專利名稱：來自棉花的纖維特異性肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的分離和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及轉(zhuǎn)基因植物和用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的啟動(dòng)子，特別是纖維特異性啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
棉花是紡織工業(yè)最廣泛使用的天然纖維，全世界棉花年產(chǎn)量為1億包，總值450億美元。在過去的幾十年間雖然已通過經(jīng)典育種明顯改進(jìn)了纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量，但是通過經(jīng)典育種進(jìn)一步改善纖維性質(zhì)的潛力已被限制，因?yàn)樾枰锓N相容性和可利用的性狀?；蚬こ烫峁┝诉M(jìn)一步改良棉花的新途徑，其是通過導(dǎo)入基因以產(chǎn)生具有高度所需特征的新種質(zhì)而進(jìn)行。
棉花纖維(種毛)是經(jīng)歷快速同步延伸的單細(xì)胞毛狀體。皮層(cortical)微管提供了規(guī)范和調(diào)控細(xì)胞延伸的纖維素微原纖維排列所需的空間信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纖維發(fā)育由4個(gè)重疊階段組成(即起始、初級(jí)細(xì)胞壁形成、次生細(xì)胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌動(dòng)蛋白可能在發(fā)育纖維細(xì)胞中起重要功能作用。成熟纖維是纖維素、水、少量蛋白質(zhì)、果膠、半纖維素、礦物質(zhì)、蠟、少量有機(jī)酸、糖和色素的生物學(xué)組合物，其提供優(yōu)異的穿著性能和審美性能(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纖維分化和發(fā)育需要許多基因，這些基因在纖維發(fā)育的不同階段差異表達(dá)，目前僅鑒別了參與大量纖維特異性結(jié)構(gòu)蛋白、酶、多糖、蠟或木質(zhì)素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。這些分離的基因由于其纖維特異性表達(dá)可被認(rèn)為具有改良棉花纖維的潛在應(yīng)用。例如，John已使用纖維特異性基因啟動(dòng)子產(chǎn)生基因工程棉花以收獲改變的纖維(John，1996b，1997a，1997b)。
啟動(dòng)子是確定植物和動(dòng)物發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性的DNA片段。在過去十年間已從各種植物和動(dòng)物中鑒別和分離了許多組織特異性基因及其啟動(dòng)子，包括一些棉花組織特異性基因和啟動(dòng)子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有幾種啟動(dòng)子以顯示在棉花中以纖維特異性方式控制基因表達(dá)(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物組織特異性啟動(dòng)子可被用于在特異組織中以發(fā)育調(diào)控模式表達(dá)外源蛋白質(zhì)(John，1996b，1997a，1997b)。
發(fā)明概述從棉花中分離了一種編碼肌動(dòng)蛋白的纖維特異性基因(稱為CFACT1)。分離的完整CFACT1基因長(zhǎng)度為3.040kb，包括一個(gè)0.816kb的啟動(dòng)子。將CFACT1啟動(dòng)子片段(0.8kb)與GUS基因融合，構(gòu)建基因表達(dá)載體以分析啟動(dòng)子的功能。用CFACT1啟動(dòng)子/GUS融合基因轉(zhuǎn)基因的棉花和煙草植物，通過Southern印跡雜交方法鑒別。在所有研究的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，GUS活性僅在新生纖維中檢測(cè)到，而在花器官如花藥，花瓣和萼片，或葉和根中未檢測(cè)到。此結(jié)果結(jié)合Northern印跡分析結(jié)果表明，CFACT1啟動(dòng)子在棉花中是纖維特異性的。此啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平控制特異性基因在棉花纖維中的表達(dá)。分離的啟動(dòng)子可用于改良棉花纖維，通過操縱基因產(chǎn)生具有高纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的新棉花變種。
附圖簡(jiǎn)述


圖1示出棉花CFACT1基因cDNA的核苷酸序列(686bp；SEQID NO1)。
圖2示出棉花CFACT1基因的核苷酸序列(3040bp；SEQ IDNO2)。
圖3示出分離的CFACT1基因的結(jié)構(gòu)圖。
圖4示出在表達(dá)載體中的與GUS基因融合的CFACT1啟動(dòng)子的構(gòu)建體。
發(fā)明詳述CFACT1啟動(dòng)子是一種在棉花中有活性的纖維特異性啟動(dòng)子。對(duì)取自各種棉花組織的cDNA進(jìn)行的Northern印跡分析結(jié)果示出，一個(gè)包含CFACT1基因的cDNA克隆在開花后(DPA)8和14天的新生纖維中強(qiáng)烈表達(dá)，也在開花后4，8和14天的幼胚珠中表達(dá)，但在其它組織中很少或根本不表達(dá)。對(duì)此cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序表明其長(zhǎng)度為686bp(
圖1)。發(fā)現(xiàn)分離自基因組DNA文庫的全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為3040bp，包括一個(gè)0.8kb的啟動(dòng)子片段，其1-818位堿基代表啟動(dòng)子(圖2)。將棉花CFACT1的核苷酸序列和推定的多肽序列與數(shù)據(jù)庫中序列相對(duì)比，表明此基因在氨基酸水平和核苷酸水平均與來自一些植物，如Malva pusilla(AF112538)，大豆(U60499)，和Brassica napus(AF11812)等的已知肌動(dòng)蛋白基因呈現(xiàn)高度同源。CFACT1基因與已知棉花肌動(dòng)蛋白基因(AF059484)在氨基酸水平只呈現(xiàn)71-93％同源性，在核苷酸水平呈現(xiàn)80-82％相同性。另外，其啟動(dòng)子不同于已知棉花和非棉花肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子，因此它是分離自棉花的一種新肌動(dòng)蛋白基因。分析CFACT1基因序列表明，在其開放讀框中含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子(圖3)。此基因結(jié)構(gòu)在分析的所有完整肌動(dòng)蛋白基因中是典型的〔Shah等，1983；Baird和Meagher，1987；Nairn等，1988；Stranathan等，1989；McElroy等，1990；Cox等，1995；An等，1996〕。
CFACT1基因的轉(zhuǎn)錄物在開花后8天的棉花新生纖維中呈最高累積(通過Northern印跡分析表明的)，然后隨著纖維的進(jìn)一步發(fā)育基因產(chǎn)物(mRNA)的累積明顯降低。對(duì)比不同發(fā)育階段的棉花胚珠中的基因表達(dá)，也示出基因轉(zhuǎn)錄物在開花后8天比在開花后4天和14天累積多，從開花后8天至28天的纖維發(fā)育中，基因產(chǎn)物的累積逐漸及明顯降低至不可檢測(cè)的水平。這提示此基因是在棉花纖維和胚珠發(fā)育期間在轉(zhuǎn)錄水平被嚴(yán)格調(diào)節(jié)而特異表達(dá)的，與其它棉花纖維特異性基因一樣〔Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999，Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992〕。
CFACT1基因的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為0.8kb，是有活性的纖維特異性啟動(dòng)子。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將CFACT1啟動(dòng)子/GUS融合基因構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化煙草和棉花，使用含有CaMV35s啟動(dòng)子/GUS融合體的pBI121載體作陽性對(duì)照。與Northern印跡分析結(jié)果相一致，在研究的所有轉(zhuǎn)基因棉花植物中，由CFACT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在新生纖維中特異表達(dá)，但在其它組織中不表達(dá)，而在陽性對(duì)照棉花植物(35SGUS)的所有組織中均檢測(cè)到GUS活性。獲得共230株轉(zhuǎn)化的棉花植物，移植入土壤中生長(zhǎng)至成熟。相似地，發(fā)現(xiàn)在CFACT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的所研究的20多株轉(zhuǎn)基因煙草植物中，GUS基因活性只在種子和果肉中檢測(cè)到，這提示CFACT1啟動(dòng)子活性在煙草中也是組織特異性的(棉花纖維是種皮的延伸毛，發(fā)現(xiàn)其與煙草種皮組織學(xué)相應(yīng))。此結(jié)果結(jié)合Northern印跡分析表明，CFACT1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平控制基因在棉花纖維中的特異表達(dá)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，得自棉花纖維肌動(dòng)蛋白基因CFACT1。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，其包含棉花纖維CFACT1基因的0.8kb啟動(dòng)子片段，具有SEQ ID NO2的1-816位核苷酸的序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，其包含CFACT1啟動(dòng)子(SEQ ID NO2的1-816位核苷酸)的一個(gè)活性片段。活性片段是序列長(zhǎng)度比SEQ ID NO2的1-816位核酸序列短但仍保留在棉花中與纖維特異性啟動(dòng)子同樣的活性的序列。片段可包含SEQ ID NO2的1-816位核苷酸序列的切除，缺失，截短或取代，或這些變化的組合。
CFACT1在棉花纖維中強(qiáng)烈表達(dá)，表明其在纖維形成和發(fā)育中的起直接作用。已經(jīng)熟知肌動(dòng)蛋白在許多植物中參與細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞擴(kuò)展。這是基于這樣一種概念，即我們?cè)谀壳把芯抗ぷ髦刑角笈c細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)的基因。在測(cè)序后，由于其是一種肌動(dòng)蛋白基因而將其命名為CFACT1。盡管還沒有進(jìn)行任何通過過表達(dá)或低表達(dá)證明CFACT1在轉(zhuǎn)基因棉花中的功能的研究工作，但可以推測(cè)CFACT1參與棉花纖維發(fā)育，因?yàn)槠渚哂幸粋€(gè)纖維特異性強(qiáng)啟動(dòng)子〔Delmer等，1995〕。
本發(fā)明的啟動(dòng)子用于產(chǎn)生纖維特性改變的轉(zhuǎn)基因棉花。使用本發(fā)明的纖維特異性強(qiáng)啟動(dòng)子使轉(zhuǎn)基因在棉花纖維中選擇性表達(dá)，使應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因的類型范圍更大。選擇性表達(dá)避免了如系統(tǒng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因強(qiáng)加于轉(zhuǎn)基因植物的代謝負(fù)擔(dān)，或轉(zhuǎn)基因在非纖維組織中表達(dá)的不利影響。在棉花纖維中表達(dá)而在棉花植物的其它部分中不表達(dá)的所需基因例如包括(1)染色棉花的花色素苷基因，(2)來自蠶或蜘蛛的絲蛋白基因，提高棉花纖維的強(qiáng)度，(3)棉花纖維中聚羥基丁酸酯的生物合成，以改良導(dǎo)熱性能和絕緣性能〔John等，1996〕。在本領(lǐng)域有許多增強(qiáng)纖維的基因可與本發(fā)明的啟動(dòng)子便利地連接，并用于通過熟知方法轉(zhuǎn)化棉花〔見例如Umbeck，1992〕，以達(dá)到轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中表達(dá)。見例如John，1996b，1997a，1997b；John等，1996。實(shí)施例1分離編碼CFACT1序列的纖維特異性cDNA將棉花種子表面用70％乙醇消毒30-60秒，及用10％H2O2消毒30-60分鐘，隨后用無菌水沖洗。將種子在1/2 MS培養(yǎng)基上在培養(yǎng)室中在28℃光照萌發(fā)，并將從無菌幼苗切下的子葉和下胚軸用作轉(zhuǎn)化外植體。將棉花植物在罐中生長(zhǎng)以提取DNA和RNA。
用硫氰酸胍方法或SV總RNA分離系統(tǒng)(Promega)，從棉花的新生纖維，胚珠，花藥，花瓣，萼片，葉和根中提取總RNA。聚(A)+RNA是通過用mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)中的寡(dT)纖維素旋轉(zhuǎn)層析柱純化的。棉花cDNA用cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech)合成。棉花cDNA文庫通過將cDNA片段插入ZAP表達(dá)載體(Stratagene)中構(gòu)建。
將分別來自開花后大約8和14天的新生棉花纖維的聚(A)+RNAs轉(zhuǎn)為cDNA，將其用于構(gòu)建棉花cDNA文庫。從此纖維cDNA文庫中，隨機(jī)挑取大約200個(gè)cDNA克隆，及隨后進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)序列數(shù)據(jù)選擇具有參與細(xì)胞擴(kuò)展?jié)摿Φ囊恍┛寺　?br> 為發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物在棉花纖維中特異表達(dá)的cDNA克隆，分析所選擇的cDNA克隆的表達(dá)模式，通過用分離自棉花纖維，胚珠，花藥，花瓣，萼片，葉和根的總RNAs，使用來自克隆的探針進(jìn)行Northern印跡雜交進(jìn)行分析。將來自不同棉花組織的RNA樣品在瓊脂糖—甲醛凝膠上分離，并通過毛細(xì)印跡移至Hybond-N尼龍膜上。將RNANorthern印跡在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃與通過隨機(jī)標(biāo)記(Promega Prime-a-Gene標(biāo)記系統(tǒng))制備的32P cDNA探針雜交。在雜交后，將印跡在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中沖洗30-60分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示出一個(gè)cDNA克隆在開花后8和14天的新生纖維中強(qiáng)烈表達(dá)，并也在開花后4，8和14天的幼胚珠中表達(dá)，但在其它組織中較低表達(dá)或不表達(dá)。
將PCR片段和cDNA片段亞克隆入載體中，并將用Qiagen質(zhì)粒試劑盒制備的質(zhì)粒DNA在PCR反應(yīng)中用作模板。通過自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆是編碼肌動(dòng)蛋白多肽一部分的一個(gè)686bp CFACT1 cDNA片段(
圖1)。Northern印跡雜交證明CFACT1 cDNA轉(zhuǎn)錄物在開花后8和14天的新生纖維中大量積累，并也在開花后4，8，14和21天的幼胚珠中或多或較少積累。但這些轉(zhuǎn)錄物在來自開花后28天的胚珠的RNA中檢測(cè)不到，在來自花藥，花瓣，萼片，葉片和根的RNA中也檢測(cè)不到(圖4)。此結(jié)果提示CFACT1 cDNA表達(dá)在棉花中是纖維特異性的。將CFACT1cDNA序列與來自數(shù)據(jù)庫的已知棉花肌動(dòng)蛋白cDNA(D88414)相對(duì)比，所述已知肌動(dòng)蛋白cDNA長(zhǎng)度只有1.079kb且不是一個(gè)完整肌動(dòng)蛋白cDNA，對(duì)比結(jié)果示出這兩個(gè)cDNA呈現(xiàn)高水平的同源性(在氨基酸水平呈97％相同性，在核酸水平呈96％相同性)。
將來自棉花不同組織的總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，其在差別展示PCR反應(yīng)中用作模板。通過使用差別展示試劑盒(Clontech)進(jìn)行差別展示分析。第一鏈cDNA是用2pg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄的起始物，寡(dT)作引物，在42℃反應(yīng)1小時(shí)合成的。差別展示PCR是開始進(jìn)行一次94℃ 5分鐘，40℃ 5分鐘和68℃ 5分鐘循環(huán)，隨后進(jìn)行94℃ 2分鐘和40℃ 5分鐘及68℃ 5分鐘的兩次循環(huán)，然后進(jìn)行94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘和68℃ 2分鐘的25次循環(huán)，最后在68℃延伸7分鐘。切除目標(biāo)差別展示條帶并再擴(kuò)增以進(jìn)一步分析。取可重復(fù)的纖維特異性差別展示產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分析。收集在每個(gè)目標(biāo)條帶中的cDNA，并通過PCR擴(kuò)增再生。隨后將分離的cDNA亞克隆入載體中并測(cè)序。
Northern印跡分析示出CFACT1基因的轉(zhuǎn)錄物在開花后8天新生棉花纖維中呈現(xiàn)最高積累，然后隨著纖維的進(jìn)一步發(fā)育，基因產(chǎn)物(mRNA)的積累明顯降低。對(duì)比棉花胚珠的不同發(fā)育階段中的基因表達(dá)也示出，基因轉(zhuǎn)錄物在開花后8天的胚珠中比在開花后4和14天的胚珠中積累的多，隨著纖維從開花后8天至28天的發(fā)育，基因產(chǎn)物的累積逐漸及明顯降低至不可檢測(cè)水平。這提示基因在棉花纖維和胚珠發(fā)育期間是在轉(zhuǎn)錄水平被嚴(yán)格調(diào)節(jié)而特異表達(dá)的，如其它棉花纖維特異性基因一樣〔Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992〕。實(shí)施例2CFACT1基因的分離和結(jié)構(gòu)分析使用以下方法從棉花植物中提取并純化總DNA。將液氮加入4g葉組織中，并將葉徹底均質(zhì)。將20ml冰凍的提取緩沖液(63g/L葡萄糖，0.1M Tris.HCl(pH8.0)，5mM EDTA，20g/L PVP-40，1g/lDIECA，1g/L抗壞血酸，2ml/L β-巰基乙醇)加入在50ml試管中的均質(zhì)組織中，并在2500rpm離心15分鐘。在除去上清后，將10ml裂解緩沖液加入每個(gè)試管中。將再懸浮的沉淀在65℃溫育30分鐘。在每個(gè)試管中加入10ml氯仿，與樣品混合并在3500rpm離心10分鐘。將上清移至清潔的試管中，再進(jìn)行一次氯仿提取。將上清移至清潔的試管中，在每個(gè)試管中加入0.6體積的異丙醇以沉淀DNA。在3500rpm離心30分鐘后，將DNA用70％乙醇沖洗。然后將分離的基因組DNA溶解于無菌水或TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA)中使用。
棉花基因組DNA文庫是從棉花植物的葉中構(gòu)建的。將DNA用BamHI部分消化，并將DNA片段克隆入ZAP表達(dá)載體(Stratagene)的BamHI位點(diǎn)中。
基因組步行(Walker)文庫是使用通用基因組步行試劑盒(Clontech)構(gòu)建的。將來自棉花植物葉的基因組DNA分別用5種限制酶消化，然后通過酚/氯仿純化，及通過乙醇沉淀。將消化的DNA與基因組步行銜接子連接。接連進(jìn)行兩次基因組步行PCR反應(yīng)。在初始PCR中將1μl每個(gè)基因組步行DNA文庫用作模板，在二級(jí)PCR中將初始PCR產(chǎn)物用作模板。PCR在95℃ 1分鐘起始，隨后進(jìn)行35次95℃ 15秒，和68℃ 4分鐘循環(huán)，最后在68℃擴(kuò)展6分鐘。切下目標(biāo)PCR條帶并通過Geneclean試劑盒純化(Bio 101)。
覆蓋全長(zhǎng)CFACT1基因的兩個(gè)重疊片段通過基因組步行方法分離，并對(duì)其進(jìn)行完全測(cè)序。完整的CFACT1基因長(zhǎng)度為3040bp，包括一個(gè)0.8kb的啟動(dòng)子(圖2)。將棉花CFACT1基因的核苷酸序列和推定的多肽序列與數(shù)據(jù)庫所示序列相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)此基因在氨基酸水平和核苷酸水平均與已知肌動(dòng)蛋白基因呈高度同源，所述已知肌動(dòng)蛋白基因例如來自Malva pusilla(AF112538)，大豆(U60499)，Brassica napus(AF11812)等植物。CFACT1基因與已知棉花肌動(dòng)蛋白基因(AF059484)在氨基酸水平只呈71％-93％同源性，在核苷酸水平呈80-82％相同性。另外，其啟動(dòng)子不同于已知棉花和非棉花肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子，因此它是分離自棉花的一種新的肌動(dòng)蛋白基因。對(duì)CFACT1基因的序列進(jìn)行分析表明在其開放讀框中含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子(圖3)。此基因結(jié)構(gòu)在迄今為止所有分析的完整肌動(dòng)蛋白基因中是典型的〔Shan等，1983；Baird和Meagher，1987；Nairn等，1988；Stranathan等，1989；McElroy等，1990；Cox等，1995；An等，1996〕。實(shí)施例3CFACT1啟動(dòng)子的功能分析為對(duì)CFACT1啟動(dòng)子的功能進(jìn)行定性，將0.8kb CFACT1啟動(dòng)子在pBI101中與GUS基因連接，以構(gòu)建基因表達(dá)載體(圖4)。將棉花和煙草用含有CFACT1啟動(dòng)子/GUS融合基因的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，使用含有CaMV35S啟動(dòng)子/GUS融合體的pBI121載體作為陽性對(duì)照。CaMV35S啟動(dòng)子在棉花和其它植物的所有組織中均是活性的，并且是一種組成型啟動(dòng)子〔Odelldeng，1985；Ow等，1987；McCabe和Martinell，1993〕。將一個(gè)含有CFACT1啟動(dòng)子/GUS融合基因或CaMV35S啟動(dòng)子/GUS融合體對(duì)照物的二元載體，轉(zhuǎn)移至根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。進(jìn)行轉(zhuǎn)化的棉花外植體得自實(shí)施例1中生長(zhǎng)的棉花幼苗。煙草外植體得自煙草幼苗。將煙草種子表面用70％乙醇滅菌30-60秒，并用0.1％HgCl2滅菌15分鐘，隨后用無菌水沖洗。將種子在培養(yǎng)室中在28℃在1/2MS培養(yǎng)基上光照萌發(fā)，并從無菌幼苗上切下葉用作轉(zhuǎn)化外植體。將棉花子葉和下胚軸外植體和煙草葉外植體通過攜帶載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化的植物移植入溫室土壤中生長(zhǎng)至成熟。
將煙草葉切成大約2×2cm的薄片，并浸漬在農(nóng)桿菌懸浮液中5分鐘。將感染的煙草外植體在MS培養(yǎng)基上用1mg/L 6-BA在28℃培養(yǎng)48小時(shí)，然后移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L 6-BA的MS選擇培養(yǎng)基上20-30天，以選擇轉(zhuǎn)化的莖(卡那霉素抗性莖)。將轉(zhuǎn)化的莖從愈傷組織中切下并在具有50-100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上生根。將轉(zhuǎn)化的煙草外植體移植至溫室土壤中，生長(zhǎng)至成熟。
將子葉和下胚軸用作外植體以轉(zhuǎn)化棉花。將棉花種子表面用70％乙醇滅菌30秒，及用10％H2O2滅菌60分鐘，隨后用無菌水沖洗。將這些種子在28℃在無菌水中溫育。將種子萌發(fā)過夜。取出胚并置于IM培養(yǎng)基上(1/2(MS(常量營(yíng)養(yǎng)物，微量營(yíng)養(yǎng)物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L)+phytogel 2g/L pH＝6.4)，在28℃培養(yǎng)7天。將棉花的子葉和下胚軸用作轉(zhuǎn)化外植體。在切成5mm2(mm)的塊后，將外植體在根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404懸浮液(OD600＝0.2-0.4)中浸漬15分鐘。然后將外植體在24℃置于CM培養(yǎng)基上(MS(常量營(yíng)養(yǎng)物，微量營(yíng)養(yǎng)物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L pH＝6.4)中培養(yǎng)2天。在用液體MS培養(yǎng)基沖洗后，將外植體置于SM培養(yǎng)基上(MS(常量營(yíng)養(yǎng)物，微量營(yíng)養(yǎng)物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L+卡那霉素50mg/L+Cefutoxime 200mg/L，pH＝6.4)，在28℃在培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)以進(jìn)行選擇，每月進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在SM上傳代培養(yǎng)2-3個(gè)月后，在外植體中誘導(dǎo)愈傷組織。將愈傷組織移至DM培養(yǎng)基上(MS(常量營(yíng)養(yǎng)物，微量營(yíng)養(yǎng)物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+KNO319g/L+MgCl20.7mg/L+葡萄糖30g/L+phytogel 3g/L，pH＝6.4)，并每月進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在大約5個(gè)月后，開始形成體細(xì)胞胚。將幼胚在DM培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)直至它們發(fā)育成熟。將成熟胚移至在盒子中的GM培養(yǎng)基上(1/2(MS(常量營(yíng)養(yǎng)物，微量營(yíng)養(yǎng)物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L)+NAA 0.01mg/L+葡萄糖30g/L+phytogel 3.5g/L，pH＝6.4)，發(fā)育成小植物。然后將此小植物移植至土壤中，生長(zhǎng)植物并收集轉(zhuǎn)基因種子。
將具有嵌合的CFACT1啟動(dòng)子/GUS基因(或35SGUS基因)的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花植物，和作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化的植物，通過DNA Southern印跡雜交和通過GUS組織學(xué)測(cè)定進(jìn)行分析。將來自棉花和煙草葉的總基因組DNA用限制酶消化，在瓊脂糖凝膠上分離，并通過毛細(xì)印跡移至Hybond-N尼龍膜上。將DNA Southern印跡在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃與通過隨機(jī)標(biāo)記(Promega Prime-a-Gene標(biāo)記系統(tǒng))制備的32P-DNA探針雜交。在雜交后，將印跡在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中沖洗30-60分鐘。將32P標(biāo)記的尼龍膜在-70℃曝光到X光膠片上以放射自顯影。Southern印跡分析表明CFACT1啟動(dòng)子/GUS融合體基因整合入棉花和煙草基因組中。
對(duì)先前Jefferson等(1987)所述方法加以修改，在轉(zhuǎn)基因的煙草和棉花植物中對(duì)GUS活性進(jìn)行組織化學(xué)分析。將植物的新鮮組織在X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中溫育過夜，所述X-gluc溶液由0.1M磷酸鈉(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亞鐵氰化鉀，和0.1％X-gluc(Clontech Chemical)組成。然后通過相繼用100％和70％乙醇漂洗洗清并固定染色的植物，并直接或在顯微鏡下檢測(cè)樣品并照像。獲得屬于21個(gè)轉(zhuǎn)化品系的共230個(gè)轉(zhuǎn)化的棉花植物，并移植至土壤中生長(zhǎng)至成熟。在研究的所有轉(zhuǎn)基因棉花植物中，只在新生纖維中檢測(cè)到GUS活性，但在花器官如花藥，花瓣和萼片中，或在葉和根中未檢測(cè)到。對(duì)比之下，當(dāng)在X-gluc溶液中在與轉(zhuǎn)基因植物組織相同條件下染色時(shí)，用陽性對(duì)照pBI121(35SGUS)轉(zhuǎn)化的植物在所有組織中均呈現(xiàn)強(qiáng)GUS活性，未轉(zhuǎn)化的植物示出在纖維以及其它組織中無GUS活性。在研究的20多個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植物中，通過CFACT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因只在種子和果肉中表達(dá)，提示CFACT1啟動(dòng)子在煙草中也是組織特異性的。這些結(jié)果表明CFACT1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平指導(dǎo)基因在棉花纖維中特異表達(dá)。
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序列表<110>李學(xué)寶蔡林程寧輝劉建偉<120>來自棉花的纖維特異性肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的分離和鑒定<130>2577-139<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>685<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>1ctggagctcg cgcgcctgca ggtcgacact agtggatcca aagtaattcg gcacgagggg 60tttctcacac cgtgccaatc tatgaaggat atgcccttcc acatgccatc ctccgtcttg 120accttgcagg tcgtgatcta accgatgcct tgatgaaaat tcttaccgag agaggttaca 180tgttcaccac cactgctgaa cgggaaattg tccgtgacat gaaggagaag cttgcttatg 240ttgccctgga ctatgagcag gaactggaga ctgcgaagag cagctcatct gttgagaaaa 300actatgagtt gcctgacgga caagtcatta ctattggagc tgagagattc cgttgcccgg 360aagtcctctt ccagccatct ttcatcggga tggaagctgc tggaatccat gaaactacct 420acaactctat catgaagtgt gatgtggata tcaggaagga tctctacggt aacattgtgc 480tcagtggggg ttcaaccatg ttccctggta ttgcagaccg catgagcaag gagatcactg 540cacttgctcc aagcagcatg aagattaaag tcgttgcccc accagaaaaa aaaatacagt 600gtctggattg gaaggatcta tcttggcatc actccacacc ttccaacaaa tgtggatttc 660ccagggtgaa tttgatgaat ccggc 685<210>2<211>3041<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>2actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc taaagaacaa ttgtgtcaag 60tcgttcttgc cgagcaaatc cgaataggag cttagagtaa catctaacag acggactgct 120ccagcattaa ctgtttggtg aaaatgttaa tggtagtgct atgtcgaagt attttcatgg 180aaggtgttaa gaattaatgt tattgggatt actaatttct agtattaatt gtggtttgga 240agttaatata taattattca atccttgttt tttatttttt ttttataaca caattacaaa 300taatttattt aactttggtt gttttcaatt tatgacggtt aatattttag tttaataatt 360gagcattatt atatattaaa taaataaatc attgtaatat atgtaaaaat aatttaaaat 420ataaatttat taatatatat aataaactca atcaaacaat aaaaagataa taaattctta 480aatatataaa ttttttaaaa tagcttttca gtaaatctgt caaacaatag aaaatatttt 540ttgcaggttc atccaaacac cagaaaagta aatcattttc agaaaagtaa atcatttttc 600agaaattatt tttcggaaat tattttactg gcaaacaaat ggagtctaag tgtttctgtt 660tttatttttt atttttctat ttagagaaac tagaaattga tttgtcaaat gtctttaatc 720tagcttgttt agattagttg aagggcacag aacccgcgtt gtcaagtgat tttgctgtac 780tcactaccta gattcttatt ttcagtattg taaaagatgg ccgacggtga ggctattcaa 840cccctcgtct gtgataatgg aactggaatg gtgaaggtta gttatttttt agaccaaagc 900aaacctgaca cctagctttt agacttggac aaggataaaa tctgtttaag tgggcttagc 960tcaggcttct acattcaaag cctgaatgca gctcagctca tttacattat ataatttata 1020gatataatag atacatatat aatactataa tttaaacatt aattttctaa atcaatggta 1080aggcatattg cactcaagag aggagacata gatttagacc ttggaaacga cattgttggg 1140aaaggtatct ataatccatg aacaaggacc ataaacatgg acatgaagaa tacccaaaaa 1200aaatatattt taagaaatag aaaatactat tggtagattt gggtaaaata tgagatcata 1260ttatggacta agccgagctt gggcacataa gaattatgat gatatcatac acaaacctgg 1320ccggtctatg aacacttcta gacctgagtc ataatctcgg ttattgttta tttctttatg 1380aaaagtaact tatggttaag ctaattttgt ctgtaatgta ggccggtttt gctggtgatg 1440atgctccaag ggcagttttt cccagtatcg ttggtcgtcc ccggcacact ggtgttatgg 1500ttgggatggg tcagaaggat gcctatgtag gagatgaagc acaatctaaa ggaggtatcc 1560ttactttgaa atatcctatt gagcatggta ttgtgagcaa ttgggatgat atggaaaaga 1620tctggcatca tacattctac aacgaactcc gtgttgttcc tgaggagctc cctgtgctac 1680tcacggaagc acctctcaac cccaaggcca atagagaaaa gaagactcag atcatgtttg 1740agaccttcaa tgtacctgct atgtatgttg ccatccaggc cgttctctct ctgtatgcca 1800gtggtcgtac aacaggtttg ttagacttga aacttctatg agcttttctc attttaatga 1860tattttcgaa tcatgttgac actggattat ccctctattg gaacaggtat tgtgctggat 1920tccggtgatg gtgtttctca catcgtgcca atctatgaag gatatgccct tccacatgcc 1980atcctccgtc ttgaccttgc aggtcgtgat ctaaccgatg ccttgatgaa gattcttacc 2040gagagaggtt acatgttcac caccactgct gaacgggaaa ttgtccgtca catgaaagag 2100aagcttgctt atgttgccct ggactatgag caggagctgg agactgccaa gagcagctca 2160tctgttgaga agaactatga gttgcctgac ggacaagtta ttactattga agctgagaga 2220ttccgttgcc cggaagtcct cttccagcca tctttcatcg ggatggaagc tgctggaatc 2280catgaaacta cctacaactc tatcatgaag tgtgatgtgg atatcaggaa ggatctctac 2340ggtaacattg tgctcagtgg gggttcaacc catgttcccc ggtattgcag accgcatgag 2400caaggagatc actgcacttg ctccaagcag catgaagatt aaggtcgttg cgccaccaga 2460gagaaagtac agtgtctgga ttggaggatc tatcttggca tcactcagca ccttccagca 2520ggtaaatata tatttttata tttggctcta cttcttttgt ttgatggttg tccgacactg 2580acgttcttgc tttacagatg tggatttcca agggtgagta tgatgaatcc ggtccatcca 2640ttgtccacag gaagtgcttc taagttttgt aattgctttt gatggtgatc tacattttgc 2700atttagttgg ctcttttttg gcgtgccgtg tcaagtgaac tcaaaagtct ggtttatgtg 2760cgggaagtta gggatcattg taggatggtg tacctgatat tgacgtatta ttattttagc 2820ctttcaccgt atcaccacca ttaagctgat gggccctaag gagatggcgg tggacggaca 2880attggtgctt aattccttcc ctacaatcca tctttgaacc atgctgctta aaaggatgtt 2940tggagcggga gactggattg tggtgctttt atttttttat ttatttaata ttcaagggtt 3000ttgagaacat taatgttaat agctattatt gtacgagatt t 304權(quán)利要求
1.一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，包括棉花肌動(dòng)蛋白基因CFACT1的啟動(dòng)子。
2.一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，包括具有SEQ ID NO2的1-816位核苷酸序列的棉花肌動(dòng)蛋白基因CFACT1啟動(dòng)子的一個(gè)0.8kb片段。
3.一種棉花纖維特異性啟動(dòng)子，包括具有SEQ ID NO2的1一816位核苷酸序列的棉花肌動(dòng)蛋白基因CFACT1啟動(dòng)子的一個(gè)活性片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花肌動(dòng)蛋白基因CFACT1,及其纖維特異性啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子顯示強(qiáng)烈的纖維特異性活性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1377417SQ00813722
公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月1日
發(fā)明者李學(xué)寶, 蔡林, 程寧輝, 劉建偉 申請(qǐng)人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院