專利名稱：Fungamyl樣α－淀粉酶變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及FungamylTM樣α-淀粉酶的α-淀粉酶變體(突變體)，具體是改進了在酸性pH值下的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明也涉及這樣的變體的應用。
背景技術：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)組成一組酶，其可以催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-葡糖苷寡糖和多糖水解。
有大量的專利和科學文獻涉及此類在工業(yè)上很重要的酶。被稱為“Termamyl樣α-淀粉酶”的α-淀粉酶及其變體可從例如WO 90/11352，WO95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873，和WO 96/23874中了解。Termamyl樣α-淀粉酶熱穩(wěn)定性很高，因此適于高溫下的處理過程，如葡萄糖生產(chǎn)過程中的淀粉液化。
還有一組稱為“FungamylTM樣α-淀粉酶”的α-淀粉酶，它們與得自米曲霉的α-淀粉酶(表示為SEQ ID NO1)相關。這些Fungamyl樣α-淀粉酶熱穩(wěn)定性相對較低(Novo Nordisk，丹麥，的商品名為FUNGAMYL的市售產(chǎn)品，最適溫度約為55℃)，因此不適于在高溫下進行處理。目前Fungamyl樣α-淀粉酶用于制造，例如釀造工業(yè)所用糖漿。這樣的處理在約60℃下進行，導致由于其熱穩(wěn)定性較低而加入的酶量必需加倍。此外，在55℃下可能會出現(xiàn)污染問題。
還由于目前這樣的處理在pH5.5下，而不是，例如pH4.5進行，故必需調(diào)整pH并向糖漿中加入鈉。
因此，提供優(yōu)選在酸性pH條件下熱穩(wěn)定性提高的Fungamyl樣α-淀粉酶是有利的。
發(fā)明簡述本發(fā)明目的是提供Fungamyl樣α-淀粉酶變體，具體是改進了特別是在酸性pH下的熱穩(wěn)定性。
術語“改進了熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體”在本文中指比相應的親本α-淀粉酶有較高熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體。熱穩(wěn)定性如下文在材料和方法部分所述進行確定。
如下所述，本發(fā)明人提供了改良的Fungamyl樣α-淀粉酶變體。
發(fā)明詳述本發(fā)明目的是改進Fungamyl樣α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性，尤其在酸性pH下。
鑒定為改進熱穩(wěn)定性而要突變的位點和/或區(qū)分子動力學(MD)模擬指示蛋白質(zhì)結(jié)構中氨基酸的可變性(mobility)(參見McCammon，JA和Harvey，SC.，(1987)，“Dynamics of proteins and nucleicacids”.Cambridge University Press.)。這樣的蛋白質(zhì)動力學經(jīng)常與晶體學B-因子(參見Stout，GH和Jensen，LH，(1989)，“X-ray structuredetermination”，Wiley)或B-因子自身對比。通過在可滴定殘基的不同質(zhì)子化狀態(tài)進行MD模擬，模擬了殘基的pH相關可變性。選擇具有最高可變性或靈活性(flexibility)(在此為各向同性的波動)的區(qū)進行隨機誘變。在此應理解地是在蛋白特定區(qū)發(fā)現(xiàn)的高流動性可通過在這些殘基進行替換而改進熱穩(wěn)定性。所述替換針對具有較大的側(cè)鏈和/或能改進與周圍殘基的接觸的殘基。得自米曲霉表示為SEQ ID NO2的親本Fungamylα-淀粉酶骨架用于所述MD模擬。
通過分子動力學(MD)模擬或B因子檢查(如收入Protein DataBase(PDB)(www.rcsb.org)file 6TAA(Swift，H.J.，Brady，L.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.J.，Dodson，G.G.，Turkenburg，J.P.，Wilkingson，A.J.Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae(TAKA)alpha-amylasean application of the simulated-annealing method.Acta CrystallogrB 47 pp.535(1991))發(fā)現(xiàn)的適合進行突變，以獲得具體是改進的熱穩(wěn)定性的區(qū)如下所列98-110區(qū)，150-160區(qū)，161-167區(qū)，280-288區(qū)，448-455區(qū)，468-475區(qū)。
上述區(qū)表現(xiàn)出是可變的。使這些區(qū)更穩(wěn)定會使該分子熱穩(wěn)定性更高。
相應地，本發(fā)明的第一個方面涉及在下述的區(qū)和位置包含一或多個突變的親本Fungamyl樣α-淀粉酶。
命名法在本說明書和權利要求中，使用傳統(tǒng)的一個和三個字母表示氨基酸殘基。為便于引用，本發(fā)明的α-淀粉酶變體采用下述的命名法原氨基酸位置用于取代的氨基酸依照此命名法，舉例說明，比如在位置30天冬酰胺對丙氨酸的取代表示為Ala30Asn或A30N在同樣位置丙氨酸的缺失表示為Ala30*或A30*一個額外氨基酸殘基，例如賴氨酸的插入，表示為Ala30AlaLys或A30AK一段連續(xù)氨基酸殘基的缺失，例如氨基酸殘基30-33，表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
與其它α-淀粉酶相比，特定α-淀粉酶包含一個“缺失”并在此位置有一個插入，這表示為*36Asp或*36D它用于表示在位置36插入天冬氨酸多個突變由加號分隔，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S代表在位置30和34的突變，由天冬酰胺和絲氨酸分別取代丙氨酸和谷氨酸。多個突變也可如下分隔表示，意義與加號相同Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S當有一個或多個備選氨基酸可以插入一個特定位置時，可以指示為A30N，E或A30N或A30E此外，當本文中鑒定出一個適于修飾的位點而沒有提示任何特定的修飾時，這應理解為此位點的氨基酸殘基可以為任一氨基酸殘基取代。這樣，例如，當提到在位點30的丙氨酸的修飾，而沒有特別指明，或者表示為“A30X”時，應理解為丙氨酸可以缺失或為任一其它氨基酸，即R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V中的任一個取代。
Fungamyl樣α-淀粉酶本發(fā)明的具有α-淀粉酶活性的親本Fungamyl樣α-淀粉酶與SEQ IDNO1所示編碼α-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ ID NO2所示α-淀粉酶蛋白序列的成熟部分有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少93％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，更優(yōu)選至少99％的同一性，和/或結(jié)構類似于SEQ ID NOS1和2所示Fungamyl α-淀粉酶的三維結(jié)構，還公開在Protein Data Base(PDB)(www.rcsb.org)file 6TAA(Swift，H.J.，Brady，L.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.J.，Dodson，G.G.，Turkenburg，J.P.，Wilkingson，A.J.Structure and moleculare model refinement of Aspergillus oryzae(TAKA)alpha-amylasean application of the simulated-annealing method.Acta CrystallogrB 47 pp.535(1991)和/或由能與SEQ ID NO1所示DNA序列中編碼本說明書SEQ ID NO2所示α-淀粉酶成熟部分的DNA雜交的DNA序列編碼。
定義“Fungamyl樣α-淀粉酶”包括的這類α-淀粉酶的具體例子有米曲霉TAKAα-淀粉酶(EP 238 023)，見SEQ ID NO2，在EP383779 B2(部分)披露的黑曲霉α-淀粉酶(還參見實施例1的黑曲霉基因的克隆)。
在一個實施方案中，F(xiàn)ungamyl樣α-淀粉酶得自一種真菌，具體是曲霉屬，具體是米曲霉或黑曲霉。
市售親本Fungamyl樣α-淀粉酶市售親本Fungamyl樣α-淀粉酶包括Fungamyl(Novo Nordisk，丹麥)。Fungamyl是得自米曲霉特定菌株的真菌α-淀粉酶。在淀粉工業(yè)中，F(xiàn)ungamyl用于高麥芽糖糖漿，45-60％麥芽糖(2-7％葡萄糖)或高轉(zhuǎn)化糖漿，DE 60-70，35-43％葡萄糖，30-37％麥芽糖，的生產(chǎn)。其它市售真菌α-淀粉酶包括得自米曲霉的ClaraseTM(Genencor Int.，美國)；和得自黑曲霉的MaltamylTM(Enzyme Biosystems)。
在釀造工業(yè)中，在發(fā)酵期間加入FUNGAMYL(和類似產(chǎn)品)以提高麥芽汁的發(fā)酵能力。
在乙醇工業(yè)中，如果現(xiàn)有設備可以進行低溫液化(55-60℃)，則FUNGAMYL可用于蒸餾醪液(distillery mash)的淀粉液化。FUNGAMYL(及類似產(chǎn)品)還可用于烘烤，可用于所有類型的面包和焙烤產(chǎn)品。例如FUNGAMYL改進了生面團穩(wěn)定性，導致更大的面包體積，改進了面包屑松軟程度，使外皮顏色更深。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體本發(fā)明的第一個方面涉及親本Fungamyl樣α-淀粉酶的變體，其在NO2所示氨基酸序列中下列位置或區(qū)包含一或多個突變98-110區(qū)，150-160區(qū)，161-167區(qū)，280-288區(qū)，448-455區(qū)，468-475區(qū)，和/或在與表示為SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少60％同一性的同源Fungamyl樣α-淀粉酶中對應的位置或區(qū)內(nèi)包含一或多個突變。
在一個實施方案中突變的區(qū)是98-110區(qū)。
在一個實施方案中突變的區(qū)是98-110區(qū)，更具體地是一或多個下列位置98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110。
具體地替換是98X，優(yōu)選T；99X，優(yōu)選T；
100F，Y，W，I，M；優(yōu)選Y；101R；102S，T，V；103I，F(xiàn)，V，優(yōu)選I；104T，V，I；105X，優(yōu)選A；106V，L，N，D，Q，E，優(yōu)選V；107V，I，M；108Y，R，K；109D，N，Q；110Q。
在一個實施方案中突變區(qū)是150-160區(qū)，更具體地是一或多個下列位置150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160。
具體的替換是151Y，Q，L，I，R，優(yōu)選Y；152V，L；153T，N，S，優(yōu)選S；154L，Y，V，T，S，優(yōu)選L；155F，N，L；156X，優(yōu)選D，N，S，T；157S，T，N；158E，Y159X，優(yōu)選S，A；160X，優(yōu)選N；在一個實施方案中突變區(qū)是161-167區(qū)，更具體地是一或多個下列位置161，162，163，164，165，166，167。
具體的替換是161I，S，T；162D，N，Q，Y；163E，Q，N；166V，F(xiàn)，Y，I，S，T，優(yōu)選V，F(xiàn)，Y；
167A；在一個實施方案中突變區(qū)是280-288區(qū)，更具體地是一或多個下列位置280，281，282，283，284，285，286，287，288。
具體的替換是280Q，Y，R；281X，優(yōu)選T，A；282X，優(yōu)選S，T；285L，N；286X，優(yōu)選D；287V，S，A；288N，F(xiàn)，Y，E，D，優(yōu)選N；在一個實施方案中突變區(qū)是448-455區(qū)，更具體地是一或多個下列位置448，449，450，451，452，453，454，455。
具體的替換是448X，優(yōu)選A，L，Y，S，T；449X，優(yōu)選L，V，S，T；450I，T，L；452I，L；454I，L；455D，E，S，T。
在一個實施方案中突變區(qū)是468-475區(qū)，更具體地是一或多個下列位置468，469，470，471，472，473，474，475。
具體的替換是468F，Y，H；469E，D，Q，N；470X，優(yōu)選A，S，T；471N，T，K，R，F(xiàn)，Y優(yōu)選N，T，Y；472R；473L，N，Y；475X，優(yōu)選T，R。
在酸性pH下改進的穩(wěn)定性本發(fā)明的一個目的是使Fungamyl樣α-淀粉酶對比其親本α-淀粉酶(即，對應的未突變α-淀粉酶)更耐酸性。
Fungamyl樣α-淀粉酶變體比其親本Fungamyl樣α-淀粉酶更耐酸性意味著其在酸性pH下的穩(wěn)定性比其對應的親本α-淀粉酶更高。可按照“材料和方法”部分所述確定所述淀粉酶更耐酸。
術語“酸性pH”至少在本文中意指pH范圍為4-6，比如4-5，尤其4.2-4.7。
需要更耐酸的真菌α-淀粉酶，因為這可以使真菌α-淀粉酶變體與合適的葡糖淀粉酶一起或同時在，例如淀粉加工中的(糊精化)糖化步驟中使用。
熱穩(wěn)定性本發(fā)明的一個目的是提供更耐熱的Fungamyl樣α-淀粉酶。
Fungamyl樣α-淀粉酶變體比親本Fungamyl樣α-淀粉酶更耐熱意味著其最適溫度更高。所述淀粉酶更耐熱可按照“材料和方法”部分所述來確定。
需要更耐熱的真菌α-淀粉酶，因為它使液化步驟更有效和/或更快。此外，其對液化溫度更不敏感，甚至可以提高溫度(即，對冷卻要求的更少)。此外，也降低了污染的風險。
應該理解地是本發(fā)明的變體可以同時為酸性pH更穩(wěn)定和熱更穩(wěn)定，尤其在酸性pH下熱穩(wěn)定性更高。
同源性(同一性)上述親本α-淀粉酶的同源性(同一性)表示兩種蛋白質(zhì)或DNA序列間相互偏差的程度?？赏ㄟ^本領域已知的計算機程序，如GCG軟件包的GAP程序(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，1994年8月，遺傳學計算機組，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，p.443-453)適當確定同源性(同一性)。進行核酸序列對比時，使用(缺省的)GAP產(chǎn)生罰分5.0，GAP延伸罰分0.3；進行蛋白質(zhì)對比時，使用(缺省的)GAP產(chǎn)生罰分3.0，缺口延伸罰分0.1。GAP采用Needleman和Wusch，(1970)，J.Mol.Biol.48，p.443-453，的方法進行比對并計算同一性。
采用多肽或DNA序列對比時所用的GAP及上述設置，親本Fungamyl樣α-淀粉酶與SEQ ID NO2所示氨基酸序列的成熟部分和SEQ ID NO1所示DNA序列的編碼部分有優(yōu)選至少60％的同一性，如70％，至少80％，至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，更優(yōu)選至少99％。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明變體改進了熱穩(wěn)定性，尤其在酸性pH下。
雜交鑒定Fungamyl樣α-淀粉酶所用寡核苷酸探針可基于目的α-淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列來制備。
雜交的合適條件包括在5×SSC中預浸，在20％甲酰胺，5×Denhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH6.8，和50mg超聲變性的牛胸腺DNA溶液中在～40℃下預雜交1小時，然后在補充有100mM ATP的相同溶液中40℃下雜交18小時，然后將雜交膜在2×SSC，0.2％SDS中，40℃下(低嚴謹度)洗30分鐘，共三遍，優(yōu)選在50℃下(中等嚴謹度)，更優(yōu)選在65℃下(高嚴謹度)，更為優(yōu)選75℃(極高嚴謹度)。有關雜交方法的細節(jié)可參照Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港，1989。
在本文中，“得自”不僅指α-淀粉酶由或可由目的生物的菌株產(chǎn)生，也指由分離自這類菌株的DNA序列編碼的α-淀粉酶和在用該DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物中產(chǎn)生的α-淀粉酶。最后，該術語指由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼并具有目的α-淀粉酶的鑒定特征的α-淀粉酶。該術語也指親本α-淀粉酶可以是自然存在的α-淀粉酶的變體，即，自然存在的α-淀粉酶經(jīng)一或多個氨基酸殘基修飾(插入，替換，缺失)而產(chǎn)生的變體。
克隆編碼Fungamyl樣α-淀粉酶的DNA序列，克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列，克隆編碼a-淀粉酶的DNA序列可采用本領域各種已知方法，從生產(chǎn)α-淀粉酶的任何細胞或微生物分離編碼親本Fungamyl樣α-淀粉酶的DNA序列。首先，采用染色體DNA或信使RNA從產(chǎn)生待研究α-淀粉酶的生物構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果所述α-淀粉酶的氨基酸序列已知，可合成標記的寡核苷酸探針并用于鑒定目的生物基因組文庫中編碼α-淀粉酶的克隆。備選地，包含與另一已知α-淀粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針可用作探針經(jīng)較低嚴謹度的雜交和沖洗條件鑒定α-淀粉酶編碼克隆。
鑒定α-淀粉酶編碼克隆的另一方法包括將基因組DNA片段插入一表達載體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化α-淀粉酶陰性細菌，然后將轉(zhuǎn)化細菌鋪板在含有α-淀粉酶底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，使表達目標α-淀粉酶的克隆生長。
備選地，所述酶的DNA序列可通過現(xiàn)有標準方法合成，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，Tetrahedron Letters 22，p.1859-1869，或Matthes等，(1984)，EMBO J.3，p.801-805所述亞磷酰胺(phosphoroamidite)方法。在亞磷酰胺方法中，在例如自動DNA合成儀上合成寡核苷酸，純化，退火，連接并克隆在合適的載體中。
最后，可根據(jù)標準技術，將合成的、基因組來源的或cDNA來源的片段(根據(jù)需要，所述片段對應于完整DNA序列的各個部分)連接在一起，從而將DNA序列制備成基因組片段與合成片段的混合物，合成片段與cDNA片段的混合物或基因組片段與cDNA片段的混合物。DNA序列還可用特異性引物經(jīng)聚合酶鏈式反應(PCR)來制備。如US 4683202或R.K.Saiki等，(1988)，Science 239，pp.487-491中所述。
定點誘變一旦分離出編碼α-淀粉酶的DNA序列，并鑒定出合乎需要的突變位點，可使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)翼于所需突變位點的核苷酸序列。在特定的方法中，在攜有α-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生橋連α-淀粉酶-編碼序列的單鏈DNA缺口。然后，使攜有所需突變的合成核苷酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)補平其余缺口，使用T4連接酶連接構建體。該方法的特例描述于Morinaga等(1984)，Biotechnology 2，p.646-639。US 4,760,025公開了通過對盒(cassette)進行微小的改變而導入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，由于Morinaga法可以導入多種長度的多個寡核苷酸，因此可在任何一次導入甚至更多個突變。
Nelson和Long(1989)，Analytical Biochemistry 180，p.147-151描述了另一種將突變導入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個步驟產(chǎn)生含有所需突變的PCR片段，所述突變是通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應的一個引物而導入的。通過用限制性內(nèi)切核酸酶裂解，可從PCR-產(chǎn)生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并將該片段重新插入表達質(zhì)粒。
隨機誘變可在翻譯成本文所示氨基酸序列的基因的至少3個部分中，或在整個基因內(nèi)適當?shù)剡M行隨機誘變，所述誘變可以是定域的或區(qū)域-特異性的隨機誘變。
利用本領域已知的任何方法，可以方便地對編碼親本α-淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變。
與上文相關，本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生親本Fungamyl樣α-淀粉酶的變體的方法，例如，其中變體相對于親本而言，表現(xiàn)出經(jīng)改變的或增加的熱穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對編碼親本Fungamyl樣α-淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達α-淀粉酶變體的宿主細胞，所述變體相對于親本Fungamyl樣α-淀粉酶而言具有經(jīng)改變的特性(如熱穩(wěn)定性)。
優(yōu)選使用添加(doped)引物進行本發(fā)明上述方法中的步驟(a)，如在工作實施例中所述(參見下文)。
例如，可使用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W誘變劑，使用適當?shù)墓押塑账幔蛲ㄟ^對DNA序列進行PCR以產(chǎn)生誘變來進行隨機誘變。另外，可使用這些誘變劑的任何組合進行隨機誘變。誘變劑可以是例如誘導堿基轉(zhuǎn)換，顛換，倒位，倒頻，缺失和/或插入的試劑。
適用于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，鄰甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當使用這些誘變劑時，一般通過在適于發(fā)生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下保溫待誘變的編碼親本酶的DNA序列來進行誘變，然后篩選具有所需特性的突變DNA。
當利用寡核苷酸進行誘變時，在合成待改變位置處的寡核苷酸的過程中，可同時添加寡核苷酸和3個非-親本核苷酸。添加的目的是避免不必要氨基酸的密碼子?？赏ㄟ^任何公開的技術如使用PCR，LCR或適當時使用任何DNA聚合酶和連接酶，將添加的寡核苷酸摻入編碼α-淀粉酶的DNA。
優(yōu)選使用“恒隨機的添加”進行添加，其中各個位置的野生型和突變的百分比是預先確定好的。另外，添加可以導致優(yōu)先導入某些核苷酸，從而優(yōu)先導入一個或多個特定的氨基酸殘基。例如，進行添加后可在每個位置導入90％野生型和10％突變。選擇添加方案的其它考慮基于遺傳學以及蛋白質(zhì)-結(jié)構的限制?？墒褂肈OPE程序制訂添加方案，所述程序可特別地確保不導入終止密碼子。
當使用PCR-產(chǎn)生的誘變時，可在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經(jīng)化學處理或未經(jīng)處理的編碼親本α-淀粉酶的基因進行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變株對編碼α-淀粉酶的DNA進行隨機誘變，誘變方法包括例如將含有親本葡糖淀粉酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至增變株，培養(yǎng)含有質(zhì)粒的增變株，從增變株中分離突變的質(zhì)粒。隨后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達生物。
待誘變的DNA序列可以方便地存在于基因組或cDNA文庫中，所述文庫生產(chǎn)自表達親本α-淀粉酶的生物?；蛘撸珼NA序列可以存在于適當?shù)妮d體，如質(zhì)粒或噬菌體上，再與誘變劑一起保溫或要不然暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細胞中，或者整合于所述細胞的基因組中，或者存在于細胞所攜帶的載體上。最后，待誘變的DNA也可以是分離的形式。應理解接受隨機誘變的DNA序列優(yōu)選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下可于實施表達步驟b)或篩選步驟c)前方便地擴增突變的DNA序列?？筛鶕?jù)本領域已知的方法進行擴增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用根據(jù)親本酶的DNA或氨基酸序列生產(chǎn)的寡核苷酸引物進行PCR擴增。
與誘變劑保溫或暴露于誘變劑之后，通過在允許發(fā)生表達的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當宿主細胞來表達突變的DNA。用于此目的的宿主細胞可以是被突變的DNA序列(任選其存在于載體上)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，或者是在誘變處理的過程中攜有編碼親本酶的DNA序列的宿主細胞。適當宿主細胞的例子如下革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進一步含有能使突變的DNA序列表達的DNA序列。
定域隨機誘變隨機誘變可有利地定域于所述親本α-淀粉酶的一部分。例如，當酶的某些區(qū)域被鑒定為對酶的給定特性特別重要時，以及當預期修飾能導致具有改良特性的變體時，定域隨機誘變較為有利。當親本酶的三級結(jié)構已被闡明，且所述結(jié)構與酶的功能相關時，一般可鑒定出所述區(qū)域。
通過使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術或本領域已知的任何其它適當?shù)募夹g，可以方便地進行定域的或區(qū)域-特異性的隨機誘變?；蛘撸ㄟ^例如插入適當?shù)妮d體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對所述部分進行誘變。
提供本發(fā)明的變體的備選方法包括基因改組，例如WO95/22625(Affymax Technologies N.V.)所述，或如WO 96/00343(Novo NordiskA/S)，或其它產(chǎn)生含有所述突變，如替換和/或缺失的雜交酶的技術。
α-淀粉酶變體的表達根據(jù)本發(fā)明，可使用表達載體，以酶的形式表達通過上述方法，或通過本領域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點，翻譯起始信號的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活子基因。
表達載體攜有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能對其方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導入該載體的宿主細胞。載體可以是當導入宿主細胞時可以整合至宿主細胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復制的載體。合適的表達載體例如有pMT838。
啟動子在所述載體中，DNA序列應該與適當?shù)膯幼有蛄锌刹僮飨噙B。啟動子可以是在選定宿主細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。
介導編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當啟動子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動子，枯草芽孢桿菌xy1A和xy1B基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，釀酒酵母TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alber等，(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶。
表達載體本發(fā)明的表達載體也含有適當?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當?shù)氐米耘c啟動子相同的來源。
載體可進一步含有能使載體在所述宿主細胞中復制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復制起點。
載體也可含有選擇標記，例如其產(chǎn)物可以補償宿主細胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
分別連接編碼葡糖淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構建體，啟動子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復制所需信息的適當載體的方法是本領域技術人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
宿主細胞含有上文所定義的本發(fā)明DNA構建體或表達載體的本發(fā)明細胞可以有利地用作宿主細胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體?？梢苑奖愕赝ㄟ^將編碼變體的本發(fā)明DNA構建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構建體轉(zhuǎn)化細胞。一般認為整合是有利的，因為整合后DNA序列可以在細胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構建體整合至宿主染色體?；蛘?，可用與不同類型的宿主細胞有關的上述表達載體轉(zhuǎn)化細胞。
本發(fā)明的細胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優(yōu)選其為微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適合的細菌為革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細菌的轉(zhuǎn)化可以通過，例如原生質(zhì)轉(zhuǎn)化或利用感受態(tài)細胞以其本身已知的方式而實施。
酵母可優(yōu)選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。
宿主細胞可以是絲狀真菌，例如屬于曲霉屬的菌株，最優(yōu)選米曲霉或黑曲霉，或鐮孢屬菌株，如尖孢鐮孢，禾谷鐮孢(完整狀態(tài)即Gribberella zeae，以前為Sphaeria zeae，又名Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis)，或硫色鐮孢(完整狀態(tài)即Gribberella puricaris，又名三隔鐮孢，桿孢狀鐮孢，接骨木鐮孢，玫瑰色鐮孢，玫瑰色鐮孢的禾谷鐮孢變種)，F(xiàn)usariumcerealis(又名Fusarium crookwellnse)，或Fusarium venenatum。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中宿主細胞是蛋白酶缺陷型菌株或蛋白酶陰性菌株。例如可以是曲霉屬蛋白酶缺陷型菌株，具體是米曲霉菌株，例如有著堿性蛋白酶基因即“alp”缺失的米曲霉JaL125。在WO 97/35956(NovoNordisk)，中有此菌株的描述。
絲狀真菌細胞可用以下方法轉(zhuǎn)化，該方法涉及原生質(zhì)形成和原生質(zhì)轉(zhuǎn)化，然后細胞壁以其本身已知的方式再生。在EP238023(Novo Nordisk)中描述了曲霉作為宿主微生物的內(nèi)容，其內(nèi)容在此引作參考。
生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法更進一步的方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在利于所述變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細胞和從細胞及/或培養(yǎng)液中回收所述變體。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是任何適于目的宿主細胞生長和本發(fā)明α-淀粉酶變體得以表達的常規(guī)培養(yǎng)基?？捎玫呐囵B(yǎng)基可從銷售商購得或按照出版物(例如按美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄)制備。
通過已熟知的方法從培養(yǎng)液中可以方便地回收宿主細胞分泌的α-淀粉酶變體，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)液分離細胞，通過鹽如硫酸銨沉淀蛋白類成分，然后使用層析的方法，如離子交換層析，親和層析，等。淀粉轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供利用本發(fā)明的α-淀粉酶變體從淀粉生產(chǎn)葡萄糖或麥芽糖或其類似物的方法。
通常，該方法包括在α-淀粉酶存在下部分水解前體淀粉，然后在葡糖淀粉酶存在下通過裂解α-(1→4)和α-(1→6)糖苷鍵從淀粉或相關的寡-和多糖分子的非還原末端水解釋放D-葡萄糖。
利用α-淀粉酶對前體淀粉進行部分水解使淀粉分子因內(nèi)部的α-(1→4)鍵水解而初步降解。在商業(yè)應用中，利用α-淀粉酶初步水解在約105℃下進行。處理的淀粉濃度很高，通常30％-40％固含量。初步水解在這樣高的溫度下一般進行5分鐘。然后將部分水解的淀粉轉(zhuǎn)移到第二個罐，85-90℃溫育約1小時，得到10-15的葡萄糖當量值(D.E.)。
通常在一個單獨的罐中使溫度降低到30-60℃之間進行進一步的水解，這是在葡糖淀粉酶的參與下從淀粉或相關的寡-和多糖分子的非還原末端釋放出D-葡萄糖。底物液體溫度優(yōu)選降至55-60℃之間。溶液pH值從6-6.5降至3-5.5。優(yōu)選溶液pH為4-4.5。將葡糖淀粉酶加入該溶液中，反應24-72小時，優(yōu)選36-48小時。
通過按照本發(fā)明改進Fungamyl樣α-淀粉酶變體的熱穩(wěn)定性，該α-淀粉酶可用于淀粉液化過程。
本發(fā)明的一個方面涉及在淀粉轉(zhuǎn)化加工中使用本發(fā)明的α-淀粉酶變體。
釀造本發(fā)明的α-淀粉酶變體可用于釀造加工。
生產(chǎn)高麥芽糖糖漿(55％麥芽糖)本發(fā)明的變體可用于麥芽糖的生產(chǎn)。高麥芽糖糖漿一般如下產(chǎn)生高麥芽糖糖漿(含有50％-55％麥芽糖)的生產(chǎn)為生產(chǎn)“高麥芽糖糖漿”，將淀粉液化為DE10-20。將液化淀粉的pH和溫度分別調(diào)整為65℃和pH約5.0，使其接受產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶(例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶，如MaltogenaseTM4000L，0.4 l/t DS(NovoNordisk))，支鏈淀粉酶(例如，芽孢桿菌支鏈淀粉酶，如PromozymeTM600L，0.3 l/t DS)(Novo Nordisk))和α-淀粉酶(例如，BAN 240L或TermamylTM120L，LS型，0.4kg/t DS)(Novo Nordisk))處理24-41小時。具體的處理時間取決于所需的糖混合物組成。通過提高產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶和支鏈淀粉酶用量，可提高麥芽糖含量。
備選地，“高麥芽糖糖漿”可如下產(chǎn)生，首先將淀粉液化為DE 10-20，然后將液化淀粉的pH和溫度分別調(diào)整為55℃和pH約5.5，使其接受真菌α-淀粉酶(例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶，如FungamylTM800L(Novo Nordisk))處理22-44小時。真菌α-淀粉酶用量有賴于預計的糖化時間，例如200g/t DS處理44小時，400g/t DS處理22小時。
麥芽糖含量為55-65％的“高麥芽糖糖漿”可如下產(chǎn)生，首先將淀粉液化為DE 10-20，然后將液化淀粉的pH和溫度分別調(diào)整為60℃和pH約6，再使該液化淀粉接受產(chǎn)麥芽糖的(Maltogenic)α-淀粉酶(例如，MaltogenaseTM4000L，0.25-1.0 l/t DS(Novo Nordisk))，真菌α-淀粉酶(例如，曲霉菌淀粉酶，如FungamylTM800L，0.4-1.0 kg/t DS(Novo Nordisk))處理24-48小時。
備選地，可將液化淀粉調(diào)整為溫度65℃，pH約5.0，然后用產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶(例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶，如MaltogenaseTM4000L，0.5-1.0 l/t DS)，支鏈淀粉酶(例如，芽孢桿菌支鏈淀粉酶，如PromozymeTM600L，0.5-1.0 l/t DS)處理18-42小時。
依照本發(fā)明，本發(fā)明的一或多個Fungamyl樣變體可用于替代上述真菌α-淀粉酶或與之一起作用。
烘烤本發(fā)明的α-淀粉酶變體可用于烘烤處理。
應用本發(fā)明的一個方面涉及本發(fā)明變體應用于淀粉轉(zhuǎn)化，乙醇生產(chǎn)，釀造，烘烤。
本發(fā)明的加工方法本發(fā)明也涉及生產(chǎn)麥芽糖糖漿的方法，其包括如下步驟1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉；2)在本發(fā)明的真菌α-淀粉酶變體存在下進行糊精化；3)回收糖漿；可選擇純化糖漿。
步驟1)所用于液化的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。優(yōu)選的α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶，如Termamyl樣α-淀粉酶，其包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(以商品名TermamylTM(Novo Nordisk)出售)，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(以商品名BAN(Novo Nordisk)出售)，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(以TermamylTM120L S型的名義出售)。所述α-淀粉酶得自芽孢桿菌菌株NCIB 12289，NCIB12512，NCIB 12513或DSM 9375，所有這些在WO 95/26397中都有詳述，所述α-淀粉酶記述在Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31中?！癟ermamyl樣α-淀粉酶”定義中的α-淀粉酶在如WO 96/23874(Novo Nordisk)中有記述。
本發(fā)明的另一方面涉及生產(chǎn)麥芽糖的加工過程，其包括如下步驟1)在pH4-6，140-160℃下液化淀粉；2)在本發(fā)明的真菌α-淀粉酶變體存在下，在60-95℃的溫度范圍內(nèi)，尤其在65-85℃，如70-80℃，pH4-6，進行糊精化；3)回收糖漿；可選擇純化糖漿。
本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟2)中加入有效量的葡糖淀粉酶。在此實施方案(包括用葡糖淀粉酶進行的處理)中所述糖漿將不是麥芽糖糖漿，而是具有不同糖組分的糖漿。
葡糖淀粉酶可以是曲霉菌葡糖淀粉酶，具體是黑曲霉葡糖淀粉酶。
備選地，此過程包括如下步驟1)在95-110℃，pH4-6，芽孢桿菌α-淀粉酶存在下，液化淀粉；2)本發(fā)明真菌α-淀粉酶變體存在下，70-95℃，pH4-6下液化，然后回收和/或任選純化所得產(chǎn)品。
固定化的本發(fā)明真菌α-淀粉酶變體本發(fā)明的一個方面涉及固定化的本發(fā)明真菌α-淀粉酶變體。所述α-淀粉酶變體可通過任何本領域已知方法固定，如US 4687742用于葡萄糖異構酶的方法。
材料和方法材料酶FUNGAMYL得自米曲霉的真菌α-淀粉酶(得自Novo Nordisk)并表示為SEQ ID NO2。
宿主細胞米曲霉JaL125米曲霉IFO4177，得自Institute for Fermention，Osaka；17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本，其中被稱為“alp”的堿性蛋白酶基因(參見Murakami K等，(1991)，Agric.Biol.Chem.55，p.2807-2811)通過一步基因取代方法而缺失(參見G.May，“Applied MolecularGenetics of Filamentous Fungi”(1992)，p.1-25.J.R.Kinghorn和G.Turner編；Blackie Academic and Professional)，采用米曲霉pyrG基因作標記。菌株JaL 125還公開在WO 97/35956(Novo Nordisk)中。
微生物菌株釀酒酵母YNG318MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir+]
方法米曲霉的轉(zhuǎn)化(一般步驟)在100ml YPD(Sherman等，(1981)，Methods in Yeast Genetics，冷泉港實驗室)中接種米曲霉孢子，振蕩培育約24小時。通過微孔布過濾收獲菌絲體，用200ml 0.6M MgSO4沖洗。將菌絲體懸浮在15ml 1.2M MgSO4，10mMNaH2PO4，pH5.8中。將該懸浮液冰上冷卻，加入1ml含有120mgNovozymTM234的緩沖液。5分鐘后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，37℃下輕微攪拌培育1.5-2.5小時，直到鏡檢觀察樣品可見大量原生質(zhì)體。
微孔布過濾懸浮液，濾過液移入無菌試管，用5ml 0.6M山梨糖醇，100mM Tris-HCl，pH7.0覆蓋。1000g離心15分鐘，從MgSO4層頂部收集原生質(zhì)體。將2倍體積STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2)加入到原生質(zhì)體懸浮液中，將該混合物1000g下離心5分鐘。將原生質(zhì)體沉淀重懸于3ml STC中，重新沉淀。重復。最終，將原生質(zhì)體重懸于0.2-1ml STC中。
將100μL原生質(zhì)體懸浮液與5-25μg p3SR2(帶有構巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒，記述在Hynes等，Mol.and Cel.Biol.，Vol.3，No.8，1430-1439，1983年8月)混合在10μL STC中?；旌衔锸覝叵路胖?5分鐘，加入0.2ml 60％PEG4000(BDH 29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH7.5，仔細混合(兩次)，最終加入0.85ml相同溶液，仔細混合?；旌衔锸覝叵路胖?5分鐘，2500g旋轉(zhuǎn)15分鐘，所得沉淀重懸于2ml 1.2M山梨糖醇中。再次沉淀后，將原生質(zhì)體鋪板在基本培養(yǎng)基(Cove，(1966)上，Biochem.Biophys.Acta 113，51-56)，該培養(yǎng)基中含有1.0M蔗糖，pH7.0，以10mM乙酰胺作氮源，用20mM CsCl抑制背景生長。37℃下培育4-7天后，采集孢子，懸于無菌水中，分散為單個菌落。重復此步驟，從二次分離后的單菌落獲得的孢子作為定義的轉(zhuǎn)化體保存。
補料分批發(fā)酵進行補料分批發(fā)酵，所用培養(yǎng)基含有麥芽糖糊精(maltodextrin)作碳源，含有尿素作為氮源，并含有酵母浸膏。補料分批發(fā)酵如下進行將所需米曲霉宿主細胞搖瓶培養(yǎng)物接種到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中。pH5.0，34℃培養(yǎng)24小時后，開始連續(xù)流加額外的碳和氮源。以碳源為限制性因素，要保證氧氣過量。培養(yǎng)持續(xù)4天，然后經(jīng)過離心，超濾，澄清過濾和除菌過濾回收所述酶?？赏ㄟ^本領域已知的陰離子交換層析方法進一步純化。
純化將培養(yǎng)液過濾，加入硫酸銨(AMS)使之濃度到1.7M AMS，調(diào)pH為5。離心去除沉淀的物質(zhì)，含α-淀粉酶活性的溶液上樣到預先用1.7M AMS，20mM乙酸鈉，pH5平衡的Toyo Pearl Butyl柱。用平衡緩沖液洗去未結(jié)合的物質(zhì)。用10mM乙酸鈉，pH4.5以在10倍柱體積中1.7-0M AMS的線性梯度洗脫被結(jié)合的物質(zhì)。收集含有葡糖淀粉酶的級分，對20mM乙酸鈉，pH4.5透析。
篩選耐熱的α-淀粉酶變體在下述的耐熱濾膜分析中篩選文庫。
耐熱性的濾膜分析將酵母文庫鋪板在含有100μg/ml氨芐青霉素的SC ura-瓊脂板上的醋酸纖維素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)-硝酸纖維素(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)濾膜夾層上，30℃下至少72小時。將菌落影印到已用甲醇活化了1分鐘的PVDF濾膜(Immobilon-P，Millipore，Bedford)上，隨后在0.1M NaAc中清洗，再在室溫下培育2小時。用自來水洗下PVDF濾膜上的菌落。在培育前用針對每一濾膜夾層和PVDF濾膜特別標記以便在篩選后定位濾膜上的陽性變體。將結(jié)合有變體的PVDF濾膜轉(zhuǎn)移到有0.1M NaAc，pH4.5的容器上，47℃下溫育15分鐘。SC ura-瓊脂板上的醋酸纖維素和硝酸纖維素濾膜夾層在室溫下保存?zhèn)溆?。溫育后，在含?％麥芽糖，1％瓊脂糖，50mM NaAc，pH4.5的平板上檢測殘余活性。帶有PVDF濾膜的分析平板以與濾膜夾層相同的方法標記，并在50℃下溫育2小時。除去PVDF濾膜后，用Glucose GOD perid(BoehringerMannheim GmbH，德國)對分析平板染色。有殘余活性的變體在分析平板上檢測為白色背景上的深綠色斑點。改進的變體位于保存平板上。在與第一次篩選相同的條件下重新篩選改進的變體兩次。
FAU活性的測定一個真菌α-淀粉酶單位(FAU)確定為以基于下列標準條件的確定α-淀粉酶的Novo Nordisk標準方法測定的每小時分解5.26g淀粉(Merck Amylum可溶性Erg.B.6，批號9947275)的酶量底物.....................可溶性淀粉溫度.....................37℃pH.....................4.7反應時間.....................7-20分鐘有對Novo Nordisk標準方法的詳述以備查詢。
測定酸性α-淀粉酶活性(AFAU)測定酸性α-淀粉酶活性為AFAU(酸性真菌α-淀粉酶單位)，其相對于酶標準品來測定。
所用標準品是AMG 300L(得自Novo Nordisk)。在此AMG中的中性α-淀粉酶在室溫下保藏3周后從約1FAU/mL降至0.05FAU/mL。
此AMG標準品中的酸性α-淀粉酶活性按照A/F 9 1/3(Novo測定真菌α-淀粉酶的方法)測定。此方法中，1FAU定義為，在標準條件下每小時降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。
碘與淀粉形成藍色復合物，而不能與淀粉的降解產(chǎn)物形成復合物。因此顏色的強度正比于淀粉濃度。采用反比色法(reverse colorimetry)將淀粉酶活性測定為在特定的分析條件下淀粉濃度的降低。
α-淀粉酶淀粉+碘 → 糊精+寡糖40℃，pH2.5藍/紫t＝23秒 脫色標準條件/反應條件(每分鐘)底物 淀粉，約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，約0.03M碘(I2) 0.03g/L
CaCl21.85mMpH2.50±0.05溫育溫度40℃反應時間23秒波長λ＝590mm酶濃度0.025 AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL可從Novo Nordisk索取EB-SM-0259.02/01查詢細節(jié)，該文獻在此引入作為參考。
本發(fā)明變體的熱/pH穩(wěn)定性測定采用下列方法測試本發(fā)明變體的熱穩(wěn)定性950μL 0.1M檸檬酸+4.3mM Ca2+緩沖液60℃下溫育1小時。加入50μL含酶緩沖液(4 AFAU/ml)。在0和60分鐘取樣2×40μL，冰上冷卻。溫育前測定的活性(AFAU/ml)用作參考(100％)。計算降低百分率相對溫育時間的函數(shù)。
為確定熱穩(wěn)定性，在不同溫度，例如50，60，70，80和90℃下重復上述試驗。
為確定pH穩(wěn)定性，該實驗在不同pH下重復進行，例如pH2.5；3；3.5；4；4.5；5。
采用DOPE程序進行隨機誘變的通用方法可如下進行隨機誘變1.在親本酶中挑選要改變的目的區(qū)，2.確定所挑選區(qū)中的突變位點和非突變位點，3.根據(jù)所要構建的變體的所需穩(wěn)定性和/或性能決定進行何種突變，4.挑選結(jié)構合理的突變，5.根據(jù)步驟4調(diào)整步驟3所選殘基，6.通過使用合適的dope算法分析核苷酸分布，7.如果需要，調(diào)整目標殘基為基因編碼實用性，例如考慮基因編碼的限制，例如避免導入終止密碼子；本領域一般技術人員了解一些密碼組合不能實際應用應予以調(diào)整
8.制備引物9.用所述引物進行隨機誘變10.通過篩選所要改進的性質(zhì)挑選所得葡糖淀粉酶Dope算法本領域人員熟知步驟6所用的合適的dope算法。例如Tomandl，D.等，1997，Journal of Computer-Aided Molecular Design 1129-38所述的。另一算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A，和Kretzschmar，T(1998)Nucleic Acids Research 26697-702)。
實施例實施例1變體Q153S的構建為構建TAKA-淀粉酶(以SEQ ID NO1和2表示的FungamylTM)的變體，按照生產(chǎn)商的指示使用市售Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒。
編碼目的淀粉酶的基因是在質(zhì)粒pTAKA17(EP 238023，圖2和實施例2)中。按照生產(chǎn)商指示通過使用下列引物將pTAKA17中氨芐青霉素基因的ScaI位點改變?yōu)镸lul位點引物72585’p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’(SEQ ID NO3)采用所述引物除去在Amylase基因的內(nèi)顯子中的ScaI位點。
引物15’p ATG GTT CAT TTC AGA ACT GAC ATT GAG TAA(SEQ ID NO4)通過添加合適的含有所需突變的寡核苷酸將所需突變導入目的淀粉酶基因中。
為導入突變?nèi)鏠153S，設計寡核苷酸引物25’p TTC TGT TTC ATT TCG AAC TAT GAA GAT(SEQ ID NO5)
含有目的淀粉酶基因的pTAKA17載體用作DNA聚合酶，DNA連接酶(用于連接到寡核苷酸5’磷酸端(5’P))，和寡核苷酸7258，引物1和引物2的模板。
制備DNA的制品，經(jīng)測序證實已導入突變。
如“材料&方法”部分所述將DNA制品轉(zhuǎn)化到米曲霉宿主細胞中，篩選轉(zhuǎn)化體的淀粉酶活性。
實施例2提高的熱穩(wěn)定性按照“材料&方法”部分公開的熱穩(wěn)定性測定實驗來檢驗實施例1中構建的變體的熱穩(wěn)定性。
實施例3提高的耐酸性按照“材料&方法”部分公開的pH穩(wěn)定性測定試驗來檢測實施例1中構建的變體在酸性pH下穩(wěn)定性的增高。
序列表序列表<110>諾沃挪第克公司(Novo Nordiks A/S)<120>Fungamyl樣α-淀粉酶變體<130>5835.204-WO<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1734<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<220><221>CDS<222>(54)..(1547)<220><221>mat_peptide<222>(114)..()<400>1tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat aaaccccaca gaaggcattt atg atg56Met-20gtc gcg tgg tgg tct cta ttt ctg tac ggc ctt cag gtc gcg gca cct 104Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala Pro-15 -10 -5gct ttg gct gca acg cct gcg gac tgg cga tcg caa tcc att tat ttc 152Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe-1 1 5 10ctt ctc acg gat cga ttt gca agg acg gat ggg tcg acg act gcg act 200Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Thr15 20 25tgt aat act gcg gat cag aaa tac tgt ggt gga aca tgg cag ggc atc 248Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile30 35 40 45atc gac aag ttg gac tat atc cag gga atg ggc ttc aca gcc atc tgg 296Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp50 55 60atc acc 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aag gat gtg gtc aag aat gaa tgg tac gac 680Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr Asp175 180 185tgg gtg gga tca ttg gta tcg aac tac tcc att gac ggc ctc cgt atc 728Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile190 195 200 205gac aca gta aaa cac gtc cag aag gac ttc tgg ccc ggg tac aac aaa 776Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Lys210 215 220gcc gca ggc gtg tac tgt atc ggc gag gtg ctc gac ggt gat ccg gcc 824Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ala225 230 235tac act tgt ccc tac cag aac gtc atg gac ggc gta ctg aac tat ccc 872Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro240 245 250att tac tat cca ctc ctc aac gcc ttc aag tca acc tcc ggc agc atg 920Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser Met255 260 265gac gac ctc tac aac atg atc aac acc gtc aaa tcc gac tgt cca gac 968Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro Asp270 275 280 285tca aca ctc ctg ggc aca ttc gtc gag aac cac gac aac cca cgg ttc 1016Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe290 295 300gct tct tac acc aac gac ata gcc ctc gcc aag aac gtc gca gca ttc 1064Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala Phe305 310 315atc atc ctc aac gac gga atc ccc atc atc tac gcc ggc caa gaa cag 1112Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln320 325 330cac tac gcc ggc gga aac gac ccc gcg aac cgc gaa gca acc tgg ctc 1160His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu335 340 345tcg ggc tac ccg acc gac agc gag ctg tac aag tta att gcc tcc gcg 1208Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser Ala350 355 360 365aac gca atc cgg aac tat gcc att agc aaa gat aca gga ttc gtg acc 1256Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val Thr370 375 380tac aag aac tgg ccc atc tac aaa gac gac aca acg atc gcc atg cgc 1304Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met Arg385 390 395aag ggc aca gat ggg tcg cag 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Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala-20 -15 -10 -5Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr-1 1 5 10Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala15 20 25Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly30 35 40Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile45 50 55 60Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly65 70 75Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu80 85 90Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His95 100 105Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly110 115 120Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe125 130 135 140Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu145 150 155Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser160 165 170Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr175 180 185Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg190 195 200Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn205 210 215 220Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro225 230 235Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr240 245 250Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser255 260 265Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro270 275 280Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg285 290 295 300Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala305 310 315Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu320 325 330Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp335 340 345Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser350 355 360Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val365 370 375 380Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met385 390 395Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys400 405 410Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr415 420 425Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr430 435 440Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro445 450 455 460Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser465 470 475Ser Ser<210>3<211>30<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>引物<400>3gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>引物<400>4atggttcatt tcagaactga cattgagtaa 30<210>5<211>27<212>DNA<213>人工/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>引物<400>5ttctgtttca tttcgaacta tgaagat 2權利要求
1.親本Fungamyl樣α-淀粉酶的變體，在選自下組的一或多個區(qū)包含改變98-110區(qū)，150-160區(qū)，161-167區(qū)，280-288區(qū)，448-455區(qū)，468-475區(qū)，其中(a)所述改變分別是(i)在占據(jù)此位置的氨基酸下游插入氨基酸，(ii)占據(jù)此位置的氨基酸的缺失，或(iii)占據(jù)此位置的氨基酸用另一不同的氨基酸取代，(b)所述變體具有α-淀粉酶活性且(c)每一區(qū)或位置對應于具有SEQ IDNO2之氨基酸序列的親本Fungamyl樣α-淀粉酶氨基酸序列的區(qū)或位置。
2.權利要求1的變體，其中所述變體是一或多個下述取代Q153S。
3.權利要求1的變體，其中所述變體改進了熱穩(wěn)定性和/或提高了在酸性pH下的穩(wěn)定性。
4.一種DNA構建體，其包含編碼權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體的DNA序列。
5.攜有權利要求4的DNA構建體的重組表達載體。
6.用權利要求4的DNA構建體或權利要求5的載體轉(zhuǎn)化的細胞。
7.權利要求6的細胞，其中所述細胞是微生物，如細菌或真菌。
8.權利要求7的細胞，其是曲霉屬尤其米曲霉的蛋白酶缺陷型菌株。
9.用于生產(chǎn)高麥芽糖糖漿的組合物，其含有權利要求1-3任一項的Fungamyl樣α-淀粉酶。
10.權利要求9的組合物，其還含有β-淀粉酶活性。
11.面團改良組合物，其含有權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體。
12.釀造組合物，其含有權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體。
13.權利要求12的釀造組合物，其還含有一或多種選自β-淀粉酶和異淀粉酶的酶。
14.一種生產(chǎn)乙醇的組合物，其含有權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體。
15.一種液化淀粉的方法，其中使用權利要求1-3的α-淀粉酶變體處理淀粉。
16.一種生產(chǎn)高麥芽糖糖漿的方法，其中用權利要求1-3的α-淀粉酶變體液化淀粉。
17.一種釀造方法，其中在麥芽汁發(fā)酵過程中加入了權利要求1-3的α-淀粉酶變體。
18.一種生產(chǎn)乙醇的方法，其中用權利要求1-3的α-淀粉酶變體在蒸餾醪液中液化淀粉。
19.一種方法，其中對含有權利要求1-3的α-淀粉酶變體的面團產(chǎn)物進行烘烤。
20.權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體或權利要求9的組合物用于淀粉液化的應用。
21.權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體或權利要求9的組合物用于生產(chǎn)乙醇的應用。
22.權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體或權利要求9的組合物用于釀造的應用。
23.權利要求1-3任一項的α-淀粉酶變體或權利要求9的組合物用于烘烤的應用。
24.一種用于產(chǎn)生親本Fungamyl樣α-淀粉酶的α-淀粉酶變體的方法，所述變體相對于其親本提高了熱穩(wěn)定性，尤其在酸性pH下的熱穩(wěn)定性，該方法包括(a)對編碼親本Fungamyl樣α-淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)中得到的突變的DNA序列，(c)篩選表達突變α-淀粉酶的宿主細胞，所述突變α-淀粉酶相對于親本Fungamyl樣α-淀粉酶提高了在酸性pH下的熱穩(wěn)定性。
25.生產(chǎn)麥芽糖糖漿的方法，其包括如下步驟1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉，然后2)在權利要求1-3的真菌α-淀粉酶變體存在下進行糊精化；3)回收糖漿；并任選進行純化。
26.生產(chǎn)糖漿，具體是麥芽糖糖漿的方法，其包括如下步驟1)在140-160℃，pH4-6下液化淀粉，然后2)在權利要求1-3的真菌α-淀粉酶變體存在下，于60-95℃，pH4-6進行糊精化；和3)回收糖漿；并任選進行純化。
27.權利要求26的方法，其中所述淀粉液化的溫度為65-85℃，尤其70-80℃。
28.權利要求27的方法，其中在步驟2)加入有效量的葡糖淀粉酶。
29.生產(chǎn)麥芽糖糖漿的方法，其中包含如下步驟1)在芽孢桿菌α-淀粉酶存在下，在95-110℃和pH4-6下進行淀粉液化，然后，2)在權利要求1-3的真菌α-淀粉酶變體存在下，于60-95℃，pH4-6進行糊精化；和3)回收糖漿；并任選進行純化。
30.固定化了的權利要求1-3的變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及親本Fungamyl樣真菌α－淀粉酶的變體,其在適于例如淀粉加工的酸性pH下表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性增強。
文檔編號C12C11/00GK1390252SQ00815549
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月10日 優(yōu)先權日1999年11月10日
發(fā)明者亨里克·比斯加德-弗蘭岑, 阿倫·斯文德森, 斯文·佩德森 申請人:諾維信公司