專利名稱：確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種確定底層發(fā)酵酵母(窖藏啤酒酵母)存在絮凝特性或檢測(cè)非絮凝的遺傳學(xué)改變的方法。
背景技術(shù)：
窖藏啤酒在日本、德國(guó)和其它國(guó)家生產(chǎn)。用于該類型啤酒釀造的大多數(shù)酵母在釀造后期具有絮凝特性，在罐底具有沉淀特性，因此被稱為底層發(fā)酵酵母。在啤酒釀造中，該酵母的沉淀特性對(duì)于酵母的回收及隨后的過(guò)濾，以及啤酒的味道和質(zhì)量等的影響都是重要的。此外，當(dāng)?shù)讓影l(fā)酵酵母的性質(zhì)穩(wěn)定時(shí)，該酵母具有在啤酒生產(chǎn)步驟中能反復(fù)作為回收酵母的優(yōu)點(diǎn)。在這種情況中，確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性在新酵母的篩選和選擇中是重要的。
作為確定酵母絮凝特性的常用方法，有許多方法，如Burns法(J.Inst.Brew.，43，31，1937)、Helm法(Wallerstein LaboratoryCommunications 16，315，1953)等。在這些方法中，在培養(yǎng)和發(fā)酵酵母后，收集的酵母在Ca離子存在下在酵母容易絮凝和沉淀的空氣下人工絮凝。利用這些方法確定絮凝和沉淀特性。
當(dāng)實(shí)際啤酒生產(chǎn)步驟中酵母的絮凝特性降低或消失時(shí)，需要確定收集的酵母是否能被重復(fù)使用。為了確定非絮凝是由于酵母本身的不可逆改變(即由于突變)引起的，還是并非由于酵母而是由于環(huán)境的可逆改變引起的，大約需要兩周的時(shí)間來(lái)獲得結(jié)果，因?yàn)檫@種確定絮凝特性的方法應(yīng)當(dāng)在特定評(píng)價(jià)條件下培養(yǎng)和發(fā)酵酵母后進(jìn)行。
酵母的突變不會(huì)在所有細(xì)胞中同時(shí)引起。分離單菌落、研究絮凝特性并了解突變?nèi)后w是重要的。然而，在確定絮凝特性的方法中，在常規(guī)培養(yǎng)和發(fā)酵后難以一次處理多個(gè)菌株。
最近幾年，搞清了實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))所有染色體中的DNA序列，證實(shí)了參與絮凝特性的幾種基因的存在(Science 274，546(1996)，Nature 387，7(1997))。在這些基因中，對(duì)染色體I上的FLO1基因研究得最多，分離并分析了該基因(日本專利Hyohei-7-509372，Yeast，9，1(1993)，Yeast，10，211(1994))。也報(bào)道了對(duì)FLO5基因的分離和分析，該基因與FLO1基因位于不同的染色體上，具有高度同源的DNA序列(Science，265，2077(1994)，Curr.Genet.，25，196(1994))。也報(bào)道了FLO8基因的分離和分析(Agric.Biol.Chem.，47，2889(1983)，Mol.Gen.Genet.，251，707(1986))。
發(fā)現(xiàn)底層發(fā)酵酵母具有來(lái)自釀酒酵母和貝酵母(Saccharomycesbayanus)兩者的染色體。然而，通過(guò)研究來(lái)自這兩種酵母的基因確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性未獲成功(Yeast，14，923(1998)，System.Appl.Microbiol.待發(fā)表(1999))。
在研究具有絮凝特性的釀酒酵母的FLO1和FLO8基因的一種方法中，確定啤酒酵母的絮凝特性未獲成功。此外，最近發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母的具有絮凝特性的一部分基因。據(jù)報(bào)道，根據(jù)這些基因的一部分DNA序列的存在，能確定啤酒酵母類型的絮凝特性的存在。然而未報(bào)道絮凝特性的降低和消失能根據(jù)酵母的遺傳學(xué)改變確定(日本專利公開(kāi)Hei 8-205900)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于容易地獲得一種方法，根據(jù)極好的可重復(fù)性在短時(shí)間內(nèi)確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的存在。
使用根據(jù)實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)染色體VIII上的絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的引物(Science，265，2077(1994))，進(jìn)行PCR探尋目的片段擴(kuò)增的存在和大小。使用絮凝的底層發(fā)酵酵母的基因組作為模板，用上述引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物作為Southern雜交的探針。通過(guò)這些步驟，發(fā)現(xiàn)能確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的存在，并檢測(cè)非絮凝特性的遺傳學(xué)改變。
也就是，第一個(gè)發(fā)明是利用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)的絮凝基因FLO5的ORF序列，確定底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性的一種方法。
第二個(gè)發(fā)明是利用ORF序列根據(jù)具有最初絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，確定非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法。
第三個(gè)發(fā)明是利用該序列根據(jù)具有最初絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，預(yù)知非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法。
第四個(gè)發(fā)明是確定底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性一種方法，其中使用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
第五個(gè)發(fā)明是根據(jù)底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，確定非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法，其中使用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
第六個(gè)發(fā)明是根據(jù)底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，預(yù)知非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法，其中使用根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)的引物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)比較顯示絮凝特性的酵母菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA大小。
第七個(gè)發(fā)明是根據(jù)底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變確定，非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法，其中從該酵母中分離幾個(gè)單菌落，用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲取酵母中的變體群體。
第八個(gè)發(fā)明是根據(jù)底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，預(yù)知非絮凝特性和絮凝特性降低的一種方法，其中從該酵母中分離幾個(gè)單菌落，用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲取酵母中的變體群體。
第九個(gè)發(fā)明是確定底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性的一種方法，其中具有絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的所有DNA都用作模板，使用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)使用擴(kuò)增產(chǎn)物。
第十個(gè)發(fā)明是根據(jù)底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變，確定非絮凝特性的一種方法，其中具有絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的所有DNA都用作模板，使用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)使用擴(kuò)增產(chǎn)物。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是一張電泳圖，顯示幾種底層發(fā)酵酵母的絮凝特性和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2是一張電泳圖，顯示絮凝株和非絮凝株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，它們來(lái)源于具有絮凝特性的底層發(fā)酵酵母。
圖3是一張電泳圖，顯示來(lái)源于具有絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與絮凝強(qiáng)度之間的關(guān)系。
圖4是一張照片，顯示來(lái)源于具有絮凝特性的底層發(fā)酵酵母的絮凝株和非絮凝株的Southern分析結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案本發(fā)明提供在底層發(fā)酵酵母的幾個(gè)水平上和來(lái)源于絮凝窖藏酵母的變體水平上確定酵母的絮凝特性的一種方法。該方法使用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)染色體VIII上絮凝基因FLO5的ORF區(qū)(3228bp)的DNA序列或互補(bǔ)序列。即，本發(fā)明是一種通過(guò)研究酵母絮凝特性發(fā)展所必需的基因的存在確定絮凝特性的方法。
本發(fā)明在下面詳細(xì)描述。任何已知的方法都能在目的酵母DNA的生產(chǎn)中使用(例如，《酵母遺傳學(xué)方法》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第130頁(yè)(1990))。當(dāng)從多個(gè)樣品中制備DNA時(shí)，顯著發(fā)展的自動(dòng)DNA提取裝置是有效的，操作更容易。
基因的存在能用迄今所知的任何方法證實(shí)。下面描述了主要方法。
①使用含有10bp或更多的連續(xù)堿基的引物對(duì)，用從目的酵母中提取的DNA作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增核酸。為了獲得高度穩(wěn)定的檢測(cè)靈敏度，引物長(zhǎng)度優(yōu)選地約20bp。當(dāng)設(shè)計(jì)組合引物時(shí)，一條引物在C端含有0-約2000bp的DNA分子，或者含有與0-約2000bp的DNA分子互補(bǔ)的DNA序列的DNA分子，而另一條引物在N端含有約2400-3228bp的DNA分子，或者含有與約2400-3228bp的DNA分子互補(bǔ)的DNA序列的DNA分子。表1顯示了引物的例子。當(dāng)選擇C端序列作為有義序列時(shí)，能選擇N端的任何序列作為反義序列。在引物的例子中，即，可以選擇序列c或序列d確定酵母的序列a。為了序列b可以類似地選擇序列c或序列d。序列a對(duì)應(yīng)于1號(hào)序列，序列b對(duì)應(yīng)于2號(hào)序列，序列c對(duì)應(yīng)于3號(hào)序列，序列d對(duì)應(yīng)于4號(hào)序列。上述DNA分子能用周知的方法化學(xué)合成。這種合成可依靠專業(yè)人員。
在PCR反應(yīng)中可以使用任何聚合酶，優(yōu)選地使用具有極佳熱穩(wěn)定性的聚合酶，它們能擴(kuò)增獲得穩(wěn)定的長(zhǎng)鏈。含有除引物對(duì)和待測(cè)基因組外的混合物的試劑盒，如TaKaRa Perfect Shot(Takara Shuzo生產(chǎn))，可有效地用來(lái)容易地獲得穩(wěn)定的結(jié)果。反應(yīng)條件是普通PCR條件，例如，優(yōu)選地，90-95℃的熱變性溫度，40-65℃的退火溫度，70-75℃的延伸溫度，和20次以上的循環(huán)。
產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和其它常用方法分離，并經(jīng)溴化乙錠檢測(cè)。
②使用由具有絮凝特性的酵母制備的DNA作為模板，用上述引物經(jīng)PCR方法擴(kuò)增核酸。產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物用已知方法簡(jiǎn)單純化，用放射性同位素、熒光染料等標(biāo)記。用該產(chǎn)物作為探針，經(jīng)電泳分離待測(cè)酵母基因組，并與印跡于膜上的樣品雜交。根據(jù)適合采用的標(biāo)記方法檢測(cè)雜交條件。
實(shí)施例1底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的確定①酵母DNA的提取底層發(fā)酵酵母30種菌株分別在10ml YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中培養(yǎng)直到穩(wěn)定期，離心收集酵母。用蒸餾水洗滌后，收集酵母。將酵母懸浮于0.2ml的2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM Na2EDTA溶液中。進(jìn)而，向懸液中加入0.2ml酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)和用酸溶液洗滌的0.3g玻璃珠，充分?jǐn)嚢柙摶旌弦?分鐘。在加入0.2ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)后，離心混合液5分鐘。分離水相后，向殘余物中加入1ml 100％乙醇，在-20℃下放置10分鐘或更長(zhǎng)，離心回收沉淀。將得到的沉淀在0.4ml上述TE中溶解，加入3μl10mg/ml RNAse A溶液，在37℃下加溫混合液5分鐘。在加入10μl 4M乙酸銨和1ml 100％乙醇后，將混合液在-20℃下放置10分鐘或更長(zhǎng)，離心回收沉淀。得到的沉淀在50μl蒸餾水中溶解，檢測(cè)一部分溶液。
②使用具有絮凝特性的基因的一部分FLO5序列，通過(guò)PCR方法對(duì)絮凝特性的確定用釀酒酵母染色體VIII上具有絮凝特性的FLO5基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物對(duì)。表1顯示這些引物對(duì)的例子。PCR反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行94℃2分鐘熱起動(dòng)；94℃1分鐘，57.5℃2分鐘，72℃2分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃20分鐘結(jié)束。取出其中一部分進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。另一方面，相同菌株在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在麥芽汁中發(fā)酵，用上述Burns法確定絮凝特性。該方法是，在適于絮凝和沉淀酵母的條件下，在加速絮凝的Ca離子存在下，人工研究酵母的絮凝特性，并確定絮凝和沉淀特性。根據(jù)沉淀量確定絮凝特性。
圖1顯示了使用引物對(duì)a和c經(jīng)PCR方法擴(kuò)增的一部分結(jié)果。這表明，約5000bp擴(kuò)增DNA的存在與用Burns法測(cè)定的結(jié)果相一致。根據(jù)本發(fā)明，確定底層發(fā)酵酵母的絮凝株(Bruchhefe)與非絮凝株(Staubhefe)之間的差異成為可能。根據(jù)本發(fā)明，在短時(shí)間內(nèi)確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性成為可能，并且證實(shí)，這種測(cè)定可能是一種篩選方法。
表1

實(shí)施例2底層發(fā)酵酵母的絮凝變體的評(píng)價(jià)絮凝株和非絮凝株自發(fā)丟失來(lái)源于三種絮凝窖藏酵母的絮凝特性，這些菌株用實(shí)施例1所示的方法培養(yǎng)直到穩(wěn)定期，并提取DNA。類似地，使用以上表1中的引物對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。
圖2顯示了一部分結(jié)果。它證實(shí)，能根據(jù)約5000bp的擴(kuò)增DNA的存在與否確定絮凝細(xì)胞和非絮凝細(xì)胞，并能評(píng)價(jià)絮凝變體。包括FLO5序列兩側(cè)的任何引物對(duì)(引物a和c)都能用來(lái)確定絮凝特性的存在。實(shí)施例3酵母群中變體的群體搜索①單菌落的分離和酵母DNA的提取將啤酒發(fā)酵中具有不同絮凝特性的同一酵母株衍生的三種酵母群分別加到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨、2％葡萄糖，2％瓊脂糖)，在25℃下培養(yǎng)3天以分別分離幾十個(gè)單菌落。使用實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)每個(gè)單菌落直到穩(wěn)定期。收集得到的酵母，洗滌，用自動(dòng)DNA提取裝置(Toyobo Mag-Extractor II)提取酵母DNA。
②利用PCR方法對(duì)絮凝特性的確定利用上述方法，用與表1所示相同的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。
圖3顯示了一部分結(jié)果，即使用引物對(duì)a和c的結(jié)果。約5000bp的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和具有不同條帶大小的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在得到證實(shí)。經(jīng)PCR獲得不同大小擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株用麥芽汁以50ml的小規(guī)模進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，用上述Burns法確定絮凝特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)約5000bp的擴(kuò)增DNA片段的存在與絮凝特性的存在相一致。在具有縮短的擴(kuò)增DNA片段的菌株中證實(shí)有較差的絮凝特性。根據(jù)該方法，不僅能檢測(cè)失去絮凝特性的菌株，而且能檢測(cè)可能減少或失去絮凝特性的菌株，到目前為止這從未報(bào)道過(guò)。
③變體的群體搜索根據(jù)如表2所示的上述結(jié)果，證實(shí)三種酵母群有不同比例的絮凝株。有極好絮凝特性的酵母群顯示高比例的絮凝株，而有較差絮凝特性的酵母群顯示低比例的絮凝株。低比例絮凝株的酵母群在發(fā)酵過(guò)程中在麥芽汁中有許多酵母細(xì)胞，預(yù)計(jì)發(fā)酵后的酵母收集較為困難。利用本方法，可能知道實(shí)際有影響力的絮凝變體的比例。
表2

實(shí)施例4通過(guò)Southern雜交確定底層發(fā)酵酵母絮凝特性的方法在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)源于絮凝酵母的絮凝株和經(jīng)過(guò)自發(fā)突變產(chǎn)生的非絮凝株直到穩(wěn)定期后，用《細(xì)胞生物學(xué)方法》(學(xué)院出版社，第12卷，第39-44頁(yè)，1975)所述的方法提取所有DNA。提取的DNA用限制酶EcoRI或BamHI(Takara Shuzo)消化，用1％瓊脂糖凝膠電泳，在尼龍膜high bond N+(Amasham Pharmacia生產(chǎn))上印跡，進(jìn)行Southern分析。
用絮凝酵母DNA作為模板，使用以上表1的引物對(duì)，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離。在紫外照射下切下約5000bp的片段，用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA。用提取物作為探針，用手冊(cè)所示的ECL檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
使用引物對(duì)a和c經(jīng)PCR獲得的擴(kuò)增片段用作探針。結(jié)果顯示于圖4中。在非絮凝株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在絮凝株中發(fā)現(xiàn)的約9.3kb。因此，利用本發(fā)明確定絮凝特性是可能的。
工作應(yīng)用可能性利用本發(fā)明，能提供一種精確的方法，能不經(jīng)過(guò)底層發(fā)酵酵母發(fā)酵，在短時(shí)間內(nèi)容易、快速地確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的存在，并檢測(cè)非絮凝變體。能一次處理多個(gè)樣品，因此該方法可用于酵母的研究與發(fā)展，以及工業(yè)生產(chǎn)的過(guò)程控制和質(zhì)量控制。
序列表<110>Asahi Breweries Ltd.<120>確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性的方法<130>99T6-24<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>1atgacaattg cacaccactg<210>2<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>2atttcctcctc agtaatttc<210>3<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>3ttaaataatt gccagcaata<210>4<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>4catgagattc gcaggatgtc
權(quán)利要求
1.一種確定底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性的方法，其特征在于使用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)絮凝基因FLO5的ORF序列。
2.一種根據(jù)底層發(fā)酵酵母絮凝特性的遺傳學(xué)改變確定非絮凝特性或較差絮凝特性的存在的方法，其特征在于使用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)絮凝基因FLO5的ORF序列。
3.一種根據(jù)底層發(fā)酵酵母絮凝特性的遺傳學(xué)改變預(yù)知非絮凝特性或較差絮凝特性的遺傳學(xué)改變的方法，其特征在于使用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)絮凝基因FLO5的ORF序列。
4.一種確定權(quán)利要求1的底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性的方法，其特征在于培養(yǎng)樣品酵母株，提取DNA，使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組，用DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2的底層發(fā)酵酵母絮凝特性的遺傳學(xué)改變確定存在非絮凝特性或較差絮凝特性的方法，其特征在于培養(yǎng)樣品酵母株，提取DNA，使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組，用DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求3的底層發(fā)酵酵母絮凝特性的遺傳學(xué)改變預(yù)知存在非絮凝特性或較差絮凝特性的方法，其特征在于培養(yǎng)樣品酵母株，提取DNA，使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組，用DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，比較DNA大小與具有絮凝特性的酵母株的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA大小。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求2的底層發(fā)酵酵母遺傳學(xué)改變確定非絮凝特性和較差絮凝特性的方法，其特征在于從酵母群中分離幾個(gè)單菌落，培養(yǎng)每個(gè)菌落，提取DNA，使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，證實(shí)酵母群中的絮凝變體群體。
8.一種預(yù)知權(quán)利要求3的底層發(fā)酵酵母的非絮凝特性和較差絮凝特性的方法，其特征在于從酵母群中分離幾個(gè)單菌落，培養(yǎng)每個(gè)菌落，提取DNA，使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，證實(shí)酵母群中的絮凝變體群體。
9.一種確定權(quán)利要求1的底層發(fā)酵酵母存在絮凝特性的方法，其特征在于，用絮凝酵母DNA作為模板，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物作為探針，其中PCR反應(yīng)使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組進(jìn)行，然后與從培養(yǎng)的樣品酵母中提取的DNA進(jìn)行雜交。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求2的底層發(fā)酵酵母的遺傳學(xué)改變確定非絮凝特性或較差絮凝特性的方法，其特征在于，用絮凝酵母DNA作為模板，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物作為探針，其中PCR反應(yīng)使用根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組進(jìn)行，與從培養(yǎng)的樣品酵母中提取的DNA進(jìn)行雜交。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一項(xiàng)的一種方法，其中根據(jù)絮凝基因FLO5的ORF序列設(shè)計(jì)的10bp或更多連續(xù)堿基的引物組的DNA序列是1-4號(hào)序列中的任一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的一種方法，其中引物組含有1或2號(hào)序列的第一條引物和3或4號(hào)序列的第二條引物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可重復(fù)的方法，不需發(fā)酵即可在短時(shí)間內(nèi)容易、快速地確定底層發(fā)酵酵母的絮凝特性。其特征在于使用實(shí)驗(yàn)室酵母(釀酒酵母)絮凝基因
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1402795SQ00816455
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者地引真紀(jì)子 申請(qǐng)人:朝日啤酒株式會(huì)社