專利名稱：纖維蛋白溶解活性多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有非天然存在序列的纖維蛋白溶解活性金屬蛋白酶及其生產(chǎn)的組合方法，和其在體內治療血栓形成方面的應用。
背景技術：
fibrolase是一種由203個氨基酸殘基組成的酶活性多肽(具體地說，是一種金屬蛋白酶)，該酶最初是由南方銅頭蛇(SouthernCopperhead snake)的毒液純化分離的；1986年9月9日授予的美國專利第4,610,879號(Markland等)；和Guan等，Archives of Biochemistryand Biophysics，第289卷，第2期，第197-207頁(1991)。此酶顯示出直接的纖維蛋白溶解活性、而極少或沒有出血活性。它溶解或者由纖維蛋白原構成的血凝塊或者由全血構成的血凝塊。
也已經(jīng)測定了fibrolase的氨基酸序列，也有關于其酵母重組生產(chǎn)方法的描述和其在體內治療血栓形成性病癥的應用；Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，第590-600頁，和于1989年7月12日公布的歐洲專利申請第0 323 722號(Valenzuela等)。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了一種纖維蛋白溶解性金屬蛋白酶，該蛋白酶具有SEQ ID NO1中所示的非天然存在的線性排列的氨基酸，在此也稱為“新型作用血栓溶解性劑(novel acting thrombolytic)”(或“NAT”)。也提供了編碼NAT的核酸分子(諸如SEQ ID NO2之一)及其變異體。
“成熟”一詞以其通常含義使用，是指在宿主細胞內進行了原位的酶加工、從前原區(qū)切割下生物活性多肽。
NAT因其具有纖維蛋白溶解活性，用作血凝塊的體內溶解劑，來治療哺乳動物(包括大鼠、豬和人類)的血栓形成。
本發(fā)明所述NAT多肽作為治療劑，提供優(yōu)于天然存在的fibrolase(即在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白溶解性多肽)的優(yōu)勢。已知天然fibrolase含有幾種可變的N-末端QQRFP、EQRFP和ERFP(其中“E”表示環(huán)化谷氨酰胺或焦谷氨酸)。更具體地說，從由QQRFP組成的N-末端開始，所述fibrolase分子經(jīng)過降解，產(chǎn)生分別具有EQRFP和ERFP的N-末端序列的兩個同種型。由酵母產(chǎn)生的重組fibrolase一般產(chǎn)生所有這3種形式的混合物，因而是不均一的。參見Loayza等，Journal ofChromatography，B 662，第227-243頁(1994)。此外，所述環(huán)化谷氨酰胺殘基導致N-末端被封閉，這使得不可能進行測序。
相反，本發(fā)明所述重組NAT提供單一的種類一般僅產(chǎn)生一種N末端。其結果是，終產(chǎn)物與重組fibrolase相比更均一，這在醫(yī)學應用是計劃的最終用途時是很有益的。
附圖簡述


圖1以線性方式顯示NAT的完整氨基酸序列(SEQ ID NO3)，所述氨基酸序列由前原區(qū)(下劃線)和成熟多肽(無下劃線)組成，在前原區(qū)中包括“信號”肽。
發(fā)明詳述NAT可通過在合適的宿主細胞中重組表達SEQ ID NO4的核酸分子而產(chǎn)生，該核酸分子編碼NAT的完整氨基酸序列(SEQ ID NO3)，包括來自核苷酸1-783的前原區(qū)和來自核苷酸784-1386的成熟多肽。在表達后，所述前原區(qū)在宿主細胞中被酶加工切掉，產(chǎn)生成熟活性多肽(SEQ ID NO1)。
NAT最好是由重組酵母產(chǎn)生，其原因在后面將會更詳細地解釋。
如此產(chǎn)生的成熟多肽(SEQ ID NO1)可能有或沒有氨基末端甲硫氨酸，這取決于其制備方式。一般來說，當所述多肽是由非分泌型細菌(如大腸桿菌)菌株作為宿主重組產(chǎn)生時，就會有一個氨基末端甲硫氨酸殘基。
除了SEQ ID NO2的核酸分子外，編碼相同多肽的其簡并序列也可采用。本發(fā)明也包含可以在所述成熟多肽編碼區(qū)5’或3’部分側翼編碼額外氨基酸殘基的核酸分子，所述額外氨基酸殘基諸如編碼取代天然前/原區(qū)(即在天然存在的fibrolase上所發(fā)現(xiàn)的)的替代前/原區(qū)的序列(即負責通過細胞膜分泌所述多肽的序列)。所述額外序列也可以是非編碼序列，包括轉錄或翻譯的調節(jié)序列，例如啟動子的，這取決于宿主細胞。
采用眾所周知的重組DNA技術，可以制備NAT，所述重組DNA技術在以下文獻中有描述Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1989)和/或Ausubel等，編輯，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishers Inc.and Wiley and Sons，New York(1994)?？色@得編碼所述多肽或其截短形式的DNA分子，例如，通過篩選基因組文庫或cDNA文庫，或通過PCR擴增，來獲得編碼fibrolase的核酸分子，然后，用絲氨酸的密碼子取代編碼N-末端氨基酸殘基QQR的密碼子。另一方面，可通過用專業(yè)人士所熟知的方法化學合成，來制備編碼NAT的DNA分子，所述方法例如為Engels等，Angew.Chem.Intl.Ed.，第28卷，第716-734頁(1989)所述的方法。通常，所述DNA的長度會有幾百個核苷酸。超過約一百個核苷酸的核酸可采用這些相同的技術，作為幾個片段合成，再將所述片段連接起來，形成一個所需長度的核苷酸序列。
將所述DNA分子插入到合適的表達載體上，在合適的宿主細胞內表達。選擇在所用的特定宿主細胞中具有功能的載體(即該載體與所述宿主細胞機制是相容的，使得可以發(fā)生所述DNA的表達)。所述多肽可以在原核、酵母、昆蟲(桿狀病毒系統(tǒng))或真核宿主細胞中表達，其中優(yōu)選酵母，其原因將在后面更詳細地解釋。
用于在任何宿主細胞中表達NAT的載體，也可含有一個5’側翼序列(也稱為“啟動子”)和有效連接于待表達DNA上的其他表達調節(jié)元件、以及一個增強子、一個復制起點元件、一個轉錄終點元件、一個包含一個供體和受體剪接位點的完整的內含子序列、一個信號肽序列、一個核糖體結合位點元件、一個聚腺苷酸化序列、一個用于插入編碼NAT的核酸序列的多接頭區(qū)和一個選擇性標記元件。這些元件中的每種在下面還要討論的。
可任選的是，所述載體還包含一個“標記”序列，例如，位于所述多肽編碼序列的5’或3’端、編碼多聚組氨酸(如六聚組氨酸(hexaHis))或其他小的免疫原性序列(例如c-myc或血凝素表位，其抗體包括單克隆抗體已有市售)的寡核苷酸序列。這種標記將和NAT一起表達，可以用作從宿主細胞中純化該多肽的一種親和標記?？扇芜x的是，該標記在其后可以采用不同方法，例如用選擇性肽酶，從純化的多肽中除去。
所述5’側翼序列可以是天然的5’側翼序列，或可以是同源的(即來源于與宿主細胞相同的物種和/或株系)、異源的(即來源于與宿主細胞不同的物種或株系)、雜種的(即來自不止一個來源的5’側翼序列的組合)、或合成的。該5’側翼序列的來源可以是任何單細胞原核生物或真核生物、任何脊椎動物或無脊椎動物、或任何植物，條件是該5’側翼序列在所述宿主細胞中是有功能的，并且可被該宿主細胞的機制所活化。
所述復制起點元件通常是從市場上購來的原核表達載體的一部分，幫助載體在宿主細胞中擴增。在某些情況下，所述載體擴增到一定的拷貝數(shù)，對于NAT的最佳表達是很重要的。如果所選用的載體不含復制起點，則可以按照已知的序列化學合成復制起點，然后將其連接到該載體上。
所述轉錄終點元件通常位于所述多肽編碼序列的3’端，其作用是終止mRNA的轉錄。通常，在原核細胞中的轉錄終止元件是一個富含G-C的片段，接著是一個多聚T序列。雖然該元件容易從文庫中克隆得到，或者甚至作為載體的一部分從市場上購買到，但它也可以用已知的核酸合成方法容易地合成。
選擇性標記基因元件編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長的宿主細胞存活和生長所必需的蛋白質。通常，選擇性標記基因編碼的蛋白質(a)使宿主細胞對抗生素或其他毒素具有抗性，所述抗生素或毒素例如對于原核宿主細胞為氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素，對于酵母宿主細胞為zeocin，對于哺乳動物宿主細胞為新霉素；(b)對該細胞的營養(yǎng)缺陷互補；或(c)提供復合培養(yǎng)基不能提供的關鍵營養(yǎng)物質。用于原核表達的優(yōu)選選擇性標記是卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。
所述核糖體結合元件通常叫做Shine-Dalgarno序列(對于原核生物而言)或Kozak序列(對于真核生物而言)，對mRNA的翻譯起始是必需的。該元件通常位于啟動子的3’端和待合成多肽編碼序列的5’端。Shine-Dalgarno序列是各不相同的，但通常是多聚嘌呤(即A-G含量高)。許多Shine-Dalgarno序列已被鑒別，每種序列均可采用上面提到的方法容易地合成并用于原核載體中。Kozak序列通常包括緊接在起始密碼子之前和之后的序列。優(yōu)選的Kozak序列是與在AUG起始密碼子高效翻譯起始有關的序列。
在希望NAT多肽從宿主細胞內分泌出來的情況下，可采用一個信號序列，來指導該多肽從合成所述多肽的宿主細胞中分泌出來。通常，所述信號序列位于核酸序列的編碼區(qū)中，或直接位于編碼區(qū)的5’端。許多信號序列已被鑒定，可以使用它們中的在所選宿主細胞中有功能的任一種。因此，該信號序列可以與所述多肽是同源的或異源的。此外，該信號序列可以采用上面提到的方法來化學合成。
當所述載體構建好后，將一種核酸插入該載體的合適位點，制備好的載體可插入到合適的宿主細胞中進行擴增和/或多肽表達。
如上所述，宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。該宿主細胞，無論是酵母還是某一其他宿主，當在合適條件下培養(yǎng)時都可以合成NAT，隨后從培養(yǎng)基中收集NAT(如果該宿主細胞將其分泌至培養(yǎng)基中的話)，或直接從生產(chǎn)NAT的宿主細胞中收集(如果它不被分泌)。收集后，可以采用分子篩色譜、親和色譜和類似方法純化NAT多肽。
對宿主細胞的選擇，在很大程度上取決于宿主細胞是否能將NAT“折疊”成它天然的二級和三級結構(例如，二硫橋合適的定向等)，從而使這些細胞制備出生物活性材料。但是，即使在宿主細胞不合成生物活性材料時，也可以在合成后，采用合適的化學條件，例如本領域技術人員已知的合適化學條件，對它進行“折疊”。在以上兩種情況下，根據(jù)獲得生物活性材料的事實，可以推斷出進行了正確折疊。
合適的宿主細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵細胞(CHO)或3T3細胞。合適的哺乳動物宿主細胞的選擇以及轉化、培養(yǎng)、擴增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)、純化的方法，是本領域人員已知的。其它合適的哺乳動物細胞系有猴COS-1和COS-7細胞系和CV-1細胞系。其它示范性哺乳動物宿主細胞包括靈長類細胞系和嚙齒動物細胞系，包括已轉化的細胞系。正常的二倍體細胞、來源于原代組織體外培養(yǎng)物的細胞株以及原代外植體也適用。候選細胞可以在選定的基因上是基因型缺陷的，或是包含一個顯性作用選擇基因。其它合適的哺乳動物細胞系包括但不限于HeLa細胞、小鼠L-929細胞、來源于Swiss的3T3細胞系、Balb-c或NIH小鼠、BHK或HaK倉鼠細胞系。
細菌細胞也可用作宿主細胞。例如，大腸桿菌的不同菌株(如，HB101、DH5a、DH10和MC1061)在生物技術領域是為人熟知的宿主細胞。也可采用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、其他芽孢桿菌(Bacillus spp.)、鏈霉菌(Streptomyces spp.)等的不同菌株。此外，本領域技術人員已知的酵母菌的許多菌株，也可作為宿主細胞，用來表達本發(fā)明所述多肽。此外，如有需要，昆蟲細胞也可用作宿主細胞。例如，參見Miller等，Genetic Engineering，第8卷，第277-298頁(1986)。
將所述載體插入(也稱為“轉化”或“轉柒”)到選定的宿主細胞中，可以采用諸如磷酸鈣、電穿孔、微注射、脂質體轉染(lipofection)或DEAE-葡聚糖方法之類的方法來完成。所選方法將部分隨所用宿主細胞類型而變化。這些方法和其他合適方法對技術人員來說是熟知的，例如在Sambrook等的上述文獻中有敘述。
可以用本領域技術人員所熟知的標準培養(yǎng)基，培養(yǎng)含所述載體的宿主細胞。所述培養(yǎng)基通常含有所述細胞生長和存活所必需的全部營養(yǎng)。例如，培養(yǎng)大腸桿菌的合適培養(yǎng)基是Luria肉湯(LB)和/或Terrific肉湯(TB)。培養(yǎng)真核細胞的合適培養(yǎng)基是RPMI 1640、MEM、DMEM，所有這些培養(yǎng)基都可以根據(jù)培養(yǎng)的特定細胞系的需要，補充血清和/或生長因子。用于昆蟲培養(yǎng)物的一種合適培養(yǎng)基是補充有yeastolate、乳清蛋白水解物和/或胎牛血清(如果必要時)的Grace培養(yǎng)基。
通常，將對轉化細胞的選擇性生長有用的一種抗生素或其他化合物作為補充物，添加到培養(yǎng)基中。所采用的化合物由轉化宿主細胞的質粒上所存在的選擇性標記元件決定。例如，當選擇性標記元件是卡那霉素抗性時，加入到培養(yǎng)基中的化合物就是卡那霉素。
在宿主細胞產(chǎn)生的NAT的量，可以用本領域所知的標準方法來估計。此類方法包括但不限于蛋白質印跡分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、高效液相色譜分離、免疫沉淀和/或活性分析，諸如DNA結合凝膠阻滯分析(DNA binding gel shift assays)。
如果NAT是從非革蘭氏陰性細菌的宿主細胞中分泌的，那么其大部分都會存在于細胞培養(yǎng)基中。如果NAT是革蘭氏陰性菌分泌的，則NAT將在一定程度上存在于細胞周質中。如果NAT是非分泌型的，則將存在于細胞質中。
對胞內NAT來說，通常先要對所述宿主細胞進行機械破碎。對位于細胞周質的NAT，可用機械破碎或滲透壓處理，使細胞周質的內容物釋放到緩沖液中。然后，從該溶液中分離NAT多肽。再用各種技術，從溶液中進行純化。如果合成NAT，使得在羧基末端或氨基末端帶有一個標記(諸如六聚組氨酸，或其他小肽)，那么使溶液通過其中親和柱基質對所述標記或直接對所述多肽具有高度親和力(即單克隆抗體)的親和柱，可能基本上以一步法純化NAT。例如，多聚組氨酸以高度親和性和特異性與鎳結合，因此可用鎳親和柱(諸如Qiagen鎳柱)來進行純化(參見例如Ausubel等，編輯，Current Protocols in MolecularBiology，同上)。
另一方面，當所述多肽沒有標記并且沒有抗體可用時，可采用其它已知的純化方法。該類方法包括但不限于離子交換色譜、分子篩色譜、反向色譜、高效液相色譜、非變性凝膠電泳結合凝膠洗脫和制備性等電聚焦(“Isoprime”設備/技術，Hoefer Scientific)。在某些情況下，可以結合兩種或更多種這些技術以達到提高純度。
尤其優(yōu)選采用酵母細胞生產(chǎn)NAT，最優(yōu)選稱為畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))的酵母屬，因為比起例如細菌細胞(如大腸桿菌)來說，畢赤酵母重折疊的效率更高。用于所述酵母菌株的合適的重組表達方法在美國專利第4,855,231(Stroman等)、4,812,405(Lair等)、4,818,700(Cregg等)、4,885,242(Cregg)和4,837,148號(Cregg)中有描述，所述專利的說明書通過引用結合到本文中。
值得注意的是，畢赤酵母屬細胞也可用于表達fibrolase，其表達效果與從編碼該金屬蛋白酶的DNA分子表達的效果相近，這樣一種方法構成了本發(fā)明的另一方面。fibrolase是已知的金屬蛋白酶，在科學文獻及專利文獻中已有描述，參見以上引用的Randolph等，和歐洲專利申請第0323722號。通常，待表達的fibrolase是具有SEQ ID NO5的fibrolase，它由SEQ ID NO6的cDNA分子(或編碼同樣氨基酸序列的變異體)編碼。在這種系統(tǒng)中表達fibrolase，一般涉及SEQ ID NO7的DNA分子，該DNA分子除了編碼“成熟”多肽(核苷酸784-1392)外，還編碼“前原”序列(核苷酸1-783)，。
其中所述多肽連接到聚合物或其他分子上、形成衍生物以修飾其特性的NAT的化學修飾形式，也包含在本發(fā)明的范圍中。采用一定方法，將一個或多個其它化學部分連接到所述多肽部分上將NAT衍生化，尤其對于人類治療目的可能是有利的。這樣的化學部分可以從不同的水溶性聚合物中選取。該聚合物應為水溶性的，這樣使得與之相連的所述NAT多肽在水性環(huán)境里(如在生理環(huán)境里)是可混溶的。水溶性聚合物可從以下組成的一組聚合物中選取例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)、聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來酐共聚物、聚氨基酸(或者是均聚物，或者是隨機或非隨機共聚物(進一步參見下面關于融合分子的描述))、和葡聚糖或聚(乙烯吡咯烷酮)聚丙二醇、丙二醇均0聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚苯乙烯馬來酸酯和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛因其在水中的穩(wěn)定性，而在生產(chǎn)中有優(yōu)勢。
所述聚合物可以具有任何分子量，可以是分支或不分支的。對聚乙二醇而言，優(yōu)選的分子量是在約2千道爾頓(kDa)和約100kDa之間(“約”一詞指在聚乙二醇的制備中，有些分子量比聲稱的分子量要大，有的則要小)，便于處理和生產(chǎn)。其他大小也可采用，這取決于所需的治療模式(例如，所需的持續(xù)釋放的持續(xù)時間、對生物活性的影響(如果有的話)、操作的容易性、免疫原性的有無和大小以及聚乙二醇對治療蛋白的其他已知的影響)。
如此連接的聚合物分子的數(shù)目可以不同，本領域專業(yè)人士能夠確定其對功能的影響?？梢杂孟嗤虿煌幕瘜W部分(如聚合物，諸如不同重量的聚乙二醇)，進行一衍生化、或可以提供二衍生化、三衍生化、四衍生化或某些組合衍生化。聚合物分子與NAT多肽分子的比例也是各不相同的，它們在反應混合物中的濃度也是不同的。一般來說，最佳比例(就反應效率而論，在反應中沒有過量的未反應的多肽和聚合物)將由諸如所需衍生程度(一、二、三、四衍生化等)、所選聚合物的分子量、聚合物是否是分支結構和反應條件等的因素來決定。
將所述化學部分連接在NAT上，應考慮其對所述多肽的功能和抗原性結構域的影響。對本領域技術人員來說，有大量的連接方法可選用。例如，參見EP 0 401 384(將聚乙二醇偶聯(lián)到G-CSF上)和Malik等，Experimental Hematology，第20卷，第1028-1035頁(1992)(報道了用tresyl chloride對GM-CSF進行聚乙二醇(PEG)化)。作為說明，聚乙二醇可以通過反應基(諸如，游離氨基或羧基)與氨基酸殘基共價結合。反應基是那些可與活化的聚乙二醇分子(或其他化學部團)結合的基團。具有一個游離氨基的氨基酸殘基，可以包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基。具有一個游離羧基的氨基酸包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基也可用作連接所述聚乙二醇分子(或其他化學部分)的反應基。為了生產(chǎn)的目的，最好是連在氨基上，諸如在N-末端或在賴氨酸基團上。如果需要受體結合，則應避免連接那些對受體結合重要的殘基。
可能特別需要N末端化學修飾的衍生物。以聚乙二醇為例，可以根據(jù)各種各樣的聚乙二醇分子(根據(jù)分子量、分支等)、聚乙二醇與多肽分子在反應混合物的比例、待進行的聚乙二醇化的反應類型、以及獲取所選N-末端聚乙二醇化NAT的方法進行選擇。獲得所述N末端聚乙二醇化制備物(即從其他單聚乙二醇化部分中分離所述部分，如果有必要的話)的方法，可以是從全體聚乙二醇化NAT分子中純化N-末端聚乙二醇材料。選擇性N末端化學修飾可以通過還原烷基化來完成，該方法利用了不同類型伯氨基(賴氨酸與N末端)的差別反應性。參見1996年4月25日公布的PCT申請WO 96/11953。在合適反應條件下，完成用含聚合物的羧基在N末端對NAT基本上選擇性地衍生化。例如，通過在允許人們利用賴氨酸的ε氨基和所述多肽N末端殘基的α氨基之間的pKa差異的pH下進行反應，可以對NAT進行選擇性的N末端PEG化。通過這樣的選擇性衍生，控制聚合物與所述多肽的連接聚合物的結合主要發(fā)生在所述多肽的N末端，而沒有其他反應基如賴氨酸的側鏈氨基的顯著修飾。用還原烷基化，聚合物可以是如上所述的類型，而且應有單個反應性的醛，用于與所述多肽偶聯(lián)?？梢圆捎煤粋€反應性醛基的聚乙二醇丙醛。
按照本發(fā)明的NAT或化學修飾衍生物，可以配制用于體內給藥，最優(yōu)選通過血栓內給藥(即通過直接局部傳遞至血管中的血凝塊處，例如通過導管)。系統(tǒng)傳遞通常不是優(yōu)選的方法，因為全身循環(huán)中先天的α2巨球蛋白可能與NAT復合，阻止其與纖維蛋白或纖維蛋白原相互作用，從而消弱血凝塊的溶解。然而，可能有這樣的情況可以采用大量的NAT，超過α2巨球蛋白的循環(huán)水平，從而使得能夠系統(tǒng)給藥和傳遞。一般來說，本發(fā)明包括藥用組合物，所述藥用組合物包含有效量的NAT以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑和/或載體。“有效量”是指足以產(chǎn)生可測量生物學效應的量(即實現(xiàn)溶解所治療的一個或多個血凝塊的血栓溶解有效量)。
通常，NAT將是高度純化的形式，而且，用作傳遞溶媒的任何藥用組合物通常都將預先滅菌待用，如通過無菌濾膜過濾。
本領域技術人員將能夠通過給藥和觀察所需的治療效果，確定有效劑量。在此范圍內的具體有效劑量，將取決于所治療的具體疾病或病癥，以及接受者的年齡和一般健康狀況，并且可以用標準臨床程序來決定。如可能的話，最好是先在生物測定系統(tǒng)中體外測定該藥用組合物的劑量-反應曲線，然后在有用的動物模型系統(tǒng)體內測定該藥用組合物的劑量-反應曲線，繼而在人體中進行試驗。有經(jīng)驗的醫(yī)師考慮到治療背景、治療中的疾病類型和其他合適的因素，無需過多的努力，就能夠確定合適的劑量。通常，醫(yī)師將給予所述NAT組合物，直到達到獲得預期效果(即血凝塊溶解)的劑量。所述組合物可以作為一劑給予，或在規(guī)定時間內作為兩劑或更多劑(它們可以含有等量或不等量的多肽)給予，或在連續(xù)的基礎上給予。
也可按標準方法用NAT來產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和/或雙特異性抗體等等。為了提高產(chǎn)生免疫應答的可能性，可以分析NAT的氨基酸序列，以鑒定可能與免疫原性增加有關的分子部分。例如，可以對所述氨基酸序列進行計算機分析，以鑒定表面表位，諸如按照Hope和Woods，Proceedings of the National Academy of Science USA，第78卷，第3824-3828頁(1981)所述方法來進行。
可以采用本領域已知的各種程序，產(chǎn)生識別NAT表位的多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，可通過注射所述多肽，免疫各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等?？梢杂酶鞣N佐劑增強免疫應答，這取決于宿主種類，所述佐劑包括但不限于弗氏佐劑、礦物凝膠例如氫氧化鋁(明礬)、表面活性物質如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚、和潛在有用的人用佐劑，如卡介苗和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
關于針對NAT的單克隆抗體的制備，任何利用連續(xù)細胞系培養(yǎng)來生產(chǎn)抗原分子的技術均可采用。例如，最初由Kohler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術(其描述見Nature，第256卷，第495-497頁(1975))以及人類B細胞雜交瘤技術-trioma技術(描述見Kozbor等，ImmunologyToday，第4卷，第72頁(1983))和用來生產(chǎn)單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(描述見Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁(1985))，均可用于按照本發(fā)明制備單克隆抗體。
可以在治療上應用本發(fā)明的抗體，諸如以便在給藥后在體內與NAT結合，并因此中和或抑制過量的NAT。所述抗體還可用于診斷目的，諸如按已知的診斷方法，以標記的形式用來檢測體液、組織樣品或其他提取物中NAT的存在。
具體實施方案的描述本發(fā)明在以下實施例中進行進一步說明。
實施例1NAT序列的來源產(chǎn)生fibrolase的一個有效方法是，一開始將其作為preprofibrolase表達，在前fibrolase中蛋白酶kex-2在“前原”區(qū)和“成熟”區(qū)之間的接點進行切割，產(chǎn)生生物活性材料(“成熟”fibrolase)。按此設計，preprofibrolase的合成和加工導致成熟fibrolase分泌到培養(yǎng)基中。在所述切割接點的實際序列是(…TKR↓QQRF…)kex-2是一種內切蛋白酶，它在相鄰的兩個堿性氨基酸的后面進行切割，在本例中是賴氨酸(K)-精氨酸(R)。從具有上述序列的DNA序列表達的成熟fibrolase表明，所預期的N末端谷氨酰胺(Q)事實上經(jīng)歷了脫酰胺和環(huán)化，產(chǎn)生焦谷氨酸(E)。這種化學修飾被認為是不希望有的，因為具有N末端環(huán)化谷氨酰胺(焦谷氨酸)殘基的多肽在用于氨基酸測序的Edman降解程序中不能進行反應。因此，使在成熟fibrolase序列中的N末端的這兩種谷氨酰胺(Q)殘基缺失，產(chǎn)生一個N末端精氨酸(R)殘基。既然kex-2如上所述在兩個相鄰堿性氨基酸之后進行切割，那么可以預料，序列(...KRRF...)存在一個不確定的kex-2切割位點。因此，所述N末端精氨酸(R)殘基(上面的下劃線部分)用一個絲氨酸(S)殘基取代，產(chǎn)生序列(...KRSF...)。之所以選擇絲氨酸，是因為需要引入一個當存在于水解位點的C末端一側時便于kex-2切割的氨基酸。Rholam等，European Journal of Biochemistry，第227卷，第707-714頁(1995)。
因此，采用標準PCR方法，通過在成熟fibrolase的N末端編碼區(qū)進行定點誘變，用一個“S”的密碼子取代“QQR”的密碼子，對preprofibrolase的DNA序列進行修飾，從而產(chǎn)生具有SEQ IN NO3的氨基酸序列的前原NAT。用作PCR反應引物的寡核苷酸列在下面，也顯示了它們與目標序列的同源性。最初，進行兩種PCR反應，采用Oligo 1和4作為一個引物對，而用Oligo 2和3作為另一個引物對，都以親代基因作為模板t。用瓊脂糖凝膠電泳純化這兩種反應的DNA產(chǎn)物(核苷酸長度為601和815)，將其混合作為第二輪PCR的模板，用寡核苷酸1和2作為引物對。這種最終的PCR產(chǎn)物(長度為1372個核苷酸)用限制性核酸內切酶XhoI和NotI切割。用苯酚/氯仿除去消化液的蛋白，沉淀DNA。將一部分回收的DNA連接到質粒pPICZα(Invitrogen，Carlsbad，CA，Catalog No.VI95-20)上，該質粒也已相似地用限制性核酸內切酶XhoI和NotI進行了切割、酶促去磷酸化和苯酚/氯仿去蛋白。所有的后續(xù)步驟都按Invitrogen畢赤酵母表達試劑盒手冊(Invitrogen Corp.，Catalog No.K1710-01)來進行。用電穿孔方法將所述連接反應產(chǎn)物轉化到大腸桿菌中，根據(jù)在含zeocin的固體培養(yǎng)基上的存活進行選擇。分離該質粒，通過DNA測序證實所述profibrolase區(qū)。通過用限制性核酸內切酶PmeI切割使該質粒線性化，再將其轉化到巴斯德畢赤酵母GS115his+中。該GS115菌株正常情況下是his-，所以通過用攜帶野生型his4基因的DNA轉化，恢復了his+基因型?；蛘撸部蓮腎nvitrogen Corp.購買一個his+菌株(X-33細胞系，Catalog No.C180-00)。選擇作為zeocin抗性菌落的整合體。在含甲醇培養(yǎng)基中誘導候選菌落，在4-20％PAGE上用考馬斯染色，來分析肉湯中NAT的產(chǎn)生。
用于定點PCR誘變的寡核苷酸如下Oligo 15′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′ (SEQ ID NO8)Oligo 25′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ (SEQ ID NO9)Oligo 3(SEQ ID NO10)5′-TCCAATTAAACTTGACTAAGAGATCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3′Oligo 4(SEQ ID NO11)5′-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3′
下面顯示了這些寡核苷酸相對于待修飾以產(chǎn)生NAT的fibrolase(包括前原區(qū))的雙鏈DNA序列(SEQ IN NO12編碼鏈或有義鏈，SEQIN NO13互補鏈或反義鏈)和相應氨基酸序列(SEQ ID NO14)的位置。成熟fibrolase的N-末端和C-末端區(qū)域通過用下劃線標注末端氨基酸序列(QQRF和LNKP)來指示。N末端區(qū)域(QQRF)是一個待修飾的區(qū)域(用S取代QQR)。對于Oligo 3和4，在下面，插入短橫線來表明所省略的編碼fibrolase N末端區(qū)中殘基QQ的密碼子的位置。ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+TACTCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGACAAAATAAGCGTCGTAGGAGGCGTAATCGACGAM R F P S I F T A V L F A A S S A L A ACCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAACGGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT---------+---------+---------+---------+---------+---------+GGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCAP V N T T T E D E T A Q I P A E A V I GTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ATGAGTCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGTCGTGTTTAY S D L E G D F D V A V L P F S N S T NOligo 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-實施例2在巴斯德畢赤酵母中表達NAT當嘗試在大腸桿菌中表達NAT的DNA時，非常差的重折疊和對稀釋條件的要求，降低了純化效率。這些考慮和其他的考慮，導致使用巴斯德畢赤酵母(一種酵母菌)作為宿主菌。將已經(jīng)用前原NAT的cDNA(SEQ ID NO4)轉染的經(jīng)選擇的巴斯德畢赤酵母克隆，接種入500ml的下列接種生長培養(yǎng)基中每升分批培養(yǎng)基酵母浸出物30.0g磷酸二氫鉀17.2g葡萄糖20.0g生物素0.004g水至1L磷酸，85％調節(jié)pH到6.00將轉染后的巴斯德畢赤酵母細胞接種，于30℃搖床培養(yǎng)約30-32小時。用約1％(w/v)的所得培養(yǎng)物接種10L發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐含已滅菌的基礎鹽和葡萄糖(如下)。發(fā)酵罐滅菌后，在每升分批培養(yǎng)基中加入12ml/L的PTM4鹽(PTM4是一種微量金屬溶液，包含五水硫酸銅、碘化鈉、一水硫酸錳、二水鉬酸鈉、硼酸、六水氯化鈷、氯化鋅、七水硫酸亞鐵、d-生物素、硫酸和純水)。發(fā)酵生長溫度為30℃。該發(fā)酵罐的pH用氫氧化銨和磷酸控制在pH6.00。得自添加到該培養(yǎng)基中的鋅鹽的鋅，摻入到NAT中作為該金屬蛋白酶結構的一部分。每升分批培養(yǎng)基中的基礎鹽磷酸，85％26.7ml硫酸鈣0.93g硫酸鉀18.2g7水硫酸錳 14.9g氫氧化鉀 4.13g葡萄糖30.0g水到1L讓分批培養(yǎng)物生長到葡萄糖完全耗盡(17到20小時)，然后開始補料分批培養(yǎng)階段。補料分批培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基含葡萄糖和12ml PTM4鹽/升。誘導補料含葡萄糖、25％甲醇和12ml PTM4鹽/升。在誘導時，該反應器溫度改到20℃。該誘導階段持續(xù)60-75小時。收獲所述條件培養(yǎng)基，去掉細胞碎片。
實施例3從巴斯德畢赤酵母純化NAT將得自實施例2的酵母肉湯(細胞碎片較少的條件培養(yǎng)基)澄清，將其pH和電導率分別調到6.5和10-20mS/cm。將該肉湯上樣到固定化金屬親和樹脂上，該樹脂已加有銅(Cu)，并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)平衡。用PBS洗該樹脂，用PBS中的咪唑梯度(0-100Mm)洗脫。合并含“成熟”NAT(SEQ IN NO1)的流分，稀釋至電導率小于1.5mS/cm，pH6.4。將所述稀釋合并液上樣到已經(jīng)用10mM的2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)平衡的SP葡聚糖樹脂(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)上。用MES清洗柱子，用MES中的NaCl梯度(0-500mM)洗脫。收集并貯存含NAT的流分。
實施例4大鼠頸動脈急性血栓形成的血栓溶解NAT和尿激酶的比較為了證明“成熟”NAT(SEQ ID NO1)具有生物活性，并有獨特功能，用通過施加陽極電流對一條頸動脈產(chǎn)生病灶性損傷的大鼠，進行了急性藥理學研究。這一損傷一般會在15分鐘內產(chǎn)生一個閉塞性血栓。一旦血栓形成，則觀察所述動脈30分鐘，以確保所述頸動脈閉塞是穩(wěn)定的。然后靜脈給予肝素和阿司匹林，以防血栓進一步形成。所述動物經(jīng)動脈內灌注受試材料進行處理。在受試材料的傳遞過程中，監(jiān)測該頸動脈的血流量，以便可以檢測到成功的血塊溶解，并記錄血塊溶解發(fā)生的時間。記錄發(fā)生溶解的實驗的百分率，并僅對于血塊溶解成功的實驗計算組的平均值。作為受試材料出血潛力的度量手段，用紗布拭子收集從手術部位流出的血。將拭子放在去垢劑溶液中，以溶解紅細胞，釋放血紅素，再用分光光度計定量測定血紅素。流出的血紅素用于計算出血量。實驗數(shù)據(jù)見下表。
表1血塊溶解的發(fā)生率、血塊溶解時間、手術出血量(平均值±標準差)
這些研究確定了，NAT在體內血塊溶解動物模型中具有生物活性。而且，與尿激酶相比，其血塊溶解時間明顯減少、手術部位出血更少。因此，NAT的活性分布型可以區(qū)別于纖維蛋白溶酶原激活劑類的血栓溶解劑(以尿激酶為代表)，因為NAT對血塊溶解更快并且出血性并發(fā)癥減少。
NAT的纖維蛋白溶解活性和fibrolase的是類似的。此外，如上所述，NAT的N末端的穩(wěn)定性，導致重組表達時終產(chǎn)物更為均一，這是明顯的優(yōu)點(即所述N末端在一定時間內將不會改變而產(chǎn)生不同形式的混合物，因而使得所述多肽更加穩(wěn)定)。
序列表<110>Boone.Thomas C.
Li，HuiminMann，Mi chael B.<120>纖維蛋白溶解活性多肽<130>A-596<140>09/411,329<141>1999-10-01<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>201<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述NAT(Agkistrodon Contourtrix的fibrolase的類似物)<400>1Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg1 5 10 15Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val20 25 30His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile35 40 45Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile50 55 60Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp65 70 75 80Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu85 90 95Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val100 105 110Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His115 120 125Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly130 135 140His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala145 150 155 160Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu165 170 175Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn180 185 190Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>2<211>603<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼NAT(fibrolase的類似物)<400>2tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600ccg 603<210>3<211>462<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述天然pro-NAT(fibrolase的類似物)<400>3Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser85 90 95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro100 105 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr115 120 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn130 135 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145 150 155 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr165 170 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala180 185 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu195 200 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys210 215 220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225 230 235 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu245 250 255Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile260 265 270Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys275 280 285Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr290 295 300Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser305 310 315 320Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala325 330 335Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His340 345 350Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val355 360 365Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly370 375 380Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met385 390 395 400Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln405 410 415Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp420 425 430Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr435 440 445Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro450 455 460<210>4<211>1386<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼pro-NAT(fibrolase的類似物)<400>4atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380aaaccg1386<210>5<211>203<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<400>5Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1 5 10 15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln20 25 30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu35 40 45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp50 55 60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65 70 75 80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala85 90 95Gln Leu Leu Thr Ala lle Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala100 105 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln115 120 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu130 135 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145 150 155 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser165 170 175Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr180 185 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>6<211>609<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>編碼Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<400>6caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600aacaaaccg 609<210>7<211>1392<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的編碼序列<400>7atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380ctgaacaaac cg 1392<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>8tactattgcc agcattgctg c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>9cctacagtct tacggtaaac g 21<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>10tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac 45<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>11ggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg44<210>12<211>1620<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><221>misc feature<222>互補((1)..(1620))<223>反義鏈(參見SEQ ID NO13)的互補(有義)鏈<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的編碼序列<400>12atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380ctgaacaaac cgtaagcggc cgccagcttt ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat 1440ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac 1500tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 1560aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt 1620<210>13<211>1620<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><221>misc feature<222>互補((1)..(1620))<223>有義鏈(參見SEQ ID NO12)的互補(反義)鏈<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的反義編碼序列<400>13aataaaaaag tatcaaaaat gaagcctgca tctctcaggc aaatggcatt ctgacatcct 60cttgattaga atctagcaag accggtcttc tcgtaagtgc ccaacttgaa ctgaggaaca 120gtcatgtcta aggctacaaa ctcaatgatg atgatgatga tggtcgacgg cgctattcag 180atcctcttct gagatgagtt tttgttctag aaagctggcg gccgcttacg gtttgttcag 240gatacactgc gggttgttaa cggtcaggaa ggtctggtag tctttcttag agcagtcgga 300gaacagtttg gatggttgat cggacagcat agcagccata acacaggagt ttgcaccgca 360gtgacactgg ttgccatcgt ggttcatacc caggttatga cccagttcgt gtgccatggt 420cagagcaacc agcaggttaa tagcggagtg gtcctggata acaccagtag aatgtttcag 480ttgacacatg ccaccaacgt aagccagacc aacagtatca ccgtcgaagt cgatagcggt 540cagcagttga gcgttatcat gacgttggcg acgcagcagg tcggtttcac gccagttacc 600gaaggatgcc agagtgtcgt gggatacaga agtaacggtg atcaaatctt ggttggacca 660gatttccaaa ccaaccaaag tgaattggat gttcagtggt ctgtagattt cgttaatggt 720gttgacgatt tggtgcaccc attgacggat tttgtcagag tcaccgttgt atttagtgtt 780catacggtgg tcagcaacga taaccagctg tacgtatctt tgtgggaatc tttgttgtct 840cttagtcaag tttaattgga aggccttctt gattggttca tatgattccc agttttgggt 900aacaccacac atctttgggg cttcatcttc cttttcgacg ttttcgtact tgtagacagc 960atgggcttca gagtcggaca attccaatgg ttcaatcaag tacatttcac cttgcaactt 1020gaaatgaccc ttcaaaccgt tacaagcaga gatagaagca gtggagtcag catcgttttc 1080gattctacca tggtagtaac agtgatcttc acccaatggg taagtagtaa tttctctacc 1140atctggggag taatgagttt cagagtaatc ttcagagaac aaacctttgt ttttttccaa 1200gtgcaagaca actggttcac tgttaacctt gaattcgtat tgcatggcat cttcgtactt 1260tggttgaaca gcacccctag gaactggagt gacctttctt ggataaacaa cttcgtaatc 1320gttaacgtta ccagattcca agataataga agaagcttca gcctctcttt tctcgagaga 1380taccccttct tctttagcag caatgctggc aatagtagta tttataaaca ataacccgtt 1440atttgtgctg ttggaaaatg gcaaaacagc aacatcgaaa tccccttcta aatctgagta 1500accgatgaca gcttcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgttgtag tgttgactgg 1560agcagctaat gcggaggatg ctgcgaataa aacagcagta aaaattgaag gaaatctcat 1620<210>14<211>540<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>位置465、493、516和536中的Xaa對應于終止密碼子。<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase<400>14Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser85 90 95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro100 105 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr115 120 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn130 135 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145 150 155 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr165 170 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala180 185 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu195 200 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys210 215 220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225 230 235 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu245 250 255Asn Leu Thr Lys Arg Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu260 265 270Val Ile Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser275 280 285Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu290 295 300Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile305 310 315 320Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr325 330 335Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln340 345 350Arg His Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp355 360 365Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser370 375 380Thr Gly Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu385 390 395 400Thr Met Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly405 410 415Asn Gln Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu420 425 430Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr435 440 445Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro450 455 460Xaa Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp465 470 475 480Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser485 490 495Leu Arg His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp500 505 510Arg Ser Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro515 520 525Glu Arg Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile530 535 540<210>15<211>203<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<220><223>位置1中的Xaa代表化合物焦谷氨酸。該化合物在說明書中用字母“E”來指代。<400>15Xaa Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1 5 10 15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln20 25 30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu35 40 45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp50 55 60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65 70 75 80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala85 90 95Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala100 105 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln115 120 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu130 135 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145 150 155 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser165 170 175Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr180 185 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>16<211>202<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<220><223>位置1中的Xaa代表化合物焦谷氨酸。該化合物在說明書中用字母“E”來指代。<400>16Xaa Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His1 5 10 15Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp20 25 30Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn35 40 45Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu50 55 60Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn65 70 75 80Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln85 90 95Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr100 105 110Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp115 120 125His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu
130 135 14061y His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly145 150 155 160Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys165 170 175Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val180 185 190Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>17<211>538<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的類似物形式<400>17Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Gln Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser85 90 95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro100 105 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr115 120 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn130 135 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145 150 155 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr165 170 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala180 185 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu195 200 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys210 215220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225 230 235 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu245 250 255Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile260 265 270Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys275 280 285Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr290 295 300Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser305 310 315 320Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala325 330 335Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His340 345 350Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val355 360 365Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly370 375 380Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met385 390 395 400Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln405 410 415Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp420 425 430Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr435 440 445Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro Xaa Ala450 455 460Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn465 470 475 480Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser Leu Arg485 490 495His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp Arg Ser500 505 510Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro Glu Arg515 520 525Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile530 535<210>18<211>602<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix fibrolase的片段<400>18tactattgcc agcattgctg 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1.一種纖維蛋白溶解活性多肽，所述多肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
2.權利要求1的多肽，所述多肽是通過在酵母中重組表達而制備的。
3.一種核酸分子，所述核酸分子編碼SEQ ID NO1的多肽。
4.權利要求3的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO4的序列。
5.一種表達載體，所述表達載體包含與權利要求3的核酸分子有效連接的表達調節(jié)元件。
6.一種權利要求5的表達載體，其中所述核酸分子具有SEQ IDNO4的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，所述宿主細胞已用權利要求3的核酸分子轉化或轉染。
8.一種權利要求7的轉化或轉染宿主細胞，所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
9.一種權利要求8的轉化或轉染原核細胞，所述細胞是一種酵母細胞
10.一種權利要求9的轉化或轉染酵母細胞，所述酵母細胞是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
11.一種生產(chǎn)NAT的方法，所述方法包括將含編碼所述金屬蛋白酶的DNA分子的宿主細胞在使得所述DNA分子表達的條件下培養(yǎng)，其中所述DNA分子與用于刺激所述DNA表達的調節(jié)元件有效連接；并且從所述宿主細胞培養(yǎng)物中分離所表達的金屬蛋白酶。
12.權利要求11的方法，其中所述DNA分子是SEQ ID NO4的DNA分子。
13.權利要求11的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述酵母細胞是巴斯德畢赤酵母細胞。
15.一種生產(chǎn)金屬蛋白酶纖維蛋白溶解劑的方法，所述纖維蛋白溶解劑選自fibrolase和NAT；所述方法包括將含編碼所述金屬蛋白酶的DNA分子的畢赤酵母屬宿主細胞在使得所述DNA分子表達的條件下培養(yǎng)，其中所述DNA分子與用于刺激所述DNA分子表達的調節(jié)元件有效連接；并且從所述宿主細胞培養(yǎng)物中分離所表達的金屬蛋白酶。
16.權利要求15的方法，其中所述畢赤酵母屬宿主細胞是巴斯德畢赤酵母。
17.一種用于治療哺乳動物血栓形成的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物血栓溶解有效量的NAT。
18.一種抗體，所述抗體是針對權利要求1的多肽的抗體。
19.權利要求17的抗體，所述抗體是一種單克隆抗體。
全文摘要
描述了一種可用于體內血凝塊溶解的纖維蛋白溶解活性金屬蛋白酶多肽(稱為“新型作用血栓溶解性劑”)，及通過重組表達生產(chǎn)所述多肽的方法和材料。
文檔編號C12N9/64GK1402788SQ00816321
公開日2003年3月12日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權日1999年10月1日
發(fā)明者T·C·波尼, 黎慧民, M·B·曼 申請人:安姆根有限公司