專利名稱：提高微生物發(fā)酵方法中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法
在細(xì)菌中工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)是在發(fā)酵罐中進(jìn)行的。同用搖瓶的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)相比，產(chǎn)量的提高可以通過增加單位體積中細(xì)胞量的方法來實(shí)現(xiàn)。補(bǔ)料分批技術(shù)可以達(dá)到很高的細(xì)胞密度。這是基于生長(zhǎng)限制性的加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般是限制碳源/能源。(例如Riesenberg D.and Guthke，R.，1999，App.Microbiol.Biotechnol.51，422-430)。對(duì)于利用大腸桿菌的方法來說，通常是限制葡萄糖或甘油?；蛘?，依所用的微生物和方法的不同，也可以限制其他底物，例如糖蜜，淀粉，蛋白胨，乳糖，甲醇和乙酸。高濃度的培養(yǎng)溶液可以連續(xù)加入，并有可能利用多種函數(shù)去詳細(xì)描述一段時(shí)間內(nèi)底物的加入情況，或是線性增加和減少。多種函數(shù)經(jīng)常在同一種方法中互相結(jié)合使用?？梢赃x擇性的以脈沖方式或隔一定時(shí)間間隔加入營(yíng)養(yǎng)性溶液，而養(yǎng)分的消耗或者養(yǎng)分量的降低低于作為下一次加樣標(biāo)志的某一給定濃度。(例如，Terasawa等，1990，EP0397097A1)。底物溶液的加入也可以通過其它參數(shù)來調(diào)節(jié)。溶解氧(DO-stat)，pH值(pH-stat)或者在線測(cè)得的排出廢氣中二氧化碳和氧氣的濃度(例如Kerns等，Acta Biotechnol。8，285-289)都可以作為控制數(shù)據(jù)，以指導(dǎo)周期性地加入營(yíng)養(yǎng)性溶液。這樣作，底物濃度就在限制性和非限制的濃度之間變化。Chen等(1997，Biotechnol。 Bioeng。56，23-31)測(cè)量到，當(dāng)高濃度的培養(yǎng)基周期性的加入補(bǔ)料分批培養(yǎng)物時(shí)，質(zhì)粒的穩(wěn)定性增加了。但在這些方法中，一個(gè)周期可以持續(xù)幾分鐘或者幾小時(shí)，這些不利于產(chǎn)物的形成。
基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)載體是質(zhì)粒，它們除了有復(fù)制起點(diǎn)之外，通常還含有編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列(產(chǎn)物基因)，以及用來保證質(zhì)粒在培養(yǎng)繁殖時(shí)保持穩(wěn)定性的選擇性標(biāo)志。產(chǎn)物基因的表達(dá)通常由調(diào)節(jié)序列控制，特別是由可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子控制。產(chǎn)物基因的表達(dá)由諸如化學(xué)誘導(dǎo)物(底物，底物類似物)，培養(yǎng)溫度或其它培養(yǎng)條件(pH值，鹽濃度，底物濃度)的改變等因素所激活。值得一提的是，也可以通過改變限制性底物，或者用乳糖誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子以及將葡萄糖培養(yǎng)改為用乳糖培養(yǎng)等方式來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)(Neubauer等，1992，Appl.Microbiol.Biotechnol.36，739-744)。那些能使宿主細(xì)胞對(duì)某種抗生素產(chǎn)生抗性的基因可作為選擇性標(biāo)記，以使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中維持穩(wěn)定。然后在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物中加入相應(yīng)的抗生素來殺死或抑制那些無質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，因?yàn)檫@些無質(zhì)粒細(xì)胞沒有攜帶抗性基因。通常使用的抗性基因/抗生素組合有β-內(nèi)酰胺酶/氨芐青霉素，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶/氯霉素，四環(huán)素抗性(tet)操縱子/四環(huán)素，以及卡那霉素抗性基因/卡那霉素。
某些這類抗性體系有個(gè)缺點(diǎn)，那就是抗生素被抗性基因滅活，例如氨芐青霉素和氯霉素(例如Kemp G.W.and Britz M.L.，1987Biotechnol.Techniques 1，157-162)。這種滅活所造成的后果是使培養(yǎng)體系中無質(zhì)粒細(xì)胞的繁殖失去了阻礙。另外，那些引起抗性的蛋白質(zhì)在制備性培養(yǎng)物中會(huì)釋放入培養(yǎng)基，從而加速抗生素的降解。在這些情況下，總培養(yǎng)體系中無質(zhì)粒細(xì)胞的比例會(huì)升高。再者，由于成本的原因，或者由于后續(xù)清除過程所造成的附加費(fèi)用(其中殘留的微量抗生素或它的失活型必須除去)，在許多工業(yè)方法中，是不使用抗生素的。同時(shí)，在這些方法中，一定比例的無質(zhì)粒細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)。
盡管在生長(zhǎng)期，無質(zhì)粒細(xì)胞通常只占有一點(diǎn)點(diǎn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但在許多情況下，當(dāng)產(chǎn)物開始形成后，含有質(zhì)粒的生產(chǎn)細(xì)胞(producing cell)的生長(zhǎng)速率開始降低，從而導(dǎo)致培養(yǎng)體系中無質(zhì)粒細(xì)胞群體的過度生長(zhǎng)。無質(zhì)粒細(xì)胞積累的缺點(diǎn)是會(huì)降低產(chǎn)物占總細(xì)胞量的相對(duì)比例；而且依所選用的分解和清除方法的不同，將造成這些發(fā)酵后步驟更加困難。
在構(gòu)建載體時(shí)，是有可能限制這些不利影響的，例如通過挑選抗性基因，使用替代的不依賴抗生素的穩(wěn)定性體系(Molin andGerdes，WO84/01172)，或者使用那些分解比較慢的改性抗生素；但是這些有問題的抗性仍在使用。再者，沒有一個(gè)替代體系是無限穩(wěn)定的；只能在某一時(shí)間跨度內(nèi)維持穩(wěn)定性。
在專利權(quán)力要求1中所述的發(fā)明是基于如下問題，即在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，特別是在工業(yè)應(yīng)用中，在誘導(dǎo)重組產(chǎn)物合成后，抑制無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，而不對(duì)產(chǎn)物形成產(chǎn)生不利影響。
在專利權(quán)利要求1中所列的特征是通過以一種周期性的波動(dòng)方式增加或減少碳源/能源的濃度來解決這個(gè)問題的。這可以通過改變含有碳源/能源的培養(yǎng)溶液的添加速度來實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)添加培養(yǎng)溶液的泵進(jìn)行相應(yīng)的程序化控制。這導(dǎo)致了一些連續(xù)的時(shí)期，在這些時(shí)期中，細(xì)胞要么只有有限量的底物可以利用，或者就根本沒有。
迄今為止有些觀點(diǎn)認(rèn)為在重組產(chǎn)物生產(chǎn)過程中，波動(dòng)式的加料方式會(huì)對(duì)產(chǎn)物形成產(chǎn)生不利影響，與這些觀點(diǎn)相反，有針對(duì)性的波動(dòng)加料方式令人驚訝的對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生了積極的影響，這種加料方式每個(gè)周期的最大時(shí)間為四分鐘，一個(gè)周期里面單個(gè)時(shí)段的持續(xù)時(shí)間最大為兩分鐘。周期時(shí)間大約在一分鐘(30秒鐘加料，30秒鐘暫停)能達(dá)到特別好的效果。
這種方法主要適用于所有利用生長(zhǎng)限制性方法生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法中，在這些方法中重組產(chǎn)物是在限制碳源的條件下誘導(dǎo)形成的，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于一.沒有必要向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加任何其它物質(zhì)；二.它不依賴于所用的表達(dá)體系；三.它對(duì)產(chǎn)物的形成沒有不利影響。這種方法特別適合于補(bǔ)料分批方式，其中糖類，如葡萄糖，乳糖，阿拉伯糖或半乳糖，或者其它有機(jī)碳源，如甲醇，甘油，糖蜜或淀粉作為限制性營(yíng)養(yǎng)成分加入培養(yǎng)體系中。這種方法不依賴于培養(yǎng)基，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基中都能使用。
這種方法并不僅限于以大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主；它也可以應(yīng)用于所有用限制碳源的分批加料方式培養(yǎng)的微生物中，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。它也不依賴于誘導(dǎo)系統(tǒng)。但是當(dāng)使用tac啟動(dòng)子時(shí)，這種方法特別有效。
當(dāng)基因產(chǎn)物的表達(dá)得到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，以及同不經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系相比，生產(chǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不利影響時(shí)，這種方法特別有效。另外，在那些生產(chǎn)時(shí)間特別長(zhǎng)的方法中，例如在周質(zhì)中表達(dá)重組蛋白質(zhì)或者產(chǎn)物形成期涉及溫度改變時(shí)，這種方法也是有效的。操作方法菌株和質(zhì)粒大腸桿菌K-12 RB791(F-，IN(rmD-rmE)1，λ-，lacIqLg；大腸桿菌保存中心，New Haven，USA)用作宿主。這個(gè)菌株用質(zhì)粒pKK177glucC(Kopetzki等，1989a)轉(zhuǎn)化。該質(zhì)粒帶有一個(gè)在tac啟動(dòng)子控制下的來自釀酒酵母的α-葡糖苷酶基因。還帶有β-內(nèi)酰胺酶基因作為選擇性標(biāo)記。另外，還用了第二個(gè)體系，在這個(gè)體系中除了用質(zhì)粒pKK177glucC轉(zhuǎn)化之外，還用帶有dnaY基因(Minor-tRNA argU，AGA/AGG)的質(zhì)粒pUBS520(Brinkmann等，1989)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基和發(fā)酵條件在所有培養(yǎng)中都使用了葡萄糖—銨—礦物鹽培養(yǎng)基(Teich等，1998，J.Biotechnol.64，197-210)。葡萄糖的起始濃度是5克/升。添加溶液含有葡萄糖200克/千克，微量元素溶液(Holme等，1970)10毫升/升，但不含MgSO4，其它成分和濃度與上述培養(yǎng)中所用培養(yǎng)基一樣(唯一不同(NH4)2SO42.0克/升)。在培養(yǎng)過程中加入10毫升1MMgSO4，OD500＝9。在制備性培養(yǎng)物和發(fā)酵介質(zhì)中都加入氨芐青霉素(100毫克/升)和卡那霉素(10毫克/升)。聚丙二醇2000(50％)作為消泡劑使用。
在37℃下?lián)u床培養(yǎng)的發(fā)酵無機(jī)鹽培養(yǎng)基體系作為發(fā)酵接種物。所有發(fā)酵在61 Biostat ED生物反應(yīng)器中進(jìn)行，初始容積為4升，溫度35℃。培養(yǎng)體系以分批培養(yǎng)開始。在這個(gè)階段，通氣速率和攪拌以一種級(jí)聯(lián)的方式調(diào)節(jié)，以使DOT值維持在至少20％。在分批階段末期，停止用DOT值控制，將通氣速率和攪拌速度設(shè)定在2vvm或800轉(zhuǎn)/分鐘。利用25％的氨水溶液將pH值調(diào)節(jié)在7.0。在分批階段的末期，細(xì)胞密度達(dá)到大約2克DCW/升(OD500＝9)時(shí)，添料泵開始以53.2克/小時(shí)(2.6克葡萄糖/升/小時(shí))的恒定速率運(yùn)作。在所有培養(yǎng)體系中，所加入的葡萄糖總量是一樣的，并不依所用的加料方式而不同。檢驗(yàn)了三種不同的加料方法(A)持續(xù)加料(受控制的培養(yǎng))，(B)以一分鐘為周期的間歇性加料方式(30秒加料，30秒停止)，(C)以四分鐘為周期的間歇性加料方式(2分鐘加料，2分鐘停止)。在加料開始3小時(shí)后加入1mM IPTG以誘導(dǎo)α-葡糖苷酶基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)之后大約20小時(shí)的時(shí)間跨度內(nèi)追蹤產(chǎn)物的形成。分析方法通過在500nm下測(cè)量光密度值(OD500)來追蹤細(xì)胞生長(zhǎng)。顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)在計(jì)數(shù)室(深0.02mm)里進(jìn)行，測(cè)定細(xì)胞干重(DCW)(見Teich等，1998，J.Biotechnol.64，197-210)。將稀釋的樣品涂在含有營(yíng)養(yǎng)成分的瓊脂平板上，孵育至少三天，從而確定菌落形成單位(cfu)的數(shù)目。然后用復(fù)制鋪板技術(shù)，將這些平板影印到選擇性瓊脂上，以測(cè)定質(zhì)粒穩(wěn)定性。DCW，OD500和細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的關(guān)系描述如下1克/升DCW對(duì)應(yīng)于OD500為4.5±0.1和細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.8×109/毫升。葡萄糖濃度用商業(yè)的酶試劑盒測(cè)定。
通過將總細(xì)胞樣品在SDS凝膠上(積層膠5％，分離膠7％)分離來測(cè)定α-葡糖苷酶的濃度。掃描產(chǎn)物的電泳條帶，通過同凝膠上不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物蛋白比較，進(jìn)行量化，從而得出表達(dá)量。結(jié)果大腸桿菌RB791 pKK177glucC和大腸桿菌RB791 pKK177glucCpUBS520用限制葡萄糖的分批補(bǔ)料方式培養(yǎng)在攪拌反應(yīng)器中。在第一個(gè)分批階段之后，開始恒定地加料，加料開始之后三小時(shí)，加入1mMIPTG誘導(dǎo)α-葡糖苷酶基因的表達(dá)。誘導(dǎo)之后α-葡糖苷酶的濃度增加，大約在誘導(dǎo)之后5小時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的該酶比濃度達(dá)到最大值，接著隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，濃度開始下降(見圖1c)。α-葡糖苷酶比濃度的降低是由于培養(yǎng)體系中無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)引起的。由于α-葡糖苷酶的形成不利于生產(chǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也抑制了生產(chǎn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，因此那些無質(zhì)粒細(xì)胞就在誘導(dǎo)之后獲得了巨大的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這也導(dǎo)致了培養(yǎng)基中葡萄糖的積累。培養(yǎng)體系中那些不含有產(chǎn)物基因的細(xì)胞并不受誘導(dǎo)物IPTG的影響，同時(shí)由于有大量的葡萄糖可以利用，這些細(xì)胞卻可以毫無限制的繼續(xù)生長(zhǎng)。
如果葡萄糖溶液不是連續(xù)的加入，而是以周期大約為一分鐘(見材料和方法)的短脈沖方式加入，所引起的α-葡糖苷酶的積累與誘導(dǎo)之后恒定加料的方法相似。但是，依賴于脈沖時(shí)間的長(zhǎng)短，該方法卻能防止培養(yǎng)體系中無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)(見圖1d)。這種能抑制無質(zhì)粒細(xì)胞的積極效果不僅在圖1所示的強(qiáng)表達(dá)體系中十分明顯，而且在用大腸桿菌RB791 pKK177glucC體系表達(dá)α-葡糖苷酶的弱表達(dá)體系中也很明顯(圖2，表1)。再者，脈沖加料方式對(duì)這兩種體系在誘導(dǎo)之后的合成速率都有輕微的積極作用，對(duì)于第一種體系，該方式還可以稍微增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，使其中超過90％的產(chǎn)物以包涵體的形式存在。限定周期時(shí)間是一個(gè)十分重要的因素。在所示的兩個(gè)實(shí)施例中，將周期時(shí)間延至4分鐘會(huì)引起產(chǎn)物量的降低，從而降低產(chǎn)量(見圖1，2和表1)。在這種情況下培養(yǎng)物中無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)減少了，然而，較長(zhǎng)的周期時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成的減少，或者增加了產(chǎn)物的降解。
表1用限制葡萄糖的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)大腸桿菌RB791pKK177glucC(含有或不含有質(zhì)粒PUBS520)，培養(yǎng)體系的生產(chǎn)能力和無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)情況。


圖1使用大腸桿菌RB791 pKK177glucC pUBS520的補(bǔ)料分批發(fā)酵，并用1mM IPTG誘導(dǎo)。持續(xù)性(a-c；空心圖標(biāo)未經(jīng)誘導(dǎo)；實(shí)心圖標(biāo)經(jīng)過誘導(dǎo))和周期性(d-f)(▲周期為1分鐘；周期為4分鐘)加入葡萄糖底物溶液的對(duì)比。(a，d)細(xì)胞量(DCW)，(b，e)葡萄糖濃度，(c，f)產(chǎn)物形成(毫克α-葡糖苷酶/克細(xì)胞干重)。所示的數(shù)據(jù)表示兩個(gè)連續(xù)加料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及周期性加料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)各一個(gè)。加入底物溶液的開始時(shí)間(-----)，加料開始3小時(shí)后用IPTG誘導(dǎo)(----)。圖2使用大腸桿菌RB791 pKK177glucC進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，并用1mMIPTG誘導(dǎo)。持續(xù)性(a-c；空心圖標(biāo)未經(jīng)誘導(dǎo)；實(shí)心圖標(biāo)經(jīng)過誘導(dǎo))和周期性(d-f)(▲周期為1分鐘；周期為4分鐘)加入葡萄糖底物溶液的對(duì)比。(a，d)細(xì)胞量(DCW)，(b，e)葡萄糖濃度，(c，f)產(chǎn)物形成(毫克α-葡糖苷酶/克細(xì)胞干重)。進(jìn)一步的解釋參見圖1。
圖3表示在周期1分鐘的發(fā)酵中泵筒示意圖。圖示為發(fā)酵過程的一部分，表示了溶解氧的反應(yīng)(DOT，％，---u----)和泵的開關(guān)(0＝關(guān)，1＝開，----)。
權(quán)利要求
1.提高微生物發(fā)酵工藝中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率的方法，其特征在于以短周期波動(dòng)性的降低或增加培養(yǎng)物中碳源/能源的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，其特征在于所述波動(dòng)是通過改變含有碳源/能源的補(bǔ)料溶液的添加速率來實(shí)現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中所述方法，其特征在于一個(gè)周期的最大持續(xù)時(shí)間為4分鐘，一個(gè)周期中單個(gè)時(shí)段的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為2分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于單個(gè)周期的持續(xù)時(shí)間為1分鐘，單個(gè)周期中單個(gè)時(shí)段的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為總周期時(shí)間的75％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于向培養(yǎng)體系中添加碳源/能源，使得只在發(fā)酵工藝的某些時(shí)段中周期性改變底物溶液的添加速率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于加料速率通過周期性的加入和停止加入補(bǔ)料溶液的方式來控制。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于葡萄糖，甘油，乳糖，半乳糖，甲醇，乙酸，糖蜜或淀粉被用作碳源/能源。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于依所用的啟動(dòng)子不同，將IPTG或吲哚丙烯酸(IAA)，或乳糖，阿拉伯糖，半乳糖，或甲醇(如果還未用作能源)加入培養(yǎng)體系以誘導(dǎo)重組產(chǎn)物的形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在誘導(dǎo)重組產(chǎn)物形成時(shí)，改變溫度。
全文摘要
在補(bǔ)料分批發(fā)酵中利用現(xiàn)有技術(shù)方法生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)時(shí)，往往在誘導(dǎo)重組產(chǎn)物合成之后，導(dǎo)致培養(yǎng)物中無質(zhì)粒細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，從而引起目的產(chǎn)物產(chǎn)量的降低。因此可以通過以一種恒定的簡(jiǎn)單方式降低或提高培養(yǎng)物中碳源/能源的濃度來實(shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率的提高。通過改變含有碳源/能源的補(bǔ)料溶液的加料速率即可產(chǎn)生這種波動(dòng)現(xiàn)象。這種方法適用于所有用限制碳源的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法培養(yǎng)的微生物。
文檔編號(hào)C12M1/36GK1391614SQ00812893
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月14日
發(fā)明者P·努鮑爾, H·Y·林 申請(qǐng)人:法馬西雅公司