈和非編碼鏈的3’末端的兩個(gè)引物，在PCR中擴(kuò)增全長(zhǎng)A節(jié)段和B節(jié)段cDNA，使用Taq和Pwo酶混合物(Expand，Boehringer Mannheim)(4)。兩個(gè)與非編碼鏈3’末端雜交的引物含有編碼T7啟動(dòng)子的5’延伸(4)。對(duì)每個(gè)節(jié)段進(jìn)行3次獨(dú)立RT-PCR反應(yīng)，將所得PCR片段克隆入pGEM-T載體中(Promega)(A節(jié)段)，或克隆入含有反基因組順式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶(10)和T7聚合酶終止子的pUC19衍生物中(見(jiàn)圖17和(3)(B節(jié)段))。在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)(BigDye終止子試劑盒，PE應(yīng)用生物系統(tǒng))，和ABI310設(shè)備(PE應(yīng)用生物系統(tǒng))中，使用序列特異性引物對(duì)這兩個(gè)鏈進(jìn)行序列分析。在D6948克隆(pHB-22)的一個(gè)A節(jié)段中的一個(gè)非有無(wú)意突變，通過(guò)交換來(lái)自一獨(dú)立克隆的一個(gè)限制酶片段而恢復(fù)(數(shù)據(jù)未示出)，產(chǎn)生pHB-22R。pHB-22R含有D6948 vvIBDV分離株A節(jié)段的共有cDNA序列。通過(guò)使用在RT-PCR方法中所用的相同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(4)，我們接著將此全長(zhǎng)A節(jié)段序列移至基于pUC18的載體中，該載體含有丁型肝炎病毒(HDV)核酶和T7聚合酶終止子(如上)，在此轉(zhuǎn)移期間，在多蛋白(A1817G)的VP4編碼部分中導(dǎo)入一個(gè)非有意的突變。此突變接著用作從此D6948 A節(jié)段質(zhì)粒中拯救的病毒的遺傳標(biāo)記。CEF94的A節(jié)段cDNA克隆(pHB-36W)含有兩個(gè)核苷酸遺傳標(biāo)記(3172C→T和3173T→A)，從而在A節(jié)段的3’UTR中導(dǎo)入一個(gè)單一KpnI限制位點(diǎn)GGTAAC(3)。
蛋白質(zhì)序列對(duì)比用于序列對(duì)比的氨基酸序列得自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登記號(hào)在括號(hào)中表示)。為對(duì)比vvIBDV的VP5和多蛋白(A節(jié)段)，我們使用分離株D6948(AF240686)，HK46(AF092944)，UK661(X92760)和OKYM(D49707)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。為對(duì)比vvIBDV VP1序列(B節(jié)段)，我們使用D6948(AF240687)，HK46(AF092944)，UK661(X92761)，OKYM(D49707)，IL3(AF083093)和IL4(AF083092)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯將含有T7啟動(dòng)子之后的全長(zhǎng)A或B節(jié)段的環(huán)形質(zhì)粒(0.4mg)，在存在35S-甲硫氨酸的體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)(TnT-T7Quick，Promega)中用作模板。所得病毒蛋白在PAGE凝膠(12％)中分離，并通過(guò)放射自顯影觀測(cè)。
感染和轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞將QM5細(xì)胞在35mm培養(yǎng)皿(M-6，9.6cm2/孔)中生長(zhǎng)至80％鋪滿(mǎn)，并用禽痘病毒T7(FPV-T7，m.o.i.＝3)感染。在1小時(shí)后，將細(xì)胞用3ml QT35培養(yǎng)基沖洗兩次，并用3ml Optimen 1(Gibco/BRL)覆蓋。同時(shí)，將DNA(1.0mg)與12.5mlLipofectAMINE(Gibco/BRL)在250ml Optimem 1中混合，并在室溫保持至少30分鐘。接著將QM5細(xì)胞用2ml新鮮Optimeml覆蓋，并加入DNA/LipofectAMINE混合物。在37℃溫箱(5.0％CO2)轉(zhuǎn)染過(guò)夜(18小時(shí))。將轉(zhuǎn)染的單層細(xì)胞用PBS漂洗一次，加入新鮮QM5培養(yǎng)基(補(bǔ)加5％FCS和2％ABII)，將平板在37℃溫箱(5.0％CO2)中進(jìn)一步溫育。在溫育24小時(shí)后，將平板凍/融一次，并將上清通過(guò)200nm濾膜(Acrodisc，GelmanSciences)過(guò)濾，以除去禽痘病毒(FP-T7)和細(xì)胞碎片。將澄清的上清在-70℃貯存或直接用于進(jìn)一步分析。
檢測(cè)感染性rIBDV在轉(zhuǎn)染后，通過(guò)用部分澄清的轉(zhuǎn)染上清接種接近鋪滿(mǎn)單層的QM5細(xì)胞，檢測(cè)感染性rIBDV。在24小時(shí)后，在免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)(3)中觀測(cè)IBDV特異性蛋白。將不能在QM5細(xì)胞上復(fù)制的拯救的IBDV(如rD6948)，也用于接種單層原始囊細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)在體外在39℃在CO2(5％)溫箱中的35mm組織培養(yǎng)皿(10cm2)中生長(zhǎng)24小時(shí)。感染的B淋巴細(xì)胞中的IBDV特異性蛋白，在48小時(shí)后在IPMA中檢測(cè)。
單步IBDV生長(zhǎng)曲線(xiàn)為確定rCEF94和srIBDV-CADB分離株的復(fù)制能力(見(jiàn)表16)，我們確定了單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。將QM5細(xì)胞(2×106)在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)過(guò)夜(16小時(shí))。接著將培養(yǎng)基除去，用1ml含有IBDV(TCID50＝107.0；m.o.i.＝5)的培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞。在1小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS沖洗3次，加入5ml新鮮培養(yǎng)基。在不同時(shí)間點(diǎn)從培養(yǎng)基中取樣品(感染后5h，10h，15h和25h)，并貯存于-20℃。通過(guò)用10倍稀釋的IBDV樣品感染含有接近鋪滿(mǎn)的QM5細(xì)胞的96孔組織培育平板，確定每個(gè)樣品中IBDV數(shù)量(TCID50)。將此96孔平板溫育48小時(shí)，通過(guò)IPMA檢測(cè)IBDV的感染中心(IBDV-抗原陽(yáng)性區(qū)域)(見(jiàn)檢測(cè)感染性rIBDV)。
構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒pHB36-vvVP2為將CEF94多蛋白的pVP2部分的編碼序列用D6948多蛋白的相應(yīng)部分置換，我們產(chǎn)生了3個(gè)PCR片段(即VP2a，VP2b，和VP2c，見(jiàn)圖21)。PCR片段VP2a(189bp)是用pHB-36W作模板，使用引物M13R(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)和ATG3(CATCGCTGCGATCGTTTGTCTGATCTCTAC)產(chǎn)生的。PCR片段VP2b(761bp)是用pHB-36W作模板，使用引物(ATCCGGGCCCTAAGGAGG)和ANC4(GCCAAGTCGGTGTGCAG)產(chǎn)生的。PCR片段VP2c(1418bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY0P(TATCATTGATGGTCAGTAGAG)和HY2M(CACCGGCACAGCTATCC)產(chǎn)生的。將這3個(gè)PCR片段用Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并在融合PCR中用作模板(每個(gè)片段50ng)，使用引物T7EcoRI(GGAATTCTAATACGACTCACTATAGG)和ANC4。接著將此PCR片段(2256bp)用EcoRI和SacII消化(產(chǎn)生一個(gè)1806bp的片段)，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化(Qiaex凝膠提取試劑盒，Qiagen)，并連接于已經(jīng)用相同限制酶消化的pHB-36W中，然后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。對(duì)一些質(zhì)粒進(jìn)行分析，選擇一個(gè)具有所需序列的質(zhì)粒(pHB36-vvVP2)。
構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒pHB36-WVP3為將CEF94多蛋白的VP3部分的編碼序列用D6948多蛋白的相應(yīng)部分置換，我們產(chǎn)生了2個(gè)PCR片段。PCR片段VP3a(1622bp)是用pHB-36W作模板，使用引物AC3(GGTAGCCACATGTGACAG)和HY3M(CCAGTCcCGcGGATTGTGAGG)產(chǎn)生的。PCR片段VP3b(1252bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY3P(AACGTTTTCCTCACAATCCgCGgGACTGGGG)和M13F(GTAAAACGACGGCCAGT)產(chǎn)生的。將這2個(gè)PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并在融合PCR中用作模板(每個(gè)片段50ng)，使用引物AC4(ACCCAGCCAATCACATCC)和AGTM(GAGACTCCCAGGtaCCTCACT)。接著將此PCR片段(2154bp)用EagI和KpnI消化(產(chǎn)生一個(gè)1857bp的片段)，并如pHB36-vvVP2相同方式用于交換pHB-36W的相應(yīng)部分，產(chǎn)生pHB36-vvVP3。
構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒pHB36-vvVP4為將CEF94多蛋白的VP4部分的編碼序列用D6948多蛋白的相應(yīng)部分置換，我們產(chǎn)生了3個(gè)PCR片段。PCR片段VP4a(796bp)是用pHB-36W作模板，使用引物AC3和HY4M(CCGGCACAGCTATCCT)產(chǎn)生的。PCR片段VP4b(644bp)是用pHB-36W作模板，使用引物HY3P和ANC2(CTGCCTGTCCTGGAGCC)產(chǎn)生的。PCR片段VP4c(864bp)是用pHB-22R作模板，使用引物HY4P(ACATAATCCGGGCCATAAGG)和HY3M產(chǎn)生的。將這3個(gè)PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并在融合PCR中用作模板(每個(gè)片段50ng)，使用引物AC4和ANC3(CGATGGGCGTTCGGGTC)。接著將此PCR片段(2154bp)用EagI和DraIII消化(產(chǎn)生一個(gè)1189bp的片段)，并如pHB36-vvVP2相同方式用于交換pHB-36W的相應(yīng)部分，產(chǎn)生pHB36-vvVP4。
rIBDV在SPF幼雞中的毒力在SPF蛋雞型雞中評(píng)價(jià)拯救的rIBDV，srIBDV和mIBDV分離株的毒力(見(jiàn)表16)，將IBDV分離株首先在含胚卵中增殖，通過(guò)尿囊絨膜途徑將轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的QM5細(xì)胞上清接種于11天齡的含胚卵中。在溫育5天后回收胚(死或活的)，在Sorval Omni混合器中均質(zhì)(3×10秒，最大速度)，接著通過(guò)離心澄清(6000g，10分鐘)，并將等分貯存于-70℃。在這些樣品中的病毒效價(jià)(50％胚致死劑量ELD50)用11天齡含胚卵確定。在毒力試驗(yàn)中，將9組雞(21天齡)經(jīng)滴鼻和滴眼接種在PBS中的1000ELD50IBDV。另外一組10只雞只接種PBS(陰性對(duì)照組)。將雞群分室隔離。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的臨床跡象，及除去死亡的雞并進(jìn)行尸檢。在感染后9天，將所有陰性對(duì)照組的雞和其中發(fā)生死亡率的組中所有剩余的雞在感染后(p.i.)9天放血(5ml)，并進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢。在其它組中，將6只雞在感染后9天放血(5ml)并進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢，剩余4只在感染后15天放血(5ml)并進(jìn)行安死術(shù)以進(jìn)行尸檢。確定所有在感染后9天進(jìn)行安死術(shù)的雞的腔上囊重和體重。腔上囊重/體重比值是通過(guò)單向方差分析及各組因子而分析的。在分析之前先將比值轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)形式?；贔isher的LSD方法成對(duì)對(duì)比各組(用合并方差估計(jì)進(jìn)行成對(duì)對(duì)比試驗(yàn))。在第9天和第15天尸檢時(shí)，將取自腔上囊的樣品固定于10％中緩沖的福爾馬林中以進(jìn)行組織學(xué)分析。將囊樣品在液氮中瞬時(shí)冷凍，并保藏在-70℃以進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。用傳染性腔上囊病抗體檢測(cè)試劑盒(Idexx，Westbrook，美國(guó))確定在安死術(shù)之前所取的血清中的IBDV抗體效價(jià)。
組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析將福爾馬林固定的囊樣品脫水，包埋在固體石蠟中，切片并用蘇木精-曙紅(HE)染色。用顯微鏡分析囊確定組織病理學(xué)囊損害評(píng)分(HBLS)。根據(jù)(2)所述以1-5等級(jí)確定HBLS1＝正常囊；2＝離散或部分濾泡損害；3＝50％或少于50％濾泡損害；4＝50-70％濾泡損害；5＝75-100％濾泡損害。將冷凍的囊樣品在低溫保持器上切成8um厚度并在玻片(Superfrost)上進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。將切片用丙酮固定10分鐘，在空氣中干燥并貯存于-20℃直至使用。如述(25)進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶染色。簡(jiǎn)而言之，將切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶用0.01％H2O2消除。非特異性反應(yīng)通過(guò)0.2％牛血清白蛋白阻斷。將1∶100稀釋的PaVP3/4用作一級(jí)抗體，而將1∶100稀釋的綴合于過(guò)氧化物酶(Dako)的山羊抗兔抗體用作二級(jí)抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)用作底物。
檢測(cè)遺傳標(biāo)記將源自其中在動(dòng)物試驗(yàn)期間發(fā)生死亡率的組的雞的囊均質(zhì)，并用QiaAmp組織試劑盒(Qiagen，德國(guó))提取病毒dsRNA。將此dsRNA通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)乙醇沉淀濃縮，接著在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作模板，使用引物ANC1(GGGGACCCGCGAACG)。在此模板上進(jìn)行PCR(用Taq聚合酶)，使用引物AC3和ANC5(CCCATCTGGAGCATATCC)，并在94℃(15s)，55℃(15s)，和72℃(15s)進(jìn)行35次循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物(1266bp)經(jīng)凝膠純化(Qiaex凝膠提取試劑盒，Qiagen)，并用作序列分析的模板，使用引物AC6(TTCACCTGGGGTACTCCG)。結(jié)果克隆vvIBDV的全長(zhǎng)cDNA為研究與vvIBDV分離株的極烈性表型相關(guān)的分子決定簇，我們對(duì)極烈性IBDV分離株D6948的全長(zhǎng)A和B節(jié)段分別單獨(dú)克隆并測(cè)序3次。D6948 A節(jié)段的cDNA(3260bp)與經(jīng)典減毒的CEF94 IBDV分離株的序列有122位核苷酸不同(數(shù)據(jù)未示出)。這些核苷酸不同導(dǎo)致推定的D6948的VP5的N末端延伸4個(gè)氨基酸(MLSL)，及在兩個(gè)VP5蛋白之間有5個(gè)另外的氨基酸不同(圖16a)。另外，在兩個(gè)多蛋白之間存在18個(gè)氨基酸不同，其中11個(gè)位于多蛋白的pVP2部分，5個(gè)位于VP4部分，2個(gè)位于VP3部分(圖16b)。在兩個(gè)B節(jié)段(2827bp)之間，我們發(fā)現(xiàn)288個(gè)核苷酸不同(數(shù)據(jù)未示出)，導(dǎo)致在兩個(gè)VP1之間有17個(gè)氨基酸不同(圖16c)，VP1是在B節(jié)段上編碼的唯一蛋白質(zhì)。
通過(guò)組合不同的全長(zhǎng)cDNA克隆的序列，我們構(gòu)建了含有D6948的A和B節(jié)段的共有cDNA序列的質(zhì)粒。接著將A和B節(jié)段cDNA，包括人工導(dǎo)入的T7啟動(dòng)子序列，移至基于pUC19的含有順式作用丁型肝炎病毒核酶載體中(10)，產(chǎn)生pHB-60(A節(jié)段)和pHB-55(B節(jié)段)(表16，和圖17)。這些基于pUC-19的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是使用重組的表達(dá)T7聚合酶的輔助病毒(禽痘病毒)(6)從克隆的cDNA中拯救rIBDV的基礎(chǔ)。我們先前已經(jīng)使用此體內(nèi)T7表達(dá)系統(tǒng)，從細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的經(jīng)典IBDV分離株CEF94的克隆的cDNA中拯救了感染性IBDV(3)。
體外轉(zhuǎn)錄/翻譯將vvIBDV分離株的A和B節(jié)段cDNA克隆在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)(TnT-T7Quick，Promega)中用作模板。這些cDNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在SDS-PAGE分析中表現(xiàn)為與經(jīng)典減毒的CEF94cDNA質(zhì)粒的蛋白質(zhì)產(chǎn)物相同(即在A節(jié)段情況為pVP2，VP3和VP4，在B節(jié)段情況為VP1)(圖18A和18B)。發(fā)現(xiàn)D6948的pVP2比CEF94的pVP2的位置略高。質(zhì)粒pHB-60(D6948 A節(jié)段)在第1817位具有單核苷酸取代(A1817G)，其得自基于PCR的克隆方法。此突變導(dǎo)致VP4中保守的氨基酸突變(I563V)。由于此突變不影響多蛋白的加工(圖18A，和未公布的結(jié)果)，我們接著用此突變作標(biāo)記，以從此D6948 A節(jié)段質(zhì)粒中拯救病毒。
轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞將含有CEF94或D6948的A和B節(jié)段cDNA的質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞。源自A或B節(jié)段的病毒蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)使用特異于VP3/4(A節(jié)段)或VP1(B節(jié)段)的抗體，在免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)的所有測(cè)試情況中均觀測(cè)到(數(shù)據(jù)未示出)。為確定源自克隆的cDNA的感染性IBDV的產(chǎn)生(后文稱(chēng)為拯救的IBDV；rIBDV)，我們將部分上清移至新鮮單層QM5細(xì)胞上(第一次傳代)，并在24小時(shí)后在IPMA中分析這些細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)。此分析示出在處理的QM5細(xì)胞中不能檢測(cè)到感染性rIBDV，所述QM5是用vvIBDV分離株D6948的A和B節(jié)段質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染上清處理的(見(jiàn)圖19)。相反，感染性rIBDV存在于用含有減毒的CEF94分離株的A和B節(jié)段的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染上清處理的QM5細(xì)胞中(圖19)。用D6948的A節(jié)段質(zhì)粒和CEF94的B節(jié)段質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，不產(chǎn)生感染性節(jié)段重排列的IBDV(srIBDV-DACB，表16)。然而，交互組合srIBDV-CADB(表16)產(chǎn)生感染性節(jié)段重排列的IBDV(圖19)。野生型IBDV分離株如D6948不能在成纖維細(xì)胞如QM5細(xì)胞上生長(zhǎng)(見(jiàn)導(dǎo)論章節(jié))。因此我們通過(guò)將轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞的上清移至已在體外生長(zhǎng)24小時(shí)的原始囊細(xì)胞中，確定源自克隆的cDNA的感染性rD6948的存在情況。與只能感染單層中存在的淋巴細(xì)胞的野生型D6948相似(數(shù)據(jù)未示出)，在用轉(zhuǎn)染上清溫育2天后我們能在一些淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到rD6948(圖19，下面一組)。用CEF94的A和B節(jié)段cDNA轉(zhuǎn)染上清溫育原始囊細(xì)胞示出，不僅淋巴細(xì)胞而且成纖維細(xì)胞也被感染，導(dǎo)致在溫育48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞單層破壞。用D6948的A節(jié)段cDNA和CEF94的B節(jié)段cDNA轉(zhuǎn)染的上清中存在的病毒只能感染淋巴細(xì)胞，在48小時(shí)后未觀測(cè)到單層破壞。與rD6948相似，srIBDV-DACB顯然不能感染成纖維細(xì)胞。另外，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被源自CEF94的A節(jié)段cDNA和D6948的B節(jié)段cDNA的轉(zhuǎn)染的病毒感染，盡管單層細(xì)胞表現(xiàn)為在48小時(shí)后與rCEF94相比破壞較輕(圖19)。
單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)為確定拯救的rCEF94和srIBDV-CADB在QM5細(xì)胞是否與野生型CEF94具有相同復(fù)制性質(zhì)，我們對(duì)每種這些病毒進(jìn)行單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)(三份)。將QM5細(xì)胞在1小時(shí)期間用IBDV感染(m.o.i.＝5)，之后將細(xì)胞沖洗3次并在完全培養(yǎng)基中溫育。在不同時(shí)間點(diǎn)取感染的QM5培養(yǎng)物的部分上清。在每個(gè)樣品中確定IBDV的數(shù)量(TCID50)(圖20)。在野生型CEF94和rCEF94中，在感染后10小時(shí)均發(fā)現(xiàn)感染性IBDV釋放，而僅在感染后15小時(shí)發(fā)現(xiàn)srIBDV-CADB首次釋放。野生型CEF94，rCEF94和拯救的含有CEF94的A節(jié)段的節(jié)段重排列IBDV的最終效價(jià)(感染后24小時(shí))相同。
構(gòu)建鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒為分析與分離株D6948的極烈性表型相關(guān)的病毒決定簇，我們構(gòu)建了3個(gè)不同的含有全長(zhǎng)鑲嵌IBDV A節(jié)段cDNA的質(zhì)粒。使用基于PCR的方法(見(jiàn)圖21)，我們構(gòu)建了DNA片段，其中間部分由源自D6948的cDNA組成(即pVP2，VP3，或VP4編碼部分)，而兩側(cè)的cDNA源自CEF94。不同cDNA之間的過(guò)渡部分位于多蛋白的pVP2-VP4和VP4-VP3之間的推定的裂解位點(diǎn)(即分別在453和723氨基酸之后(18)，見(jiàn)圖16B)。接著使用特異性限制性?xún)?nèi)切酶將嵌合PCR片段用于置換質(zhì)粒pHB-36W中CEF94 A節(jié)段cDNA的相應(yīng)部分。對(duì)稱(chēng)為pHB36-vvVP2，pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4的產(chǎn)生的質(zhì)粒的交換部分進(jìn)行測(cè)序，并將含有所述嵌合cDNA序列的質(zhì)粒用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯，并通過(guò)SDS-PAGE分析病毒蛋白的產(chǎn)生(圖18C)。在由這些嵌合cDNA A節(jié)段編碼的多蛋白中沒(méi)有觀測(cè)到自動(dòng)催化裂解的明顯不同。
從A節(jié)段cDNA中拯救IBDV將質(zhì)粒pHB36-vvVP2，pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4，與CEF94的B節(jié)段cDNA(pHB-34Z)一起用于轉(zhuǎn)染QM5細(xì)胞。通過(guò)將等分的轉(zhuǎn)染上清移至新鮮的單層QM5細(xì)胞中，分析感染性IBDV(后文稱(chēng)為mIBDV，見(jiàn)表16)的存在情況。在溫育1天后，將細(xì)胞固定并使用一種IBDV特異性抗體分析(IPMA)，測(cè)試mIBDV的存在情況。當(dāng)使用pHB36-vvVP2質(zhì)粒的上清時(shí)，在QM5單層細(xì)胞中未檢測(cè)到mIBDV，而在pHB36-vvVP3，pHB36-vvVP4的情況中，明顯可見(jiàn)mIBDV(圖22)。我們?cè)趩螌観M5細(xì)胞中未檢測(cè)到mCEF94-vvVP2這一事實(shí)，可能是rCEF94和mCEF94-vvVP2之間細(xì)胞嗜性不同所致。為檢測(cè)這種可能性，我們將用pHB36-vvVP2轉(zhuǎn)染的部分上清移至單層原始囊細(xì)胞上。在2天后，我們可以示出在一些B淋巴細(xì)胞中存在mCEF94-vvVP2病毒(圖22，下面一組)。顯然的，mCEF94-vvVP2與D6948，rD6948和srIBDV-DACB具有相同細(xì)胞嗜性，因?yàn)槠渲荒茉贐淋巴細(xì)胞上生長(zhǎng)，而不能在成纖維細(xì)胞上生長(zhǎng)。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為對(duì)比rIBDV，srIBDV和mIBDV分離株與親代分離株的毒力，我們將21天齡的SPF雞(每個(gè)病毒10只雞)經(jīng)滴鼻和滴眼途徑接種1000 ELD50每種病毒。臨床跡象只在給予D6948，rD6948和srIBDV-DACB的組中發(fā)生(數(shù)據(jù)未示出)。在這些組中，死亡率為3/10(D6948)，5/10(rD6948)，和2/10(srIBDV-DACB)(表17)。在其它組中既未發(fā)現(xiàn)死亡也未發(fā)現(xiàn)發(fā)病。在感染后9天，將其中發(fā)生死亡的組中所有剩余的雞(D6948(n＝7)，rD6948(n＝5)和srIBDV-DACB(n＝8))，和所有對(duì)照組的雞，放血并尸檢。在剩余的組中，將6只雞放血及尸檢，而剩余4只在感染后15天放血及尸檢以確定IBDV抗體水平。在其中發(fā)生死亡的組中腔上囊重/體重的比值非常低(＜2.0)。Fisher的LDS實(shí)驗(yàn)示出D6948，rD6948，srIBDV-DACB和mCEF94-vvVP2的腔上囊重/體重比值，與對(duì)照組和給予其它病毒的實(shí)驗(yàn)組的比值相比明顯降低(P＜0.01)。通過(guò)用mCEF94-vvVP2接種可清楚了解腔上囊重/體重比值降低與死亡率不總是相關(guān)。盡管腔上囊重/體重比值明顯降低(＜2.0)，但在此組中未發(fā)病(數(shù)據(jù)未示出)和死亡(表17)。mCEF94-vvVP3和mCEF94-vvVP4分離株既不誘導(dǎo)死亡或發(fā)病也不誘導(dǎo)粘液重/體重比值明顯降低。只有在那些腔上囊重/體重比值嚴(yán)重降低的組中，我們發(fā)現(xiàn)所有的雞在感染后9天均具有抗IBDV的抗體，而在不發(fā)生死亡的組中一些雞不具有IBDV抗體(表17)。所有在感染后15天檢測(cè)的雞均具有IBDV抗體，除了給予野生型CEF94病毒的3只雞(檢測(cè)4只)之外(數(shù)據(jù)未示出)。
檢測(cè)遺傳標(biāo)記收集其中發(fā)生死亡的組中一些雞的囊(D6948，rD6948，和srIBDV-DACB)。衍生自均質(zhì)的囊的病毒RNA，在RT-PCR中用作模板(見(jiàn)材料和方法章節(jié))。將跨越A節(jié)段的709-1975nt的所得PCR片段用于進(jìn)行核苷酸序列確定。衍生自用rD6948和srIBDV-DACB接種的組的PCR片段含有遺傳標(biāo)記(A1817G)，其存在于A節(jié)段cDNA質(zhì)粒中(pHB-60)(數(shù)據(jù)未示出)。源自用野生型D6948感染的囊的dsRNA的PCR片段，不含有此遺傳標(biāo)記(數(shù)據(jù)未示出)。
已經(jīng)公布了一些研究，其中得自非B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的(極)烈性IBDV分離株的氨基酸變化已經(jīng)作圖(20，22，33)。迄今為止所述的反向遺傳IBDV系統(tǒng)(3，20，22)，只能從源自適應(yīng)的(即能在非B淋巴細(xì)胞上生長(zhǎng)的)IBDV分離株的克隆的cDNA中拯救IBDV。由于這一限制，在拯救的具有原始B淋巴細(xì)胞嗜性的IBDV中沒(méi)有誘變研究可進(jìn)行。為克服此限制，我們修改了從克隆的cDNA中拯救IBDV的方法。
使用原始囊細(xì)胞探索拯救vvIBDV的可能性。因此我們首先用含有A和B節(jié)段cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原始囊細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)囊的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染是非常無(wú)效的。細(xì)胞非常易碎，且分離和維持這些B淋巴細(xì)胞是非常費(fèi)力的。
另外，與B淋巴細(xì)胞一起分離自囊的成纖維細(xì)胞在體外迅速生長(zhǎng)，與淋巴細(xì)胞相反。此生長(zhǎng)速率的不同在溫育42小時(shí)后產(chǎn)生一個(gè)主要由非B淋巴細(xì)胞組成的單層，此時(shí)間點(diǎn)是使用禽痘病毒T7體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染所需的時(shí)間。
在尋求拯救vvIBDV的更有效的系統(tǒng)中，我們接著修改了從轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞中拯救細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的IBDV(CEF94，(3))的方法，即收集轉(zhuǎn)染的QM5細(xì)胞(不允許增殖野生型IBDV的細(xì)胞)的上清，并將其移至原始囊細(xì)胞(含有B淋巴細(xì)胞，其是允許增殖野生型IBDV的細(xì)胞)的單層中。此方法使我們能從克隆的cDNA(rD6948)中拯救vvIBDV。將拯救的D6948接著隨同野生型D6948一起用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以確定其毒力。將雞(21天齡，SPF)用不同的IBDV分離株感染。對(duì)比在感染后9天收集的所有分析的參數(shù)(死亡率，腔上囊重/體重比值，組織病理學(xué)囊損害評(píng)分，免疫組織化學(xué)分析，抗體效價(jià)(表17)，和發(fā)病率(數(shù)據(jù)未示出))，示出野生型和拯救的D6948的毒力相同。這表明拯救的D6948確實(shí)是極烈性的。D6948和rD6948的dsRNA分離自感染的雞的囊，并用于RT-PCR中，隨后進(jìn)行直接序列測(cè)定。由D6948 A節(jié)段cDNA質(zhì)粒編碼的多蛋白的VP4部分中的遺傳標(biāo)記，正如所期望的存在于rD6948衍生的dsRNA中(數(shù)據(jù)未示出)。得自A節(jié)段cDNA中的遺傳標(biāo)記的VP4中的單突變(I563V)，不引起rD6948的表型(在體外和在體內(nèi))與D6948相比有變化。這是第一篇闡述從克隆的cDNA中拯救野生型vvIBDV分離株的報(bào)道。
在已經(jīng)證實(shí)D6948的推導(dǎo)的cDNA序列確實(shí)代表真實(shí)vvIBDV序列之后，我們將D6948蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列與其它(vv)IBDV分離株的序列相對(duì)比。經(jīng)典減毒的分離株CEF94和vvIBDV分離株D6948的VP5序列之間的明顯不同是vvIBDV VP5的N末端具有4個(gè)氨基酸延伸(見(jiàn)圖16a)。此延伸也預(yù)計(jì)在兩個(gè)其它vvIBDV分離株中出現(xiàn)，此區(qū)域的序列已經(jīng)公布(HK46(20)和UK661(7))。所有經(jīng)典分離株缺失此N末端延伸，而只此區(qū)域cDNA序列可知的唯一抗原性變體(GLS)具有同樣延伸。在85位的AUG密碼子是否確實(shí)用作起始密碼子以產(chǎn)生極烈性和GLS分離株的VP5還需確定。令人感興趣的是N末端延伸的VP5是否導(dǎo)致不同表型。在VP5的其它氨基酸差異(圖16A)中，在所有已知的vvIBDV VP5序列只發(fā)現(xiàn)R49G和W137R(UK661，OKYM(33)，和HK46)。一些報(bào)道針對(duì)不同起源的IBDV分離株的pVP2序列之間的不同(例如(15))。在253，279，284和330位氨基酸的不同(圖16B)主要是CEF94在CEF細(xì)胞上適應(yīng)的結(jié)果(20，22，33)。在所有4個(gè)vvIBDV分離株(D6948，UK661，OKYM和HK46)與經(jīng)典和抗原性變體分離株的公布的序列的對(duì)比中，剩余的氨基酸不同只有8個(gè)是保守的(見(jiàn)黑體表示的氨基酸殘基，圖16B)。
CEF94的VP1/VPg的ORF的長(zhǎng)度比D6948的相同ORF長(zhǎng)2個(gè)氨基酸。其它研究人員也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VP1/VPg ORF的長(zhǎng)度的不均勻性(34)。vvIBDV分離株的所有VP1/VPg表現(xiàn)為具有879個(gè)氨基酸，而一些經(jīng)典分離株的VP1只具有877個(gè)氨基酸。CEF94的VP1/VPg的881個(gè)氨基酸是迄今為止公布的最大的VP1。另外，我們?cè)贑EF94和D6948的VP1/VPg序列之間鑒別了17個(gè)氨基酸不同(圖16C)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IBDV的減毒導(dǎo)致VP1序列中氨基酸變化(34)，但沒(méi)有證實(shí)由Yehuda等鑒別的3個(gè)變化與減毒直接相關(guān)。事實(shí)上我們示出含有經(jīng)典減毒的IBDV分離株的B節(jié)段的節(jié)段重排列的IBDV(srIBDV-DACB，見(jiàn)表16)，誘導(dǎo)與野生型極烈性IBDV相同的死亡率和組織病理學(xué)損害。這表明在適應(yīng)后在VP1中發(fā)現(xiàn)的氨基酸變化與病毒的減毒不相關(guān)。17個(gè)氨基酸不同中的6個(gè)在cDNA序列已經(jīng)公布的所有vvIBDV分離株中發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖16C中黑體所示的氨基酸殘基)。
為確定不同分離株的病毒蛋白之間氨基酸差異，我們構(gòu)建了含有CEF94和D6948的cDNA的質(zhì)粒。在SDS-PAGE分析中發(fā)現(xiàn)由CEF94和D6948編碼的pVP2蛋白之間分子量的小差異(圖18A)。在SDS-PAGE凝膠分析中也發(fā)現(xiàn)由pHB36W和pHB36-vvVP2編碼的pVP2蛋白位置的不同(圖18C)。由pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4編碼的VP4的位置，與由pHB36-36W編碼的VP4相比，存在小差異。在CEF94和D6948的兩個(gè)VP3蛋白之間的第一個(gè)氨基酸差異(H751D，圖16B)，在所述裂解位點(diǎn)的下游的28個(gè)氨基酸處發(fā)現(xiàn)(在722位氨基酸之后(18)，見(jiàn)圖16B)。如果VP4-VP3的真實(shí)裂解位點(diǎn)不在兩個(gè)堿性氨基酸殘基之后，而是在其至少28個(gè)以上氨基酸下游，則可解釋VP4的分子量的不同。VP4/VP3之間的可變裂解位點(diǎn)已有提出位于736位氨基酸之后(在Tyr-Leu之后(13))，或在752-756區(qū)域(A-X-A-A-S，(18))。近來(lái)使用定位誘變方法，確實(shí)示出位于VP4和VP3之間的裂解位點(diǎn)更可能在755-756氨基酸殘基之間(27)。我們觀測(cè)到抗起自722位的部分多蛋白的多克隆抗體也能與VP4強(qiáng)烈反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)真實(shí)裂解位點(diǎn)位于722位氨基酸的下游(Boot未公布的數(shù)據(jù))。
檢測(cè)衍生自鑲嵌A節(jié)段質(zhì)粒的病毒在QM5細(xì)胞和/或原始囊細(xì)胞上的生長(zhǎng)，并用于攻擊SPF雞。含有D6948的A節(jié)段和CEF94的B節(jié)段的節(jié)段重排列的病毒(srIBDV-DACB，表16)，誘導(dǎo)與野生型和重組D6948相同的臨床跡象和損害(表17)。在經(jīng)典(適應(yīng)的)和極烈性(非適應(yīng)的)分離株的VP1/VPg蛋白內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不同顯然對(duì)毒力沒(méi)有主要影響。交互組合(srIBDV-DACB，表16)在單層原始囊細(xì)胞中與rCEF94相比誘導(dǎo)較少的CPE(圖19)。我們還發(fā)現(xiàn)與CEF94和rCEF94相比，srIBDV-CADB的新病毒顆粒釋放延遲(圖20)。盡管這些分離株之間體外病毒釋放有差異，但我們發(fā)現(xiàn)在用SPF雞進(jìn)行的體內(nèi)攻擊中沒(méi)有差異。在感染后9天(表17)和15天(數(shù)據(jù)未示出)的rCEF94和srIBDV-CADB的IBDV抗體效價(jià)是相當(dāng)?shù)?。已有提示血清型I和II分離株的B節(jié)段之間的重排列在野外發(fā)生(7)。天然發(fā)生的節(jié)段重排列通常在高度節(jié)段化的dsRNA(呼腸孤病毒和輪狀病毒，(26))發(fā)現(xiàn)。我們未發(fā)現(xiàn)IBDV節(jié)段的天然重排列的任何系統(tǒng)發(fā)生證據(jù)。當(dāng)與經(jīng)典血清型I分離株和血清型II分離株相比時(shí)，所有vvIBDV的VP1蛋白均具有獨(dú)特的氨基酸變化(圖16C，數(shù)據(jù)未示出)。盡管未證實(shí)IBDV重排列在野外呈現(xiàn)，通過(guò)共培養(yǎng)屬于不同血清型的毒株，Muller已在實(shí)驗(yàn)室中成功產(chǎn)生節(jié)段重排列的病毒(21)。
將CEF94的pVP2(包括大部分VP5)，VP3或VP4用D6948的相應(yīng)蛋白質(zhì)交換，均產(chǎn)生存活的病毒。mCEF94-vvVP3和mCEF94-vvVP4均能在QM5細(xì)胞上復(fù)制，而mCEF94-vvVP2只能在B淋巴細(xì)胞上復(fù)制。我們發(fā)現(xiàn)mCEF94-vvVP3，mCEF94-vvVP4，CEF94和rCEF94在QM5細(xì)胞上的單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)沒(méi)有不同(數(shù)據(jù)未示出)。先前已經(jīng)示出與在非B淋巴細(xì)胞中增殖相關(guān)的因子位于VP2上(20，22，32)。在此研究中，我們示出一旦將其人工導(dǎo)入(DNA轉(zhuǎn)染)這些細(xì)胞中，野生型vvIBDV能在QM5細(xì)胞中復(fù)制。因此不能在非B淋巴細(xì)胞增殖顯然是由于不能識(shí)別受體和/或進(jìn)入細(xì)胞所致。對(duì)野生型VP2的突變所致的細(xì)胞嗜性的這種變化有兩種可能解釋?zhuān)?)這些突變導(dǎo)致VP2(構(gòu)象)變化，產(chǎn)生時(shí)在許多細(xì)胞上存在的受體的識(shí)別(普通IBDV受體)，同時(shí)喪失特異性B淋巴細(xì)胞受體識(shí)別(B淋巴細(xì)胞IBDV受體)。與普通IBDV受體和B淋巴細(xì)胞IBDV受體相互作用相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，在此情況中位于VP2的相同區(qū)域(例如高變區(qū))。2)這些突變導(dǎo)致VP2(構(gòu)象)變化，產(chǎn)生普通IBDV受體識(shí)別，但仍保持B淋巴細(xì)胞IBDV受體識(shí)別(通過(guò)VP2，VP3，或其組合)。細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的IBDV仍然能進(jìn)入和在B淋巴細(xì)胞中復(fù)制的現(xiàn)象，可通過(guò)普通IBDV受體也在B淋巴細(xì)胞上存在加以解釋(進(jìn)入模式1和2)。當(dāng)B淋巴細(xì)胞中沒(méi)有普通IBDV受體時(shí)，進(jìn)入模式2甚至預(yù)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的分離株通過(guò)使用真正的B淋巴細(xì)胞受體在B淋巴細(xì)胞中復(fù)制。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種特異性氨基酸突變(天冬氨酸279→天冬酰胺279，丙氨酸284→蘇氨酸284)單獨(dú)或組合第三種突變(谷氨酰胺253→組氨酸253)，可足以改變野生型IBDV毒株的嗜性，將獨(dú)特的B淋巴細(xì)胞嗜性改變?yōu)楦胀ǖ氖刃?例如VERO，QM7，QM5或CEF細(xì)胞)。支持這種論點(diǎn)只公布了一些有限的數(shù)據(jù)(20，22，33)。具有所有這些適應(yīng)性突變的IBDV毒株(在253位的組氨酸，在279位的天冬酰胺，在284位的蘇氨酸)能在B淋巴細(xì)胞上生長(zhǎng)，但仍然不能在非B淋巴細(xì)胞上生長(zhǎng)，也可能是由于在VP2或一種其它病毒蛋白某處另外的特異性氨基酸序列所致。


圖1在具有高水平母體抗體的broiler中于0天的抗體效價(jià)。
圖2aA節(jié)段的核苷酸序列圖2bB節(jié)段的核苷酸序列圖3a多蛋白的氨基酸序列圖3bVP1的氨基酸序列圖3cVP5的氨基酸序列圖4質(zhì)粒5apHB36-vvVP2的構(gòu)建圖5bpHB36-vvVP3的構(gòu)建圖5cpHB36-vvVP4的構(gòu)建圖5dpHB36-s2VP3的構(gòu)建圖5epHB36-s2VP3C的構(gòu)建圖5fpHB36-s2VP3N的構(gòu)建圖5gpHB36-s2VP3C1的構(gòu)建圖6細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的血清型I經(jīng)典毒株CEF94和野生型血清型II毒株TY89的cDNA的VP3編碼部分的氨基酸序列的對(duì)比。給出CEF94蛋白的序列，而針對(duì)TY89只示出了與CEF94序列不同的那些氨基酸。相同的氨基酸用圓點(diǎn)表示。質(zhì)粒pHB36-s2VP3編碼血清型II的全部給定的氨基酸序列(TY89)。用于推導(dǎo)氨基酸序列的A節(jié)段cDNA的核苷酸序列已經(jīng)保藏在GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)中A節(jié)段CEF94(AF194428，全長(zhǎng))，TY89(xxxxx，部分)。示出了相應(yīng)cDNA(見(jiàn)圖7)中SacII和ScaI位點(diǎn)的位置。
圖7含有全長(zhǎng)血清型I(CEF94)IBDV A節(jié)段cDNA(pHB-36W)，和基于血清型I(CEF94)和血清型II(TY89)IBDV毒株的基因組的鑲嵌全長(zhǎng)A節(jié)段cDNA(pHB36-s2VP3N，pHB36-s2VP3C和pHB36-s2VP3)的質(zhì)粒的圖示?？招目虼砘谘逍虸 cDNA的開(kāi)放讀框，而陰影框代表血清型II cDNA。一些遺傳元件如多蛋白的剩余部分，VP5 ORF，T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和終止子序列，及丁型肝炎病毒核酶(HDVR)僅在pHB-36W中示出，但它們也存在于其它質(zhì)粒的相同位置。
圖8IBDV蛋白的SDS-PAGE分析。a)用含有CEF94全長(zhǎng)A節(jié)段序列(泳道1pHB-36W)或鑲嵌全長(zhǎng)A節(jié)段序列(泳道2pHB36-s2VP3，泳道3pHB36-s2VP3N，或泳道4pHB36-s2VP3C)的質(zhì)粒，在體外聯(lián)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的放射自顯影。病毒(前體)蛋白的位置在右側(cè)表示，標(biāo)記蛋白(14C標(biāo)記的Amersham Rainbow標(biāo)記)的位置及其大小(kDa)在左側(cè)表示。b)血清型I(泳道1CEF94)和血清型II(泳道2TY89)的純化的IBDV的Western印跡分析。VP3蛋白(以箭頭表示)是用VP3特異性單克隆抗體觀測(cè)的。標(biāo)記蛋白(預(yù)染色的Amersham Rainbow標(biāo)記)的位置及其大小(kDa)在右側(cè)表示。c)免疫沉淀的35C-甲硫氨酸標(biāo)記的IBDV蛋白的放射自顯影。源自pHB-36W(泳道1)，pHB36-s2VP3(泳道2)，pHB36-s2VP3N(泳道3)，或pHB36-s2VP3C(泳道4)的體外合成的病毒蛋白，用抗血清型I VP3和VP4的多克隆抗體(PaVP3/4)，或用特異于血清型I(Mab IVSI)或血清型II(Mab VIISII)的VP3的單克隆抗體免疫沉淀。
圖9rCEF94和mCEF94-s2VP3C的單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。QM5細(xì)胞用IBDV感染(m.o.i.＝5，T＝0h)1小時(shí)，沖洗4次，并用新鮮培養(yǎng)基覆蓋。樣品取自不同時(shí)間點(diǎn)的上清，并確定IBDV的數(shù)量(TCID50/ml)。誤差桿代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖10在(m)IBDV感染的QM5細(xì)胞中用不同的單克隆抗體檢測(cè)VP3抗原。QM5細(xì)胞的新鮮單層用rCEF94，mCEF94-s2VP3，mCEF94-s2VP3N，或mCEF94-s2VP3C感染，并溫育48小時(shí)。特異于IBDV的VP3的不同單克隆抗體在IPMA中用于確定與不同的鑲嵌病毒的反應(yīng)性。所有使用單克隆抗體進(jìn)行的IPMA的結(jié)果概括示于表11。
圖11含有全長(zhǎng)(雜種)A節(jié)段cDNA序列的質(zhì)粒圖示。只針對(duì)pHB-36W和pHB60繪出了T7啟動(dòng)子序列，丁型肝炎病毒核酶(HDR)，和T7終止子，但其也存在于每個(gè)質(zhì)粒中?？招目虮硎綜EF94cDNA，而黑框表示TY89 cDNA。
圖12在用pHB-36W(1)，pHB36-s2VP3(2)，pHB36-s2VP3N(3)，pHB36-s2VP3C(4)，pHB-60(5)，pHB60-s2VP3N(6)，pHB60-s2VP3C1(7)，pHB60-s2VP3C3(8)轉(zhuǎn)染FP-T7感染的QM-5細(xì)胞后24小時(shí)分離的蛋白質(zhì)樣品的Western印跡分析。將含有等量細(xì)胞提取物的4個(gè)SDS-PAGE凝膠印跡于硝化纖維上，并用4種指示的Mabs檢測(cè)VP3。大小標(biāo)記(Rainbow標(biāo)記，Amersham)以kDa在左側(cè)表示。
圖13對(duì)比經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的血清型I CEF94毒株，極烈性血清型I D6948毒株和野生型血清型II TY89毒株的VP3的氨基酸序列。給出了CEF94蛋白的序列，而D6948和TY89只給出了與CEF94不同的那些氨基酸。示出了在相應(yīng)cDNA(見(jiàn)圖11)中SacII和ScaI內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的位置。
圖14用蘇木精-曙紅(H&E)染色的福爾馬林固定的囊切片。用指示的病毒(右上角所示)感染的21天齡蛋雞型SPF雞在感染后13天進(jìn)行安死術(shù)，檢測(cè)囊。根據(jù)Bayyari等(1996)所述確定濾泡結(jié)構(gòu)的總損害，并示于表13。
圖15競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的所得數(shù)據(jù)。包被CEF94 VP3抗原，將用指示的病毒感染的雞的稀釋血清樣品(取自感染后13天)與MabIVSI或I/G4SI混合。結(jié)合的Mab的數(shù)量用綴合過(guò)氧化物酶的兔抗小鼠抗體和作為底物的TMB進(jìn)行確定。
圖16野生型vvIBDV分離株D6948和細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的經(jīng)典分離株CEF94的cDNA的不同ORF之間的氨基酸對(duì)比。給出了D6948蛋白完整的序列，而對(duì)CEF94(在D6948序列之下)只給出了與D6948不同的那些氨基酸。用于推導(dǎo)氨基酸序列的A和B節(jié)段的核苷酸序列，可見(jiàn)于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登記號(hào)在括號(hào)內(nèi)表示A節(jié)段D6948(AF240686)和CEF94(AF194428)及B節(jié)段D6948(AF240687)，和CEF94(AF194429))。A)由A節(jié)段的第一個(gè)ORF(VP5)編碼的氨基酸序列，B)由A節(jié)段的第二個(gè)ORF(多蛋白)編碼的氨基酸序列。多蛋白的VP4(下劃線(xiàn))之前為pVP2，而VP3位于C末端(見(jiàn)圖17)。使用在pVP2與VP4之間及VP4之間并由(18)所提示的推定的裂解位點(diǎn)。只是在最近才示出真正的裂解位點(diǎn)更可能位于氨基酸512-513(pVP2-VP4)和755-756(VP4/VP3)之間(27)。C)由B節(jié)段編碼的單一ORF編碼的氨基酸序列(VP1/VPg)。相應(yīng)氨基酸缺失時(shí)用破折號(hào)表示。在所有vvIBDV序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸變化用黑體表示。據(jù)報(bào)道參與對(duì)非B淋巴細(xì)胞的適應(yīng)的氨基酸殘基以斜體表示。
圖17含有野生型極烈性IBDV分離株D6948的A節(jié)段(pHB-60)和B節(jié)段(pHB-55)的全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒的圖示。cDNA序列之前為T(mén)7啟動(dòng)子序列，后接丁型肝炎病毒核酶(HDR)，和T7終止子。不同的ORF以空心框表示。
圖18體外聯(lián)合轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的SDS-PAGE分析的放射自顯影。A)減毒的經(jīng)典IBDV分離株CEF94(泳道1)和野生型極烈性IBDV分離株D6948(泳道2)的全長(zhǎng)A節(jié)段質(zhì)粒。B)CEF94(泳道1)和D6948(泳道2)的全長(zhǎng)B節(jié)段質(zhì)粒。C)全長(zhǎng)A節(jié)段的CEF94(泳道1)和經(jīng)典減毒IBDV分離株(pHB-36)的全長(zhǎng)A節(jié)段質(zhì)粒，其中pVP2(pHB36-vvVP2，泳道2)，VP3(pHB36-vvVP3，泳道3)，或VP4(Phb36-vvVP4，泳道4)已經(jīng)交換。病毒蛋白的位置在右側(cè)表示。標(biāo)記蛋白(Rainbow標(biāo)記，Amersham)的大小在左側(cè)表示。
圖19用VP3/4多克隆抗血清檢測(cè)IBDV。將不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染物的上清樣品用于感染QM5或原始囊細(xì)胞。在感染后，將QM5細(xì)胞溫育24小時(shí)，而原始囊細(xì)胞溫育48小時(shí)。通過(guò)進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶單層分析觀測(cè)IBDV蛋白。
圖20CEF94，rCEF94和srIBDV-CADB的單步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。將QM5細(xì)胞用IBDV感染(m.o.i.＝5，T＝0h)1小時(shí)，沖洗4次，并用新鮮培養(yǎng)基覆蓋。在不同時(shí)間點(diǎn)取上清，并確定IBDV數(shù)量(TCID50/ml)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TCID50值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；誤差桿代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖21具有源自D6948 cDNA的中間部分(陰影框)，和源自CEF94 cDNA的兩側(cè)部分(空心框)的嵌合PCR片段的構(gòu)建圖示。為構(gòu)建pHB-36-vvVP2，我們首先產(chǎn)生了PCR片段VP2a，VP2b，和VP2c。將這些PCR片段純化，接著在融合PCR中用作模板，產(chǎn)生PCR片段VP2d(17)。接著將此PCR片段純化，并通過(guò)使用指定的EcoRI和SacII限制位點(diǎn)，用于置換CEF94 A節(jié)段cDNA的相應(yīng)部分。用相同方法使用不同引物產(chǎn)生pHB36-vvVP3和pHB36-vvVP4，以產(chǎn)生PCR片段和不同限制位點(diǎn)以將PCR片段導(dǎo)入全長(zhǎng)A節(jié)段克隆中(見(jiàn)材料與方法章節(jié)和表16)。
圖22用VP3/4多克隆抗血清檢測(cè)鑲嵌IBDV。將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染物上清的樣品用于感染QM5和原始囊細(xì)胞。在感染后，將QM5細(xì)胞溫育24小時(shí)，原始囊細(xì)胞溫育48小時(shí)(見(jiàn)圖19)。與陰性對(duì)照(模擬感染的)相反，陰性對(duì)照中沒(méi)有B淋巴細(xì)胞陽(yáng)性染色(數(shù)據(jù)未示出)，我們發(fā)現(xiàn)在在下面一組示出IPMA中一些染色的B淋巴細(xì)胞分散于組織培養(yǎng)皿中。
表1用于在由母體IBDV抗體被動(dòng)保護(hù)的幼雞中誘導(dǎo)活性保護(hù)的活I(lǐng)BDV疫苗的分類(lèi)

*動(dòng)物健康服務(wù)機(jī)構(gòu)(Deventer，荷蘭)使用Idexx Elisa值128(2log7)作為使用活中度疫苗的最大效價(jià)，512(2log9)為強(qiáng)疫苗的最大效價(jià)。表2在RT-PCR或PCR反應(yīng)中用于確定序列的引物(寡核苷酸)。不能與野生型IBDV基因組雜交的核苷酸以小寫(xiě)字母表示。示出了特異于血清型II(s2)或極烈性(vv)基因組的引物。

表3相應(yīng)于IBDV(CEF94)兩個(gè)基因組節(jié)段的編碼鏈的5′和3′末端的核苷酸序列。具體序列之后的數(shù)字表示獲得每個(gè)序列的次數(shù)A節(jié)段編碼鏈的5′末端A節(jié)段非編碼鏈的5′末端的 B節(jié)段編碼鏈的5′末端 B節(jié)段非編碼鏈的5′末端的互補(bǔ)互補(bǔ)序列序列5′UGAUACGAUC>>>>>>CGGG 3′5′UGAUACGAUG>>>(2x) >>>GGGGGCCA 3′5′AGAUACGAUC>>>>>>CGGGUCCC 3′5′GGAUACGAUG>>>(5x) >>>GGGGGCCU 3′5′GGAUACGAUC>>>(7x)>>>CGGGUCCCU 3′>>>GGGGGCCC 3′(2x)>>>CGGGUCCCC 3′(6x)>>>GGGGGCCCC 3′(2x)>>>CGGGUCCCCCC 3′ >>>GGUGGCCCCC 3′>>>CGGGUCCCCCCU 3′ >>>GGGGGCCCCCC 3′>>>CGGGUCCCCCCC 3′ >>>GGGGGCCCCCG 3′共有5′GGAUACGAUC>>>>>>CGGGUCCCC 3′(nt3260) 5′GGAUACGAUG>>> >>>GGGGGCCCCC 3′(nt2827)表4 所用質(zhì)粒的描述名稱(chēng) 所基于的質(zhì)粒 描述pUC18-RibopUC18 含有pTV-2A的SmaI-XbaI片段pHB-36A pUC18-Ribo含有CEF94的A節(jié)段的共有cDNA序列(見(jiàn)圖2a)pHB-36W pHB-36A 在CEF94 A節(jié)段編碼cDNA的3′-UTR中有一人工導(dǎo)入的KpnI位點(diǎn)(遺傳標(biāo)記)(圖2)pHB-36pHB-36A 含有在多蛋白的VP4部分的一致死氨基酸取代(V582A)pHB-60pUC18-Ribo含有D6948 A節(jié)段的共有cDNA序列(見(jiàn)圖2a)pHB-34Z pUC18-Ribo含有CEF94 B節(jié)段的共有cDNA序列(見(jiàn)圖2b)pHB-55pUC18-Ribo含有D6948 B節(jié)段的共有cDNA序列(見(jiàn)圖2b)pSV-TY89-VP3 pGEM-Teasy含有編碼完整VP3的TY89的共有cDNA(A節(jié)段，見(jiàn)圖2)pHB36-vvVP2 pHB-36W 含有編碼完整VP2(453個(gè)氨基酸)的D6948 A節(jié)段的cDNApHB36-vvVP3 pHB-36W 含有編碼完整VP3(289個(gè)氨基酸)的D6948 A節(jié)段的cDNApHB36-vvVP4 pHB-36W 含有編碼完整VP4(270個(gè)氨基酸)的D6948 A節(jié)段的cDNApHB36-s2VP3 pHB-36W 含有編碼完整VP3(289個(gè)氨基酸)的TY89 A節(jié)段cDNApHB36-s2VP3C pHB-36W 含有編碼VP3的C-末端部分(122個(gè)氨基酸)的TY89 A節(jié)段cDNApHB36-s2VP3N pHB-36W 含有編碼VP3的N-末端部分(168個(gè)氨基酸)的TY89 A節(jié)段cDNApHB60-s2VP3C1 pHB-60含有編碼嵌合多蛋白(D6948(1-543AA)、CEF94(544-889AA)和TY89(890-1012AA))的cDNA。5′-UTR衍生自D6948，而3′-UTR衍生自CEF94。在3′-UTR中還存在一單一KpnI位點(diǎn)(遺傳標(biāo)記)表5 所產(chǎn)生的rIBDV3 srIBDV和mIBDV的描述。用抗VP3的多克隆抗血清或抗IBDV血清型I的VP2(1.4)、血清型II的VP3(T-75)或血清型I的VP3(B10和C3)的單克隆抗體，在免疫過(guò)氧化物酶單層分析(IPMA)中檢測(cè)這些病毒感染QM5或原始囊細(xì)胞的能力；nd是指未確定IBDV病毒 所衍生的質(zhì)粒 在如下細(xì)胞上的復(fù)制 單克隆抗體A節(jié)段 B節(jié)段QM5細(xì)胞 囊 1.4 T75 B10 C3rCEF94pHB-36W pHB-34Z + + + -++rD6948pHB-60 pHB-55 - + + -++srIBDV-DACB pHB-60 pHB-34Z - + ndnd nd ndsrIBDV-CADB pHB-36W pHB-55 +nd ndnd nd ndmCEF94-vvVP2 pHB36-vvVP2 pHB-34Z - + ndnd nd ndmCEF94-vvVP3 pHB36-vvVP3 pHB-34Z +nd ndnd nd ndmCEF94-vvVP4 pHB36-vvVP4 pHB-34Z +nd ndnd nd ndmCEF94-s2VP3 pHB36-s2VP3 pHB-34Z +nd + +- +/-mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3CpHB-34Z +nd + +- +/-mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3NpHB-34Z +nd ++/- +-mD6948-s2VP3C1pHB60-s2VP3C1 pHB-55 - + + +- +/-表6 用野生型、rIBDV、srIBDV或mIBDV分離株感染的21日齡小雞的臨床數(shù)據(jù)(12組，每組10只小雞)。除陰性對(duì)照組(PBS)之外，每一小雞用1000 ELD50IBDV接種，每一組在單獨(dú)的分離器中保持。在感染后第9天測(cè)定安樂(lè)死小雞的腔上囊重和體重。括號(hào)中給出標(biāo)準(zhǔn)差以及用于測(cè)定所得數(shù)值的動(dòng)物數(shù)(n)。計(jì)算每一動(dòng)物的腔上囊重/體重比，并給出每組平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)。IBDV病毒 死亡數(shù)(9天后) 體重(克) 腔上囊重(克) 腔上囊重/體重(×1000)PBS 0 305(29，n＝10) 1.9(0.4，n＝10) 6.1(1.2)CEF940 341(16，n＝6)2.0(0.6，n＝6) 6.0(1.8)D69483 245(56，n＝7)0.4(0.1，n＝7) 1.7(0.6)rCEF94 0 317(15，n＝6)1.3(0.5，n＝6) 4.2(1.3)rD6948 5 261(24，n＝5)0.4(0.1，n＝5) 1.7(0.2)srIBDV-DACB 2 263(35，n＝8)0.4(0.1，n＝8) 1.5(0.3)srIBDV-CADB 0 314(13，n＝6)1.8(0.8，n＝6) 5.7(2.7)mCEF94-vvVP2 0 309(27，n＝6)0.6(0.2，n＝6) 1.9(0.4)mCEF94-vvVP3 0 325(33，n＝6)2.0(0.3，n＝6) 6.2(0.7)mCEF94-vvVP4 0 330(23，n＝6)1.5(0.5，n＝6) 4.4(1.3)mCEF94-s2VP3C0 320(11，n＝6)1.3(0.4，n＝6) 4.1(1.3)mD6948-s2VP3C1 0 315(26，n＝6)0.6(0.2，n＝6) 1.9(0.6)表7 IBDV分離株的來(lái)源和表型分離株 參考文獻(xiàn) 毒力D6948 Boot等，未發(fā)表 極烈性rD6948 Boot等，未發(fā)表 極烈性UK661 Brown和Skinner，1996 極烈性5123 Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性96-B4 Ter Huurne等，未發(fā)表 無(wú)毒96-C4 Ter Huurne等，未發(fā)表 無(wú)毒96-C5 Ter Huurne等，未發(fā)表 無(wú)毒96-C6 Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性97-B3 Ter Huurne等，未發(fā)表 無(wú)毒97-B4 Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性97-B5 Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性97-B6 Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性Zoontjes Ter Huurne等，未發(fā)表 極烈性HungaryTer Huurne等，未發(fā)表 極烈性O(shè)KYM Yamaguchi等，1996極烈性O(shè)KYMT Yamaguchi等，1996無(wú)毒TKSM Yamaguchi等，1996極烈性TKSMT Yamaguchi等，1996無(wú)毒HK46 Lim等，1999 極烈性HK46-NTLim等，1999 未確定表8 不同IBDV分離株VP2的高變區(qū)的氨基酸序列。極烈性分離株D6948的親水區(qū)(下劃線(xiàn))和疏水區(qū)的序列(氨基酸214-328)用作親本分離株以與其它序列進(jìn)行對(duì)比。相同氨基酸用-號(hào)表示。D6948 214AADDYQFSSOYQAGGVTITLFSANIDAITSLSIGGELVFQTSVQGLILGATIYLIGFDGTAVITRAVAADNGLTAGTDNLMPFNIVIPTSEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDOMSWS328rD6948 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------UK661-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5123 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------96-B4------------P-------------------V-------------V------------T-------N-----T-----L---------N-----------------------------96-C4------------L--------------------------N------A-N----------T------S------T-I-------------N-----------------------------96-C5------------P-------------------V-------------V--------------------Y-----T-----L---------N-----------------------------96-C6-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B3-------------------------------------------------------------------N---------------------------------------------------97-B4-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B5-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------97-B6-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Zoontjes -------------------------------------------------------------------------------------------T---------V-----------------Hungary -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------OKYM -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------OKYMT----------------------T----------------------------------------------N----T------------------------------F-------------TKSM -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TKSMT----------------H--------D-------------------------------------------N----T--------------------------------------------HK46 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------HK46-NT ---------------------------------------------------------------------N----T--------------------------------------------表9病毒A節(jié)段質(zhì)粒 B節(jié)段質(zhì)粒 特征rCEF94 pHB-36WpHB-52 拯救的CEF94mCEF94-s2VP3pHB36-s2VP3pHB-52 拯救的鑲嵌IBDV，其編碼由源自CEF94的氨基酸1-723和源自TY89的氨基酸724-1012組成的多蛋白；已交換了760個(gè)核苷酸，其中102個(gè)是不同的(13％)mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3N pHB-52 拯救的鑲嵌IBDV，其編碼由源自CEF94的氨基酸1-723和857-1012和源自TY89的氨基酸724-856組成的多蛋白；已交換了398個(gè)核苷酸，其中65個(gè)是不同的(16％)mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3C pHB-52 拯救的鑲嵌IBDV，其編碼由源自CEF94的氨基酸1-856和源自TY89的氨基酸857-1012組成的多蛋白；已交換了371個(gè)核苷酸，其中37個(gè)是不同的(16％)表10病毒 轉(zhuǎn)染后TCID50最大*TCID50實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2 實(shí)驗(yàn)3 平均rCEF94 4.95.64.75.17.0mCEF94-s2VP3 2.00.31.01.16.0mCEF94-s2VP3N3.03.52.93.16.1mCEF94-s2VP3C5.05.04.34.86.9*在最初拯救的病毒傳代3次后測(cè)定表11單克隆抗體所抗的抗原 IBDV蛋白在免疫過(guò)氧化物酶單層分析中的反應(yīng)CEF94 TY89 rCEF94mCEF94-s2VP3 mCEF94-s2VP3N mCEF94-s2VP3C1.4 VP2，血清型I + - ++ + +9.8 VP2，血清型I + - ++ + +9.7 VP3，血清型I + + ++ + +IV VP3，血清型I + - +- + -I/G4 VP3，血清型I + - +- + -VII VP3，血清型II- + -+ - +17/80VP3，血清型I + + ++ + +表12 所用病毒的描述名稱(chēng)所基于的質(zhì)粒2主要特征CEF94 n.r. 血清型I，細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的經(jīng)典IBDV毒株D6948 n.r. 血清型I，極烈性IBDV野毒株TY89n.r. 原型血清型II IBDV野毒株rCEF94 pHB-36W+pHB-34Z 拯救的CEF94細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的經(jīng)典IBDVrD6948 pHB-60+pHB-55 拯救的D6948極烈性IBDVmCEF94-s2VP3pHB36-s2VP3+pHB-34Z 具有雜合多蛋白的拯救鑲嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-723及TY89的氨基酸723-1012mCEF94-s2VP3N pHB36-s2VP3N+pHB-34Z 具有雜合多蛋白的拯救鑲嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-723和857-1012及TY89的氨基酸723-856mCEF94-s2VP3C pHB36-s2VP3C+pHB-34Z 具有雜合多蛋白的拯救鑲嵌IBDV；CEF94的氨基酸1-856及TY89的氨基酸857-1012mD6948-s2VP3N1pHB60-s2VPN+pHB-55編碼雜合多蛋白的鑲嵌IBDV cDNA；D6948的氨基酸1-723和857-1012及TY89的氨基酸723-856mD6948-S2VP3C1 pHB60-s2VP3C1+pHB-55 具有雜合多蛋白的拯救鑲嵌IBDV；D6948的氨基酸1-543，CEF94的氨基酸544-856及TY89的氨基酸857-1012mD6948-s2VP3C3 pHB60-s2VP3C3+pHB-55 具有雜合多蛋白的拯救鑲嵌IBDV；D6948的氨基酸1-856及TY89的氨基酸857-10121這一病毒不能被拯救2n.r.不相關(guān)表13 小雞感染實(shí)驗(yàn)1和2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)病毒 CODE死亡率 Idexx抗體效價(jià)2VN效價(jià)3腔上囊重量(g)4腔上囊重/體重5HBLS6實(shí)驗(yàn)1 99.161PBSGr.10/100(0，10，0) 0.0(0.0) 1.9(0.4，10)6.1(1.2) 1.0(0.0，9)CEF94 Gr.20/10207(507，6，1) 6.5(1.2) 2.0(0.6，6) 6.0(1.8) 1.6(1.1，10)rCEF94 Gr.40/10260(290，6，3) 9.7(1.8) 1.3(0.5，6) 4.2(1.3) 1.9(0.7，10)mCEF94-s2VP3C Gr.11 0/10824(433，6，6) 10.8(1.5) 1.3(0.4，6) 4.1(1.3) 1.1(0.3，10)D6948 Gr.33/101626(690，7，7) 10.3(1.4) 0.4(0.1，7) 1.7(0.6) 5.0(0.0，7)rD6948 Gr.55/101549(791，4，4) 10.3(1.5) 0.4(0.1，5) 1.7(0.2) 5.0(0.0，4)mD6948-s2VP3C1 Gr.12 0/10956(326，6，6) 10.8(1.2) 0.6(0.2，6) 1.9(0.6) 5.0(0.0，8)實(shí)驗(yàn)2 99.18PBSGr.10/150(0，15，0) 0.0(0.0) 2.3(0.7，15)6.1(1.8) 1.4(1.3，10)D6948 Gr.28/152489(948，7，7) 11.7(1.6) 0.3(0.2，7) 0.8(0.7) 5.0(0.0，8)rD6948 Gr.3+6 7/302308(905，23，23) 10.0(1.5) 0.3(0.1，23)1.0(0.4) 5.0(0.0，20)mD6948-s2VP3C1 Gr.41/152122(1300，14，14) 9.0(1.8) 0.9(0.2，14)2.7(0.7) 4.7(0.7，10)mD6948-s2VP3C3 Gr.50/151760(880，15，15) 8.8(1.6) 0.5(0.1，15)1.6(0.4) 5.0(0.0，10)1感染后前5天累積的死亡數(shù)/受攻擊的小雞總數(shù)2平均值(標(biāo)準(zhǔn)差，所用小雞樣品數(shù)，陽(yáng)性樣品數(shù))3中和抗體的存在用CEF94IBDV毒株確定；效價(jià)以2Log值(標(biāo)準(zhǔn)差)給出4給出每組小雞的平均腔上囊重量(×1000)(標(biāo)準(zhǔn)差，動(dòng)物數(shù))5計(jì)算每一動(dòng)物的腔上囊重量/體重比，并給出每組平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)6給出感染后存活的小雞的根據(jù)Bayvari等(1996)的平均組織病理囊損害評(píng)分(HBLS)(標(biāo)準(zhǔn)差，記錄的腔上囊數(shù))表14 用mD6948-s2VP3C3感染前和感染后的IBDV特異抗體效價(jià)(Idexx)p.h.天數(shù)1組12組2 組3 組4 組57 1997(300，17，17)2991(543，17，17) 3332(691，18，18)3657(676，17，17)3970(446，14，14)15 18(75，17，1)361(101，17，16) 576(65，18，18) 899(150，17，17) 1283(154，14，14)18 感染 感染 感染 感染 感染22 0(0，17，0) 0(0，17，0) 0(0，17，0) 0(0，17，0) 95(261，14，2)25 391(600，12，4) 822(1261，12，5) 477(1166，13，2) 479(750，12，4) 516(1084，9，3)32 1587(852，12，11)1468(746，12，12) 367(882，12，2) 0(0，11，0) 0(0，9，0)42 3241(905，11，11)2877(1177，10，10)149(227，11，4) 132(234，11，2) 2809(633，9，9)1p.h.＝孵化后2給出的抗體效價(jià)是陽(yáng)性動(dòng)物平均值，帶標(biāo)準(zhǔn)差(括號(hào)中的第一個(gè)值)，所用動(dòng)物樣品數(shù)(括號(hào)中第二個(gè)值)，陽(yáng)性樣品數(shù)(括號(hào)中的第三個(gè)值)，數(shù)值的測(cè)定是在給定孵化后天數(shù)對(duì)每組中每一小雞重復(fù)測(cè)定的。表15 用mD6948-s2VP3C3感染前和感染后測(cè)定的IBDV中和抗體效價(jià)p.h.天數(shù)1組12組2 組3 組4 組5157.2(0.8，17) 8.8(1.0，17) 9.3(1.4，15)9.3(1.4，15)9.9(1.2，14)18感染 感染 感染感染感染255.8(1.9，12) 4.8(1.6，12) 6.4(1.5，8) 7.6(1.6，7) 7.3(0.9，9)3210.9(1.1，12)10.8(1.4，12)5.3(1.2，12)5.4(0.7，11)5.6(0.7，9)429.8(1.6，11) 10.0(1.3，10)3.6(0.9，11)3.7(0.7，11)9.3(1.3，9)1p.h.＝孵化后2給出的值是屬于相同組的動(dòng)物的個(gè)體2Log病毒中和抗體效價(jià)平均值，括號(hào)中數(shù)值分別是標(biāo)準(zhǔn)差和所用血清數(shù)表16 質(zhì)粒和病毒的描述名稱(chēng) 所基于的質(zhì)粒*主要特征質(zhì)粒pUC18-Ribo pUC18含有丁型肝炎病毒核酶pHB-22RpGEM-T D6948 A節(jié)段cDNA(共有序列)pHB-60 pUC18-Ribo D6948 A節(jié)段cDNA，包括一遺傳標(biāo)記pHB-36WpUC18-Ribo CEF94 A節(jié)段cDNA，包括一遺傳標(biāo)記pHB-34ZpUC18-Ribo CEF94 B節(jié)段cDNA(共有序列)pHB-55 pUC18-Ribo D6948 B節(jié)段cDNA(共有序列)pHB36-vvVP2pHB-36W CEF94 cDNA的pVP2被D6948的pVP2替換(453個(gè)氨基酸)pHB36-vvVP3pHB-36W CEF94 cDNA的VP3被D6948的VP3替換(289個(gè)氨基酸)pHB36-vvVP4pHB-36W CEF94 cDNA的VP4被D6948的VP4替換(270個(gè)氨基酸)病毒CEF94 n.r. 細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的經(jīng)典IBDV分離株(PV1衍生物)D6948 n.r. 極烈性IBDV野毒株(荷蘭，1989)rCEF94 pHB-36W+pHB-34Z 拯救的IBDV細(xì)胞培養(yǎng)物適應(yīng)的經(jīng)典IBDVrD6948 pHB-60+pHB-55拯救的IBDV極烈性IBDVsrIBDV-CADBpHB-36W+pHB-55 拯救的節(jié)段重配IBDV(A節(jié)段＝CEF94，B節(jié)段＝D6948)srIBDV-DACBpHB-60+pHB-34Z 拯救的節(jié)段重配IBDV(A節(jié)段＝D6948，B節(jié)段＝CEF94)mCEF94-vvVP2 pHB36-vvVP2+pHB-34Z 拯救的鑲嵌IBDV，pVP2源自D6948，其余部分來(lái)自CEF94mCEF94-vvVP3 pHB36-vvVP3+pHB-34Z 拯救的鑲嵌IBDV，VP3源自D6948，其余部分來(lái)自CEF94mCEF94-vvVP4 pHB36-vvVP4+pHB-34Z 拯救的鑲嵌IBDV，VP4源自D6948，其余部分來(lái)自CEF94*n.r.不相關(guān)表17 用1000 ELD50的野生型、rIBDV、srIBDV或mIBDV分離株攻擊的21日齡小雞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)病毒*死亡率1腔上囊重量(g)2腔上囊重量/體重3HBLS4IBDV抗原5抗體效價(jià)6(Idexx)(×1000)PBS 0/10 1.9(0.4，10)6.1(1.2) 1.0(0.0，9) - 0(0，10，0)CEF94 0/10 2.0(0.6，6) 6.0(1.8) 1.6(1.1，10)+ 207(507，6，1)D6948 3/10 0.4(0.1，7) 1.7(0.6) 5.0(0.0，7) nd1626(690，7，7)rCEF940/10 1.3(0.5，6) 4.2(1.3) 1.9(0.7，10)+ 260(290，6，3)rD69485/10 0.4(0.1，5) 1.7(0.2) 5.0(0.0，4) + 1549(791，4，4)srIBDV-DACB 2/10 0.4(0.1，8) 1.5(0.3) 5.0(0.0，6) + 833(415，8，8)srIBDV-CADB 0/10 1.5(0.4，5) 4.7(1.0) 1.9(1.3，10)+ 400(619，6，2)mCEF94-vvVP2 0/10 0.6(0.2，6) 1.9(0.4) 5.0(0.0，10)+ 953(186，6，6)mCEF94-vvVP3 0/10 2.0(0.3，6) 6.2(0.7) 1.4(0.5，10)nd454(399，6，4)mCEF94-vvVP4 0/10 1.5(0.5，6) 4.4(1.3) 1.5(0.5，10)+ 431(356，6，4)1在感染后前9天死亡的累積數(shù)/受攻擊的小雞的總數(shù)2給出了小雞的平均腔上囊重量(感染后9天)(標(biāo)準(zhǔn)差，動(dòng)物數(shù))3計(jì)算每一動(dòng)物的腔上囊重量/體重比，并給出每組平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)4給出攻擊后存活的小雞的平均組織病理學(xué)囊損害評(píng)分(HBLS)(標(biāo)準(zhǔn)差，記分的腔上囊囊數(shù))5測(cè)定囊分隔(coupes)中VP4/VP3抗原的存在(nd＝未測(cè)定)6在感染后9天安樂(lè)死的小雞的IBDV抗體效價(jià)(Idexx)(標(biāo)準(zhǔn)差，所用小雞數(shù)，陽(yáng)性小雞數(shù))*黑體字示出的病毒不能在QM5細(xì)胞上生長(zhǎng)這一組的一個(gè)小雞的值被剔除，因?yàn)檫@只小雞具有非同尋常的大腔上囊(3.4g)
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權(quán)利要求
1.一種基本上不能在非囊細(xì)胞或其衍生的細(xì)胞中生長(zhǎng)的重組傳染性腔上囊病病毒(rIBDV)。
2.一種保留極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分極烈性性質(zhì)的傳染性rIBDV。
3.權(quán)利要求1的一種rIBDV，其保留極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分極烈性性質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的rIBDV，其基本上不能在CEF細(xì)胞，VERO細(xì)胞或QM5細(xì)胞中生長(zhǎng)。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位不是天冬酰胺。
6.權(quán)利要求5的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第279位是天冬氨酸。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位不是蘇氨酸。
8.權(quán)利要求7的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列在第284位是丙氨酸。
9.權(quán)利要求8的rIBDV，其中VP2蛋白的氨基酸序列至少包含vvIBDV分離株的279-289、優(yōu)選229-314，最優(yōu)選214-328位氨基酸的一段氨基酸序列，如表8所示。
10.一種獲得在非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞上基本不能生長(zhǎng)的感染性重組傳染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，包括用包含至少部分衍生自IBDV的IBDV基因組的核酸轉(zhuǎn)染至少一個(gè)第一種細(xì)胞，在培養(yǎng)基中溫育所述第一種細(xì)胞，從所述轉(zhuǎn)染的第一種細(xì)胞或所述培養(yǎng)基中回收rIBDV，并在至少一個(gè)第二種細(xì)胞中增殖所述回收的rIBDV，該第二種細(xì)胞是所述rIBDV的允許細(xì)胞。
11.一種獲得感染性重組傳染性腔上囊病病毒(rIBDV)的方法，所述病毒保留極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分極烈性性質(zhì)，所述方法包括用包含至少部分衍生自vvIBDV的IBDV基因組的核酸轉(zhuǎn)染至少一個(gè)第一種細(xì)胞，在培養(yǎng)基中溫育所述第一種細(xì)胞，從所述轉(zhuǎn)染的第一種細(xì)胞或所述培養(yǎng)基中回收rIBDV，并在至少一個(gè)第二種細(xì)胞中增殖所述回收的rIBDV，該第二種細(xì)胞是所述rIBDV的允許細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述第一種細(xì)胞是非囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)方法，其中所述第二種細(xì)胞是囊細(xì)胞衍生的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中所述的第一種細(xì)胞如CEF細(xì)胞，VERO細(xì)胞或QM5細(xì)胞是vvIBDV的非允許細(xì)胞。
15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中一種肝炎病毒或其衍生的病毒蛋白被另外提供給所述第一種細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的病毒蛋白包括T7聚合酶。
17.權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)的方法，其中所述的rIBDV至少保留在vvIBDV非允許細(xì)胞如VERO，QM5或CEF細(xì)胞上基本不能增殖的能力。
18.權(quán)利要求10-17任一項(xiàng)的方法，其中所述第二種允許細(xì)胞是原始囊細(xì)胞。
19.權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的方法，其中所述rIBDV包括至少一種衍生自vvIBDV基因組節(jié)段A的至少一部分的核酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述核酸編碼至少VP2蛋白的功能部分。
21.權(quán)利要求10-20任一項(xiàng)的方法，其中所述rIBDV包括至少一種衍生自血清型IIIBDV的核酸。
22.權(quán)利要求10-21任一項(xiàng)的方法，其中所述rIBDV缺失至少一個(gè)特異于血清型IIBDV的優(yōu)勢(shì)免疫表位。
23.一種包括rIBDV的感染性鑲嵌IBDV(mIBDV)，其中至少一個(gè)基因組節(jié)段包含衍生自至少兩個(gè)不同雙RNA病毒分離株的核酸。
24.權(quán)利要求23的mIBDV，其中至少一個(gè)所述分離株是vvIBDV。
25.權(quán)利要求23或24的mIBDV，特征在于其基本不能在vvIBDV非允許細(xì)胞如VERO，QM5或CEF細(xì)胞上增殖。
26.權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)的mIBDV，特征在于其基本能在vvIBDV允許細(xì)胞如原始囊細(xì)胞上增殖。
27.權(quán)利要求23-26任一項(xiàng)的mIBDV，其中至少一個(gè)所述分離株是血清型IIIBDV。
28.權(quán)利要求23-27任一項(xiàng)的mIBDV，其缺失至少一個(gè)特異于血清型IIBDV的優(yōu)勢(shì)免疫表位。
29.包含權(quán)利要求1-9或23-28任一項(xiàng)的rIBDV的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組傳染性腔上囊病病毒(IBDV)及其衍生的疫苗。本發(fā)明提供了基本上不能在非衍生自囊細(xì)胞的細(xì)胞中生長(zhǎng)的感染性重組傳染性腔上囊病病毒(rIBDV),或保留了極烈性傳染性腔上囊病病毒(vvIBDV)的至少一部分極烈性特征的感染性rIBDV。
文檔編號(hào)C12N7/04GK1373807SQ00812836
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月14日
發(fā)明者亨德里克·約翰尼斯·布特, 安娜·阿格奈斯·亨德里卡·瑪麗亞·特爾胡爾內(nèi), 伯納德斯·彼得魯斯·胡貝圖斯·佩特斯 申請(qǐng)人:Id-萊利斯塔德動(dòng)物育種及動(dòng)物保健研究所公司