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      顯示廣譜病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法

      文檔序號:566348閱讀:1130來源:國知局
      專利名稱:顯示廣譜病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及經(jīng)過遺傳工程改造的表達(dá)屬于殺菌肽-蜂毒素(mellitin)雜合體家族的一個或多個肽的植物。發(fā)明背景植物中的疾病
      植物是各種感染性疾病(數(shù)以千計)的受體,這些疾病是由大量植物致病性真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲引起的,這些病原體例如由于感染了生長中的植物和破壞已收獲的作物而導(dǎo)致世界范圍內(nèi)莊稼損失慘重。為減少由這些病原體所引起的損失,應(yīng)用最廣泛的方法包括利用能夠殺死或降低各個病原體作用的各種化學(xué)試劑。不幸的是,許多植物病原體具有了對這些化學(xué)品的抗性,并且,一些植物病原體(特別是病毒)對用化學(xué)方法控制是不敏感的。另外,利用的許多化學(xué)試劑是廣譜毒素,可以引起嚴(yán)重的環(huán)境破壞,和毒害人及動物。
      為對付植物病原體已經(jīng)利用了植物育種,并且最近還采用了遺傳工程技術(shù)。在某些情況中,育種家和分子生物學(xué)家已經(jīng)在植物中成功地改造了對一些病原體的抗性。在過去的幾年中,已經(jīng)從植物中分離了許多植物R(抗性)基因。當(dāng)導(dǎo)入敏感作物中時,這些R基因產(chǎn)生對一些病原體的增強(qiáng)的抗性。例如,美國專利5,571,706公開了對煙草花葉病毒給予增強(qiáng)抗性的煙草N基因的分離。但是,雖然目前報道的常規(guī)育種和遺傳工程方法可以成功地在植物中增強(qiáng)病原體抗性,但這些途徑通常論述的只是一個靶病原體引起的問題,或少量密切相關(guān)的病原體引起的問題。結(jié)果是,當(dāng)利用這些方法產(chǎn)生的作物對靶病原體可能已增強(qiáng)保護(hù)時,傳統(tǒng)的化學(xué)試劑仍然必須用于控制其它病原體??刮⑸锏碾?br> 在過去的二十年中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有大范圍的抗微生物活性的大量天然多肽(“肽”)(綜述參見,Hancock和Lehrer,Trends Biotechnol.,1622-28,1998;Hancock,Mol.Microbiol.,12951-958,1994,和Nicholas和Mor,Ann.Rev.Microbiol.,49277-304,1995)。植物和動物的內(nèi)源抗微生物肽通常由12-45個氨基酸組成,并且是在生理pH時具有靜正電荷(陽離子)的兩親性分子。雖然陽離子抗微生物肽(CAPs)在結(jié)構(gòu)上是多種多樣的,但他們主要有兩大類結(jié)構(gòu)螺旋肽,如殺菌肽和爪澹(蟲詹)抗菌肽,和分子內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的片層(折疊)肽,如防衛(wèi)素,protegrins,和tachyplesins。Hancock和Lehrer,TrendsBiotechnol.,1622-28,1998;Zasloff,Curr.Opin.Immunol.,43-7,1992;Cociancich等,Biochem.J.,300567-575,1994;和Piers和Hancock,Mol.Microbiol.,12951-958,1994。天然CAP在各自的生物活性范圍變化很大,包括殺死細(xì)菌(革蘭氏陽性和陰性)、真菌和原生動物,甚至病毒。CAP通常在0.25g/mL到4g/mL的濃度范圍內(nèi)體外殺死敏感微生物(Hancock和Lehrer,Trends Biotechnol.,1622-28,1998),面對常規(guī)抗生素效率下降的情況下,提供了令人激動的可能性。另外,在植物中表達(dá)CAP可以引入對植物致病性微生物廣譜抗性。Jaynes,Plant Science,8943-53,1993;和Misra和Zhang,Plant Physiol.,106977-981,1994。
      昆蟲殺菌肽代表了在昆蟲免疫應(yīng)答中形成重要組分的小的高度堿性的□螺旋抗微生物肽的家族。Bohman和Hultmark,Annu.Rev.Microbiol.,41103-126,1987。從大的蠶蛾中分離的殺菌肽Hyalophoraceropia約含有具有兩親性N末端和親水的C末端的35個氨基酸殘基(van Hofsten等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,822240-2243,1985)。所有殺菌肽在體外是有潛力的抗菌劑,并且這一家族的幾個成員在體外抗許多植物致病性細(xì)菌特別強(qiáng)烈。Hultmark等,Eur.J.Biochem.127207-217,1982;Jaynes等,BioEssays,6263-270,1987;和Nordeen等,Plant Sci,82101-107,1992。
      另一個抗菌肽蜂毒素(mellitin)含有26個氨基酸,是蜂毒的主要成分。與殺菌肽相反,蜂毒素具有明顯的有兩親性C末端的疏水N末端。Habermann,Science,177314-322,1972。雖然蜂毒素具有強(qiáng)有力的抗微生物活性,但它的強(qiáng)力溶血活性(Tosteson等,J.Membr.Biol.8735-44,1985)使它不適用于治療用途,可能不是好的轉(zhuǎn)基因?qū)W的候選物。
      從上面可見,存在著對具有比普通病原體,包括細(xì)菌和真菌病原體更廣譜的增強(qiáng)抗性的植物需求。發(fā)明概要
      本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)一些陽離子抗微生物肽(CAP)給予了對普通病原體更廣譜的抗性,包括對真菌和細(xì)菌病原體的增強(qiáng)的抗性。另外,本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的CAP可以通過在N末端或C末端(末端延伸)添加氨基酸殘基來修飾,使CAP與植物生理更相容。實驗對象CAP是與屬于殺菌肽-蜂毒素(CEMA)的雜合體家族的小的帶正電的(陽離子)肽相關(guān)的,其含有部分天然存在的肽殺菌肽A和蜂毒素。Piers和Hancock,Mol.Microbiol.,12951-958,1994;和Hancock和Lehrer,Trends Biotechnol.,1622-28,1998。
      本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物可以用于常規(guī)的農(nóng)業(yè)用途,如糧食作物?;蛘呷缦滤觯梢允斋@植物,并加工提取表達(dá)的CEMA,或與CEMA相關(guān)的肽,如ECEMA。在這些方法中,可以將分離的肽用于醫(yī)藥用途。另外,這些植物可以直接或間接用作食物添加的藥物植物,以對抗動物如人中的微生物感染。
      所以,本發(fā)明包括表達(dá)至少一個CEMA和/或至少一個與CEMA相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物和生產(chǎn)這些植物的方法。這些植物的各部分,包括種子、果實、莖、葉和根通??梢杂米魇澄飦碓?,或用作CEMA和/或CEMA相關(guān)肽的來源。因為所有植物類型對一個或多個植物病原體是敏感的,本發(fā)明可以用于各種植物任意類型中產(chǎn)生廣譜抗性。所以,本發(fā)明可以用于單子葉、雙子葉和裸子植物,包括,但不限于玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、豆、油菜/卡諾拉(canola)、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、亞麻、花生和三葉草;蔬菜如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、土豆、胡蘿卜、小蘿卜、豌豆、小扁豆、甘藍(lán)、椰菜、花莖甘藍(lán)、湯菜和椒;樹果實如檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃;和花如蘭花、康乃馨和玫瑰;咖啡;可可豆;針葉樹如花旗松(Douglas fir)、云杉和松;和木本落葉樹如白楊和榆木。
      本發(fā)明的一個方面提供了表達(dá)一個或多個CEMA肽和/或一個或多個CEMA相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物??梢岳玫腃EMA肽的例子包括但不限于Hancock等,美國專利5,707,855所述的CEMA肽。
      本發(fā)明的另一方面提供了修飾后含有其它氨基酸的CEMA相關(guān)肽,從而形式“融合”肽。轉(zhuǎn)基因植物中融合肽的表達(dá)可以提供比這些植物中CEMA的表達(dá)更有效的廣譜病原體抗性,或可以增強(qiáng)表達(dá)的CEMA相關(guān)肽的穩(wěn)定性,以便提供更高的表達(dá)水平。所以,加強(qiáng)了從植物組織中純化該肽。在其它實施方案中,本發(fā)明提供了表達(dá)融合肽的轉(zhuǎn)基因植物,包括
      (1)CEMA相關(guān)肽的第一個肽序列;和
      (2)與第一個肽序列可操作連接的第二個肽序列。
      第二個肽序列通常但不一定與第一個肽序列的氨基(N-)端連接。
      在有些實施方案中,第二個肽序列含有陰離子(帶負(fù)電荷)“原區(qū)”(Pro-region)肽序列。這樣的原區(qū)序列的作用是中和CEMA或CEMA相關(guān)肽的陽離子特性,并因此可以在細(xì)胞環(huán)境中提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性,或降低CEMA或CEMA相關(guān)肽對宿主生物體的毒性。因此,原區(qū)通常包括大量的帶負(fù)電的氨基酸,如谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。例如,適當(dāng)?shù)脑瓍^(qū)通常是在天然存在的未加工的(全長)dermaseptin和temporin肽中發(fā)現(xiàn)的。也可以從其它肽,包括哺乳動物起源的肽中獲得陰離子原區(qū),如羊cathelin蛋白質(zhì)的原區(qū)。包括這樣的原區(qū)的融合肽可以表示為P-C。
      原區(qū)肽可以直接與CEMA或CEMA相關(guān)肽的N末端連接。但是,原區(qū)和陽離子肽也可以用間隔肽連接。連接兩個肽區(qū)的間隔肽的用途是本領(lǐng)域熟知。適當(dāng)?shù)拈g隔肽通常是2到25個氨基酸長,并且提供了柔性鉸合部,連接第一個肽序列和第二個肽序列。已經(jīng)用于提供連接兩個肽序列的柔性鉸合部的間隔序列包括文獻(xiàn)Chaudhary等,Nature,339394-397,1989所述的甘氨酸(4)-絲氨酸間隔區(qū)(GGGGSx3)。
      本發(fā)明也提供含有N端延伸的CEMA相關(guān)肽。一個這樣的肽是ECEMA(SEQ ID NO4)。這樣的N端延伸的作用是降低或增加CEMA肽的抗微生物效果,所以使肽與植物生理更相容(指植物可以與它的非轉(zhuǎn)基因植物相對等的方式生長和繁茂)。N端延伸可能的作用是提供間隔肽功能。含有原區(qū)肽、間隔肽和CEMA肽的融合肽可以表示為P-S-C,其中S表示間隔肽。
      間隔序列也可以包括切割位點,如蛋白酶識別和裂解的肽序列。切割位點使得在從植物組織純化CEMA肽后有助于從CEMA肽中除去原區(qū)。
      最后,本發(fā)明也提供了保存期和儲藏期增長的植物。將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和對照非轉(zhuǎn)化植物比較,可以觀察到保存期增長。對于水果和蔬菜的長期儲藏以及切花和藥用植物的保存,特別需要增長保存期。本發(fā)明的這些和其它方面在下面進(jìn)一步詳細(xì)敘述。序列表
      附加的序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸堿基的字母縮寫和氨基酸的三字母密碼表示的。每個核酸序列只表示了一條鏈,但應(yīng)當(dāng)理解,互補(bǔ)鏈通過參考所顯示的鏈也包括在內(nèi)。
      SEQ ID NO1是編碼CEMA的核酸序列。
      SEQ ID N2是CEMA肽的氨基酸序列。
      SEQ ID NO3是編碼ECEMA肽的核酸序列。
      SEQ ID NO4是ECEMA肽代表性的氨基酸序列。
      SEQ ID NO5-7是各種N端延伸序列的各個氨基酸序列。
      SEQ ID NO8是temporin G原區(qū)的氨基酸序列。
      SEQ ID NO9和10是用于擴(kuò)增ECEMA編碼序列各自的PCR核苷酸引物。
      SEQ ID NO11是用于ECEMA肽的N端延伸序列。附圖的簡要說明


      圖1A和1B表示了ECEMA的結(jié)構(gòu)和表達(dá)構(gòu)建體。
      圖1A表示了陽離子肽CEMA和N端延伸版本ECEMA的氨基酸序列。
      圖1B表示了ECEMA的pSAI4質(zhì)粒表達(dá)載體。圖中的縮寫如下RB,Ti質(zhì)粒的右邊的邊緣區(qū),LB,Ti質(zhì)粒左邊的邊緣區(qū),NOS-pro,啟動子,和NOS-ter,胭脂堿合酶基因的終止子;NPT II,新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II;2×35S,雙倍增強(qiáng)子CaMV 35S啟動子;AMV,來自苜?;ㄈ~病毒RNA4的引導(dǎo)序列;ECEMA,ECEMA的蛋白質(zhì)編碼序列。
      圖2A-2D包括各個凝膠的數(shù)碼圖象,表示ECEMA基因整合和mRNA表達(dá)。圖2A表示了從對照(非轉(zhuǎn)化)和轉(zhuǎn)基因Russet Burbank土豆植物分離的總基因組DNA的PCR擴(kuò)增的結(jié)果。PCR引物與pSAI4構(gòu)建中利用的相同。道1,來自質(zhì)粒pSAI4的PCR產(chǎn)物(陽性對照);道2-4,從pSAI4轉(zhuǎn)化的Russet Burbank分離的基因組DNA得到的PCR產(chǎn)物;道5,從對照Russet Burbank分離的基因組DNA得到的PCR產(chǎn)物;道6,無模板的PCR(陰性對照);道7,分子大小標(biāo)準(zhǔn)(□X174RFDNA/HaeIII)。圖2B表示了含有ECEMA mRNA表達(dá)產(chǎn)物的凝膠的數(shù)碼圖象,所述mRNA來自對照和轉(zhuǎn)基因Russet Burbank的總RNA通過RT-PCR測試。PCR的引物與pSAI4構(gòu)建中利用的相同。道1,從對照Russet Burbank分離的RNA的PCR產(chǎn)物,沒有逆轉(zhuǎn)錄;道2-4,從轉(zhuǎn)基因Russet Burbank分離的RNA的PCR產(chǎn)物,沒有逆轉(zhuǎn)錄(質(zhì)控);道5,來自對照Russet Burbank的RT-PCR產(chǎn)物;道6-8,來自轉(zhuǎn)基因Russet Burbank的RT-PCR產(chǎn)物。圖2C表示了從對照(非轉(zhuǎn)化)和轉(zhuǎn)基因Desiree土豆植物分離的總基因組DNA徑PCR擴(kuò)增的ECEMA編碼序列的數(shù)碼圖象。PCR引物與pSAI4構(gòu)建中的相同。道1,無模板的PCR(陰性對照);道2,從非轉(zhuǎn)化的Desiree分離的基因組DNA的PCR產(chǎn)物;道3,質(zhì)粒pSAI4的PCR產(chǎn)物(陽性對照);道4-11,從用pSAI4轉(zhuǎn)化的Desiree分離的基因組DNA的PCR產(chǎn)物;道12,代表100,200,300個堿基的100堿基梯度(Parmacia)帶。圖2D表示了從ECEMA mRNA表達(dá)試驗結(jié)果的數(shù)碼圖象。利用從對照和轉(zhuǎn)基因Desiree分離的總RNA的RT-PCR進(jìn)行這些實驗。PCR的引物與pSAI4構(gòu)建中利用的相同。道1,從對照Desiree分離的RNA的PCR產(chǎn)物,沒有逆轉(zhuǎn)錄;道2-5,從轉(zhuǎn)基因Desiree分離的RNA的PCR產(chǎn)物,沒有逆轉(zhuǎn)錄(質(zhì)控);道6,來自對照Desiree的RT-PCR產(chǎn)物;道7-10,來自轉(zhuǎn)基因Desiree的RT-PCR產(chǎn)物;道11,來自質(zhì)粒pSAI4的PCR產(chǎn)物(陽性對照);道12,代表100,200和300堿基的100堿基階梯(Parmacia)帶。
      圖3A-3F包括數(shù)碼圖象,表示轉(zhuǎn)基因土豆植物和塊莖的形態(tài)學(xué)特征。在轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中后,將Desiree對照(圖3A)和ECEMA轉(zhuǎn)基因植物(圖3B)拍照。來自對照(圖3,CI)和轉(zhuǎn)基因(圖3,CII,III,IV,V)植物的塊莖在收獲后拍照。在轉(zhuǎn)移到土壤后,將RussetBurbank對照(圖3D)和ECEMA轉(zhuǎn)基因植物(圖3E)拍照。在收獲后,將來自對照(圖3,F(xiàn)I)和轉(zhuǎn)基因(圖3,F(xiàn)II,III,IV)的植物的塊莖拍照。
      圖4A和圖4B表示轉(zhuǎn)基因土豆對胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)的抗性。圖4A是表達(dá)ECEMA的轉(zhuǎn)基因Desiree土豆塊莖的軟腐抗性研究的結(jié)果。用胡蘿卜軟腐歐文氏菌感染從對照(C)和轉(zhuǎn)基因植物ME1、ME2和ME3的塊莖中所制備的復(fù)盤。室溫6天后,從復(fù)盤中輕輕除去軟腐的組織,并將對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的敏感度/抗性表示為塊莖組織的重量損失。圖4B描述從離子交換層析得到的級分對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的殺菌效果。下面敘述了蛋白質(zhì)分離技術(shù)。S加到柱上的過濾上清液;FT穿透E11-E13用0.2M NaCl洗脫得到的級分;E21-E23用0.3M NaCl洗脫得到的級分;E31-E33用0.5M NaCl洗脫得到的級分。各種級分中的蛋白用Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離并銀染。級分E22、E23和E31含有與對照相同的能遷移到凝膠中相對位置的帶(對照是200ng化學(xué)合成ECEMA蛋白質(zhì)(3.8kDa))。正如預(yù)期,級分E22、E23和E31顯示了最高的殺菌活性水平。
      圖5A-5C中的數(shù)碼圖象表示在用蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)(US-8分離物)感染后的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?2×35S GUS;圖5A),對照非轉(zhuǎn)基因植物(圖5B)和表達(dá)ECEMA的植物(2×35SECEMA;圖5C)。
      圖6A-6D是受到真菌病原體仙人掌疫霉(Phytophthora cactorum)攻擊的各個轉(zhuǎn)基因土豆植株的數(shù)碼圖象。在MS培養(yǎng)基上生根后,用真菌仙人掌疫霉對對照(圖6A)Russet Burbank植物和ECEMA轉(zhuǎn)基因(圖6B)Russet Burbank植物以及對照(圖6C)Desiree植物和ECEMA轉(zhuǎn)基因(圖6D)Desiree植物進(jìn)行攻擊。感染后11天(圖6A和6B)或19天(圖6C和6D)拍照。對照植物嚴(yán)重感染,而轉(zhuǎn)基因植物仍然是綠色并生長。
      圖7A-7D是受到真菌病原體茄病鐮孢(Fusarium solani)攻擊的各個轉(zhuǎn)基因土豆植株的數(shù)碼圖象。在MS培養(yǎng)基上生根后,用茄病鐮孢對對照(圖7A)Russet Burbank植物和ECEM轉(zhuǎn)基因(圖7B)RussetBurbank植物以及對照(圖7C)Desiree植物和ECEMA轉(zhuǎn)基因(圖7D)Desiree植物進(jìn)行攻擊。感染后11天(圖7A和7B)或19天(圖7C和7D)拍照。對照植物嚴(yán)重感染,而轉(zhuǎn)基因植物仍然是綠色并生長。本發(fā)明的詳細(xì)說明I.定義
      除非特別說明,根據(jù)常規(guī)用法使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可在下列工具書中找到Lewin,Genes VII,OxfordUniversity Press,1999(ISBN 0-19-879276-X);Kendrew等,TheEncyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9);和Meyers(主編),Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
      “CEMA和CEMA-相關(guān)肽。”短語“CEMA和CEMA相關(guān)肽”指CEMA肽,其含有殺菌肽AN端的8個氨基酸和在C端修飾的蜂毒素序列(Hancock等,美國專利5,707,855),以及指如上所述的CEMA肽的變體。CEMA肽的變體可以含有與CEMA氨基酸序列(SEQ IDNO1)可操作連接的其它氨基酸序列或CEMA氨基酸序列的片段。其它氨基酸序列可以是如下所述的原區(qū)、間隔序列、N端延伸或C端延伸。CEMA變體也可以含有如下所述的一個或多個保守氨基酸取代。然而,本發(fā)明所包含的CEMA和CEMA相關(guān)肽特征是在植物各個肽表達(dá)后,至少部分給予疾病抗性的能力,而基本上不影響植物的生長和健康。如本文所述,當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因植物比較時,一些轉(zhuǎn)基因植物可能顯示了各種形態(tài)學(xué)上的差異。但是,這些植物將保持對廣譜病原體的抗性,并且能夠生長。
      CEMA相關(guān)肽的例子是命名為“ECEMA”的肽(SEQ ID NO4)。ECEMA由34個氨基酸組成,包括來自殺菌肽A的8個氨基酸和來自蜂毒素的16個氨基酸,并在N端(6個殘基)和C端(4個殘基)有延伸。6個氨基酸的N端延伸含有序列MALEHM(SEQ ID NO11)。
      除了利用如上所述的CEMA和CEMA相關(guān)肽外,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白利用與天然存在的抗菌肽有些變化的肽可實施本發(fā)明,而在植物中表達(dá)時所述肽仍然給予增強(qiáng)的廣譜病原體抗性。
      “CEMA和CEMA相關(guān)肽生物活性。”短語“CEMA和CEMA相關(guān)肽生物活性”指CEMA或CEMA相關(guān)肽如ECEMA抑制細(xì)菌生長和/或真菌生長的能力。利用下面給出的方案可以容易地確定CEMA和CEMA相關(guān)肽生物活性。
      通過確定肽抑制果膠分解菌株如胡蘿卜軟腐歐文氏菌或者甚至是大腸桿菌DH5的生長能力可以方便地評估給定的CEMA和/或CEMA相關(guān)肽的抗菌活性。用Luria-Bertaini(LB)培養(yǎng)基系列稀釋該肽,并將100-L所得效價的等份試樣加入到96孔的微滴平板的孔中可以測定給定肽的活性。然后使新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物(~0.3A550)在LB培養(yǎng)基(1%w/v胰蛋白胨和0.5%w/v酵母粉)上生長,并且用LB稀釋到10-2,以表示約104-105菌落形成單位(CFU)mL-1。然后在含有肽的每個孔中接種10L細(xì)菌培養(yǎng)物,并將樣品在37C溫育4小時。然后用LB稀釋孔中的內(nèi)容物,鋪在LB瓊脂板上,適當(dāng)溫度下溫育過夜。每個平板上生長的細(xì)菌菌落數(shù)與CEMA和/或CEMA相關(guān)肽的各個稀釋液相對應(yīng)(對照平板中沒有加入肽)。將菌落計數(shù),通過比較對照平板測定受檢肽的抗菌活性。
      如果在該試驗條件下,濃度7g/mL的肽至少能夠抑制10%(比較對照)的細(xì)菌生長(即在這一濃度下,細(xì)菌菌落數(shù)沒超過對照平板的90%),則確定CEMA或CEMA相關(guān)肽具有生物活性。
      利用真菌菌株仙人掌疫霉、蔓延疫霉和/或茄病鐮孢可以評估給定的CEMA或CEMA相關(guān)肽的抗真菌活性。將選定的真菌菌株在含有20gL-1的五谷嬰兒食品“速溶”麥片和8gL-1瓊脂的五谷瓊脂(FCA)培養(yǎng)基上生長(Terras等,Plant Cell 7573-588,1995)。室溫生長5天后,去除菌絲體孢塞并倒置于新鮮FCA平板的中央。然后在距離平板邊緣3厘米的孔中接入測試肽的無菌溶液(10∶1),并在同一平板上建立含有無菌水的對照孔。在同一平板或其它平板上可以測試各種濃度的試驗肽。室溫溫育分析平板5天,然后測量各個孔周圍的生長抑制圈。
      如果在該分析條件下,與對照比較,在高達(dá)10μg/mL的濃度下能夠抑制真菌生長(即在含有這一濃度肽的孔周圍具有明顯的抑制真菌生長圈),則確定CEMA或CEMA相關(guān)肽具有生物活性。
      “末端延伸。”如本文所用,術(shù)語“末端延伸”指在肽的N端或C端添加的序列,如SEQ ID NO5-7和11所示的那些。例如,序列MALEHM敘述了一個N端延伸(SEQ ID NO11),它加在陽離子肽如CEMA(SEQ ID NO2)的N端。在下面的討論中,當(dāng)提及的是N端延伸時,應(yīng)該理解指的是N-或C-端延伸。
      N端延伸的特征是它們能夠調(diào)節(jié)陽離子肽的抗微生物活性,即增強(qiáng)或降低抗微生物的活性。本發(fā)明內(nèi)容提供了能用于測試延伸的陽離子肽抗微生物活性的分析方法。如果與非延伸肽比較,N端延伸增強(qiáng)或降低肽的抗微生物活性,那么就發(fā)現(xiàn)N端延伸調(diào)節(jié)陽離子肽的抗微生物活性。然而,例如通過改變給定肽的抗微生物活性,與肽的非延伸肽比較至少10%、20%、30%、40%、50%或60%,將發(fā)現(xiàn)一些N端延伸基本上改變了抗微生物活性。
      例如,利用下面所述的抗菌分析,CEMA(SEQ ID NO2)在4.5μg/mL時殺死了50%的細(xì)菌細(xì)胞(大腸桿菌),而ECEMA(SEQ IDNO4)在36μg/mL時殺死了50%的細(xì)菌細(xì)胞(大腸桿菌)。所以,ECEMA(SEQ ID NO4)比CEMA(SEQ ID NO2)毒性小8-10倍。相類似,當(dāng)對胡蘿卜軟腐歐文氏菌測試時,ECEMA比CEMA(SEQ IDNO2)毒性小15-20倍。
      除了他們的活性特征外,N端延伸的特征是長度。通常N端延伸長度不超過25個氨基酸殘基,實際在許多情況下,N端延伸長度不超過20、15、10或5個氨基酸。特定延伸的長度將部分依賴于所需的抗微生物活性的水平,本文所述的抗真菌和抗細(xì)菌分析能用于分析N端延伸的陽離子肽。
      “轉(zhuǎn)基因植物?!比绫疚乃?,“轉(zhuǎn)基因植物”指含有同種野生型植物中通常未發(fā)現(xiàn)的重組遺傳物質(zhì)(“轉(zhuǎn)基因”)的植物。所以,從借助轉(zhuǎn)化導(dǎo)入重組DNA的植物細(xì)胞生長成的植物就是轉(zhuǎn)基因植物,含有導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物的所有子代(不管是有性或無性產(chǎn)生的)同樣是轉(zhuǎn)基因植物?!稗D(zhuǎn)基因植物”也指轉(zhuǎn)基因保留在質(zhì)體中的植物,如葉綠體、造粉體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體等等。這樣的質(zhì)體豐富且母系遺傳。
      “陽離子肽。”術(shù)語“陽離子肽”指長度約5到約50個氨基酸,優(yōu)選長度約15到約35個氨基酸的氨基酸序列。如果肽具有足夠的正電荷氨基酸,并且其pKa大于9.0,那么這個肽就是“陽離子的”。通常,至少四個陽離子肽的氨基酸殘基可以是帶正電荷的,例如賴氨酸或精氨酸?!罢姾伞笔侵竝H7.0時具有凈正電荷的氨基酸殘基的側(cè)鏈??梢愿鶕?jù)本發(fā)明重組產(chǎn)生的天然存在的陽離子肽的例子包括防衛(wèi)素、爪??咕?、melittin和殺菌肽、dermaseptins、temporins和其類似物。
      “序列同一性?!睂蓚€核酸序列或兩個氨基酸序列間的相似性按照序列間共享的序列同一性水平來表示。序列同一性通常依據(jù)同一性百分?jǐn)?shù)表示;百分?jǐn)?shù)越高,兩個序列越相似。
      為比較目的,序列比對的方法是本領(lǐng)域熟知的。各種程序和比對算法在下面的文獻(xiàn)中有敘述Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2482,1981;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48443,1970;Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444,1988;Higgins和Sharp,Gene 73237-244,1988;Higgins和Sharp,CABIOS 5151-153,1989;Corpet等,Nucleic Acid Research 1610881-10890,1988;Huang等,Computer Application in the Biosciences 8155-165,1992;和Pearson等,Methods in Molecular Biology 24307-331,1994。文獻(xiàn)Altschul等,J.Mol.Biol.,215403-410,1990提呈了一個序列比對方法和同源性計算的詳細(xì)論述。
      為了與序列分析程序BLASTP、BLSATN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX結(jié)合使用,可以從幾個來源,包括國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互聯(lián)網(wǎng)獲得NCBI基本局部比對檢索工具(BLASTTM,Altschul等,J.Mol.Biol.,215403-410,1990)。BLASTTM可以在互聯(lián)網(wǎng)上存取。
      為了比較大于約30個氨基酸的氨基酸序列,利用系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)的默認(rèn)BLOSUM62距陣,使用BLASTTM程序中的“Blast 2序列”函數(shù),(間隙存在值(gap existence cost)11,每個殘基間隙值(gap cost)1)。當(dāng)比對短肽時(少于約30個氨基酸),應(yīng)該利用Blast 2序列函數(shù),利用系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)的PAM30距陣進(jìn)行比對(開放間隙9,延伸間隙1罰分(penalties))。甚至與參考序列具有更大相似性的蛋白質(zhì),當(dāng)用這一方法評估時,將顯示增加的百分比同一性,如至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性。
      “重組。”“重組”核酸是一個核酸,具有非天然存在的序列,或具有通過人工組合兩個分離的更短的序列而制成的序列。這種人工組合通常是通過化學(xué)合成,或更常見是通過人工操作分離的核酸區(qū)段,例如通過遺傳工程技術(shù)來完成的。
      “寡核苷酸(“寡”)。”“寡核苷酸”是指長度多達(dá)約100個核苷酸堿基的線性聚核苷酸序列。
      “探針和引物。”核酸探針和引物可以容易地根據(jù)本發(fā)明提供的核酸序列來制備?!疤结槨卑ǜ街诳蓹z測標(biāo)記或報道分子上的分離的核酸序列。典型的標(biāo)記包括放射性同位素、配體、化學(xué)熒光試劑和酶。標(biāo)記的方法和選擇適于各種目的的標(biāo)記的指南在下面文獻(xiàn)中有討論,例如,Sambrook等(主編),Molecular CloningA LaboratoryManual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989;和Ausubel等(主編),Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(with periodic updates),1987。
      “引物”是短核酸,優(yōu)選DNA寡核苷酸長度為15個核苷酸或更多,其通過退火與互補(bǔ)靶DNA鏈核酸雜交形成引物和靶DNA鏈間的雜合體,然后借助DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸。引物對例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或本領(lǐng)域已知的其他核酸擴(kuò)增方法能用于擴(kuò)增核酸序列。
      如提示,探針和引物長度優(yōu)選為15個核苷酸或更多,但為增強(qiáng)特異性,可優(yōu)選20或更多個核苷酸的探針和引物。
      探針和引物制備和使用的方法在下列文獻(xiàn)中描述,例如Sambrook等(主編),Molecular CloningA Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989;Ausubel等(主編),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York(with periodic updates),1987;和Innis等,PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications,Academic PressSan Diego,1990。PCR引物對例如可以利用針對此目的的計算機(jī)程序如PrimerTM(Version 0.5,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)從已知序列中派生出來。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到特定探針或引物的特異性隨著探針或引物的長度而增加。例如,含有20個連續(xù)核苷酸的引物退火至靶上將可以與比只有15個核苷酸的對應(yīng)引物具有更高的特異性。所以,為了獲得更大的特異性,可以選擇含有例如10、20、25、30、35、40、50或更多的連續(xù)核苷酸的探針和引物。
      “分離。”“分離”的生物組分(如核酸或蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)已經(jīng)基本上與生物體細(xì)胞中的其它生物組分分離或純化,其中該組分是天然存在的,即其它染色體和染色體外的DNA和RNA,蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。已經(jīng)“分離”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括在宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì),以及化學(xué)合成的核酸。
      “載體?!薄拜d體”是導(dǎo)入宿主細(xì)胞的核酸分子,從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。載體可以含有一個或多個核酸序列,如復(fù)制起點,允許載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制。載體也可以含有一個或多個可選擇的標(biāo)記基因和本領(lǐng)域已知的其它遺傳因子。
      “可操作連接?!碑?dāng)?shù)谝粋€核酸序列與第二個核酸序列無論何時存在功能性關(guān)系,第一個核酸序列與第二個核酸序列“可操作連接”。例如,如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá),啟動子即與編碼序列可操作連接。一般而言,可操作連接的DNA序列是相鄰的,并且如需要可在同一讀碼框中連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)。兩個肽序列可以通過正常的肽鍵,或通過其它共價鍵可操作連接。
      “轉(zhuǎn)化。”“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞是已經(jīng)通過分子生物學(xué)技術(shù)導(dǎo)入核酸分子的細(xì)胞。如本文所用,術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括可以將核酸分子導(dǎo)入這種細(xì)胞的所有技術(shù),包括用病毒載體轉(zhuǎn)染、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、用葉綠體載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入葉綠體,和通過電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、微注射和粒子槍加速導(dǎo)入裸DNA。選擇CEMA肽a.CEMA和/或CEMA相關(guān)肽
      上面提供了舉例的CEMA和CEMA相關(guān)肽(ECEMA)的列表。通過簡單應(yīng)用肽序列的遺傳密碼可以派生編碼CEMA和ECEMA肽的核酸分子。例如,在SEQ ID NO1中提供了CEMA肽的氨基酸序列,SEQ ID NO4中表示了編碼ECEMA的氨基酸序列。
      本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到各種CEMA和ECEMA肽顯示不同程度的抗微生物活性,一些能夠比其他類別更有效地抵抗某些病原體。所以當(dāng)選擇生產(chǎn)具有增強(qiáng)的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的肽時,選擇特定的CEMA相關(guān)肽將依賴于,在其他因子中,肽表達(dá)的植物類型以及常見的感染該植物類型的病原體類型。
      在選擇了待表達(dá)所需的CEMA肽或CEMA相關(guān)肽后,可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)編碼該肽的核酸分子。因為CEMA和CEMA相關(guān)肽相對短,合成核酸分子的簡單方法是通過在購買的寡核苷酸合成儀上合成重疊的寡核苷酸。然后,將寡核苷酸在體外合成全長的編碼區(qū)。這一途徑也允許選擇編碼特定氨基酸殘基的密碼子,所述密碼子反映了待導(dǎo)入核酸分子的植物偏愛使用的密碼子,從而增強(qiáng)表達(dá)效率。利用這一途徑生產(chǎn)編碼序列的詳細(xì)實施例提供在下面的實施例中。b.加入其它肽序列
      也可以在轉(zhuǎn)基因植物中以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)CEMA和CEMA相關(guān)肽。雖然,為了在植物中表達(dá),可以將任何所需的肽與選定的CEMA和/或CEMA相關(guān)肽融合,但是含有陰離子原區(qū)肽與CEMA或CEMA相關(guān)肽的氨基端可操作連接的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)將是特別有利的。對于這一目的,可以利用任何陰離子原區(qū)肽,包括在天然存在的全長(即未加工)抗微生物肽中發(fā)現(xiàn)的陰離子原區(qū)。例如,可以將含有temporin G的氨基酸23-46(SEQ ID NO8中所示)用作原區(qū)。這樣的原區(qū)肽作用是中和抗微生物肽的陽離子特性,并因此可以在細(xì)胞環(huán)境中提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性。為達(dá)到此目的,這些原區(qū)通常包括大量的帶負(fù)電的氨基酸,如谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
      其它本領(lǐng)域已知天然存在的原區(qū)肽的例子包括下面蛋白質(zhì)的原區(qū)肽人嗜中性防衛(wèi)素蛋白質(zhì)(Daher等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,857327-7331,1988);小牛抗微生物cathelicidin蛋白質(zhì)BMAP28(Skerlavaj等,J.Biol.Chem.,27128375-28381,1996);羊抗微生物cathelin蛋白質(zhì)家族(Mahoney等,F(xiàn)EBS Lett.,377519-522,1995);小牛indolicidin(Del Sal等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,187467-472,1992);豬抗微生物肽prophenin-2和PR-39(Zhao等,F(xiàn)EBS Lett.,367130-134,1995)和PMAP-37(Tossi等,Eur.J.Biochem.15941-946,1995);人抗微生物脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)CAP18(Larrick等,F(xiàn)EBS Lett.,398(1)74-80,1966);和鼠蛋白質(zhì)E3(Scott和Collins,Blood,882517-2530,1996)。
      由于陰離子原區(qū)肽可以直接與陽離子肽的N端連接,備選的實施方案包括利用間隔肽序列將原區(qū)肽與CEMA和/或CEMA相關(guān)肽連接。利用間隔肽連接兩個肽區(qū)是本領(lǐng)域熟知的;這樣的間隔肽通常是2到25個氨基酸長度,并且提供將第一個肽序列與第二個肽序列連接的柔性鉸合部。已經(jīng)用于提供連接兩個肽序列的柔性鉸合部的間隔序列包括文獻(xiàn)Chaudhary等,Nature 339394-397,1989中所述的甘氨酸(4)-絲氨酸間隔區(qū)(GGGGSx3)。或者,如下所述的N端肽延伸可以提供間隔肽功能。間隔序列肽也可以包括切割位點,如蛋白酶如Xa因子所識別和切割的肽序列。這樣的位點使得CEMA和/或CEMA相關(guān)肽從植物組織中純化后,有助于再從CEMA和/或CEMA相關(guān)肽中除去原區(qū)。利用陰離子原區(qū)肽和間隔肽在微生物系統(tǒng)中表達(dá)一些陽離子肽是本領(lǐng)域已知的,并且在Hancock的美國專利5,707,855中有敘述。
      在一些實施方案中,可以在CEMA和/或CEMA相關(guān)肽上添加N端延伸肽序列。這些N端肽延伸的作用可能是提供對蛋白酶剪切增強(qiáng)的抗性、增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄水平和/或增強(qiáng)或降低肽的抗微生物活性,以致表達(dá)的肽在提供適當(dāng)?shù)目刮⑸锘钚缘耐瑫r與植物物種的特殊生理相容。盡管也可以利用更長的延伸,但通常這些N端延伸是2到25個氨基酸的長度。一些實施方案中所利用的N端延伸序列的例子包括SEQ ID NO5-7和11中所示的肽序列。在每種情況中,加入N端甲硫氨酸可以保證肽的適當(dāng)表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到可以容易地用本文所述的生物活性分析方法評估添加任何特定的N端延伸的效果。
      d.變體CEMA和CEMA相關(guān)肽
      可以將編碼CEMA或CEMA相關(guān)肽的核酸序列進(jìn)行操作,從而使它編碼變體CEMA或CEMA相關(guān)肽。這可以通過各種方法進(jìn)行,例如通過采用定向位點誘變或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)?;蛘?,因為這些肽是相對短的分子,可以從頭簡單地合成變體肽的編碼區(qū)并導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。
      氨基酸序列最簡單的修飾包括用一個或多個氨基酸取代具有相似生物化學(xué)特性的氨基酸。這些所謂的“保守取代”似乎對得到的肽的活性影響最小。所以,本發(fā)明可以利用一個或多個保守氨基酸取代而有差異的肽來代替CEMA和CEMA相關(guān)肽,如ECEMA(SEQ IDNO4)。表1表示了在蛋白質(zhì)中可以取代的各個原始氨基酸,并且被認(rèn)作保守取代的氨基酸。
      表1
      通過選擇比表1更不保守的取代,即選擇對維持下列結(jié)構(gòu)效果區(qū)別更明顯的殘基可以獲得主題肽的功能或任何各種其它特征的更基本的變化(a)取代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu),例如折疊或螺旋構(gòu)型,(b)靶位點分子的電荷或疏水性,或(c)大塊側(cè)鏈。一般而言,期望在蛋白質(zhì)特性中產(chǎn)生最大變化的取代是(a)用親水殘基,例如絲氨?;蛱K氨酰取代疏水殘基,例如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?;虮滨?,或后面的取代前面的;(b)用半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它殘基,或相反;(c)用具有正電的側(cè)鏈的殘基,例如賴氨酰、精氨酰或組氨酰取代負(fù)電的側(cè)鏈,例如谷氨酰或天冬氨酰,或相反;或(d)用具有大塊側(cè)鏈的殘基,例如苯丙氨酸取代不具有側(cè)鏈的殘基,例如甘氨酸,或相反。假如保留了CEMA的生物活性,那么具有一個或多個更多基本變化的變體肽也可以用于本發(fā)明。
      也可以將廣泛的氨基酸變化改造成變體CEMA或CEMA肽。但是,如上所述,這樣的變體肽的特征通常為與各個天然存在的氨基酸序列在全長比對上具有至少40%的序列同一性,序列同一性的確定利用的是如上所述的任何比對程序。另外,這些變體肽將保留生物活性。
      利用如上所述的任何分析系統(tǒng)可以證明變體CEMA肽具有生物活性。在證實了肽具有所需的活性后,利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以容易地生產(chǎn)編碼肽的核酸分子。如果合適,可讀框的選擇將考慮待表達(dá)肽的植物物種偏愛使用的密碼子。III.在植物中導(dǎo)入CEMA和CEMA相關(guān)肽
      在已經(jīng)生產(chǎn)編碼CEMA或CEMA相關(guān)肽如ECEMA的核酸序列后,為了給予對植物的病原體抗性,可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中的序列?;就緩绞菍⒑怂峥寺∵M(jìn)轉(zhuǎn)化載體,以使得核酸與植物細(xì)胞中指導(dǎo)核酸表達(dá)的控制序列(例如啟動子)可操作連接。然后,通過任何技術(shù)(例如電穿孔)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入轉(zhuǎn)化載體。從細(xì)胞中產(chǎn)生了完整的植物,選擇含有導(dǎo)入核酸的子代植物。如愿地,所有或部分轉(zhuǎn)化載體穩(wěn)定地整合進(jìn)了植物細(xì)胞的基因組或細(xì)胞器如線粒體和/或葉綠體的基因組中。整合進(jìn)植物細(xì)胞并含有導(dǎo)入序列和控制表達(dá)的相關(guān)序列(導(dǎo)入“轉(zhuǎn)基因”)的轉(zhuǎn)化載體部分可以稱為重組表達(dá)盒。
      根據(jù)改變的表型測定可以選擇含有導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的子代。這樣的表型可以直接從由導(dǎo)入序列給予的疾病抗性中產(chǎn)生或者由于在轉(zhuǎn)化載體中摻入了顯性可選擇的標(biāo)記基因而明顯表現(xiàn)出對化學(xué)試劑(如抗生素)的增強(qiáng)的抗性。
      用克隆的核酸序列轉(zhuǎn)化來修飾植物特征的成功例子在技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中有很多。選擇的用于說明本技術(shù)領(lǐng)域知識的例子包括
      美國專利5,571,706(“植物病毒抗性基因和方法”)
      美國專利5,677,175(“植物病原體誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)”)
      美國專利5,510,471(“用于轉(zhuǎn)化植物的嵌合基因”)
      美國專利5,750,386(“病原體抗性轉(zhuǎn)基因植物”)
      美國專利5,597,945(經(jīng)遺傳增強(qiáng)疾病抗性的植物“)
      美國專利5,589,615(“通過表達(dá)修飾的2S儲藏白蛋白生產(chǎn)營養(yǎng)價值增高的轉(zhuǎn)基因植物的方法”)
      美國專利5,750,871(“白菜物種中的轉(zhuǎn)化和外源基因的表達(dá)”)
      美國專利5,268,526(“轉(zhuǎn)基因植物中的光敏色素的過量表達(dá)”)
      美國專利5,780,708(“可育轉(zhuǎn)基因玉米植物”)
      美國專利5,538,880(“制備可育轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法”)
      美國專利5,773,269(“可育轉(zhuǎn)基因燕麥植物”)
      美國專利5,736,369(“生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因谷類植物的方法”)
      美國專利5,610,042(“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化小麥的方法”)
      美國專利5,576,198(“植物質(zhì)體中的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的控制表達(dá)”)
      這些例子包括轉(zhuǎn)化載體選擇、轉(zhuǎn)化技術(shù)和設(shè)計過量表達(dá)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體構(gòu)建的說明。a.植物類型
      各種病原體引起的疾病能夠影響許多植物種類。敏感植物包括單子葉、雙子葉和裸子植物。所以,例如CEMA和/或CEMA相關(guān)的肽可導(dǎo)入的植物物種包括但不限于玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、莢果、油菜/卡諾拉、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、煙草、亞麻、花生、三葉草、豇豆和葡萄;蔬菜如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、土豆、胡蘿卜、小蘿卜、豌豆、小扁豆、甘藍(lán)、椰菜、花莖甘藍(lán)、湯菜和椒;樹果實如檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃;樹如花旗松、火炬松木、白楊和榆木;花如蘭花、康乃馨和玫瑰百合;和可可豆、咖啡和橡膠。b.載體的構(gòu)建和啟動子的選擇
      已經(jīng)敘述了適于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或適于建立轉(zhuǎn)基因植物的大量重組載體,包括下面文獻(xiàn)中敘述的那些Pouwels等,Cloning VectorALaboratory Manual,1987;Weissbach and Weissbach,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,5173-184,1989;和Gelvin等,PlantMolecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。通常,植物轉(zhuǎn)化載體包括在5’和3’調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的一個或多個克隆序列以及包括顯性可選擇標(biāo)記。這樣的植物轉(zhuǎn)化載體通常也含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如,控制可誘導(dǎo)或構(gòu)成的表達(dá)、環(huán)境調(diào)節(jié)的或發(fā)育調(diào)節(jié)的表達(dá)或細(xì)胞特異或組織特異表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。
      可以用于表達(dá)轉(zhuǎn)基因的構(gòu)成植物啟動子的例子包括椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子,其能在大多數(shù)植物組織中給予構(gòu)成的、高水平的表達(dá)(參見例如,Odel等,Nature 313810,1985;Dekeyser等,Plant Cell,2591,1990;Terada和Shimamoto,Mol.Gen.Genet.220389,1990;和Benfey和Chua,Science 250959-966,1990);胭脂堿合酶啟動子(An等,Plant Physiol.88547,1998);章魚氨酸合酶啟動子(Fromm等,Plant Cell 1977,1989);具有翻譯增強(qiáng)子序列的2xCaMV/35S啟動子(Kay等,Science 2361299-1302,1987);和葉綠體16S rRNA啟動子(Daniell等,Nat.Biotech.16345-348,1998)。
      在對環(huán)境、激素、化學(xué)品和/或發(fā)育信號應(yīng)答中調(diào)節(jié)的各類植物基因啟動子也可以用于植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá),這些啟動子包括由一種或多種下面的信號所調(diào)節(jié)的啟動子(a)熱(Callis等,Plant Physiol.88965,1988;Ainley等,Plant Mol.Biol.,2213-23,1993;和Gilmartin等,Plant Cell 4839-949,1992);(b)光(例如豌豆rbcS-3A啟動子,Kuhlemeier等,Plant Cell 1471,1989和玉米rbcS啟動子,Schaffner和Sheen,Plant Cell 3997,1991);(c)激素(例如抗壞血酸,Marcotte等,Plant Cell 1471,1989);(d)創(chuàng)傷(例如土豆PinII啟動子,Keil等,Nucl.Acids.Res.145641-5650,1986;農(nóng)桿菌mas啟動子,Langridge等,Bio/Technology 10305-308,1989;和葡萄酒vst1啟動子,Weise等,Plant Mol.Biol.26667-677,1994);和(e)化學(xué)品(例如甲基茉莉酸或唾液酸,Gatz等,Plant Mol.Biol.4889-108,1997)。
      或者可以將特異于組織(例如根、葉、花和種子)的啟動子(Carpenter等,Plant Cell 4557-571,1992;Denis等,Plant Physiol.1011295-1304,1993;Opperman等,Science 263221-223.1993Stockhause等,Plant Cell 9479-489,1997;Roshal等,EMBO J.61155,1987;Schemthaner等,EMBO J.71249,1988;Yamamoto等,PlantCell 3371-382,1990;和Bustos等,Plant Cell 1839-1989)與編碼序列融合以獲得在各個器官中特異表達(dá)。
      植物轉(zhuǎn)化載體也可以包括RNA加工信號,例如內(nèi)含子,其可以定位在轉(zhuǎn)基因中可讀框(ORF)序列的上游或下游。另外,表達(dá)載體也可以包括來自植物基因的3’未翻譯區(qū)的其它調(diào)節(jié)序列,例如可以增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的3’終止子區(qū),如土豆的PI-II終止子區(qū)域或章魚氨酸或胭脂堿合酶(NOS)3’終止子區(qū)。
      最后,如上所述,植物轉(zhuǎn)化載體也可以包括顯性可選擇標(biāo)記基因,從而使得容易地選擇轉(zhuǎn)化體。這樣的基因包括編碼抗生素抗性(例如對潮霉素、卡那霉素、博來霉素、G418、鏈霉素或壯觀霉素的抗性)和除草劑抗性(例如膦絲菌素?;D(zhuǎn)移酶)的那些基因。c.轉(zhuǎn)化和繁殖技術(shù)
      單子葉和雙子葉植物細(xì)胞和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)化和再生現(xiàn)在已經(jīng)是常規(guī)技術(shù),適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)將由實驗者來確定。方法的選擇將根據(jù)待轉(zhuǎn)化的植物類型而變化;本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠識別對于給定植物類型特定方法的適宜性。適當(dāng)?shù)姆椒梢园ǖ幌抻陔姶┛字参镌|(zhì)體;脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化;聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化;利用病毒的轉(zhuǎn)化;微注射植物細(xì)胞;微發(fā)射物轟擊植物細(xì)胞;真空滲透;農(nóng)桿菌(AT)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和葉綠體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化和再生植物的常用方法敘述在本節(jié)開頭列出的專利文件中。d.選擇轉(zhuǎn)化植物
      在用轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化和再生植物后,通常利用摻入轉(zhuǎn)化載體的顯性可選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化植物。通常,這樣的標(biāo)記將給予轉(zhuǎn)化植物的幼苗抗生素抗性,并且轉(zhuǎn)化體的選擇可以通過將幼苗與適當(dāng)濃度的抗生素接觸來進(jìn)行。
      選擇也可以通過開發(fā)經(jīng)轉(zhuǎn)基因給予植物的病原體抗性而完成。如下面實施例所述,這樣篩選可以在轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)再生后完成,或(根據(jù)利用的轉(zhuǎn)基因方法)可以在植物再生之前的綠色轉(zhuǎn)基因愈傷組織上進(jìn)行。IV.含有多個陽離子肽的編碼區(qū)的植物
      在一些情況中,導(dǎo)入多個拷貝的單陽離子肽基因或編碼不同陽離子肽的幾個基因可以增強(qiáng)由單個拷貝編碼CEMA或CEMA相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因所給予的抗性水平。
      通過利用遺傳工程,在單個載體中導(dǎo)入多個陽離子肽的編碼區(qū)是可能的。通常(雖然不是必需的)這樣的載體含有兩個或多個各自與其自身5’-和3’-調(diào)節(jié)序列可操作連接的CEMA和/或CEMA相關(guān)的可讀框(ORF)。當(dāng)導(dǎo)入植物中時,這樣的載體可以導(dǎo)致多個陽離子肽種類的表達(dá)。
      利用標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)還能產(chǎn)生含有多個轉(zhuǎn)基因的植物。在第一個植物中可以導(dǎo)入編碼第一個陽離子肽的轉(zhuǎn)基因,并在第二個植物中可以導(dǎo)入編碼第二個陽離子肽的第二個轉(zhuǎn)基因。然后,將得到的這兩個轉(zhuǎn)基因植物雜交產(chǎn)生攜帶兩個轉(zhuǎn)基因的子代。V.生產(chǎn)和分離CEMA和CEMA相關(guān)肽
      上述的組成和方法不僅可以用于生產(chǎn)顯示增強(qiáng)的廣譜病原體抗性的植物,而且為大范圍的其它應(yīng)用可以用于大規(guī)模地生產(chǎn)CEMA和CEMA相關(guān)肽。例如,可以純化在植物中大量產(chǎn)生的CEMA和CEMA相關(guān)肽,并且用于醫(yī)藥用途。本發(fā)明的另一個方面提供生產(chǎn)CEMA和CEMA相關(guān)肽的植物,可以用作藥用植物而不需要進(jìn)一步純化陽離子肽。這樣的植物可以用于治療或預(yù)防疾病,如感染性微生物疾病和/或動物如人中的癌癥。
      植物生產(chǎn)生物活性肽現(xiàn)在已經(jīng)廣泛使用,大量的表達(dá)和純化方法是熟知的。在Goodman等的美國專利4,956,282中可以找到使植物生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)更簡便的構(gòu)建體的例子。這些構(gòu)建體通常含有啟動子區(qū)和編碼后來用于純化過程的氨基酸序列的其它核酸序列。用于使CEMA和/或CEMA相關(guān)肽分離簡化的氨基酸序列隨后可以切割并丟棄。
      通過在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器如葉綠體中轉(zhuǎn)化和表達(dá)可以增強(qiáng)植物中生物活性肽的生產(chǎn)。在這些情況中,細(xì)胞器的作用可能是增強(qiáng)表達(dá)以及包含該肽,從而通過過量表達(dá)預(yù)防植物毒性。這些細(xì)胞器將是高度濃縮的CEMA或CEMA相關(guān)肽的來源,從中可以分離肽。VI.具有N端延伸CAP的生產(chǎn)
      如本文所述的ECEMA分子是N端延伸的CAP的例子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到其它CAP可以修飾成含有N端延伸,并且意識到通過在CAP上添加其他氨基酸殘基,CAP的活性得到修飾,并在一些情況下,允許待成功利用的CAP保護(hù)植物免遭廣譜病原體的感染(其中“廣譜抗性表示至少對一種真菌菌株的抗性和至少對一種細(xì)菌菌株的抗性)。
      所以,本發(fā)明提供了在CAP上添加N端延伸和在體外測試延伸CAP所得到的活性的方法。本發(fā)明也提供植物中測試這樣的N端延伸的CAP的方法。在SEQ ID NO5-7和11中提供了N端延伸的例子。另外,不改變N端延伸的能力可以制備這樣的延伸變體,從而使得CAP的表達(dá)與植物生理相容,即允許植物生長。變體如上所述可以含有保守的氨基酸的取代、缺失和添加。但是,這些變體N端延伸將保持足夠的抗微生物活性,從而在植物表達(dá)后上它們可以增強(qiáng)植物對廣譜病原體的抗性。VI.給予的抗性
      細(xì)胞對細(xì)胞傳輸?shù)鞍踪|(zhì)的機(jī)制還沒很好了解。但是,已知從病毒分離各種運動蛋白質(zhì)有利于蛋白質(zhì)細(xì)胞到細(xì)胞的運動(Lucas和Wolf,Current Opinion in Plant Biology 2192-197,1999;和Lazarowitz,CurrentOpinion in Plant Biology 2332-338,1999)。另外,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)韌皮液含有許多蛋白質(zhì)并且這些蛋白質(zhì)的存在與長距離傳遞大分子如蛋白質(zhì)有關(guān)(Thompson,Trends in Plant Science 4354-360,1999)。所以可能當(dāng)將表達(dá)CEMA或CEMA相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物組織嫁接到其它非轉(zhuǎn)基因組織上時,轉(zhuǎn)基因組織將至少給予非轉(zhuǎn)基因部分一些病原體抗性。給予非轉(zhuǎn)基因植物組織病原體抗性在本文中稱為“給予抗性”?!敖o予抗性”可以通過在轉(zhuǎn)基因根莖(下面的植物組織)上嫁接幼芽(上面的植物組織),或通過在非轉(zhuǎn)基因根莖上嫁接轉(zhuǎn)基因幼芽來建立。這樣嫁接產(chǎn)生的植物在本文的下面稱為“嵌合植物”。
      另外可預(yù)料通過將CEMA或CEMA相關(guān)蛋白質(zhì)與病毒運動蛋白質(zhì)或通常存在于韌皮中的其它蛋白質(zhì)共表達(dá)或可操作連接,能增強(qiáng)非轉(zhuǎn)基因組織的滲透。
      利用交叉物種嫁接可以使嫁接方案更靈活。所以,來自例如杏仁(Prumus amygdalus)的嫁接體可以放置在桃(Prumus persica)的根莖上。這種靈活性增大了可利用給定轉(zhuǎn)基因組織的植物范圍。例如,在已經(jīng)產(chǎn)生含有CEMA或CEMA相關(guān)肽的杏仁組織后,得到的轉(zhuǎn)基因組織不僅能用作給予其他杏仁樹抗性而且能用作給予桃樹抗性。
      利用給予抗性也降低了依據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)基因?qū)氕h(huán)境的可能性。這是因為抗性是起源于移植體本身的,而植物的其它部分仍然無轉(zhuǎn)基因。所以,植物的果實和種子仍然是非轉(zhuǎn)基因,從而不傳導(dǎo)該基因。
      通過防止轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锶?,用于人消費的產(chǎn)品可以由非轉(zhuǎn)基因的植物生產(chǎn)。
      另外,如上所述的嵌合植物不一定必須給予非轉(zhuǎn)基因組織病原體抗性。在一些情況下,嵌合植物的轉(zhuǎn)基因部分僅對轉(zhuǎn)基因組織提供所需的病原體抗性。實施例1.選擇和產(chǎn)生編碼CEMA和CEMA相關(guān)肽的核酸序列
      設(shè)定引物(Oligo#15’-CAAGG AAAAA CGGTC TAGAG CATATGAAAT GGAAA C-3’(SEQ ID NO9);和Oligo#25’-GAACT CGAGCAGCGA GCTCT TACTT AGTTA GCTTC-3’(SEQ ID NO10))各自在擴(kuò)增片段的5’端具有XbaI識別位點,和在3’端具有BamHI識別位點。將質(zhì)粒pR78hproCEMA(R.E.W.Hancock,Vancoucer,B.C.;Piers,等,Antimicrob.Agents Chemother.382311-2316,1994)用作PCR的模板。用NucleoSpinTM柱(CLONTECH,Palo Alto,CA,USA)純化含有編碼ECEMA序列的擴(kuò)增DNA片段,用XbaI和BamHI消化,并且插入已經(jīng)用XbaI和BamHI消化的載體(Promega Corp.,Madison,WI,USA)中。得到的載體命名為pSAI1。
      切出含有CaMV 35S啟動子、GUS基因和NOS-ter序列的pBI121(Clontech)的HindIII-EcoRI片段,用來自pSAI1(含有增強(qiáng)的35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強(qiáng)因子、ECEMA編碼序列(SEQ IDNO3)和NOS-ter序列)的HindIII-EcoRI片段替代。得到的載體指定為pSAI4。然后,將編碼ECEMA的雙鏈DNA克隆進(jìn)下述的一個或多個載體。2.含有各種啟動子序列的載體
      將編碼ECEMA和CEMA的核酸序列組裝進(jìn)各種植物轉(zhuǎn)化載體,從而將序列置于各種不同啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。
      將編碼ECEMA和CEMA的核酸序列克隆進(jìn)一個這樣的載體,并將各個序列置于含有兩個拷貝的CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強(qiáng)元件的啟動子的控制下。Kay等,Science 2361299-1302,1987。將這樣的載體產(chǎn)生的克隆用前綴“pD”命名。所以,例如,pDECEMA命名的是含有在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強(qiáng)子控制下的ECEMA構(gòu)建體的載體,pDCEMA命名的是含有在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強(qiáng)子控制下的CEMA構(gòu)建體的載體。
      構(gòu)建了另一個載體以使ECEMA編碼序列在重建的“超級啟動子”的控制下。從這樣的載體產(chǎn)生的克隆命名為pRSHECEMA。含有mas(甘露氨酸合酶)啟動子/激活子區(qū)的超級啟動子(Langridge等,Bio/Technology 10305-308,1989)在ocs(章魚氨酸合酶)上游激活序列的三聯(lián)體(反向)的前面。文獻(xiàn)Ni等,The Plant J.7661-676,1995提供了這個超級啟動子更詳細(xì)的敘述。
      將編碼CEMA的核酸序列克隆進(jìn)含有單拷貝的CaMV 35S啟動子和來自人嗜中性防衛(wèi)素蛋白質(zhì)原區(qū)的另一個載體中(Daher等,Pro.Natl.Acad.Sci USA,857327-7331,1988)。得到的載體命名為“pProCEMA”。3.轉(zhuǎn)化土豆和煙草
      將土豆作物,“Russet Burbank”和“Desiree”,以及煙草用作轉(zhuǎn)化的代表性植物物種。根據(jù)文獻(xiàn)De Block,Theoret.Appl.Genet.76767-774,1988,作一些修改進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)化。用文獻(xiàn)Holster,等,Mol.Gen.Genet.163181-187,1978所述的凍融方法進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌LBA4404或MP90的轉(zhuǎn)化。
      將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞涂抹于選擇培養(yǎng)基上(對LBA4404,LB+100g/mL利福霉素+50g/mL卡那霉素;對MP90,LB+10g/mL慶大霉素+50g/mL卡那霉素)。用質(zhì)粒分離和限制性酶切分析證明在農(nóng)桿菌細(xì)胞中存在質(zhì)粒pSAI4。
      用文獻(xiàn)De Block,Theoret.Appl.Genet.76767-774,1988中所述的修飾的方法進(jìn)行土豆作物“Desiree”和“Russet Burbank”的轉(zhuǎn)化。從4周齡的幼苗中切掉葉(5毫米直徑)和莖,并進(jìn)一步用無菌吸管尖創(chuàng)傷。將約15個創(chuàng)傷葉和莖倒浮在9厘米直徑皮氏培養(yǎng)皿中的15毫升“感染培養(yǎng)基S2”上(Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,Physiol.Plant.15473-479,1962),培養(yǎng)基中補(bǔ)充了30g/L蔗糖、0.5g/L MES(2-[N-嗎啉]乙烷磺酸pH5.5)和20g/L甘露醇)。在皮氏培養(yǎng)皿中加入60L攜帶質(zhì)粒pSAI4的農(nóng)桿菌(在含有適當(dāng)抗生素的LB上生長到對數(shù)后期)。在低光強(qiáng)度(500勒克斯)下溫育3天后,用含有1g/L羧芐青霉素的S2培養(yǎng)基洗滌葉子,在無菌濾紙上拍干,倒置于培養(yǎng)基S4上(Murashige-Skoog培養(yǎng)基補(bǔ)充有200mg/L谷氨酸、0.5g/L MES pH5.5、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、5g/L瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L萘乙酸(NAA)、1g/L羧芐青霉素、50mg/L卡那霉素和10g/L AgNO3),在高光強(qiáng)度(3000勒克斯)下室溫溫育。兩個星期后,在葉子和莖的創(chuàng)傷邊緣形成了許多小的愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮S6培養(yǎng)基(沒有NAA的S4培養(yǎng)基)。另兩個星期后,將愈傷組織轉(zhuǎn)移到S8培養(yǎng)基(加0.1mg/mL赤霉素(GA3)的S6培養(yǎng)基),允許長出新芽。再兩個星期后,將第一個新苗(0.5cm長)轉(zhuǎn)移到洋紅茄子瓶中的S1培養(yǎng)基上(“B5”培養(yǎng)基,Gamborg等,Exp.Cell Res.50151-158,1968,含有20g/L蔗糖,補(bǔ)充150mg/LCaCl2、4g/L瓊脂糖、pH5.8,并含有1g/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素)。通常一個星期后,將苗植根。將再生植物轉(zhuǎn)移到含有1g/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上,并且用于進(jìn)一步分析。4.篩選對疾病抗性的愈傷組織
      對疾病抗性分析的簡單早期檢測方法已經(jīng)開發(fā)。在S4培養(yǎng)基(沒有蔗糖的MS培養(yǎng)基,并補(bǔ)充200mg/L谷氨酸、0.5g/L MES、pH5.7、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、0.5%瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L NAA、1g/L羧芐青霉素以及50g/mL卡那霉素,和10mg/L AgNO3)上生長對照和轉(zhuǎn)基因愈傷組織。然后將樣品于3000勒克斯光照下室溫放置,允許形成愈傷組織。兩個星期后,在葉和莖的創(chuàng)傷邊緣形成許多小的愈傷組織。取除小的愈傷組織并轉(zhuǎn)移到新鮮的S6培養(yǎng)基(沒有NAA的S4)中。2-3個星期后,將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上并在存在植物病原體(鐮刀菌或疫霉)下生長。將存活并保持亮綠的愈傷組織計數(shù)。在對照樣品中未發(fā)現(xiàn)真菌抗性的愈傷組織,并且發(fā)現(xiàn)對真菌病原體有抗性的愈傷組織是轉(zhuǎn)化的。5.轉(zhuǎn)基因植物的分子特征
      用下述方法,從轉(zhuǎn)基因土豆和煙草植物分離DNA。在一些情況下,純化包括了更嚴(yán)格的方案;而在其他情況下,進(jìn)行簡單粗提取過程。在更嚴(yán)格的抽提過程中,取10g新鮮葉組織并立即冷凍在液氮中。將冷凍組織研磨成細(xì)粉,并用20mL抽提緩沖液(50mM Tris-HCl緩沖液、5mM EDTA、0.35M山梨醇、0.1%BSA、0.1%巰基乙醇、10%聚乙二醇4000)抽提。將勻漿物通過幾層干酪包布和一層MiraclothTM(Calbiochem,la Jolla,CA,USA)過濾。然后根據(jù)文獻(xiàn)Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842097-2100,1987進(jìn)行最后的純化步驟。
      粗提取方法主要用于制備PCR分析的樣品。對這個過程,收集約200mg新鮮葉子,在液氮中研磨成粉末。在粉末中加入100L 0.5NNaOH并混合(渦旋)30秒。離心上清液5分鐘,將5升上清液加入到45L 100mM Tris緩沖液(pH8.0)中。將得到的基因組DNA粗提液用作PCR擴(kuò)增的模板。
      檢測是否存在ECEMA或CEMA構(gòu)建體是利用提取的基因組DNA和SEQ ID NO9和10中所示的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來實現(xiàn)。根據(jù)這一方法,鑒定了用pDECEMA或pRSHECEMA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草和土豆植物。
      在一些情況中,用Northern印跡分析證實轉(zhuǎn)基因的活性表達(dá)。用于這種分析的RNA底物從轉(zhuǎn)基因煙草和土豆植物中分離出來并純化。分離方案按照文獻(xiàn)Verwoerd等,Nucl.Acids Res.172362,1989進(jìn)行。
      在一個說明性的實施例中,pDECEMA用于轉(zhuǎn)化土豆作物。用pDECEMA通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩個土豆作物,Russet Burbank和Desiree。在抗生素選擇后,再生卡那霉素抗性植株。從非轉(zhuǎn)化(對照)和轉(zhuǎn)基因植物分離的基因組DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增ECEMA序列(SEQID NO3)證實了ECEMA(SEQ ID NO4)整合進(jìn)了植物基因組DNA。擴(kuò)增的DNA片段的大小與從pDECEMA質(zhì)粒DNA擴(kuò)增的片段相同。同樣,對于Desiree,轉(zhuǎn)基因植物,在轉(zhuǎn)化植物而不是非轉(zhuǎn)化植物的基因組的PCR產(chǎn)物中檢測到了一條帶。因此ECEMA(SEQ ID NO4)已經(jīng)成功地整合進(jìn)了這些轉(zhuǎn)基因土豆植物的基因組中。
      用RT-PCR,在RNA水平檢測ECEMA(SEQ ID NO4)的表達(dá)。在所有Russet Burbank和Desiree作物的轉(zhuǎn)基因系中證實了有表達(dá),而對照植物中沒有出現(xiàn)RNA產(chǎn)物。另外,在PCR之前用脫氧核糖核酸酶處理的RNA樣品中沒有帶證明RNA樣品沒有被基因組DNA污染(圖2)。
      將表達(dá)ECEMA(SEQ ID NO4)的轉(zhuǎn)基因Desiree植物和塊莖的形態(tài)學(xué)特征與對照非轉(zhuǎn)化植物比較(圖3A-3B)。然而當(dāng)與對照植物比較時,Russet Burbank中ECEMA(SEQ ID NO4)的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因土豆植物中引起形態(tài)學(xué)變化。觀察到最明顯的變化是葉子變得卷曲以及塊莖較小和分支。在測試的所有Russet Burbank轉(zhuǎn)基因系中觀察到了這一明顯的“損傷-模擬”表型。
      不論“損傷-模擬”,表達(dá)Russet Burbank ECEMA的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量(總塊莖質(zhì)量/植株)與對照的非轉(zhuǎn)化植株的產(chǎn)量相當(dāng)。
      表達(dá)ECEMA的Desiree植株的產(chǎn)量(總的塊莖質(zhì)量/植株)(1845g)大于用GUS轉(zhuǎn)化的對照(1544g)和非轉(zhuǎn)化對照(1502g)。
      另外,在一系列的對照實驗中,用與上面的構(gòu)建體相似的方式選擇表達(dá)GUS、花旗松NADPH光敏色素P450還原酶或pProCEMA的轉(zhuǎn)基因植物。這些轉(zhuǎn)基因植物中沒有一個顯示疾病抗性特征。6.對細(xì)菌病原體的抗性
      為了檢測轉(zhuǎn)基因土豆植物對細(xì)菌病原體Erwinia carotovora cvcarotovora的抗性,2mL病原體過夜培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基中室溫生長)用無菌蒸餾水稀釋5倍。將1mL稀釋培養(yǎng)物加入試管中的2mL液體MS培養(yǎng)基中。將從轉(zhuǎn)基因或?qū)φ胀炼怪参锷闲虑邢碌姆种?4cm長)插入到試管中,把各個分枝的底邊浸入細(xì)菌培養(yǎng)物中,并在室溫下溫育。
      一星期后結(jié)果顯示,對照植物嚴(yán)重感染并且生長抑制。隨后植物死亡。相反,轉(zhuǎn)基因植物未感染并繼續(xù)生長,這表明ECEMA的表達(dá)增強(qiáng)了土豆植物對這種細(xì)菌病原體的抗性。
      從表達(dá)CEMA和ECEMA的“Desiree”植株(以及對照植株)收獲的塊莖也被用于塊莖-組織對胡蘿卜軟腐歐文氏菌抗性的測試。對于定性試驗,在用無菌木栓穿孔器從塊莖制備的復(fù)盤(2cm直徑,1cm厚)表面上移液20升100x稀釋的過夜細(xì)菌培養(yǎng)物(大約2×107CFU)。然后室溫下將塊莖復(fù)盤在皮氏培養(yǎng)皿中溫育6天。對于定量試驗,在每個塊莖復(fù)盤(2cm直徑,3cm厚)中打一小孔。在每個小孔中移入20μ1 100×稀釋細(xì)菌過夜培養(yǎng)物,并室溫溫育復(fù)盤6天。然后從塊莖復(fù)盤中輕柔地除去腐爛的組織,測定余下組織的質(zhì)量。
      結(jié)果表明,在用2×107CFU的胡蘿卜軟腐歐文氏菌溫育6天后,對照(C;圖4A)土豆塊莖由于軟腐已經(jīng)丟失了約60%的鮮重。來源于用胡蘿卜軟腐歐文氏菌感染的轉(zhuǎn)基因Desiree植物(ME1、ME2、ME3 圖4A)的塊莖復(fù)盤的重量的損失小于5%,并且是與未感染的復(fù)盤比較的(圖4A)。在另一個實驗中,來自對照(未轉(zhuǎn)化)的土豆的復(fù)盤已經(jīng)降解了大部分,而來自表達(dá)ECEMA的植株的復(fù)盤未受影響。在4℃儲藏6個月后,來自未轉(zhuǎn)化的土豆的塊莖的約1/3自然感染并腐爛,而所有表達(dá)ECEMA的轉(zhuǎn)基因株系仍然健康無疾病征兆。7.對真菌的抗性
      利用下面的方法測試成熟植株對各種真菌的抗性。切下含有鐮孢和疫霉的培養(yǎng)基塊(1cm×1cm×0.5cm),放置于9厘米皮氏培養(yǎng)皿的V8瓊脂培養(yǎng)基(250ml/L V8汁,7g/L瓊脂)新鮮平板的中央,并在室溫下生長約1個月,或直到真菌菌絲體完全覆蓋了皮氏培養(yǎng)皿。切下轉(zhuǎn)基因植株的幼苗(約10cm)并轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基中進(jìn)一步生長。根據(jù)不同的處理,允許植株生長3天或2星期直到幼苗長根。然后,將兩塊(1cm×1cm×0.5cm)的真菌瓊脂加到植株幼苗的兩邊,而不損傷幼苗。然后肉眼鑒定得到的感染程度。
      在代表性實驗中,將用pDECEMA或pProCEMA轉(zhuǎn)化的各個轉(zhuǎn)基因土豆植株(Russet Burbank和Desiree)、用pRSHECEMA、pDECEMA或pProCEMA轉(zhuǎn)化的煙草植株和對照土豆和煙草植株與仙人掌疫霉接觸。7天后,在MS培養(yǎng)基表面已經(jīng)生長了仙人掌疫霉,并且滲入了對照植株的根和莖中,引起致命的植物功能損傷。顯然對照植株的根嚴(yán)重?fù)p傷。對照植株和真菌的相互作用引起了指示腐敗的黃棕色素的分泌。隨后,對照植株失去水分,葉子卷曲,各個莖的底邊發(fā)軟,根死亡。相反,轉(zhuǎn)基因植株卻健康地生長,未顯現(xiàn)疾病癥狀,甚至在真菌菌絲體完全覆蓋了MS培養(yǎng)基后也一樣。
      在另一個實驗中,用茄病鐮孢攻擊pDCEMA轉(zhuǎn)基因土豆植株和用pProCEMA轉(zhuǎn)化的對照土豆植株。6天后,鐮孢生長覆蓋了MS培養(yǎng)基的表面。對照植株的根損傷嚴(yán)重。對照植株的莖的基部滲入了鐮孢,莖松軟,感染的葉子脈明顯變棕色并壞死。幾天后,對照植株倒下死亡。但是,轉(zhuǎn)基因植株甚至在茄病鐮孢極度橫行的情況下還繼續(xù)生長。
      用pDECEMA轉(zhuǎn)化的Russet Burbank和Desiree植株和植物病原體真菌茄病鐮孢進(jìn)行相似的一組實驗。感染6天后,在MS培養(yǎng)基表面長滿了鐮孢,并且對照植株的根和莖嚴(yán)重?fù)p傷。感染后11天,對照植株死亡,而轉(zhuǎn)基因植株仍然生長正常,無感染的跡象。
      ECEMA的表達(dá)大大地增強(qiáng)了Russet Burbank和Desiree植株對細(xì)菌(歐文氏桿菌)以及真菌(鐮孢、疫霉)植物病原體的抗性,這使得ECEMA成為植物抗微生物中非常有前途的工具。雖然沒有損傷模擬效果,但這些結(jié)果在煙草中已經(jīng)得到重復(fù)。上述方案包括采用高水平的攻擊性病原體共培養(yǎng)和以生存作為終點,對疾病抗性高度嚴(yán)格生物分析,而其它方案依賴于較不嚴(yán)格的分析,例如以對損傷形成增強(qiáng)的抗性作為感染性指征(Cao等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956531-6536,1999;和Heo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96776-771,1999)。
      當(dāng)整個植株生長在病原體中時,上述的攻擊模型更接近地代表野外情況是可能的,在野外土壤和感染植株提供恒定的植物病原體儲備。在這方面,本文所述的轉(zhuǎn)基因植株在存在細(xì)菌和真菌病原體時已經(jīng)生長了2個月以上,而仍沒有疾病的跡象。進(jìn)一步,在4C下儲藏一年,此法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因土豆塊莖保留了他們的抗微生物特征,并且保持了對歐文氏桿菌軟腐的抗性。下面所述的ECEMA的提取也使得估計的ECEMA濃度約為3-4μg/g原始塊莖組織,該濃度足以保護(hù)塊莖不受細(xì)菌的攻擊。另外,預(yù)先的一個月的喂養(yǎng)實驗表明來自表達(dá)ECEMA的轉(zhuǎn)基因土豆植株的塊莖對小鼠是沒有毒性的。
      在如上述的轉(zhuǎn)基因Russet Burbank土豆的情況下,ECEMA的構(gòu)成性表達(dá)也可以引起與所謂“損傷-模擬”表型相似的形態(tài)學(xué)變化。植物中外源基因的表達(dá)能引發(fā)通常只在發(fā)病過程中試圖去除病原體時所激活的植物-防衛(wèi)機(jī)制的活化,已經(jīng)觀察到這一現(xiàn)象。Mittler等,TrendsMicrobiol.410-15,1996;Abad等,Mol.Plant Microbe Interact.10635-645,1997;和Dempsey等,Trends Microbiol.654-61,1997。但是,在這些前面所報道的觀察中,轉(zhuǎn)基因植株顯示損傷-模擬應(yīng)答,但植株未顯示廣譜的病原體抗性。與本文所報道的數(shù)據(jù)相反,表達(dá)ECEMA的Russet Burbank植株具有高水平的抗微生物活性,即使這些植株具有損傷模擬應(yīng)答。所以能認(rèn)為本文公開的在對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的應(yīng)答中顯示損傷模擬的轉(zhuǎn)基因植株將保留病原體抗性。8.生物活性ECEMA的生產(chǎn)
      將10克來自土豆塊莖的組織在液氮N2中研磨成精細(xì)粉末,并用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑雞尾酒(P9599,Sigma)的10mL抽提緩沖液(EB;50mM Bicine-NaOH,pH9.0;1mM EDTA;20mM NaCl;1%TritonX-100)在4C抽提30分鐘。將勻漿物12000rpm(BeckmanJ2-21)4C離心30分鐘,并將上清液通過0.45μm濾紙過濾以除去微粒物質(zhì)。將得到的勻漿物加到用EB平衡的陽離子交換柱HiTrapTMSP(0.7×2.5cm;Pharmacia Biotech,Sweden)。在用6個柱體積的含有蛋白酶抑制劑的EB洗滌后,用含有蛋白酶抑制劑的EB中NaCl梯度(0.2M、0.3M和0.5M)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)和肽。然后在Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析各個組分(Schagger等,Anal.Biochem.166368-379,1987),并且用于體外抗細(xì)菌分析。
      利用上述的提取方法,從轉(zhuǎn)基因土豆塊莖中證明了ECEMA的存在并部分純化了ECEMA。進(jìn)一步,只在含有和ECEMA同樣大小肽的那些級分中觀察到了殺菌活性(以胡蘿卜軟腐歐文氏菌作為靶子)(
      圖1B)。在同齡的對照和非轉(zhuǎn)基因的塊莖中完全缺乏肽和殺菌活性。這些結(jié)果證明來自轉(zhuǎn)基因植株的塊莖含有生物活性ECEMA,其濃度足以在4℃延長儲藏過程中保留他們的抗菌特性。9.抵抗后期枯萎(仙人掌疫霉分離株US-8和US-11)的轉(zhuǎn)化植物和塊莖
      在黑麥瓊脂上培養(yǎng)兩個仙人掌疫霉菌株(US-11A1和US-8A11)。通過在2升蒸餾水中煮沸120g有機(jī)生長的黑麥顆粒制備黑麥瓊脂。然后,將水保持沸騰煮到1000-1250mL。接著通過在干酪包布上的干濾器除去顆粒濾干得到的混合物。然后,2000rpm離心收集的上清液5分鐘,用蒸餾水將體積加到2升。加入2g葡聚糖和27g BactoAgarTM,高壓滅菌培養(yǎng)基(121℃、40分鐘),然后冷卻并傾倒。
      為了接種植物,用水稀釋兩個菌株,產(chǎn)生含有5000-10000個孢子囊/mL的后期枯萎孢子囊懸浮液,其在5℃冷凍產(chǎn)生動孢子。將得到的含孢子囊的混合物噴灑在具有已知后期枯萎抗性的5個標(biāo)準(zhǔn)土豆株系和ECEMA轉(zhuǎn)基因Desiree植株。讓植物生長在塑料帳篷中,并引入霧促進(jìn)疾病發(fā)生。
      在接種后7、14和21天進(jìn)行葉子比例計算以評估后期枯萎引起的脫葉百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因土豆植株(Desiree)比測試的五個對照株系的任何一個更能抵抗后期枯萎(圖5)。
      進(jìn)行相似的實驗以評估轉(zhuǎn)基因塊莖(Desiree)對后期枯萎的抗性。在接種前每個土豆株系洗滌15到20個塊莖,以便從塊莖表面除去土壤并選擇那些沒有疾病癥狀的塊莖。對于US-8和US-11的各個表型,將各個土豆株系的重復(fù)塊莖在后期枯萎孢子囊懸浮液中蘸接種。研究中也包括五個已知有枯萎抗性的土豆株系。在封閉的氣候控制室中12℃、95-100%濕度下溫育接種的土豆塊莖14-21天。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因塊莖對后期枯萎比測試的五個對照株系中的任何一個都更有抗性。
      在多個實施方案和實施例中已經(jīng)敘述和說明了本發(fā)明的原理,本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白本發(fā)明可以在排列和細(xì)節(jié)上作修改而不脫離這些原理。我們要求保護(hù)在下面權(quán)利要求的精神和保護(hù)范圍內(nèi)的所有修改部分。
      序列表
      序列表<110>維多利亞大學(xué)創(chuàng)新和發(fā)展公司<120>顯示廣譜病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物
      (Transgenic Plants Exhibiting Resistance to a Spectrum of Pathogen)<130>3055-22/PAR<140><141><150>60/165,249<151>1999-11-12<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼陽離子肽的改造DNA序列<400>1aaatggaaac tgttcaagaa gatcggcatc ggcgccgtgc tgaaactgct gaccaccggt 60ctgccggcgc tgaagctaac taactaa 87<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述改造的陽離子肽<400>2Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val 1 5 10 15Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu Thr Lys
      20 25<210>3<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼ECEMA的核酸序列<400>3atggctctag agcatatgaa atggaaactg ttcaagaaga tcggcatcgg cgccgtgctg 60aaagtgctga ccaccggtct gccggcgctg aagctaacta agtaa 105<210>4<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述改造的陽離子肽<400>4Met Ala Leu Glu His Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile 1 5 10 15Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu
      20 25 30Thr Lys<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>5Ala Met Trp Lys 1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>6Ala Ser Arg His 1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>7Ala Leu Trp Lys 1<210>8<211>24<212>PRT<213>Rana temporaria<400>8Glu Glu Glu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asp Glu 1 5 10 15Arg Asp Val Gln Val Glu Lys Arg
      20<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>9caaggaaaaa cggtctagag catatgaaat ggaaac 36<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>10gaactcgagc agcgagctct tacttagtta gcttc 35<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>11Met Ala Leu Glu His Met 1 權(quán)利要求
      1.轉(zhuǎn)基因植物,其表達(dá)選自CEMA和CEMA相關(guān)肽的陽離子肽。
      2.轉(zhuǎn)基因植物,其包含重組核酸分子,其中核酸分子編碼選自CEMA和CEMA相關(guān)肽的肽。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽包括選自在SEQ IDNO2和SEQ ID NO4中所闡述的氨基酸序列的氨基酸序列。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽進(jìn)一步包括長度少于25個氨基酸的N端肽延伸。
      5.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽進(jìn)一步包括長度小于25個氨基酸的C端肽延伸。
      6.根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物,其中N端肽選自SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO11。
      7.轉(zhuǎn)基因植物,其含有重組核酸分子,其中核酸分子編碼具有選自P-C和P-E公式的融合肽,其中C是CEMA肽,E是CEMA相關(guān)肽和P是陰離子原區(qū)肽。
      8.轉(zhuǎn)基因植物,其包含編碼具有選自P-S-C和P-S-E公式的融合肽的重組核酸分子,其中C是CEMA肽,E是CEMA相關(guān)肽,P是陰離子原區(qū)肽和S是間隔肽。
      9.轉(zhuǎn)基因植物,其包含編碼包括氨基酸序列的肽的核酸分子,所述氨基酸序列選自
      (a)SEQ ID NO2和SEQ ID NO4;
      (b)與(a)中特定氨基酸序列相差一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列;和
      (c)與(a)中特定氨基酸序列至少共享40%的序列同一性的氨基酸序列,其中肽具有CEMA生物活性。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽進(jìn)一步包括與肽的N端可操作連接的陰離子原區(qū)肽。
      11.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽進(jìn)一步包括N端延伸。
      12.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物,其中肽進(jìn)一步包括C端延伸。
      13.轉(zhuǎn)基因植物,其包含編碼包括氨基酸序列的肽的重組核酸分子,所述氨基酸序列選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。
      14.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9和13任一個的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物選自土豆、煙草、玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、莢果、油菜/卡諾拉、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、亞麻、花生、三葉草、萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、胡蘿卜、小蘿卜、豌豆、小扁豆、甘藍(lán)、椰菜、花莖甘藍(lán)、湯菜、椒和其它蔬菜;檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃和其它果樹;蘭花、康乃馨、玫瑰和其它花;可可豆、咖啡和橡膠樹;花旗松、云杉、松和其它針葉樹;白楊、榆木和其它落葉樹;和草皮和草坪草。
      15.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物是土豆植物。
      16.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物是煙草植物。
      17.生成至少一種陽離子肽的方法,該方法包括依據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23的任何一個繁殖至少一種轉(zhuǎn)基因植物,和分離陽離子肽,其中肽是從完整的植物、部分植物或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器分離的。
      18.轉(zhuǎn)基因植物,其表達(dá)與陽離子肽可操作連接的末端延伸序列。
      19.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物,其中N端延伸序列包括小于25個氨基酸的殘基。
      20.根據(jù)權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因植物,其中N端延伸選自SEQ IDNO5、6、7和11。
      21.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法,所述轉(zhuǎn)基因植物給予廣譜病原體抗性的末端延伸的陽離子肽并且與植物生理相容,該方法包括
      (a)用編碼N端延伸的陽離子肽的核酸序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞;
      (b)在植物中表達(dá)末端延伸的陽離子肽;和
      (c)確定表達(dá)末端延伸肽的植物對廣譜病原體具有抗性。
      22.權(quán)利要求21的方法,其中N端延伸序列選自SEQ ID NO5、6、7和11。
      23.轉(zhuǎn)基因植物,由權(quán)利要求21的方法生產(chǎn)。
      24.生成至少部分具有增強(qiáng)的保存期或儲藏期的植物的方法,該方法包括
      (a)根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23中的任一個種植轉(zhuǎn)基因植物;和
      (b)收獲至少部分植物,其中收獲的植物部分比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ毡3指L時間的無病原體感染。
      25.轉(zhuǎn)基因植物部分,其中植物部分選自切花、果實、蔬菜和草。
      26.嵌合植物,其包含第一部分和第二部分,其中第一部分含有來自權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉(zhuǎn)基因植物的組織,第二部分含有非轉(zhuǎn)基因植物組織。
      27.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物顯示與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比增加的植株產(chǎn)量或植株產(chǎn)物的產(chǎn)量。
      28.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物對仙人掌疫霉導(dǎo)致的晚期枯萎顯示抗性。
      29.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉(zhuǎn)基因植物,其中轉(zhuǎn)基因植物對胡蘿卜軟腐歐文氏菌導(dǎo)致的軟腐顯示抗性。
      全文摘要
      公開了表達(dá)抗微生物的CEMA和/或與CEMA相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物。在一些實施方案中,這些植物具有增強(qiáng)的廣譜病原體抗性,并且可用作農(nóng)作物或園藝作物。在其它實施方案中,這些植物用于生產(chǎn)大量的CEMA和/或與CEMA相關(guān)的肽。
      文檔編號C12N15/82GK1390262SQ0081559
      公開日2003年1月8日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
      發(fā)明者桑托什·米斯拉, 威廉·D·凱, 米蘭·奧蘇斯基 申請人:維多利亞大學(xué)創(chuàng)新和發(fā)展公司
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