專利名稱：去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將D-N-氨甲?；?α-氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-α-氨基酸的酶(下文稱為去氨甲酰酶)結(jié)晶。本發(fā)明還涉及用結(jié)晶通過X光晶體照像術(shù)確定的立體結(jié)構(gòu)及其用途，更具體的，涉及利用其立體結(jié)構(gòu)設(shè)計氨基酸突變，改善酶穩(wěn)定性(如熱抗性、有機(jī)溶劑抗性、空氣氧化抗性等)，改變酶反應(yīng)的最佳pH，改善去氨甲酰酶的比活力的方法。另外，本發(fā)明還設(shè)計一種利用上述立體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生去氨甲酰酶突變體的方法，得到的去氨甲酰酶突變體，及其用途。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性的D-α-氨基酸是作為藥物中間物有價值的化合物。特別是，工業(yè)上有用的D-α-氨基酸的例子包括D-苯基甘氨酸和D-對羥苯基甘氨酸，它們是生產(chǎn)半合成青霉素或半合成頭孢菌素的中間物。作為生產(chǎn)這些D-α-氨基酸的方法，已知一種方法，包括除去相應(yīng)D-N-氨甲酰基-α-氨基酸的氨甲?；?，從而獲得D-α-氨基酸。對此，用化學(xué)方法或一種利用微生物酶反應(yīng)的方法除去氨甲?；?。
除去氨甲?；拿阜Q為去氨甲酰酶。該酶催化D-N-氨甲?；?α-氨基酸轉(zhuǎn)化成D-α-氨基酸。已從假單胞菌(Pseudomonas)屬、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、氣桿菌(Aerobacter)屬、氣單胞菌(Aeromonas)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、黃桿菌(Flavobacterium)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、微球菌(Micrococcus)屬、節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)屬、無色桿菌(Achromobacter)屬、莫拉氏菌(Moraxella)屬、副球菌(Paracoccus)屬、芽生桿菌(Blastbacter)屬和叢毛單胞(Comamonas)菌屬的細(xì)菌中鑒定出該酶。已從土壤桿菌屬(如放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)NRRL B11291和土壤桿菌KNK712(Kaneka菌))確定了去氨甲酰酶的氨基酸序列和/或核酸序列。
一般說，在對抗室溫或高溫下的工業(yè)化反應(yīng)的使用條件下，大多數(shù)酶是不穩(wěn)定的，而且酶的穩(wěn)定性經(jīng)常對產(chǎn)品成本有影響。用所謂的“生物反應(yīng)器”，如用固定化的酶或固定化的細(xì)菌重復(fù)進(jìn)行反應(yīng)，可以使酶反應(yīng)有利地進(jìn)行。此中，因為酶的穩(wěn)定性還有酶使用次數(shù)的限制，仍對產(chǎn)品成本有影響。
為了在工業(yè)應(yīng)用中有效使用能催化有用反應(yīng)的酶，需要一種快速或有效建立具有卓越物理性質(zhì)(如穩(wěn)定性)或高催化活性的酶的方法。作為一種獲得具有改善的物理性質(zhì)或功能的方法，已知一種所謂的隨機(jī)篩選法，其中用化學(xué)處理、酶處理等人工突變一個編碼酶的基因，將具有突變的重組DNA引入宿主細(xì)胞，篩選具有所要功能和/或物理性質(zhì)的酶。另一方面，隨著最近在結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的進(jìn)展，用X-光晶體照像術(shù)或NMR分析，使用立體結(jié)構(gòu)和分子設(shè)計技術(shù)，已揭示了許多蛋白質(zhì)(包括酶)的立體結(jié)構(gòu)，使越來越多地進(jìn)行了蛋白質(zhì)物理性質(zhì)或功能的修飾不斷得以實施。
本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)”指某些條件下蛋白質(zhì)氨基酸序列確定的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，即具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)在某些條件下折疊而成的三維結(jié)構(gòu)?？捎肵-光晶體照像術(shù)或核磁共振確定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。
已成功的用隨機(jī)篩選法改變?nèi)グ奔柞Ｃ傅奈锢硇再|(zhì)，獲得產(chǎn)生具有改善熱抗性的酶的細(xì)菌菌株(大腸桿菌JM109)，該酶是工業(yè)上有用的去氨甲酰酶突變體(國際出版物WO94/03613)。另外，已通過位點專一性誘變(待批日本公開出版物號9-173068)獲得了具有改善的穩(wěn)定性的突變體。這些例子是基于其一級氨基酸序列產(chǎn)生的突變體，而不是利用酶立體結(jié)構(gòu)的合理分子設(shè)計方法。
尚未測定去氨甲酰酶和類似酶的立體結(jié)構(gòu)。使用蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫PIRRelease57(國家生物技術(shù)信息中心(NCBI))對氨基酸序列已知的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)去氨甲酰酶與水解酶，如酰胺酶和腈水解酶具有約25-30％的弱序列相似性。然而，這些具有弱序列相似性的酶的立體結(jié)構(gòu)都未被確定。因此，實際上不可能用所謂的同源建模技術(shù)，使用相似蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)估計去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)，該技術(shù)常用于分子設(shè)計技術(shù)，(如Swiss-Pdbviewer(建模程序)(瑞士生物信息協(xié)會(SIB)，ExPASy分子生物學(xué)服務(wù)器(從http//www.expasy.ch/上可進(jìn)入))；Guex，N.和Peitsch，M.C.(1997)SWISS-MODEL和Swiss-pdbViewer比較蛋白質(zhì)建模的環(huán)境，Electrophoresis 18，2714-2723)。即使測定了相似酶的立體結(jié)構(gòu)，基于小于30％的序列相似性也難以獲得用于合理的分子設(shè)計方法的具有足夠準(zhǔn)確率的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)模型。需要去氨甲酰酶準(zhǔn)確的原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)，用分子設(shè)計的高度精確性來預(yù)測涉及酶反應(yīng)最佳pH改變、比活力的改進(jìn)等的氨基酸突變。如果可測定去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)，可精確分析立體結(jié)構(gòu)，建立基于其上的合理分子設(shè)計技術(shù)，就可能由此進(jìn)一步快速或有效地獲得有利于工業(yè)應(yīng)用的修飾酶。
本發(fā)明要解決的問題為了解決上述問題，本發(fā)明的一個目的是獲得現(xiàn)在用于工業(yè)應(yīng)用的去氨甲酰酶單晶，用X-光晶體照像術(shù)揭示去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的另一個目的是通過以改進(jìn)與D-N-氨甲?；?α-氨基酸(即去氨甲酰酶底物)的反應(yīng)性，優(yōu)化反應(yīng)pH、對熱和空氣氧化的穩(wěn)定性為目的進(jìn)行分子設(shè)計，提供工業(yè)應(yīng)用中更有利的去氨甲酰酶突變體，和一種用獲得的去氨甲酰酶突變體產(chǎn)生D-α-氨基酸的方法。
發(fā)明公開(解決問題的方法)為解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了積極的研究。結(jié)果，獲得了去氨甲酰酶單晶及其重原子衍生物結(jié)晶。用重原子同晶置換法和多波長反常色散法確定了去氨甲酰酶的精確立體結(jié)構(gòu)?；诖肆Ⅲw結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了具有改善特征的突變體。從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及在正交晶系中具有空間群P21212和SEQ ID NO1列出的氨基酸序列，或在正交晶系中具有空間群P212121和SEQ ID NO2列出的氨基酸序列的去氨甲酰酶結(jié)晶。本發(fā)明涉及具有空間群P21212和SEQ ID NO1列出的氨基酸序列，或具有在正交晶系中空間群P212121和SEQ ID NO2列出的氨基酸序列的去氨甲酰酶結(jié)晶。在一個實施方案中，結(jié)晶可具有長方體形式的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝66.5-68.5，b＝135.5-138.0，c＝66.5-68.5。氨基酸序列可以是SEQ ID NO1。在另一個實施方案中，結(jié)晶可具有長方體形式的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝68.5-70.5，b＝138.0-140.5，c＝68.5-73.0。氨基酸序列可以是SEQ ID NO1。在另一個實施方案中，結(jié)晶可具有長方體形式的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝81.5-82.5，b＝133.0-135.0，c＝119.5-121.5。氨基酸序列可以是SEQ ID NO2。在一個方面，本發(fā)明可提供一種每個去氨甲酰酶分子含有至少一個或多個重金屬原子的結(jié)晶。在一個實施方案中，重金屬原子可以是汞、金、鉑、鉛、銥、鋨和鈾中的任一種。在另一個實施方案中，本發(fā)明可提供在液氮中凍結(jié)去氨甲酰酶結(jié)晶而制得的凍結(jié)結(jié)晶。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備去氨甲酰酶結(jié)晶的方法，包括以下步驟提供濃度為1-50毫克/毫升的去氨甲酰酶溶液；提供含有濃度為5-30％重量的聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(PEGMME)的沉淀劑和其濃度能使pH達(dá)到6.0-9.0的緩沖劑的溶液；將去氨甲酰酶溶液與沉淀劑溶液混合；讓得到的混合物溶液放置一段預(yù)定的時間，直到去氨甲酰酶結(jié)晶在溶液中長到預(yù)定大小或更大。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中的混合步驟包括將一滴去氨甲酰酶溶液與一滴沉淀劑溶液混合，放置得到的混合物溶液的步驟包括，使混合步驟中得到的混合物液滴懸在密封容器中的裝有沉淀劑溶液的溶液儲器之上。另外，在本發(fā)明的方法中，混合步驟包括將一滴去氨甲酰酶溶液和一滴沉淀劑溶液混合，放置得到的混合物溶液的步驟包括將混合步驟中得到的混合物液滴懸在將沉淀劑溶劑裝在密封容器中的溶劑儲器中的液滴臺上。溶液儲器中的沉淀劑溶液的蒸汽壓比混合物液滴的蒸汽壓低。在另一個實施方案中，放置混合物溶液的預(yù)定時間是1天至3周。在另一個實施方案中，該方法還包括在提供去氨甲酰酶溶液后，將去氨甲酰酶溶液置于尺寸排阻半透膜中?；旌喜襟E包括使沉淀劑溶液擴(kuò)散通過半透膜到達(dá)去氨甲酰酶溶液。在另一個實施方案中，混合步驟包括在去氨甲酰酶溶液中逐漸加入沉淀劑溶液，放置得到的混合物溶液的步驟包括在密封容器中放置混合物溶液。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及去氨甲酰酶，其特征是具有


圖1所示的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有四層夾心結(jié)構(gòu)的去氨甲酰酶，具有4個α螺旋和12個β-折疊的二級結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，與酶反應(yīng)有關(guān)的氨基酸殘基是一個半胱氨酸殘基、兩個谷氨酸殘基；一個賴氨酸殘基，酶反應(yīng)的一種底物是D-N-氨甲?；?α-氨基酸；其底物結(jié)合的活性位點的特征是圖3代表的底物結(jié)合活性位點的立體結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有去氨甲酰酶活性的酶分子，其中其底物是D-N-氨甲?；?α-氨基酸，其中酶分子具有由至少與SEQ IDNO1或2的下列氨基酸對應(yīng)的氨基酸形成的活性位點腔46位的Glu，126位的Lys，145位的Glu和171位的Cys。在另一個實施方案中，在反應(yīng)中，D-N-氨甲酰基-α-氨基酸可與活性位點腔處SEQ ID NO1或2對應(yīng)于126位的Lys、143位的His、145位的Glu、174位的Arg、175位的Arg和197位的Thr的氨基酸相互作用。在另一個實施方案中，對應(yīng)于SEQ ID NO1或2中46位的Glu、145位的Glu和171位的Cys的氨基酸具有與活性位點腔的水分子的氫鍵。在另一個實施方案中，D-N-氨甲?；?α-氨基酸選自D-N-氨甲?；?苯基甘氨酸、D-N-氨甲酰基-對羥苯基甘氨酸、D-N-氨甲酰基-苯丙氨酸、D-N-氨甲酰基-纈氨酸、D-N-氨甲?；?丙氨酸、D-N-氨甲酰基-半胱氨酸、D-N-氨甲?；?天冬氨酸、D-N-氨甲?；?谷氨酸、D-N-氨甲?；?甘氨酸、D-N-氨甲?；?組氨酸、D-N-氨甲?；?異亮氨酸、D-N-氨甲?；?賴氨酸、D-N-亮氨酸、D-N-氨甲?；?甲硫氨酸、D-N-氨甲酰基-天冬酰胺、D-N-氨甲?；?脯氨酸、D-N-氨甲酰基-谷氨酰胺、D-N-氨甲?；?精氨酸、D-N-氨甲酰基-絲氨酸、D-N-氨甲?；?蘇氨酸、D-N-氨甲?；?色氨酸和D-N-氨甲?；?酪氨酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及以去氨甲酰酶復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)為特征的去氨甲酰酶復(fù)合物，其突變體，或其活性成分，和D-N-氨甲?；?α-氨基酸或D-α-氨基酸。該復(fù)合物用分子設(shè)計技術(shù)從去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，包括步驟設(shè)計具有根據(jù)權(quán)利要求14、16和21任一的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)改變的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰突變體。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，包括步驟制備具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶；對結(jié)晶進(jìn)行X-光晶體照像術(shù)分析確定結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)；根據(jù)確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改善的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，包括步驟制備具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶；對結(jié)晶進(jìn)行X-光晶體照像術(shù)分析確定結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)；根據(jù)確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改善的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體；和制造去氨甲酰酶突變體。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的立體結(jié)構(gòu)是本發(fā)明的去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)。在另一個實施方案中，設(shè)計去氨甲酰酶突變體的步驟旨在改變酶的一個或多個特征，這些特征選自底物專一性的改變、比活力的改變、穩(wěn)定性的改善、最佳pH的優(yōu)化和水溶性的改變。在另一個實施方案中，去氨甲酰酶突變體的制造方法旨在改善穩(wěn)定性。最好的是，穩(wěn)定性改善的突變體設(shè)計包括一種突變，該突變包括氨基酸殘基的取代，該殘基導(dǎo)致由于空氣氧化的活性下降。在另一個實施方案中，酶特征的改變包括改變比活力和優(yōu)化最佳pH。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的方法獲得的去氨甲酰酶突變體。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的立體結(jié)構(gòu)篩選和/或設(shè)計去氨甲酰酶抑制劑的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種利用去氨甲酰酶結(jié)晶或去氨甲酰酶結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)，改變其它與去氨甲酰酶具有至少30％一級氨基酸序列相似性的多肽或蛋白質(zhì)酶的方法。
附圖簡述
圖1是一張圖表，顯示去氨甲酰酶的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。三角表示β鏈結(jié)構(gòu)。圓圈表示α螺旋結(jié)構(gòu)?！癗-端”表示網(wǎng)絡(luò)的末端?！癈-端”表示羧基末端。
圖2是去氨甲酰酶的帶-鏈圖。β-鏈結(jié)構(gòu)用片層表示。α-螺旋結(jié)構(gòu)用螺旋表示。與催化活性有關(guān)的氨基酸側(cè)鏈用小球和棒表示。
圖3是顯示去氨甲酰酶活性位點底物結(jié)合方式的示意圖。R-表示D-α-氨基酸的側(cè)鏈。氨基酸的名稱用殘基號和三字母名稱表示。
圖4是去氨甲酰酶催化活性位點的立體結(jié)構(gòu)圖。β-鏈結(jié)構(gòu)用片層表示。與催化活性有關(guān)的氨基酸側(cè)鏈用球和棒符號表示。氨基酸名稱用殘基號和三字母名稱表示。
圖5是從1.00和0.98衍射數(shù)據(jù)算得的差異帕特孫圖的Harker投影。
圖6是從1.00和1.27衍射數(shù)據(jù)算得的差異帕特孫圖的Harker投影。
圖7是從1.00和0.98衍射數(shù)據(jù)算得的差異帕特孫圖的Harker投影。
圖8是催化活性位點的代表性電子密度圖，表示本發(fā)明的立體結(jié)構(gòu)。
實施本發(fā)明的方式下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本文所用的術(shù)語“去氨甲酰酶活性”指通過除去修飾氨基酸的氨甲?；?，將D-N-氨甲?；?α-氨基酸轉(zhuǎn)化為D-α-氨基酸的活性。術(shù)語“去氨甲酰酶”指具有去氨甲酰酶活性的酶。去氨甲酰酶的例子包括具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列的酶。SEQ ID NO1的去氨甲酰酶分離自土壤桿菌KNK712并已測序。具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的酶是篩選具有隨機(jī)突變的SEQ ID NO1的突變大腸桿菌菌株獲得的酶。
本文所用的術(shù)語“突變體”和“去氨甲酰酶的突變體或其它酶”指一種酶，該酶具有具有至少一個氨基酸取代、添加或缺失的一條氨基酸序列，或改變的氨基酸序列，而保留至少一部分原來酶的活性。術(shù)語“活性片段”指某些蛋白質(zhì)酶或多肽酶的氨基酸序列片段(部分)，它保留了原來酶的至少一部分活性。此中，“至少一部分活性”代表性地指原來酶比活力的至少10％，優(yōu)選原來酶比活力的至少50％，或如需要，比活力的10％以下。
本文所用的術(shù)語“天然結(jié)晶”指在含有合適沉淀劑(如硫酸銨、聚乙二醇等)、添加的鹽等的組分的緩沖液中生長，而且不含重金屬原子的去氨甲酰酶單晶。
本文所用的“重原子衍生結(jié)晶”指用下列方法獲得的任一結(jié)晶(i)將制備的天然結(jié)晶浸在含有重金屬(如汞、金、鉑、鉛、銥、鋨和鈾等)化合物的溶液中，從而使重金屬原子與結(jié)晶中的去氨甲酰酶通過共價鍵或配位鍵偶聯(lián)，而不干擾結(jié)晶性，(ii)去氨甲酰酶在含有合適的沉淀劑(如硫酸銨、聚乙二醇等)、添加的鹽等，還含有合適濃度的上述重金屬組分的緩沖溶液中生長成單晶，和(iii)使用一種去氨甲酰酶突變體，其中甲硫氨酸和/或半胱氨酸殘基被硒代甲硫氨酸和/或硒代半胱氨酸殘基取代。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可在含有聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(PEGMME)、緩沖劑和任何添加的鹽的沉淀劑溶液中生長具有SEQ ID NO1或2的氨基酸序列的去氨甲酰酶結(jié)晶，同時在預(yù)定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)溶液濃度和pH(去氨甲酰酶濃度是1-50毫克/毫升，聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇濃度是5-30重量％，pH是6.0-9.0)?？墒褂萌N蛋白質(zhì)結(jié)晶生長的常用基礎(chǔ)技術(shù)中的任一種，即蒸汽擴(kuò)散法、透析法和批料法(Methods in Enzymology，114卷，生物大分子衍射法，A部分或卷276，大分子晶體照像術(shù)，A部分)；蒸汽擴(kuò)散法是優(yōu)選的。
根據(jù)蒸汽擴(kuò)散法，將一滴含有沉淀劑的蛋白質(zhì)溶液置于一容器中，該容器中裝有含有高濃度沉淀劑的緩沖液(外部溶液)，密封容器并放置。有兩種方法放置液滴懸滴法和坐滴法。在懸滴法中，將一小滴蛋白質(zhì)溶液置于玻璃蓋片上，將玻璃蓋片反蓋在儲器上將其封閉。在坐滴法中，將合適的液滴臺置于儲器內(nèi)，將一小滴蛋白質(zhì)溶液置于液滴臺上，用玻璃蓋片等密封儲器。儲器內(nèi)的溶液含有沉淀劑，同時在小蛋白質(zhì)液滴中存在少量沉淀劑。蒸汽擴(kuò)散法中使用的沉淀劑溶液含有下列組分(a)分子量為4000-9000，優(yōu)選平均分子量7500，濃度為10-20重量％的PEG或PEGMME，(b)作為添加的鹽的氯化鈉、氯化鋰或氯化鎂，具有0.1-0.5M的濃度(用0.2M氯化鋰獲得了最佳結(jié)果)，和(c)足量緩沖劑，提供pH6.5-8.0，優(yōu)選pH7.5。對此，可使用0.05-0.1M HEPES(Sigma，St Louis，MO USA)。可使用其它緩沖劑，如磷酸鈉、磷酸鉀和蘋果酸三(羥甲基)氨基甲酯。
術(shù)語“批料法”指一種方法，其中在蛋白質(zhì)中小批量加入沉淀劑溶液；當(dāng)溶液略變混濁時，離心除去不溶性物質(zhì)；然后將上清液轉(zhuǎn)移到小試管中，密封并放置。術(shù)語“透析法”指一種方法，其中用半透膜在含有沉淀劑(外部溶液)的緩沖液中透析蛋白質(zhì)溶液(Methods in Enzymology，114卷，生物大分子的擴(kuò)散方法，A部分)。
本文所用的術(shù)語“預(yù)定尺寸”指能用X-光晶體照像術(shù)測量的最小尺寸。對于本文的去氨甲酰酶，可優(yōu)選0.3×0.3×0.1毫米。本文所用的術(shù)語“預(yù)定時間”指結(jié)晶大小足夠達(dá)到預(yù)定尺寸或以上的時間段。就本發(fā)明的去氨甲酰酶而言，可優(yōu)選1天至3周。
如此制備的具有適合X-光晶體照像術(shù)的預(yù)定尺寸的去氨甲酰酶天然結(jié)晶具有(1)菱形的外形，和(2)在同樣外形的結(jié)晶中可能具有不同的晶格常數(shù)。當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)臈l件如沉淀劑和緩沖液時，可獲得針狀或柱狀的小型或微小結(jié)晶，雖然它們不適合X-光晶體照像術(shù)。關(guān)于這些晶體的使用，如果酶的微晶與蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如戊二醛)交聯(lián)，可能在長時間內(nèi)維持穩(wěn)定的酶反應(yīng)，即使使用有機(jī)溶劑亦無妨。該技術(shù)稱為CLEC(交聯(lián)酶結(jié)晶)，已被報道(N.L.St.Clair&M.A.Navia，(1992)J Am.Chem.Soc.114，7314-7316)。本發(fā)明的去氨甲酰酶結(jié)晶擴(kuò)大了CLEC技術(shù)應(yīng)用的范圍。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種用于X-光晶體照像術(shù)的重原子衍生結(jié)晶，即重金屬原子與晶體中的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，同時維持天然結(jié)晶的結(jié)晶性。當(dāng)使用蛋白質(zhì)X光晶體照像術(shù)的基礎(chǔ)技術(shù)重原子同晶置換法和多波長反常色散法時，利用重原子衍生晶體。制備重原子衍生結(jié)晶時，可將天然結(jié)晶浸在含有能提供所需濃度的一定量的重金屬化合物溶液中制備去氨甲酰酶重原子衍生晶體，其中天然晶體可穩(wěn)定維持至少數(shù)日或更長，而不溶解和衰變。浸泡法中使用的重金屬化合物的例子包括含有金、鉑、銥、鋨、汞、鉛、鈾、釤等金屬的鹽或有機(jī)金屬化合物。在重金屬浸泡法中，使用的儲藏溶液中具有濃度為0.1-100mM的重金屬化合物，如汞化合物EMTS(硫代水楊酸乙汞鈉)和二氰化金酸鉀(I)，以及提供所需pH的合適沉淀劑和添加的鹽成分。儲備溶液的優(yōu)選例子是0.01M含有20-30重量％聚乙二醇6000和0.2M氯化鋰的HEPES緩沖液(pH7.5)。收集用浸泡法制備的結(jié)晶的X-光衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，與之前獲得的天然結(jié)晶的衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)比較，判斷是否在結(jié)晶中引入重金屬原子(即與結(jié)晶中的蛋白質(zhì)偶聯(lián))。
另外，可在含有硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸(含有重金屬原子硒)的培養(yǎng)液中生長和培養(yǎng)產(chǎn)生去氨甲酰酶的微生物(如重組的大腸桿菌，具有土壤桿菌屬的DNA)，從而可獲得去氨甲酰酶的甲硫氨酸或半胱氨酸殘基被硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸取代的突變體。如果可由此獲得引入重金屬原子的去氨甲酰酶而不用浸泡法，即可通過在上述條件下結(jié)晶以制備重原子衍生結(jié)晶。
眾所周知X-光有破壞蛋白質(zhì)結(jié)晶的極大危險。因此，重要的是獲得抵抗破壞的結(jié)晶，以成功的進(jìn)行X-光晶體照像術(shù)分析。近來，已嘗試用凍結(jié)結(jié)晶和測量凍結(jié)時的結(jié)晶以獲得高質(zhì)量和高解析度的數(shù)據(jù)(Methods in Enzymology，276卷，大分子晶體照像術(shù)，A部分，C.W.Carter，Jr.和R.M.Sweet編，[13]，實用低溫晶體照像術(shù)(D.W.Rodgers))。通常當(dāng)凍結(jié)蛋白質(zhì)晶體時，用含有冷凍用的穩(wěn)定劑(如甘油)的溶液處理蛋白質(zhì)結(jié)晶，以防止凍結(jié)引起的結(jié)晶衰變。在本發(fā)明中，可將小的已結(jié)晶的液滴或從浸泡溶液取出的結(jié)晶直接浸在液氮中，立即冷凍而不加入凍結(jié)用的穩(wěn)定劑，以制備去氨甲酰酶的天然結(jié)晶和凍結(jié)的重原子衍生晶體。另外，可對浸泡在加過冷凍用的穩(wěn)定劑的儲備溶液中的晶體進(jìn)行上述立即冷凍過程，以制備凍結(jié)結(jié)晶。
對于去氨甲酰酶等新蛋白質(zhì)，由于不知道類似蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，不可能用利用類似蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)的分子置換法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。可用重原子同晶置換法(Methods in Enzymology，卷115，生物大分子的衍射法，B部分，H.W.Wyckoff，C.H.W.Hirs和S.N.Timasheff編；和Methods in Enzymology，卷276，大分子晶體照像術(shù)，A部分，C.W.Carter，Jr.和R.M.Sweet編)或多波長反常色散法(S.N.Timasheff編，和Methods in Enzymology，卷276，大分子晶體照像術(shù)，A部分，C.W.Carter，Jr.和R.M.Sweet編)測定這些新蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。特別是，用天然結(jié)晶和重原子衍生結(jié)晶衍射數(shù)據(jù)的差異中的衍射強(qiáng)度差異，或用不同波長測量的衍射數(shù)據(jù)中的衍射強(qiáng)度差異算出計算初始相的電子密度。當(dāng)用重原子同晶置換法或多波長反常色散法測定去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)時，可使用含有汞、金、鉑、鈾或釤原子等作為重金屬原子的的重原子衍生結(jié)晶?？蓛?yōu)選使用用汞化合物EMTS或二氰化金酸鉀(I)的浸泡法獲得的重原子衍生結(jié)晶。
可用R-AXIS IIc(理學(xué)電機(jī)公司)或SPring-8(西播磨大型輻射設(shè)備公司)的蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析用光束路線，獲得天然結(jié)晶和重原子衍生結(jié)晶的衍射數(shù)據(jù)。為了使用多波長反常色散法，用SPring-8蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析的光束路線獲得了多波長的衍射數(shù)據(jù)。用附于R-AXIS的數(shù)據(jù)處理程序或DENZO程序(McScience)或其它類似的影像處理程序(或單晶分析軟件)，將獲得的衍射影像數(shù)據(jù)加工成反射強(qiáng)度數(shù)據(jù)?；谔烊唤Y(jié)晶的反射強(qiáng)度數(shù)據(jù)和多波長DF的反射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，用不同的Patterson圖，然后用PHASES程序(W.Furey，賓西法尼亞大學(xué)或CCP4(英國生物技術(shù)和生物科學(xué)研究委員會，SERC))計算結(jié)晶中與結(jié)晶中的蛋白質(zhì)偶聯(lián)的重金屬原子位置，或用其它類似衍射數(shù)據(jù)分析程序測定初始相，其中使用了更精確的重原子位置參數(shù)。根據(jù)溶劑矯平法和使用DM程序(CCP4軟件包)或類似的相改進(jìn)程序(電子密度改進(jìn)程序)的直方圖配合法進(jìn)行逐漸從低解析度到高解析度的相延伸計算，改進(jìn)得到的初始相，其中去氨甲酰酶結(jié)晶的溶劑區(qū)是30-50％，優(yōu)選35％。在蛋白質(zhì)結(jié)晶中，蛋白質(zhì)以外的溶劑分子(大部分是水分子)占了30-60％體積。本文中溶液中被溶劑分子占的體積稱為“溶劑區(qū)”。通常當(dāng)?shù)玫降牡鞍踪|(zhì)結(jié)晶具有非晶體學(xué)對稱性時，可以進(jìn)行電子密度中和(稱為非晶體學(xué)對稱(NCS)中和)提高相可靠性。從結(jié)晶密度測量的結(jié)果已知去氨甲酰酶結(jié)晶在一個非對稱單元中含有兩個分子。推斷結(jié)晶中的氨甲酰酶分子具有非晶體學(xué)的雙重軸?；谠谑褂萌軇┏C平法和限定重原子坐標(biāo)后計算的電子密度圖，計算出含有平移和旋轉(zhuǎn)的非晶體學(xué)對稱母體。同時，從溶劑矯平法獲得的電子密度圖中鑒定出一個區(qū)域，其中存在稱為屏蔽的蛋白質(zhì)分子。用程序DM等，使用非晶體學(xué)對稱母體和屏蔽進(jìn)行NCS平均計算，從而獲得更可靠的位相和用于構(gòu)建立體結(jié)構(gòu)模型的電子密度圖。
可用基于根據(jù)下列方法在三維圖像上顯示電子密度圖的程序O(A，Jones，Uppsala Universitet，Sweden)構(gòu)建去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)模型。首先，在電子密度圖上找到多個具有特征氨基酸序列(如含有色氨酸殘基的部分序列)的區(qū)域。接著，用程序O在三維圖上構(gòu)建與其電子密度相對應(yīng)的氨基酸殘基的部分結(jié)構(gòu)，同時參考建立的區(qū)域用作起始點的氨基酸序列。該方法依次重復(fù)，從而將所有去氨甲酰酶的氨基酸殘基與相關(guān)電子密度匹配。結(jié)果，構(gòu)建了整個分子的原始立體結(jié)構(gòu)模型。根據(jù)結(jié)構(gòu)精制程序XPLOR(A.T.Brunger，Yale University)的精制方法，精制用作起始模型結(jié)構(gòu)的構(gòu)建起來的立體結(jié)構(gòu)模型，從而精制了描述立體結(jié)構(gòu)的三維坐標(biāo)?？捎梅肿犹鎿Q法，使用得到的EMTS衍生結(jié)晶計算起始位相，并進(jìn)行上述程序，即電子密度改進(jìn)、模型構(gòu)建和結(jié)構(gòu)精制確定去氨甲酰酶的天然結(jié)晶(如SEQ ID NO1所示的去氨甲酰酶)和去氨甲酰酶突變體的天然結(jié)晶(如具有SEQ ID NO2所示序列的去氨甲酰酶突變體)的立體結(jié)構(gòu)。對此，完成了對本發(fā)明去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)的確定。可將這樣確定的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)與在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中注冊的各種蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)(包括具有與去氨甲酰酶類似功能的酶)比較，該數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的公眾數(shù)據(jù)庫。催化與去氨甲酰酶類似的去氨甲?；磻?yīng)的N-氨甲酰-肌氨酸-酰胺水解酶(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫ID1NBA)的立體結(jié)構(gòu)是已知的。然而，不認(rèn)為去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)與該酶的立體結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)相似性。在立體結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中注冊的蛋白質(zhì)中，青霉素?；?1PNK)、葡糖胺-6-磷酸合成酶(1GDO)、谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸氨化酶(1ECF)、蛋白體(1PMA)等具有所謂的四層夾心結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋與稱為結(jié)構(gòu)域的立體結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)中兩個β-折疊的夾心結(jié)構(gòu)對側(cè)緊密接觸，表明了與去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)的相似性。然而，這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-鏈的拓?fù)鋵W(xué)，即蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)的排列不同(T.P.Flores等(1994，Prot.Eng.7，31-37))。換言之，去氨甲酰酶的特征是在β-折疊結(jié)構(gòu)中具有平行的β-鏈(
圖1)。另外，去氨甲酰酶具有新的4層夾心結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)，因此本文所用的術(shù)語“拓?fù)鋵W(xué)”指蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)單元的排列或空間結(jié)構(gòu)構(gòu)型。
本文所用的術(shù)語“螺旋”指螺旋結(jié)構(gòu)，它是蛋白質(zhì)或肽的二級結(jié)構(gòu)之一，也是能量最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)之一，其中每3.6個氨基酸殘基構(gòu)成1圈，螺距是5.4?？赡苄纬搔?螺旋的氨基酸的例子包括谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸和亮氨酸。相反，不大可能形成α-螺旋的氨基酸的例子包括纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸。本文所用的術(shù)語“β-折疊”指蛋白質(zhì)或肽的二級結(jié)構(gòu)之一，其中具有鋸齒構(gòu)型的兩條或多條多肽鏈平行排列成片層，其中肽的酰氨基和羰基與相鄰肽的羰基和酰氨基分別形成氫鍵，是能量穩(wěn)定的。術(shù)語“平行β-折疊”是一類β-折疊，其中相鄰多肽鏈的氨基酸序列具有相同的方向。術(shù)語“反平行β-折疊”指一類β-折疊，其中相鄰的氨基酸序列方向相反。本文所用的術(shù)語“β-鏈”指構(gòu)成β-折疊的一條肽鏈，它具有曲折構(gòu)型。
發(fā)現(xiàn)含有約30個殘基(SEQ ID NO1或2中約280位的氨基酸到303位的羧基末端)的去氨甲酰酶的羧基端區(qū)與分子間相互作用形成二聚體有關(guān)。另外，在進(jìn)行此研究的去氨甲酰酶結(jié)晶中，二聚體由于分子間相互作用形成四聚體。去氨甲酰酶的四層夾心結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)具有4個α-螺旋和12條β-鏈。表1顯示了所有二級結(jié)構(gòu)單元。
表1
去氨甲酰酶的二級結(jié)構(gòu)單元

下文將總結(jié)本發(fā)明去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)的特征。
(1)稱為四層夾心的結(jié)構(gòu)，其中兩個α-螺旋與兩個由6條β-鏈構(gòu)成的β-折疊的夾心各條對邊緊密接觸(
圖1和2)。在
圖1中，從氨基端開始第1、3、5和6位處的4個α-螺旋與β-折疊緊密接觸(下文稱為α1、α3、α5和α6)。
(2)β-折疊主要由6條平行β-鏈構(gòu)成，具有在立體結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)中未觀察到的朝向(
圖1)。
(3)作為催化酶反應(yīng)的氨基酸殘基，含有一個半胱氨酸殘基、兩個谷氨酸殘基、一個賴氨酸殘基、一個組氨酸殘基和兩個精氨酸殘基。存在具有底物結(jié)合性的活性位點(圖3)，這是已知立體結(jié)構(gòu)的酶中沒有的(圖4)。
(4)約30個殘基的羧基末端區(qū)起到了通過分子間相互作用形成二聚物的作用。
上述立體結(jié)構(gòu)的具體坐標(biāo)數(shù)據(jù)已作為化合物N-氨基甲?；?D-氨基酸酰胺水解酶，實驗方法X-光衍射(Acc.No1ERZ)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB由結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究聯(lián)合實驗室(RCSB)運行)注冊。數(shù)據(jù)在本文中引入以供參考。
已完成本發(fā)明的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)的確定，其中可推測與催化活性有關(guān)的酶的氨基酸殘基；用分子建模技術(shù)可輕易的構(gòu)建酶的立體結(jié)構(gòu)和酶獲得的與底物(如D-N-氨甲?；?羥基苯基甘氨酸)結(jié)合的復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)模型(Swiss-PDBViewer(上述)、Autodock(OxfordMolecular)，Guex，N.和Peitsch，M.C.(1997)SWISS-MODEL和Swiss-PDBViewer比較蛋白質(zhì)建模的環(huán)境，Electrophoresis18，2714-2723；Morris，G.M.等，J.Computational Chemistry，191639-1662，1998；Morris，G.M.等，J.Computer-Aided Molecular Design，10，294-304，1996；Goodsell，D.S.等，J.Mol.Recognition，91-5，1996)?？捎昧Ⅲw結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)模型，在某種程度上建立與存在于催化反應(yīng)的活性位點的氨基酸殘基和活性位點反應(yīng)機(jī)制有關(guān)的結(jié)構(gòu)。去氨甲酰酶的活性位點由一個腔構(gòu)成，該腔由氨基酸殘基Glu46、Lys126、His143、Glu145、Cys171、Arg174和Arg175(圖4)構(gòu)成。比較氨基酸序列與去氨甲酰酶的序列相似性弱的酶(如酰胺酶和腈水解酶)，對由此發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸殘基進(jìn)行分析，提示Glu46、Lys126、Glu145和Cys171與催化反應(yīng)密切相關(guān)。特別是，預(yù)期Cys171是與形成酶反應(yīng)中間物的?；虚g物有關(guān)的主要催化殘基(圖3)，提示去氨甲酰酶是半胱氨酸水解酶。該發(fā)現(xiàn)符合Cys171到Ser171的突變導(dǎo)致催化活性喪失的實驗事實(R.Grifantini等(1996)J.Biol.Chem.271，9326-9331)。認(rèn)為Arg174和Arg175的作用是使D-N-α-氨甲酰氨基酸底物的羧基基團(tuán)由于靜電作用而穩(wěn)定。
基于立體結(jié)構(gòu)上的這些發(fā)現(xiàn)，可修飾去氨甲酰酶改進(jìn)去氨甲酰酶的穩(wěn)定性或酶活性。本文所用的術(shù)語酶的“穩(wěn)定性”指即使酶在高于生物的通常環(huán)境的溫度下(如70℃)變性后，酶活性仍有熱變性前的至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％?？捎忙m(熱變性溫度差)測量穩(wěn)定性的進(jìn)步。本文所用的術(shù)語“酶活性”指當(dāng)提到去氨甲酰酶時，將D-N-氨甲酰-α-氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)D-α-氨基酸的活性。
本文所用的術(shù)語突變分子的“設(shè)計方法”或“分子設(shè)計技術(shù)”指分析突變前蛋白質(zhì)或多肽分子(如天然存在的分子)的蛋白質(zhì)或多肽分子的氨基酸序列和立體結(jié)構(gòu)，預(yù)測各氨基酸的特征(如催化活性和與其它分子的相互作用)，然后計算適合所需特征改變的氨基酸突變(如催化反應(yīng)性的改進(jìn)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改進(jìn))。設(shè)計方法優(yōu)選用計算機(jī)進(jìn)行。用于設(shè)計方法的計算機(jī)程序的例子包括本文提到的X-光衍射數(shù)據(jù)處理程序DENZO(McScience)，作為分析結(jié)構(gòu)的程序；PHASES(Univ.ofPennsylvania，PA，USA)，作為確定相的數(shù)據(jù)；程序DM(CCP4包，SERC)，作為改進(jìn)初始位相的程序；程序O(Uppsala Universitet，Uppsala，Sweden)，作為獲得三維圖像的程序；XPLOR(Yale University，CT，USA)，作為精制立體結(jié)構(gòu)的程序；和Swiss-PDBViewer(上述)，作為突變引入建模的程序。
本文所用的用于突變體設(shè)計的氨基酸例子包括氨基酸添加、缺失或修飾，以及氨基酸取代。氨基酸取代指原始肽的一個或多個氨基酸(如1-20個氨基酸，優(yōu)選1-10個氨基酸和更優(yōu)選1-5個氨基酸)被相同數(shù)目的氨基酸取代。氨基酸添加指一個或多個氨基酸(如1-20個氨基酸，優(yōu)選1-10個氨基酸，更優(yōu)選1-5個氨基酸)加入原始肽鏈。氨基酸缺失指原始肽上一個或多個氨基酸(如1-20個氨基酸，優(yōu)選1-10個氨基酸，更優(yōu)選1-5個氨基酸)的缺失。氨基酸修飾包括但不限于酰胺化、羧化、硫化、鹵化、?；?如乙酰化)等。要取代或加入的氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，或氨基酸類似物。天然存在的氨基酸是優(yōu)選的。
術(shù)語“天然存在的氨基酸”指天然存在的氨基酸的L-異構(gòu)體。天然存在的氨基酸的例子指甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。除非另外說明，本文的所有氨基酸是L-異構(gòu)體。
術(shù)語“非天然存在的氨基酸”指在天然存在的蛋白質(zhì)中通常不存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸的例子包括正亮氨酸、對硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、對氟苯丙氨酸、3-氨基-2-芐基丙酸、D-或L-高精氨酸和D-苯丙氨酸。
術(shù)語“氨基酸類似物”指一個非氨基酸，但具有與氨基酸類似的物理性質(zhì)和/或功能的分子。氨基酸類似物的例子包括乙硫氨酸、刀豆氨酸、2-甲基谷氨酰胺等。
在本發(fā)明的其它實施方案中，去氨甲酰酶突變體可以是肽鹽的形式，如銨鹽(烷基或芳基銨鹽)、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫代硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、苯甲酸鹽、磺酸鹽、硫代磺酸鹽、甲磺酸鹽(甲基磺酸鹽)、乙磺酸鹽和苯磺酸鹽。
下文中將討論蛋白質(zhì)中用于產(chǎn)生突變體的氨基酸突變。氨基酸取代的方法等包括但不限于用化學(xué)合成或遺傳工程改變密碼子(編碼氨基酸序列的DNA序列)。
可用另一個氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(如催化區(qū)或底物分子結(jié)合位點)中取代某個氨基酸，而不明顯降低或喪失相互作用的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)的某種生物功能是由蛋白質(zhì)的相互作用活性或性質(zhì)確定的。因此，可在氨基酸序列或在DNA編碼序列水平進(jìn)行特定氨基酸取代，以產(chǎn)生在取代后維持原始性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此，本文公開了各種肽修飾，可產(chǎn)生編碼這些肽的DNA，而不明顯喪失生物有用性。
當(dāng)設(shè)計了上述修飾，可考慮氨基酸疏水性指標(biāo)。疏水性氨基酸指標(biāo)在對蛋白質(zhì)提供具有相互作用的生物功能的蛋白質(zhì)上起到了重要作用，此點是本領(lǐng)域普遍認(rèn)可的(Kyte，J.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Biol.157(1)105-132，1982)。氨基酸的疏水性對產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)起作用，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和其它分子(如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等)之間的相互作用?；诟靼被岬氖杷院蛶щ娦再|(zhì)，各有如下的疏水性指標(biāo)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
眾所周知，如果某些氨基酸被另一種具有相似疏水指數(shù)的氨基酸取代，得到的蛋白質(zhì)將仍然具有與原始蛋白質(zhì)(如具有相當(dāng)酶活性的蛋白質(zhì))類似的生物功能。對于這樣的氨基酸取代，疏水指數(shù)優(yōu)選是±2以內(nèi)，更優(yōu)選±1以內(nèi)，甚至更優(yōu)選±0.5以內(nèi)。本領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)，這種基于疏水性的氨基酸取代是有效的。如美國專利號4,554,101中所述，給予氨基酸殘基如下親水性指數(shù)精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1. 5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)?？梢岳斫?，用另一個具有相似親水指數(shù)的氨基酸取代一個氨基酸時，仍能提供生物等價物。對于這種氨基酸取代，親水指數(shù)優(yōu)選在±2以內(nèi)，更優(yōu)選±1，甚至更優(yōu)選±0.5。
本文所用的術(shù)語“保守取代”指氨基酸取代，其中被取代的氨基酸和取代的氨基酸具有相似親水指數(shù)或/和疏水指數(shù)。保守取代的例子包括但不限于下列各組中的取代精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，它們都是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。
從立體結(jié)構(gòu)獲得的催化反應(yīng)機(jī)制的信息對于針對酶的比活力的改進(jìn)和優(yōu)化反應(yīng)最適pH的分子設(shè)計是非常有用的。在本發(fā)明中，通過改變?nèi)グ奔柞Ｃ窩ys171的側(cè)鏈巰基(SH)的pKa，可設(shè)計導(dǎo)致比活力和最適pH改變的氨基酸突變。特別是可通過計算蛋白質(zhì)的靜電勢估計SH基團(tuán)pKa上的氨基酸突變作用(Takahashi等，(1992)，Biopolymers 32，897-909)，因此可能設(shè)計合適的氨基酸突變。例如，使Cys171硫原子周圍的靜電場更加陽性的突變，促進(jìn)Cys171硫醇基團(tuán)(SH)的分離，而對Glu46和/或Glu145側(cè)鏈羧基周圍的靜電場基本沒有影響的突變是優(yōu)選的。
關(guān)于本發(fā)明去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)，推斷去氨甲酰酶中存在的5個半胱氨酸與其功能和物理性質(zhì)有關(guān)，如催化活性和對空氣氧化的抗性?？紤]到去氨甲酰酶的半胱氨酸殘基的作用，結(jié)合氨基酸突變、變性劑和Cys修飾劑，對上述細(xì)菌(土壤桿菌712(Kaneka菌))的去氨甲酰酶的高水平序列同源性的不同細(xì)菌(放射形土壤桿菌NRRL B11291)(R.Grifantini等，(1996)，J.Biol.Chem.271，9326-9331)進(jìn)行了研究。在該研究中，5個半胱氨酸殘基與二硫鍵的形成無關(guān)，用Ser取代對應(yīng)于Cys171的Cys172，使衍生自放射形土壤桿菌NRRL B11291的去氨甲酰酶的催化活性喪失，但其它半胱氨酸取代不影響。推斷Cys171對催化活性是必須的。相應(yīng)的半胱氨酸殘基在其它類似酶中是保守的事實也強(qiáng)烈的提示了這一點。本文所用的術(shù)語“相應(yīng)氨基酸”指某種蛋白質(zhì)分子或多肽分子的氨基酸，它具有(或預(yù)期具有)與用作比較參照的蛋白質(zhì)或肽中預(yù)定氨基酸相似的功能，特別是在酶分子中的處于活性位點相似處的具有對催化活性相似的作用的氨基酸。
在具有SEQ ID NO1和2的氨基酸序列的去氨甲酰酶中，推斷Cys192和Cys249不太可能被修飾，它們被包埋在分子內(nèi)，而Cys242和Cys278可被容易地用化學(xué)方法修飾，它們位于分子表面環(huán)結(jié)構(gòu)部分中。用丙氨酸取代對應(yīng)于SEQ ID NO1的Cys242和Cys278的放射形土壤桿菌NRRL B11291的兩個半胱氨酸殘基(Cys243和Cys279)，獲得了具有改進(jìn)穩(wěn)定性的突變體(待審日本專利公開出版物號8-84584)。如上所述，從立體結(jié)構(gòu)確定Cys242和Cys278存在于分子表面，提示這些Cys殘基與去氨甲酰酶對空氣氧化的抗性有關(guān)。推斷包埋在分子內(nèi)的Cys192和Cys249對空氣氧化的抗性改善不起大作用。另外，通過用具有大體積的疏水氨基酸殘基取代Cys192和Cys249，補償分子內(nèi)側(cè)鏈體積或腔，得到的去氨甲酰酶突變體具有針對熱或有機(jī)溶劑的改進(jìn)的穩(wěn)定性。
可考慮不僅半胱氨酸殘基，而且甲硫氨酸殘基也與去氨甲酰酶由于空氣氧化的酶活性下降和穩(wěn)定性的保持性下降有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)，在去氨甲酰酶9個甲硫氨酸殘基中，有5個完全包埋在分子內(nèi)，而兩個殘基完全暴露在分子外側(cè)(Met238和Met243)，存在于轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)部分。推斷這兩個殘基與去氨甲酰酶空氣氧化抗性關(guān)系更大。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)”或“β轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)”指由3個或多個氨基酸構(gòu)成的局部結(jié)構(gòu)，其中肽主要鏈的延伸方向在立體結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)之間有很大改變。另外，Met4和Met72環(huán)繞分子表面，基本包埋在分子內(nèi)，但位于導(dǎo)致其與溶劑分子等容易接觸的位置。因此，這些似乎與去氨甲酰酶對空氣氧化的抗性有關(guān)。基于這些結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，可設(shè)計預(yù)期提高去氨甲酰酶對空氣氧化抗性的其它氨基酸取代。特別是用疏水氨基酸殘基取代Met4和Met72，這些疏水取代基補償了側(cè)鏈體積或分子中的腔，不被空氣氧化，從而使得到的突變體具有改進(jìn)的抗性。Met238和Met243完全暴露于分子外側(cè)。因此，優(yōu)選用不被空氣氧化的中性或親水氨基酸取代這些殘基，可改善抗性。另外從Met238到Met243的去氨甲酰酶轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)部分含有易被空氣氧化的Cys242。通過產(chǎn)生三突變體(其中這三個殘基被合適的氨基酸取代)，或產(chǎn)生某個突變體(其中含有三個殘基的轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)缺失)，可改進(jìn)對空氣氧化的抗性。另外，通過用另一種β-轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)替換含有這些殘基的轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)序列，可改善對空氣氧化的抗性。當(dāng)設(shè)計半胱氨酸和甲硫氨酸突變體時，可通過在計算機(jī)上用其它氨基酸取代這些氨基酸，來分析與突變體穩(wěn)定性有關(guān)的結(jié)構(gòu)能量。
除了半胱氨酸和甲硫氨酸殘基以外，可著重于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，例如，補償分子內(nèi)空腔(如在去氨甲酰酶氨基酸Asn92周圍形成的腔)的氨基酸突變，和能量(例如去氨甲酰酶氨基酸Pro203和Val236)，以及α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化的眾所周知的因素進(jìn)行設(shè)計。
作為與上述通過氨基酸突變的修飾設(shè)計不同的設(shè)計策略，刪去推測與去氨甲酰酶的酶活性無關(guān)的區(qū)域，將去氨甲酰酶改變成分子量更小的酶。從而可能提高穩(wěn)定性。例如，可刪去遠(yuǎn)離活性位點的一部分或整個環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)，導(dǎo)致更緊密壓縮的去氨甲酰酶。另外，本發(fā)明的發(fā)明人推測去氨甲酰酶的一個區(qū)域(從羧基端起30個殘基)與二聚物的形成有關(guān)。推測當(dāng)去氨甲酰酶在一般緩沖液中顯示催化能力時，去氨甲酰酶存在的形式是二聚物或四聚物。推測單體蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)變性狀態(tài)恢復(fù)過程中更有利。如果二聚物的形成受到缺少一部分或整個羧基端區(qū)域(30個殘基)的限制，可制備穩(wěn)定的單體。從工業(yè)觀點看，可作為所謂的固定酶(其中去氨甲酰酶被固定在載體上)利用。而且，在這種情況下，一個單體可以更有效的被固定。
可用許多上述方法以外的方法設(shè)計或制備本發(fā)明的去氨甲酰酶突變體。例如，可用寡核苷酸特異性誘變或其它常規(guī)技術(shù)手段(缺失)在用本發(fā)明鑒定為突變所需的位點使具有去氨甲酰酶活性的酶序列突變。另外，可通過用非天然存在的氨基酸位點專一性取代特定氨基酸，制備突變體。例如，可通過用硒代半胱氨酸或硒代甲硫氨酸取代特定的半胱氨酸或甲硫氨酸殘基制備去氨甲酰酶突變體。此點可通過在培養(yǎng)基上培養(yǎng)能表達(dá)野生型多肽或突變多肽的宿主生物體實現(xiàn)，該培養(yǎng)基的天然存在的半胱氨酸和/或甲硫氨酸已被耗盡，而硒代半胱氨酸和/或硒代甲硫氨酸已被強(qiáng)化。當(dāng)使用同源重組法時，用合成寡核苷酸將突變引入編碼去氨甲酰酶的DNA序列。這種寡核苷酸含有與所需突變位點鄰接的核苷酸序列?？稍谌グ奔柞Ｃ傅娜LDNA序列或任何編碼其片段多肽的序列中制備突變。
根據(jù)本發(fā)明用上述方法或其它本領(lǐng)域已知的方法制備的突變?nèi)グ奔柞Ｃ傅腄NA序列可用表達(dá)載體表達(dá)。如本領(lǐng)域熟知的，表達(dá)載體通常含有能在宿主細(xì)胞中不依賴宿主基因組而自身復(fù)制的因素，并含有一個或多個篩選用的表型標(biāo)記。在圍繞所需去氨甲酰酶突變體編碼序列的DNA序列插入位點前后，表達(dá)載體還含有啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點、翻譯起始信號和如需要，抑制蛋白基因或各種激活蛋白基因，和編碼終止信號的調(diào)控序列。在一些實施方案中，當(dāng)要分泌需要產(chǎn)生的突變體時，編碼“信號序列”的核苷酸可插入去氨甲酰酶突變體編碼序列前。為了在調(diào)控序列控制下表達(dá)，所需DNA序列須與調(diào)控序列可操縱地連接。特別是，在調(diào)控序列控制下的去氨甲酰酶突變體編碼序列必須有起始信號(即ATG)，來維持合適的閱讀框，以便使該序列產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物。
各種各樣熟知的表達(dá)載體都能用于表達(dá)編碼本發(fā)明突變的去氨甲酰酶的序列。這包括已知細(xì)菌質(zhì)粒(如pBR322)，范圍更廣泛的質(zhì)粒(如RP4、噬菌體DNA)，2μ質(zhì)?；蚪湍纲|(zhì)粒及其衍生物，和含有染色體DNA序列片段的載體，非染色體DNA序列，和合成的DNA序列，如質(zhì)粒和噬菌體DNA獲得的組合載體。
任何各式各樣的調(diào)控序列(當(dāng)與DNA序列可操縱性連接，可調(diào)節(jié)DNA序列的表達(dá))可用于載體內(nèi)。這些有用的表達(dá)調(diào)控序列的例子包括其它已知調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)的序列及其組合。
各式各樣的宿主物種可用于產(chǎn)生本發(fā)明的去氨甲酰酶突變體。這些宿主的例子包括細(xì)菌(如大腸桿菌、桿菌和鏈霉菌)、真菌(如酵母)、動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)、植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
應(yīng)理解不是所有的表達(dá)載體和系統(tǒng)都以相同方法表達(dá)本發(fā)明的突變DNA序列，產(chǎn)生去氨甲酰酶突變體。不是所有的宿主在相同表達(dá)系統(tǒng)中功能都相同。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的載體、表達(dá)調(diào)控序列和宿主，而不用進(jìn)行過度實驗，或違背本發(fā)明的范圍。
例如，在篩選中可考慮載體的復(fù)制能力。在篩選表達(dá)調(diào)控序列中必須考慮各種因素。這些例子包括系統(tǒng)的相對強(qiáng)度、調(diào)節(jié)能力、和與編碼本發(fā)明的去氨甲酰酶突變體的DNA序列的兼容性。特別是應(yīng)考慮可能的二級結(jié)構(gòu)的兼容性。選擇宿主時，應(yīng)考慮所選載體，去氨甲酰酶突變體對宿主的毒性，分泌成熟產(chǎn)品的能力，折疊蛋白的能力和形成合適的高級結(jié)構(gòu)，發(fā)酵要求，從宿主純化去氨甲酰酶突變體的容易程度和安全性。在這些參數(shù)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇各種載體/表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)/宿主組合，以便產(chǎn)生有用量的突變?nèi)グ奔柞Ｃ浮?br> 可用純化具有去氨甲酰酶活性的天然存在的酶的各種常規(guī)方法，純化這些系統(tǒng)或其它系統(tǒng)產(chǎn)生的去氨甲酰酶突變體。
一旦在所需位置(如活性位點，與穩(wěn)定性有關(guān)的位點或結(jié)合位點等)建立去氨甲酰酶突變體，可對得到的突變體的各種所需特征進(jìn)行測試。
例如，可用生理pH下突變體電荷改變篩選突變體。測量去氨甲酰酶突變體的等電點(pI)，同時將其與突變前的等電點比較確定電荷改變。根據(jù)Wellner，D.，Analyt.Chem.，43，p.597(1971)所述的方法用凝膠電泳測量等電點。具有改變的表面電荷的去氨甲酰酶蛋白質(zhì)是pI被取代于酶表面的氨基酸所改變(根據(jù)本發(fā)明結(jié)構(gòu)信息提供)的突變體。
另外，可與天然去氨甲酰酶相比較以篩選比活力高的突變體。通過例如測量其用本文所述的試驗(見下文實施例7)將D-N-氨甲酰酶-α-氨基酸轉(zhuǎn)化成D-α-氨基酸的能力確定突變體去氨甲酰酶的活性。
可用本發(fā)明去氨甲酰酶突變體產(chǎn)生的D-α-氨基酸作為藥物中間物(如D-苯基甘氨酸和D-對羥基苯基甘氨酸)制造藥物(如合成的青霉素和合成的頭孢菌素)。還可用本發(fā)明提供含有如此產(chǎn)生的藥物的藥物組合物。該藥物組合物可含有藥物學(xué)上可接受的輔助成分，包括賦形劑、穩(wěn)定劑、載體等。
利用本發(fā)明的去氨甲酰酶突變體產(chǎn)生的D-α-氨基酸可用作肽中間物(如D-纈氨酸)，制備殺蟲劑(如氟胺氰菊酯)。還可根據(jù)本發(fā)明提供含有如此制備的殺蟲劑的殺蟲劑組合物。殺蟲劑組合物可含有農(nóng)業(yè)上可接受的輔助成分，包括賦形劑、穩(wěn)定劑、載體等。
利用本發(fā)明的去氨甲酰酶突變體產(chǎn)生的D-α-氨基酸可用作食品添加劑中間物(如D-丙氨酸和D-天冬氨酸)生產(chǎn)食品衍生物(如天門冬酰丙氨酸酯)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可設(shè)計和生產(chǎn)去氨甲酰酶突變體及其類似的酶的抑制劑?？捎萌グ奔柞Ｃ傅慕Y(jié)構(gòu)信息設(shè)計這些抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)使用例如Segel，I.H.，Enzyme Kinetics，J.Wiley & Sons(1975)的標(biāo)準(zhǔn)公式的計算機(jī)兼容酶反應(yīng)動力學(xué)數(shù)據(jù)，鑒定出競爭性、反競爭性或非競爭性抑制劑。另外，可用去氨甲酰酶或其類似酶的反應(yīng)中間物的信息(如底物或反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu))設(shè)計抑制劑。該信息可用于設(shè)計已知化合物的改進(jìn)類似物(它們可作為已知去氨甲酰酶或其酶的抑制劑)和一類新的抑制劑。
在本發(fā)明的還有一個實施方案中，可利用本發(fā)明去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)修飾具有與去氨甲酰酶類似的氨基酸序列的多肽酶或蛋白質(zhì)酶(如酰胺酶或氰水解酶)。這種修飾可用類似于上述突變體設(shè)計的方法進(jìn)行?！邦愃贫嚯拿富虻鞍踪|(zhì)酶”最好具有一氨基酸序列，該序列與SEQ ID NO1或2代表的去氨甲酰酶的氨基酸序列在全長氨基酸序列中，代表性的具有至少30％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少80％，更具體的，在限定去氨甲酰酶活性位點的區(qū)域內(nèi)(氨基酸號范圍是38-49、108-127、143-148和164-177，包括SEQ ID NO1或2中的氨基酸Glu46、Lys126、Glu145和Cys171)代表性地具有至少60％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選90％，甚至更優(yōu)選95％氨基酸序列相同性。
對于用與某種酶類似的酶的立體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變其特征的例子，有一個研究，其中利用異青霉素合成酶的類似立體結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化稱為擴(kuò)張酶的底物專一性。見國際出版物WO97/02005。據(jù)其記載，將異青霉素合成酶，該酶已測定了立體結(jié)構(gòu)(Roach(1995)，Nature，375，700-704)和擴(kuò)張酶，該酶的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)類似于合成酶并被認(rèn)為有類似的立體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了彼此比較，比較了它們的序列，從而鑒定出與底物識別有關(guān)的擴(kuò)張酶的氨基酸序列，并通過使這些氨基酸殘基突變，將擴(kuò)張酶的底物特異性轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生可對青霉素G作用的突變酶。
可用例如下列序列分析工具FASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman，PNAS85，2444-2448(1988))；BLAST(S.F.Altschul，T.L.Madden，A.A.Schaffer，J.-H.，Zhang，Z.Zhang，W.Miller，和D.J.Lipman(1997)Nucl.Acids.Res.253389-3402(1997))；基于Unix的GCG Wisconsin package(Wisconsin Package的程序菜單，第8版，1994年9月，Genetics Computer Group，575 Science DriveMadison，Wisconsin，USA 53711；Rice，P.(1996)EGCG軟件包的程序菜單，PeterRice，The Sanger Centre，Hinxton Hall，Cambridge，CB101RQ，England)和ExPASy萬維網(wǎng)分子生物學(xué)服務(wù)器(Geneva University Hospital and Universityof Geneva，Geneva，Switzerland)和MacVector 6.0(Teijin System Technology)計算氨基酸序列相同性的相似之處。
根據(jù)本發(fā)明，可利用上述方法提供具有與去氨甲酰酶類似的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)酶。例如可用這些突變體在生物反應(yīng)器中代替其野生型酶。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用計算機(jī)設(shè)計去氨甲酰酶突變體的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用X-光晶體照像術(shù)確定具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)的方法，和基于確定的立體結(jié)構(gòu)，設(shè)計具有改進(jìn)的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體的方法。可用本領(lǐng)域已知的計算機(jī)系統(tǒng)(如本文所述的本領(lǐng)域已知的系統(tǒng))構(gòu)建本發(fā)明的計算機(jī)系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，還可提供計算機(jī)可讀記錄介質(zhì)，其中記錄了上述分子(如去氨甲酰酶)立體結(jié)構(gòu)的三維坐標(biāo)數(shù)據(jù)和/或分子設(shè)計和/或修飾方法。計算機(jī)可讀介質(zhì)的例子包括磁帶、磁盤(如軟盤)、光磁盤(如MO)和光盤(如CD-ROM、CD-R、CD-RW和DVD-ROM)。在一個實施方案中，這些計算機(jī)可讀記錄介質(zhì)可以是計算機(jī)記錄介質(zhì)，其中有執(zhí)行去氨甲酰酶突變體的設(shè)計過程的程序。此時，設(shè)計方法可包括步驟輸入用X-光晶體照像術(shù)測定的、具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶數(shù)據(jù)，基于確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改進(jìn)的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種記錄介質(zhì)，其中數(shù)據(jù)描述去氨甲酰酶突變體的立體結(jié)構(gòu)。就此，可用一種方法獲得突變體的立體結(jié)構(gòu)，該方法包括步驟輸入X-光晶體照像術(shù)確定的具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶數(shù)據(jù)，和根據(jù)確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改進(jìn)的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。
將用下列實施例更詳細(xì)的描述本發(fā)明。提供這些實施例是為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明。
實施例除非另外說明，從Nacalai Tesque，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，或SIGMA(St.Louis，MO，USA)獲得了下列實施例中使用的試劑。
實施例1 去氨甲酰酶天然結(jié)晶的制備用已知方法獲得去氨甲酰酶(見H.Nanba等，Biosci.Biotechnol.Biochem.62，875-881(1998)。制備濃度為10-20毫克/毫升的去氨甲酰酶溶液(0.001M HEPES緩沖液，pH7.5)。在液滴臺上混合10微升去氨甲酰酶溶液和10微升作為沉淀劑，含有15-20％重量的聚乙二醇6000(Nacalai Tesque制造)和0.2M氯化鋰的0.1MHEPES緩沖液(pH7.5，SIGMA制造)。密封300微升具有上述沉淀劑組分的溶液作為儲液，用蒸汽擴(kuò)散法在20-25℃進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶開始2天到2周后，結(jié)晶長到0.3×0.3×0.1毫米到0.6×0.6×0.3毫米大小。
實施例2 去氨甲酰酶重原子衍生結(jié)晶的制備在顯微鏡下從液滴臺上的小液滴中移出實施例1獲得的天然結(jié)晶。將天然結(jié)晶浸在含有20重量％聚乙二醇6000(Nacalai Tesque制造)和0.2M氯化鋰(制備成具有0.5-1.0mM EMTS(乙基汞硫代水楊酸鈉)濃度(EMTS是汞化合物))的0.1MHEPES緩沖液(pH7.5)過夜，制備重原子衍生物。
實施例3 凍結(jié)去氨甲酰酶結(jié)晶從結(jié)晶的液滴中回收實施例1和2制備的去氨甲酰酶的天然結(jié)晶和重原子衍生結(jié)晶，直接浸在液氮中，不加冷凍穩(wěn)定劑，如甘醇。
實施例4 收集去氨甲酰酶結(jié)晶的X-光衍射數(shù)據(jù)為了進(jìn)行多波長反常色散法分析，在發(fā)射光設(shè)備Spring-8中獲得了衍射數(shù)據(jù)。用在液氮中冷凍的EMTS衍射結(jié)晶進(jìn)行這種測量。為了測量，使用三種波長(0.98、1.00和1.27)，考慮汞的異常色散。三種波長的衍射數(shù)據(jù)都從一粒結(jié)晶收集。用數(shù)據(jù)處理程序DENZO(McScience)處理獲得的53幅衍射圖像數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示于表2。用1.00波長以冷凍形式測量去氨甲酰酶的天然結(jié)晶，以獲得衍射數(shù)據(jù)，結(jié)果示于表3。見“X線解析入門”(Masao Kakuto等，Tokyo Kagaku Dojin)中例如獨立反射性、晶格常數(shù)等的術(shù)語。
表2去氨甲酰酶EMTS衍生結(jié)晶的處理衍射數(shù)據(jù)的結(jié)果

R-合并表示多幅測量的圖之間的誤差。
表3去氨甲酰酶天然結(jié)晶的處理衍射數(shù)據(jù)的結(jié)果

R-合并表示多幅測量的圖之間的誤差。
實施例5 重原子坐標(biāo)和位相改進(jìn)的測定在用EMTS衍生晶體獲得的三種波長衍射數(shù)據(jù)中，推測1.00是天然結(jié)晶的數(shù)據(jù)，0.98的數(shù)據(jù)是反常數(shù)據(jù)，1.27的數(shù)據(jù)是同形數(shù)據(jù)。計算差分Patterson函數(shù)和反常差分Patterson函數(shù)，繪出Harker投影(稱為差分Patterson圖，圖5-7)。嘗試從Harker投影上的高強(qiáng)度峰位置和對應(yīng)于交叉載體的顯著峰位置鑒定出重原子位置。從兩張差分Patterson圖(在1.00-0.98和1.00-1.27之間)選出各Harker投影上具有高強(qiáng)度的Patterson峰，鑒定兩個汞原子(汞1和汞2)，計算其坐標(biāo)。為了確定，首先僅用汞1的坐標(biāo)計算位相，然后用該位相通過差分Fourier計算計算汞2的坐標(biāo)。然后測定是否在差分Patterson圖中有沒有來自汞2的峰和汞1-汞2交叉峰。為了找到其它結(jié)合汞原子的位置，精練重原子位置參數(shù)，用汞1和2的坐標(biāo)進(jìn)行位相計算。用差分Fourier計算計算汞原子的位置。用鑒定汞2時類似的方式確定自身峰和交叉峰。結(jié)果，可確定對應(yīng)于其它4個汞原子的自身峰和交叉峰，其中確定了汞3、汞4、汞5和汞6的坐標(biāo)。
用1.00波長測定EMTS衍生結(jié)晶的1.8解析度數(shù)據(jù)，用程序MLPHARE(CCP4軟件包)(SERC)精練6個計算出的汞原子坐標(biāo)(重原子參數(shù))，以確定初始位相。精練后優(yōu)值的平均值是0.50。然后，進(jìn)行溶劑矯平法和使用程序DM(CCP4軟件包，SERC)的直方圖匹配法，逐漸將位相從低解析度延伸到高解析度(去氨甲酰酶結(jié)晶的溶劑區(qū)是35％)，從而改進(jìn)初始位相。從結(jié)晶密度的測量已知去氨甲酰酶結(jié)晶在一個非對稱晶格中含有兩個分子。為了利用非晶體學(xué)對稱性，平均電子密度以改進(jìn)相。為了使用該方法，首先確定去氨甲酰酶結(jié)晶中的非晶體學(xué)雙重軸。使用溶劑矯平后的位相，計算電子密度圖，在三維圖上顯示重原子的位置和電子強(qiáng)度圖。發(fā)現(xiàn)在汞原子坐標(biāo)之間的中點連接的兩條線彼此在Z軸上垂直(晶體學(xué)雙重軸)。因此，推測去氨甲酰酶分子具有三種對稱性，即兩種非晶體學(xué)雙重軸和一晶體學(xué)雙重軸(222)。詳細(xì)觀察電子密度圖的各段，以確定兩個分子中心的坐標(biāo)，并計算包括平移和旋轉(zhuǎn)的非晶體學(xué)對稱母體。同時，從溶劑矯平法獲得的電子密度圖鑒定出存在稱為屏蔽的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域?；谒愠龅姆蔷w學(xué)對稱母體和屏蔽，用程序DM進(jìn)行NCS平均計算。結(jié)果，兩個分子之間的相關(guān)系數(shù)是0.92，表明高相關(guān)水平，自由R-因子是24.5％。改進(jìn)的電子密度圖極端清晰(如見圖8；在圖8中，觀察到作為連續(xù)電子強(qiáng)度的肽主鏈連接；在圖中部，觀察到對應(yīng)于鑒定為Glu46、Cys171和Glu145的氨基酸側(cè)鏈的電子強(qiáng)度)。在二級結(jié)構(gòu)部分，如α螺旋或β折疊中，氨基酸主鏈的形成可以清楚跟蹤，芳族氨基酸側(cè)鏈等的電子強(qiáng)度也是清楚的。
實施例6 去氨甲酰酶模型的立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和精練基于實施例5獲得的電子密度圖，在三維圖上用Program O(UppsalaUniversitet)裝配去氨甲酰酶模型的立體結(jié)構(gòu)。為了使電子強(qiáng)度與氨基酸序列匹配，首先找到具有特征性電子強(qiáng)度的部分氨基酸序列，如色氨酸殘基，然后參考氨基酸序列用Program O構(gòu)建匹配電子強(qiáng)度的氨基酸殘基的部分結(jié)構(gòu)。通過連續(xù)重復(fù)該過程，將所有去氨甲酰酶的氨基酸殘基(303個殘基)與對應(yīng)電子強(qiáng)度匹配，從而構(gòu)建整個分子的起始立體結(jié)構(gòu)模型。根據(jù)立體結(jié)構(gòu)精練程序XPLOR(XPLOR菜單，Yale University)用獲得的立體結(jié)構(gòu)模型作為起始模型結(jié)構(gòu)精練立體結(jié)構(gòu)。在該精練過程中，收集了從電子密度圖有很大漂移的局部結(jié)構(gòu)，鑒定相對于水分子的電子強(qiáng)度。在精練計算中重復(fù)包括水分子的操作，同時考慮R值和自由R-因子，得到進(jìn)一步的精練。含有水分子的天然結(jié)晶最終模型結(jié)構(gòu)的R值是500-1.7解析度的反射數(shù)據(jù)的19.6％。
實施例7 去氨甲酰酶的穩(wěn)定化設(shè)計提供了穩(wěn)定化設(shè)計去氨甲酰酶的例子，其中當(dāng)能量不利的氨基酸殘基突變時，觀察到穩(wěn)定性的改進(jìn)。從本發(fā)明的立體結(jié)構(gòu)計算出，203位的脯氨酸(Pro203)主鏈的二面角(φ-60°，Ψ-44°)是α-螺旋結(jié)構(gòu)特有的二面角。一般已知脯氨酸殘基是使螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或破壞它的殘基。推測去氨甲酰酶中203位脯氨酸的存在可導(dǎo)致主鏈結(jié)構(gòu)扭曲，使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。由于該部分是螺旋結(jié)構(gòu)特有的二面角，用適合螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基取代脯氨酸，可穩(wěn)定天然存在的結(jié)構(gòu)能量。α-螺旋結(jié)構(gòu)形成起作用的氨基酸取代脯氨酸，例如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)。亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)。用20個天然存在的氨基酸突變使203位的氨基酸突變，用AMBER勢能參數(shù)(Weiner，P.A.等，J.Comp.Chemistry 7(2)230-252，1986)計算各結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)能量，獲得該部分的最佳氨基酸突變，其中想要的氨基酸突變越多，結(jié)構(gòu)能量值越低。結(jié)果，天冬氨酸＞蘇氨酸＞絲氨酸＞纈氨酸＞谷氨酸＞異亮氨酸＞丙氨酸＞苯丙氨酸＞酪氨酸＞亮氨酸＞組氨酸＞天冬氨酸＞精氨酸＞谷氨酰胺＞半胱氨酸＞脯氨酸。表4顯示了實施例1制備的氨基酸突變體的變性溫度(國際出版物號WO94/03613)。在任何下列突變中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性的改進(jìn)(ΔTm＝3.4-8.2℃)?？珊侠淼卣J(rèn)為獲得了這些改進(jìn)，因為通過用其它氨基酸取代脯氨酸消除了主鏈結(jié)構(gòu)的扭曲。當(dāng)用谷氨酸取代脯氨酸時(ΔTm＝8.2℃)，獲得最高的穩(wěn)定性。這是由于脯氨酸到谷氨酸的突變使得谷氨酸側(cè)鏈羧基與羧基旁139位的精氨酸側(cè)鏈胍基形成離子鍵或氫鍵?？紤]這種新加入的相互作用對穩(wěn)定性的改善起作用，結(jié)果，可獲得高于其它突變體的穩(wěn)定性。His突變體穩(wěn)定性的增加是ΔTm＝3.4℃，小于其它突變體是由于當(dāng)組氨酸在pH7.0帶正電時，由于組氨酸和139位精氨酸之間的靜電斥力，主鏈扭曲的消除不存在。
203位最佳氨基酸突變的穩(wěn)定性順序級別并不完全符合實驗獲得的變性溫度的增加數(shù)值。但是，當(dāng)遇到比天然存在的去氨甲酰酶的脯氨酸結(jié)構(gòu)能量低(即更穩(wěn)定)的突變時，任何突變都處于更高的順序級別。這與實驗結(jié)果相符合。
表4
203位氨基酸突變引起的熱穩(wěn)定性變化

變性溫度定義為殘余比活力為50％的溫度，其中上述制備的(粗)酶溶液在各溫度下熱處理10分鐘，然后除去由于熱變性而不溶的物質(zhì)，接著測量比活力。如下測定殘余比活力。將N-氨甲酰基-D-α-對羥基苯基甘氨酸溶于0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)至1.0wt％底物濃度。在1毫升底物溶液中加入0.1毫升酶溶液，然后40℃反應(yīng)20分鐘。加入0.25毫升三氯乙酸，停止反應(yīng)。用D-苯基丙氨酸對反應(yīng)溶液進(jìn)行高效液相層析，測量殘余比活力，其中用活力被轉(zhuǎn)化的D-α-對羥基苯基甘氨酸作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。篩選獲得用名稱號代表的突變株。ΔTm表示突變前后變性溫度之間的差異。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了去氨甲酰酶、去氨甲酰酶突變體的立體結(jié)構(gòu)和突變體的立體結(jié)構(gòu)模型。酶的立體結(jié)構(gòu)用于合理設(shè)計氨基酸突變，其目標(biāo)是熱抗性、有機(jī)溶劑抗性、空氣氧化抗性等的穩(wěn)定性；酶反應(yīng)的最佳pH改變以及比活力的改進(jìn)。這種設(shè)計使得可能快速有效地獲得一種工業(yè)上有用的修飾的酶。另外，此酶的立體結(jié)構(gòu)是酰胺酶或腈水解酶(它們與該酶立體結(jié)構(gòu)相似)中唯一已被測定的。清楚的是此酶的立體結(jié)構(gòu)確實可用于這些酶的工業(yè)可應(yīng)用的領(lǐng)域。
序列表<110>鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社<120>去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)及其用途<130>J199247416<140>PCT/JP00/05901<141>1999-08-31<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>303<212>PRT<213>土壤桿菌(Agrobacterium sp.)<400>1Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala Arg1 5 10 15Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu Thr20 25 30Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu Ala35 40 45Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu Leu50 55 60Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro Leu65 70 75 80Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala85 90 95Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile100 105 110Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His115 120 125Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu130 135 140Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp145 150 155 160Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp165 170 175Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile Cys
180 185 190Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His Asp195 200 205His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr210 215 220Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu Glu225 230 235 240Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu245 250 255Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala Ala260 265 270Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn Phe275 280 285Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu290 295 300<210>2<211>303<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400> 2Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala Arg1 5 10 15Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu Thr20 25 30Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu Ala35 40 45Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu Leu50 55 60Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro Leu65 70 75 80Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala85 90 95Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile100 105 110Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His115 120 125Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu130 135 140Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp145 150 155 160Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp165 170 175Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile Cys180 185 190Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Glu Val Pro Gln His Asp195 200 205His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr210 215 220Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu225 230 235 240Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu245 250 255Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala Ala260 265 270Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn Phe275 280 285Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu290 295 300
權(quán)利要求
1.一種去氨甲酰酶結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶具有正交晶系中的空間群P21212和SEQ ID NO1中列出的氨基酸序列，或正交晶系中的空間群P212121和SEQ IDNO2中列出的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的去氨甲酰酶結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶具有長方體形的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝66.5-68.5，b＝135.5-138.0，c＝66.5-68.5；所述氨基酸序列是SEQ ID NO1。
3.如權(quán)利要求1所述的去氨甲酰酶結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶具有長方體形的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝68.5-70.5，b＝138.0-140.5，c＝68.5-73.0；所述氨基酸序列是SEQ ID NO1。
4.如權(quán)利要求1所述的去氨甲酰酶結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶具有長方體形的晶胞，具有晶格常數(shù)a＝81.5-82.5，b＝133.0-135.0，c＝119.5-121.5；所述氨基酸序列是SEQ ID NO2。
5.如權(quán)利要求1-4所述的結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶中每個去氨甲酰酶分子含有至少一個或多個重原子。
6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)晶，其特征在于，所述重原子是汞、金、鉑、鉛、銥、鋨和鈾中的任一種。
7.一種凍結(jié)結(jié)晶，其特征在于，該結(jié)晶是通過用液氮凍結(jié)權(quán)利要求1-6任一所述的去氨甲酰酶結(jié)晶而獲得的。
8.一種制備去氨甲酰酶結(jié)晶的方法，其特征在于，該方法包括步驟提供濃度為1-50毫克/毫升的去氨甲酰酶溶液；提供含有濃度為5-30％重量的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇的沉淀劑和濃度能使pH達(dá)到6.0-9.0的緩沖劑的沉淀劑溶液；將去氨甲酰酶溶液與沉淀劑溶液混合；讓得到的混合物溶液放置一段預(yù)定的時間，直到去氨甲酰酶結(jié)晶在溶液中長到預(yù)定大小或更大。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，混合步驟包括將一滴去氨甲酰酶溶液與一滴沉淀劑溶液混合，放置得到的混合物溶液的步驟包括，使混合步驟中得到的混合物液滴懸在密封容器中的裝有沉淀劑溶液的溶液儲器上，其中溶液儲器中的沉淀劑溶液的蒸汽壓比混合物液滴的蒸汽壓低。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將一滴去氨甲酰酶溶液與一滴沉淀劑溶液混合，放置得到的混合物溶液的步驟包括，使混合步驟中得到的混合物液滴懸在密封容器中的裝有沉淀劑溶液的溶液儲器的液滴臺上，其中溶液儲器中的沉淀劑溶液的蒸汽壓比混合物液滴的蒸汽壓低。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述放置混合物溶液的預(yù)定時間是1天至3周。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該方法還包括在提供去氨甲酰酶溶液后，將去氨甲酰酶溶液置于尺寸排阻半透膜中，其中混合步驟包括使沉淀劑溶液擴(kuò)散通過半透膜到達(dá)去氨甲酰酶溶液。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述混合步驟包括在去氨甲酰酶溶液中逐漸加入沉淀劑溶液，放置得到的混合物溶液的步驟包括在密封容器中放置混合物溶液。
14.一種去氨甲酰酶，其特征在于，該酶的立體結(jié)構(gòu)具有下圖代表的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué) 或其活性片段。
15.一種去氨甲酰酶，其特征在于，該酶具有四層夾心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有具有4個α螺旋和12個β-折疊的二級結(jié)構(gòu)，或其活性片段。
16.一種去氨甲酰酶，其特征在于，該酶的與酶反應(yīng)有關(guān)的氨基酸殘基是一個半胱氨酸殘基、兩個谷氨酸殘基；一個賴氨酸殘基，酶反應(yīng)的一種底物是D-N-氨甲?；?α-氨基酸；其底物結(jié)合的活性位點的特征是下圖表示的立體結(jié)構(gòu) 其中取代基R是D-N-氨甲?；?α-氨基酸或去氨甲酰酶突變體、或其活性片段的側(cè)鏈。
17.一種具有去氨甲酰酶活性的酶，其特征在于，其底物是D-N-氨甲?；?α-氨基酸，其中酶分子具有由至少與SEQ ID NO1或2的下列氨基酸對應(yīng)的氨基酸形成的活性位點腔46位的Glu，126位的Lys，145位的Glu和171位的Cys，或其活性片段。
18.如權(quán)利要求17所述的酶，其特征在于，在反應(yīng)中，D-N-氨甲?；?α-氨基酸可與活性位點腔處SEQ ID NO1或2的對應(yīng)于126位的Lys、143位的His、145位的Glu、174位的Arg、175位的Arg和197位的Thr的氨基酸相互作用。
19.如權(quán)利要求17或18所述的酶，其特征在于，該酶對應(yīng)于SEQ ID NO1或2的46位的Glu、145位的Glu和171位的Cys的氨基酸具有與活性位點腔的水分子的氫鍵，或其活性片段。
20.如權(quán)利要求16-19任一所述的酶分子，其特征在于，D-N-氨甲?；?α-氨基酸選自D-N-氨甲?；?苯基甘氨酸、D-N-氨甲?；?對羥苯基甘氨酸、D-N-氨甲?；?苯丙氨酸、D-N-氨甲?；?纈氨酸、D-N-氨甲?；?丙氨酸、D-N-氨甲?；?半胱氨酸、D-N-氨甲?；?天冬氨酸、D-N-氨甲?；?谷氨酸、D-N-氨甲?；?甘氨酸、D-N-氨甲?；?組氨酸、D-N-氨甲?；?異亮氨酸、D-N-氨甲?；?賴氨酸、D-N-氨甲?；?亮氨酸、D-N-氨甲?；?甲硫氨酸、D-N-氨甲?；?天冬酰胺、D-N-氨甲?；?脯氨酸、D-N-氨甲?；?谷氨酰胺、D-N-氨甲?；?精氨酸、D-N-氨甲?；?絲氨酸、D-N-氨甲?；?蘇氨酸、D-N-氨甲?；?色氨酸和D-N-氨甲?；?酪氨酸，或其活性片段。
21.一種去氨甲酰酶復(fù)合物，其特征在于，該去氨甲酰酶復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)、其突變體、或其活性片段和D-N-氨甲酰基-α-氨基酸或D-α-氨基酸，其中復(fù)合物是用分子設(shè)計技術(shù)從權(quán)利要求14-15所述的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)構(gòu)建的。
22.一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟根據(jù)權(quán)利要求14、16和21任一所述的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改良的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰突變體。
23.一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，其特征在于，該方法包括步驟制備具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶；對結(jié)晶進(jìn)行X-光晶體照像術(shù)分析確定結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)；根據(jù)確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改善的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述立體結(jié)構(gòu)是權(quán)利要求14、16和21任一所述的去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)。
25.一種設(shè)計去氨甲酰酶突變體的方法，其特征在于，該方法包括步驟制備具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶；對結(jié)晶進(jìn)行X-光晶體照像術(shù)分析確定結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)；根據(jù)確定的立體結(jié)構(gòu)設(shè)計具有改善的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體；和產(chǎn)生去氨甲酰酶突變體。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述立體結(jié)構(gòu)是權(quán)利要求14、16和21任一所述的去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，設(shè)計去氨甲酰酶突變體的步驟旨在改變酶的一個或多個特征，所述特征選自底物專一性的改變、比活力的改變、穩(wěn)定性的改善、最佳pH的優(yōu)化和水溶性的改變。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述酶特性的改變包括改善穩(wěn)定性。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述穩(wěn)定性改善的突變體設(shè)計包括一種突變，該突變包括氨基酸殘基的取代，該殘基導(dǎo)致由于空氣氧化的活性下降。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，酶特征的改變包括改變比活力和優(yōu)化最佳pH。
31.一種用權(quán)利要求25-30任一所述的產(chǎn)生方法獲得的去氨甲酰酶突變體。
32.一種修飾具有與去氨甲酰酶類似的一級氨基酸序列的多肽或蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括利用權(quán)利要求1-7任一所述的去氨甲酰酶結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)，或權(quán)利要求14、16和21任一所述的去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu)。
33.一種用計算機(jī)設(shè)計去氨甲酰酶突變體的系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括用于確定具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)的工具；和設(shè)計基于確定的立體結(jié)構(gòu)的具有改善的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體的工具。
34.一種計算機(jī)可讀記錄介質(zhì)，用于執(zhí)行設(shè)計去氨甲酰酶突變體的過程，其特征在于，該設(shè)計過程包括步驟輸入用X-光晶體照像術(shù)測定的、具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶數(shù)據(jù)；和基于確定的立體結(jié)構(gòu)，設(shè)計具有改進(jìn)的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。
35.一種記錄用一種方法獲得的去氨甲酰酶立體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)的記錄介質(zhì)，其特征在于，該過程包括以下步驟輸入用X-光晶體照像術(shù)測定的、具有去氨甲酰酶活性的酶結(jié)晶數(shù)據(jù)；和基于確定的立體結(jié)構(gòu)，設(shè)計具有改進(jìn)的物理性質(zhì)和/或功能的去氨甲酰酶突變體。
全文摘要
本發(fā)明用X－光晶體照像術(shù)揭示了去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu),并提供了去氨甲酰酶突變體,它對于工業(yè)應(yīng)用更有用,該突變體是利用立體結(jié)構(gòu)通過分子設(shè)計獲得的,以改善去氨甲酰酶與其底物D－N－氨甲?；粒被岬姆磻?yīng)性。特別是,本發(fā)明涉及用X－光晶體照像術(shù)確定的去氨甲酰酶的立體結(jié)構(gòu);其與底物、產(chǎn)物等的復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)模型;一種利用這些立體結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計方法;和用該方法獲得的去氨甲酰酶突變體;以及設(shè)計和產(chǎn)生具有與去氨甲酰酶類似的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)突變體的方法。
文檔編號C12N9/78GK1376202SQ00813349
公開日2002年10月23日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月31日
發(fā)明者中井孝尚, 守川壯一, 石井清人, 難波弘憲, 矢島麗嘉, 池中康裕, 高橋里美 申請人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社