專利名稱：植物的光周期敏感性基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物的光周期敏感性有關(guān)的基因，以及用這些基因改變植物的光周期敏感性的方法。改變植物的光周期敏感性的方法對植物品種改良十分有用。
背景技術(shù)：
一般情況下，水稻的抽穗(開花)在短晝時提前而長晝時延遲。在已知的栽培品種中，通常是那些來自九州島和日本大陸南部的品種具有較強(qiáng)的光周期敏感性，而來自Tohoku區(qū)或北海道的品種完全喪失了這種敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生長期后有特征性的開花，該植物的抽穗期不隨光周期的改變而變化。水稻植物對栽培地區(qū)和季節(jié)的適應(yīng)性根據(jù)該植物中光周期敏感性的存在而大大不同。因此，改變水稻的光周期敏感性對于水稻品種改良十分重要。
在常規(guī)品種改良項(xiàng)目中，水稻抽穗期通過涉及以下方面的方法來改變(1)通過雜交選擇早熟品種或晚熟品種；和(2)通過放射線和化學(xué)試劑進(jìn)行誘變；等。但是，這類品種改良項(xiàng)目的成功需要較長時間，并存在其它問題，如不能預(yù)計后代中突變的程度或方向。
“光周期敏感性基因”是在水稻遺傳學(xué)領(lǐng)域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名稱。已發(fā)現(xiàn)多個光周期敏感性基因的存在是突變體和栽培品種中是固有的，還提示光周期敏感性基因存在于，例如，Sel基因座(6號染色體；Yokoo和FFujimaki(1971)Japan.J.Breed.2135-39)，E1基因座(7號染色體；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51115-128；Okumoto，Y.et al.(1992)Jpn.J.Breed.42415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3號染色體？；Okumotoet al.Japanese Society of Breeding，91st lecture，Japanese Journal of Breeding47(Suppl.1)31)；和其它類似基因座(Yamagata et al.(1986)In Rice genetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。
分離水稻的光周期敏感性基因使得能通過轉(zhuǎn)化方法將這些基因?qū)肴我馄贩N，從而改變這些品種的光周期敏感性，并最終能調(diào)節(jié)水稻的抽穗期。因此，用這些基因進(jìn)行品種改良是一種相對于傳統(tǒng)方法而言特別有效并且簡單可靠的方法。
但至今未見關(guān)于水稻光周期敏感性基因的分離的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本領(lǐng)域的上述需要導(dǎo)致本發(fā)明，本發(fā)明的目的是提供新的植物光周期敏感性基因，尤其是來自水稻的基因。本發(fā)明另一目的是用這些基因改變植物的光周期敏感性，從而改變植物的花期。本發(fā)明的另一目的是提供評估植物的光周期敏感性的方法。
本發(fā)明人關(guān)注于需要通過簡單方法改變其抽穗期的那些水稻，并進(jìn)行了深入研究以分離與水稻光周期敏感性基因相關(guān)的基因。
從Nipponbare和Kasalath雜交的后代中鑒定出了一種水稻特征性基因座Hd6，它位于3號染色體上。此外，用近似純合系對具有Nipponbare遺傳背景的Hd6區(qū)進(jìn)行了分析(Yamamoto et al.(1996)Abstract for Plant GenomeIV.p124)，揭示Hd6基因座就是光周期敏感性基因的基因座。
本發(fā)明人首先對Hd6基因區(qū)進(jìn)行連鎖分析并與酵母人工染色體(YAC)克隆進(jìn)行對比排列，以便分離出光周期敏感性基因Hd6，這是一種已知基因但從未被分離出過。
具體地，本發(fā)明人對一個大的隔離群(200+980＝1180植物)進(jìn)行了連鎖分析，這種分析是分離Hd6基因所必需的。在該分析中使用CAPS標(biāo)志來提高效力。此外，YAC克隆在Hd6基因候選區(qū)周圍的對比排列圖譜根據(jù)在水稻基因組研究項(xiàng)目(Rice Genome Research Program)中構(gòu)建的YAC克隆的重疊群圖譜來構(gòu)建。Hd6基因區(qū)限定在E11893和Y3626L這兩個標(biāo)志之間，使用YAC克隆的DNA末端片段和每個YAC克隆各自的cDNA克隆作為RFLP標(biāo)志。
然后，本發(fā)明人利用來自人工染色體(PAC)克隆的P1對Hd6基因區(qū)進(jìn)行對比排列。更具體地，使用通過上述分析確定的Hd6基因區(qū)周圍的DNA克隆從Nipponbare基因組文庫中選出7個PAC克隆，據(jù)稱它們包含所述DNA克隆的核苷酸序列。此外，對這些克隆的排列狀態(tài)進(jìn)行研究顯示，PAC克隆P0689D1含有Hd6基因的候選區(qū)(


圖1)。
本發(fā)明人通過分析PAC克隆P0689D1的核苷酸序列，成功地將假定存在Hd6候選基因的區(qū)域定位在一個約26.4kb的位點(diǎn)。針對該候選區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行了基因預(yù)測分析和相似性搜索，以便找到與擬南芥屬(Arabidopsis)CKIIα基因高度相似的區(qū)域(圖2和3)。據(jù)報道，CKIIα基因參與擬南芥中CCA1(晝夜節(jié)律鐘)基因的活化。
Kasalath基因組CKIIα基因的核苷酸序列利用Nipponbare的CKIIα基因的核苷酸序列信息來測定。然后比較這兩個序列。結(jié)果在Nipponbare的CKIIα基因的蛋白編碼區(qū)中鑒定出一個終止密碼子，但在Kasalath的相應(yīng)區(qū)域中沒有(圖4-13)。候選基因CKIIα在Nipponbare(它被認(rèn)為缺乏光周期敏感性基因Hd6)和帶有Kasalath的Hd6基因的近似純合系Nipponbare中的表達(dá)用RT-PCR法進(jìn)行比較，以便揭示Nipponbare中Hd6候選基因CKIIα的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于Hd6近似純合系的(
圖14)。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人得出結(jié)論Kasalath的CKIIα基因是水稻的光周期敏感性基因Hd6。
因此，通過分離能賦予水稻植物以光周期敏感性的Hd6基因，就能利用Hd6基因和其它具有與Hd6基因相同功能的植物基因。這類基因的利用使得能改變水稻的抽穗期，并進(jìn)一步改變廣泛多種植物的花期。此外，這使得能培育出對栽培地區(qū)和季節(jié)的適應(yīng)能力改變了的植物品種。
本發(fā)明人還揭示，由于Nipponbare Hd6基因和Kasalath Hd6基因的ORF之間的核苷酸差異，在Kasalath中產(chǎn)生了一個特異性限制酶HindIII的識別位點(diǎn)。本發(fā)明人提出，可以利用這種核苷酸差異，通過限制酶片段多態(tài)性分析來測定水稻品種中光周期敏感性基因的存在與否。另一方面，據(jù)認(rèn)為光周期敏感性基因E3位于3號染色體上，而且它的位置對應(yīng)于Hd6的位置。相應(yīng)地，本發(fā)明人對那些已通過遺傳分析確定存在或缺乏光周期敏感性基因E3的品種群檢查了這種限制酶片段多態(tài)性分析的有效性(Okumoto et al.(1991)International Rice Research Institute，Rice genetics II pp.778-780)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在被測定缺乏E3的品種中Hd6基因的擴(kuò)增片段不被Hind III消化，而在8個被確定保留了E3的品種中Hd6基因的擴(kuò)增片段可被該酶消化。因此，本發(fā)明人揭示，水稻品種的光周期敏感性可通過鑒定位于Hd6基因中特異性位點(diǎn)的終止密碼子的存在與否的方法來有效確定。
換而言之，本發(fā)明人成功分離出一種與植物的光周期敏感性相關(guān)的基因。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過利用該基因可改變植物的光周期敏感性，和評估植物的光周期敏感性，最終完成本發(fā)明。
更具體地，本發(fā)明提供(1).一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA選自(a)編碼含有SFQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；(c)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
(2).如(1)所述的DNA，其中該DNA來自水稻。
(3).一種DNA，其編碼與(1)或(2)所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA。
(4).一種DNA，其編碼具有特異性消化(1)或(2)所述DNA之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
(5).一種DNA，其編碼能通過在植物細(xì)胞中表達(dá)而利用共抑制效應(yīng)來抑制(1)或(2)所述DNA的表達(dá)的RNA。
(6).如(1)或(2)所述DNA，其中該DNA用于提高植物的光周期敏感性。
(7).如(3)-(5)中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。
(8).一種載體，其含有如(1)-(5)中任一項(xiàng)所述的DNA。
(9).一種植物細(xì)胞，其被如(8)所述的載體轉(zhuǎn)化。
(10).一種植物轉(zhuǎn)化體，其含有如(9)所述的植物細(xì)胞。
(11).如(10)所述的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
(12).一種植物轉(zhuǎn)化體，它是(10)或(11)所述植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
(13).如(10)-(12)中任一項(xiàng)所述的植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
(14).一種產(chǎn)生如(10)或(11)所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，它包括以下步驟(a)將(1)或(2)所述的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，和(b)從該植物細(xì)胞再生植物。
(15).一種提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在該植物體中表達(dá)如(1)或(2)所述DNA的步驟。
(16).如(15)所述的方法，其中依賴于光周期的植物花期通過提高該植物的光周期敏感性而延遲。
(17).一種降低植物的光周期敏感性的方法，該方法包括抑制該植物體的細(xì)胞中如(1)或(2)所述DNA表達(dá)的步驟，其中所述DNA為該植物細(xì)胞的內(nèi)源性DNA。
(18).如(17)所述的方法，其中如(3)-(5)中任一項(xiàng)所述DNA是在該植物體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
(19).如(17)或(18)所述的方法，其中依賴于光周期的該植物的花期通過降低該植物的光周期敏感性而提前。
(20).如(15)-(19)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物是水稻。
(21).一種評估植物的光周期敏感性的方法，它包括檢測該植物中如(1)所述的DNA存在與否的步驟。
(22).如(21)所述的方法，其中所述植物是水稻。
(23).如(22)所述的方法，其中檢測核苷酸序列SEQ ID NO2中第2815位的核苷酸“A”是否被“T”取代。
(24).如(23)所述的方法，還包括以下步驟(a)以水稻基因組DNA為模板，用針對由SEQ ID NO2的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA的引物對進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中所述引物對被設(shè)計成能夾住核苷酸序列SEQ ID NO2中第2815位的核苷酸“A”；(b)將步驟(a)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所擴(kuò)增的DNA片段與限制性酶Hind III反應(yīng)，(c)檢測所述DNA片段是否被限制酶Hind III消化。
(25).一種宿主細(xì)胞，其中已插入了攜有(1)或(2)所述DNA的載體。
(26).由(1)或(2)所述的DNA編碼的蛋白。
(27).一種產(chǎn)生(26)所述蛋白的方法，它包括以下步驟(a)培養(yǎng)(25)所述宿主細(xì)胞，和(b)從該宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收蛋白。
(28).與(26)所述蛋白結(jié)合的抗體。
(29).一種DNA，其中至少15個核苷酸與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。
本發(fā)明提供了編碼來自水稻的Hd6蛋白的DNA。由本發(fā)明人分離的Kasalath Hd6的基因組DNA和cDNA的核苷酸序列分別示于SEQ ID NO2和3。由這些DNA編碼的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO1。此外，Nipponbare Hd6基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO5，由該DNA編碼的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。
Hd6是用Nipponbare和Kasalath的雜交后代檢測出的定量特征基因座(quantitative trait loci，QTL)之一，已知它位于3號染色體上。根據(jù)利用在Hd6區(qū)帶有Nipponbare遺傳背景的一個近似純合系進(jìn)行的試驗(yàn)還得知，Hd6基因座是光周期敏感性基因座。這種近似純合系從播種到抽穗(抽穗期)需要比Nipponbare多約5-7天。換而言之，Hd6能強(qiáng)化光周期敏感性從而延遲抽穗。已知Hd6基因是一種與植物的光周期敏感性有關(guān)的基因，它位于3號染色體上某一位置。但迄今仍未鑒定或分離到Hd6基因。本發(fā)明人通過復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，最終鑒定出了該基因所處的染色體區(qū)，并首次成功地將該基因作為單個基因而分離出。
目前在日本，水稻品種改良的一個重要目標(biāo)是控制水稻的抽穗期。在寒冷地區(qū)逃避由于秋季低溫的早早到來而引起的低溫?fù)p害是十分重要的。另一方面，在西南部溫暖地區(qū)的大規(guī)模水稻種植區(qū)，為了減少收獲過于集中而帶來的繁重勞動，也需要提前或延遲抽穗期。
植物的抽穗期(花期)可通過用編碼Hd6蛋白(它能提高植物的光周期敏感性)的DNA轉(zhuǎn)化植物而延遲。或者，用反義方法或核酶方法來控制所述DNA的表達(dá)，也能降低光周期敏感性和使植物的花期提前。具體地，植物的花期可通過將編碼Hd6蛋白的DNA以重組方式導(dǎo)入缺乏該DNA的植物中，和通過用反義、核酶等控制該DNA在具有該DNA的品種中的表達(dá)而多樣化。因此可培育新的品種。
本發(fā)明編碼Hd6蛋白的DNA包括基因組DNA、cDNA和化學(xué)合成的DNA。基因組DNA和cDNA可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來制備。更具體地，基因組DNA可以如下制備(1)從具有光周期敏感性基因的水稻品種(如Kasalath)中提取基因組DNA；(2)構(gòu)建基因組文庫(利用載體，如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC等)；(3)將該文庫鋪板；和(4)利用根據(jù)編碼本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO2)進(jìn)行菌落雜交或空斑雜交?；蛘撸衫锰禺愋葬槍幋a本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO2)的引物經(jīng)PCR來制備基因組DNA。另一方面，cDNA可如下制備(1)根據(jù)從具有光周期敏感性基因的水稻品種(如Kasalath)提取的mRNA合成cDNA；(2)通過將該合成的cDNA插入載體，如λZAP來制備cDNA文庫；(3)將該cDNA鋪板；和(4)如上所述進(jìn)行菌落雜交或空斑雜交。或者，cDNA也可通過PCR來制備。
本發(fā)明包括能編碼與SEQ ID NO1所示Hd6蛋白功能等價的蛋白的DNA。本文中術(shù)語“與Hd6蛋白功能等價”指目標(biāo)蛋白具有提高植物的光周期敏感性的功能。這類DNA的實(shí)例包括編碼含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的突變體、衍生物、等位基因變體、變體或同系物的那些DNA。
制備能編碼含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知氨基酸改變的蛋白的DNA的方法包括定點(diǎn)誘變(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directed constructionof mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154350-367，1987)。蛋白的氨基酸序列也可由于核苷酸序列的突變而自然突變。編碼具有天然Hd6蛋白的氨基酸序列但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、和/或添加的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中，只要它們編碼與天然Hd6蛋白(SEQ ID NO1)功能等價的蛋白。此外，不引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列改變的那些核苷酸序列突變體(簡并突變體)也包括在本發(fā)明的DNA中。
對一種DNA是否編碼能提高植物光周期敏感性的蛋白可如下進(jìn)行評估最普通的方法包括用所述DNA轉(zhuǎn)化植物和將該植物培養(yǎng)在能改變光照時間長短的培養(yǎng)箱中。更具體地，使植物在短光照(通常9-10小時)或長光照(14-16小時)的條件下培養(yǎng)，比較在這些不同條件下生長的植物從播種到開花(如果是水稻，從播種到抽穗)所需的天數(shù)。在長光照和短光照條件下達(dá)到抽穗所需天數(shù)沒有不同的那些植物被確定為缺乏光周期敏感性。在所述兩種條件下達(dá)到抽穗所需天數(shù)有差異的那些植物被確定為具有光周期敏感性，而這種差異被視為該植物的光周期敏感程度。如果不能提供培養(yǎng)箱，可通過將植物在田間和在溫室中以自然光照時間來栽培。具體地，將植物每20天播種一次，恒溫自然光照培養(yǎng)，測定每種植物開花所需天數(shù)。一般情況下，具有較強(qiáng)光周期敏感性的水稻品種如果是在8月份-2月份期間播種則抽穗提前，如果在4月份-7月份期間播種則抽穗會延遲。另一方面，光周期敏感性較弱的水稻品種達(dá)到抽穗期所需時間不受播種季節(jié)的影響，也不因光照時間的長短而發(fā)生大的改變。
編碼與SEQ ID NO1所示Hd6蛋白功能等價的蛋白的DNA可通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，這些方法包括雜交技術(shù)(Southern，E.M.Journal ofMolecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是說，用Hd6基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2或3)或其部分作為探針，用能與Hd6基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2或3)特異性雜交的寡核苷酸作為引物，分離出與水稻和其它植物的Hd6基因高度同源的DNA是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這類能編碼Hd6蛋白的功能等價蛋白的DNA可通過雜交技術(shù)或PCR技術(shù)獲得，它們都包括在本發(fā)明的DNA中。
用于分離這類DNA的雜交反應(yīng)優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。本發(fā)明的嚴(yán)謹(jǐn)條件包括如下條件6M尿素，0.4％SDS，和0.5xSSC；和那些產(chǎn)生類似嚴(yán)謹(jǐn)度的條件。能在較高嚴(yán)謹(jǐn)條件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1xSSC下雜交的DNA具有更高的同源性。在這類條件下分離的DNA預(yù)計能編碼與Hd6蛋白(SEQ ID NO1)具有較高氨基酸水平同源性的蛋白。本文中高同源性是指同一性至少50％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％(如至少95％)。一種氨基酸序列或核苷酸序列與另一種序列的同源性程度可按照Karlin和Altschl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877，1993)所述BLAST算法來確定。BLASTN和BLASTX等程序都是根據(jù)該算法開發(fā)的(Altschul et al. J.Mol.Biol.215403-410，1990)。為了根據(jù)基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，將參數(shù)設(shè)置為，例如score＝100和word length＝12。另一方面，用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列時，所用參數(shù)包括score＝50和wordlength＝3。當(dāng)使用BLAST和空隙化BLAST程序時，使用每種程序的默認(rèn)參數(shù)。這類分析的特定技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本發(fā)明的DNA可用于制備重組蛋白，產(chǎn)生已改變其光周期敏感性的植物轉(zhuǎn)化體等等。
重組蛋白常如下制備將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，和純化所表達(dá)的蛋白。重組蛋白可表達(dá)為與便于純化的其它蛋白融合的蛋白，如與大腸桿菌(Escherichiacoli)麥芽糖結(jié)合蛋白(New England Biolabs，USA，載體pMAL系列)融合的蛋白，與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(Amersham Pharmacia Biotech，vector pGEXseries)融合的蛋白，或帶有組氨酸標(biāo)記(Novagen，pET系列)的融合蛋白。對宿主細(xì)胞沒有限制，只要該細(xì)胞適于表達(dá)所述重組蛋白。除了上述大腸桿菌以外，可以使用酵母或各種動物、植物、或昆蟲細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，可用利用了鈣離子的轉(zhuǎn)化方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.53158-162，(1970)；Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166557-580，(1983))將載體導(dǎo)入大腸桿菌。表達(dá)在宿主細(xì)胞中的重組蛋白可用已知方法從所述宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中純化和回收。當(dāng)重組蛋白表達(dá)為與麥芽糖結(jié)合蛋白或其它配對物融合的蛋白時，該重組蛋白可通過親和層析方便地純化。
所得蛋白可用于制備能結(jié)合該蛋白的抗體。例如，可用本發(fā)明的純化蛋白或其一部分免疫動物，如兔等，一段時間后收集血液并去除血凝塊，從而制備多克隆抗體。將骨髓瘤細(xì)胞與用上述蛋白或其一部分免疫的動物的抗體生成細(xì)胞融合，分離能表達(dá)所需抗體的單克隆細(xì)胞(雜交瘤)，從所述細(xì)胞回收抗體，可獲得單克隆抗體。所得抗體可用于純化或檢測本發(fā)明的蛋白。相應(yīng)地，本發(fā)明包括能結(jié)合本發(fā)明蛋白的抗體。
光周期敏感性提高了的植物轉(zhuǎn)化體可用本發(fā)明的DNA來產(chǎn)生。更具體地，可將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適當(dāng)載體；將該載體導(dǎo)入植物細(xì)胞；然后使所得已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。由本發(fā)明人分離的光周期敏感性基因Hd6能提高水稻的光周期敏感性并延遲水稻的抽穗期。因此，可通過用該基因轉(zhuǎn)化各種品種并使它們表達(dá)來控制各種品種的抽穗期。轉(zhuǎn)化所需時間相對于常規(guī)通過雜交進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移而言大大縮短。此外，轉(zhuǎn)化不伴有其它特征改變，這一事實(shí)也是有利的。本文中新鑒定并分離了控制水稻抽穗期的基因，而對水稻抽穗期的控制由于本發(fā)明而首次變?yōu)榭赡堋?br> 另一方面，降低了光周期敏感性的植物轉(zhuǎn)化體可利用能抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達(dá)的DNA來產(chǎn)生將該DNA插入適當(dāng)載體，將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，然后使所得已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。術(shù)語“抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達(dá)”包括抑制基因轉(zhuǎn)錄以及抑制蛋白的翻譯。它不僅包括徹底使DNA表達(dá)能力喪失，還包括降低表達(dá)水平。
植物中特定內(nèi)源基因的表達(dá)可通過領(lǐng)域內(nèi)常用的、利用了反義技術(shù)的方法來抑制。Ecker等人首次通過瞬時基因表達(dá)法證實(shí)了經(jīng)電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞的反義RNA的反義效應(yīng)(J.R.Ecker和R.W.Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372(1986))。此后，有報道在煙草和矮牽牛中通過表達(dá)反義RNA減少了靶基因的表達(dá)(A.R.van der Krol et al.，Nature 333866(1988))。如今反義技術(shù)已作為抑制植物中靶基因表達(dá)的一種成熟手段。反義核酸抑制靶基因表達(dá)需要多種因素，包括通過形成三鏈而抑制轉(zhuǎn)錄起始；通過在RNA酶形成局部開環(huán)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)處形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過與被合成的RNA形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過在內(nèi)含子與外顯子連接處形成雜合體而抑制剪接；通過在剪接體形成位點(diǎn)形成雜合體而抑制剪接；通過與mRNA形成雜合體而抑制mRNA從核到細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位；通過在加帽位點(diǎn)或poly A添加位點(diǎn)形成雜合體而抑制剪接；通過在翻譯起始因子結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制翻譯的起始；通過在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制翻譯；通過在已翻譯區(qū)或在mRNA的多體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制肽鏈延伸；通過在核酸與蛋白相互作用的位點(diǎn)形成雜合體而抑制基因表達(dá)。這些因素通過抑制轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯而抑制靶基因的表達(dá)(Hirashima和Inoue，“ShinSeikagaku Jikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication andExpression of genes)”，Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese BiochemicalSociety)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.3 19-347，(1993))。
本發(fā)明的反義序列可通過上述任何機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，如果將反義序列設(shè)計成與所述基因的mRNA5’端附近的非翻譯區(qū)互補(bǔ)，它就能有效抑制基因翻譯。也有可能使用與編碼區(qū)或非翻譯區(qū)在3’側(cè)互補(bǔ)的序列。因此，本發(fā)明中使用的反義DNA包括具有針對所述基因非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。將所用的反義DNA連接在適當(dāng)啟動子下游，并優(yōu)選將含有轉(zhuǎn)錄終止信號的序列連接在3’側(cè)。將如此制備的DNA通過已知方法轉(zhuǎn)染至目標(biāo)植物中。優(yōu)選反義DNA的序列是互補(bǔ)于轉(zhuǎn)化植物的內(nèi)源基因的序列或其一部分，但它不需要完全互補(bǔ)，只要它能有效抑制基因表達(dá)。所轉(zhuǎn)錄的RNA優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％互補(bǔ)于靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。為了用反義序列有效抑制靶基因的表達(dá)，該反義DNA應(yīng)至少含有15個核苷酸，更優(yōu)選至少100個核苷酸，還更優(yōu)選至少500個核苷酸。所用反義DNA通常短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb。
編碼核酶的DNA也可用于抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶有很多種，它們具有不同的活性。對核酶作為RNA裂解酶的研究使得能設(shè)計出以位點(diǎn)特異性方式裂解RNA的核酶。一部分I組內(nèi)含子型核酶或包含在RNA酶P中的M1RNA由至少400個核苷酸組成，而其它屬于錘頭型或發(fā)卡型的核酶具有約40個核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域(MakotoKoizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，和Enzyme)，352191(1990))。
錘頭型核酶的自我裂解區(qū)在序列G13U14C15中C15的3’側(cè)裂解。U14與第9位的A之間形成核苷酸對被認(rèn)為對核酶活性是十分重要的。此外，已知當(dāng)?shù)?5位的核苷酸是A或U而不是C時也發(fā)生裂解(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.228225(1988))。如果將核酶的底物結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計成與靶位點(diǎn)的鄰近RNA序列互補(bǔ)，則能產(chǎn)生限制酶樣RNA裂解性核酶，它識別靶RNA中的序列UC、UU、或UA(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.239285(1988)；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，和Enzyme)，352191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.177059(1989))。例如，在Hd6基因(SEQ ID NO3)的編碼區(qū)中有多個可作為核酶作用目標(biāo)的位點(diǎn)。
發(fā)卡型核酶也可用于本發(fā)明。發(fā)卡型核酶可在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA負(fù)鏈中找到(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。該核酶也能以靶特異性方式裂解RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751(1992)；Yo Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemistry和Biology)30112(1992))。
設(shè)計用于裂解目標(biāo)的核酶可與啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子融合，并與轉(zhuǎn)錄終止序列融合，使它能在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。但如果在所轉(zhuǎn)錄的RNA的5’或3’端添加了額外的序列，核酶的活性可能丟失。在這種情況下，可另外安排一個能清理接縫(trimming)的核酶，它能在核酶部分的5’或3’側(cè)順式清理接縫，從而從含有該核酶的轉(zhuǎn)錄RNA上準(zhǔn)確切出核酶部分(K.Tairaet al.，Protein Eng.3733(1990)；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823(1989)；C.A.Grosshands和R.T.Cech，Nucleic AcidsRes.193875(1991)；K..Taira et al.Nucleic Acid Res.195125(1991))。通過隨機(jī)排列靶基因內(nèi)的這些結(jié)構(gòu)單位可以裂解其中的多個位點(diǎn)并獲得更大效應(yīng)(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。通過利用這類核酶，有可能特異性裂解本發(fā)明靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達(dá)。
內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過用具有與該靶基因序列相同或相似序列的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化而進(jìn)行共抑制。“共抑制”是指將具有與內(nèi)源靶基因序列相同或相似序列的基因通過轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入植物后，導(dǎo)入基因和內(nèi)源靶基因的表達(dá)都受到抑制的現(xiàn)象。共抑制的詳細(xì)機(jī)制目前尚不明了，但它常見于植物(Curr.Biol.7R793(1997)，Curr.Biol.6810(1996))。例如，如果想獲得Hd6基因已被共抑制的植物體，可以用設(shè)計成能表達(dá)Hd6基因或具有相似序列的DNA的載體DNA來轉(zhuǎn)化該植物，在所得植物群體中選出具有Hd6突變體特性的植物，即光周期敏感性已降低的植物。用于共抑制的基因不必與靶基因完全相同，但應(yīng)有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％(如至少95％)的序列同一性。
序列同一性可通過上述方法確定。
此外，本發(fā)明內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過用具有該靶基因的顯性陰性表型(dominant negative phenotype)的基因轉(zhuǎn)化該植物來抑制。具有該靶基因的顯性陰性表型的基因是指，表達(dá)后能消除或降低該植物固有的野生型內(nèi)源基因活性的那些基因。
對用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體沒有限制，只要該載體能在植物細(xì)胞中表達(dá)所插入的基因。例如，可以使用含有用于植物細(xì)胞中組成型基因表達(dá)的啟動子(如花椰菜花葉病毒35S啟動子)和受外源刺激誘導(dǎo)的啟動子的載體。術(shù)語“植物細(xì)胞”在本文中包括各種形式的植物細(xì)胞，如培養(yǎng)細(xì)胞上清，原生質(zhì)體，葉切片，和愈傷組織。
可通過已知方法將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，如聚乙二醇法，電穿孔，農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，和粒子轟擊?？筛鶕?jù)植物細(xì)胞的類型用已知方法從已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，水稻植物的轉(zhuǎn)化和再生方法包括(1)用聚乙二醇將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于indica水稻品種)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于japonica水稻品種)(Toki et al(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通過粒子轟擊將基因直接導(dǎo)入細(xì)胞并再生植物體(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；(4)利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因并再生植物體(Hiei et al.(1994)Plant J.6271-282)；等等。這些都是領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)有方法，都廣泛用于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域。這些方法適用于本發(fā)明。
一旦獲得了一種轉(zhuǎn)化植物，其中已將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入了基因組，就有可能通過有性或無性繁殖從該植物體獲得后代?；蛘?，可從該植物及其后代或克隆獲得繁殖材料(如種子、果實(shí)、穗、塊莖、塊根、株、愈傷組織、原生質(zhì)體等)來大規(guī)模生產(chǎn)植物。用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，包含這些細(xì)胞的植物體，該植物的后代和克隆，以及從該植物獲得的繁殖材料、其后代或克隆，它們都包括在本發(fā)明中。
如上述制備的改變了光周期敏感性的植物的花期不同于野生型植物。例如，用編碼Hd6蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的植物提高了光周期敏感性，而且該植物的花期延遲了。另一方面，由于導(dǎo)入反義DNA使得編碼Hd6蛋白的DNA的表達(dá)受到抑制的那些植物降低了光周期敏感性，且該植物的花期提前。因此，植物開花所需時間可通過控制Hd6基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，可以嚴(yán)密控制水稻，這種極具價值的作物的抽穗期，這對于培育能適應(yīng)特定環(huán)境的水稻品種非常有利。
此外，本發(fā)明提供了評估植物的光周期敏感性的方法。通過對Kasalath的Hd6基因(Hd6的功能性等位基因)和Nipponbare的Hd6基因(Hd6的非功能性等位基因)的ORF進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這些品種的ORF之間僅有一個核苷酸被取代。Kasalath中編碼賴氨酸的位點(diǎn)在Nipponbare的Hd6基因ORF中已通過一個核苷酸取代而變?yōu)榻K止密碼子。Nipponbare基因中的終止密碼子阻止從該基因翻譯出功能性產(chǎn)物。這一事實(shí)表明，植物中功能性Hd6蛋白的表達(dá)是決定植物對光周期的敏感程度的因素之一。本發(fā)明評估植物的光周期敏感性的方法是基于這一發(fā)現(xiàn)，其特征在于檢測植物是否保留編碼功能性Hd6蛋白的DNA的步驟。
根據(jù)植物是否保留編碼功能性Hd6蛋白的DNA來評估植物的光周期敏感性的方法在水稻中可如下實(shí)施檢測SEQ ID NO2所示核苷酸序列中第2815位的核苷酸“A”的突變。而且，由于Kasalath和Nipponbare的Hd6基因ORF中核苷酸序列有差異，Kasalath Hd6 DNA中限制酶Hind III的識別位點(diǎn)在Nipponbare中已改變，使得后者的位點(diǎn)不能被限制酶Hind III識別。Hind III識別位點(diǎn)在光周期敏感性水稻品種中可通過光周期敏感性E3基因的存在來特異性檢測。因此，上述核苷酸突變可通過Hind III識別作用的存在與否來檢測(CAPS，裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified PolymorphicSequence)法)。更具體地，使用了Hind III的這種方法包括以下步驟(a)用水稻基因組DNA作模板，用針對由SEQ ID NO2所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA的引物對進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中所述引物對被設(shè)計成包含核苷酸序列SEQ ID NO2中第2815位的核苷酸“A”；(b)使限制酶Hind III與步驟(a)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行反應(yīng)；和(c)檢測所述DNA片段是否被Hind III消化。SEQ ID NO20和21所示引物是可用于上述方法的引物對實(shí)例。PCR產(chǎn)物是否被Hind III消化可通過使所述DNA片段與所述限制酶反應(yīng)后進(jìn)行電泳并檢測電泳模式來確定。那些PCR產(chǎn)物不被Hind III消化的植物就不具有Hd6的功能性等位基因。
除了上述CAPS法(裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列)，本發(fā)明的方法中還可使用dCAPS法(Neff et al.，The Plant Journal 14387-392，1998)。dCAPS法可以在核苷酸取代位點(diǎn)并不對應(yīng)于特異性限制酶識別位點(diǎn)的情況下使用。具體地，可將引物設(shè)計成與核苷酸取代位點(diǎn)附近的序列雜交，并在引物中導(dǎo)入一個錯配，使得用該引物擴(kuò)增的產(chǎn)物含有新的限制酶識別位點(diǎn)。事實(shí)上，本發(fā)明使用引物“SEQ ID NO22/5’-CTTTGTGGAGGTCCAAACATTGTC-3作為包含錯配的引物，使用引物“SEQ ID NO21/5’-CTACAGATCCACAGAACAGG-3作為CAPS標(biāo)志的常用引物。
此外，本發(fā)明可使用ASPCR(等位基因特異性PCR)法(Dan et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862757-2760，1989)，該方法將引物設(shè)計成其中一個引物的3’端對應(yīng)于核苷酸取代位點(diǎn)，并且其中一個品種不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
用本發(fā)明的方法評估植物的光周期敏感性對于，如通過雜交來改良植物品種十分有效。即，當(dāng)不希望導(dǎo)入光周期敏感性特征時，可通過本發(fā)明避免與具有光周期敏感性的植物雜交。相反，當(dāng)希望導(dǎo)入光周期敏感性特征時，通過本發(fā)明就能與具有光周期敏感性的植物進(jìn)行雜交。此外，本發(fā)明的方法還可用于從雜交的后代植物群體中篩選植物。在基因序列中確定植物的光周期敏感性比根據(jù)植物的表型來進(jìn)行確定更簡單可靠。因此，本發(fā)明評估光周期敏感性的方法對植物品種改良方法的進(jìn)步作出了很大貢獻(xiàn)。
而且，本發(fā)明提供了一種DNA，它有至少15個核苷酸與本發(fā)明中由核苷酸序列SEQ ID NO2或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。本文中將“互補(bǔ)鏈”定義為由A∶T和G∶C堿基對構(gòu)成的雙鏈DNA中相對于一條鏈的另一條鏈。“互補(bǔ)”不僅指在至少15個連續(xù)核苷酸的區(qū)域內(nèi)互補(bǔ)配對的那些，還指在所述區(qū)域內(nèi)具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同源性的那些。所述DNA可作為有效檢測或分離本發(fā)明DNA的探針，或作為擴(kuò)增本發(fā)明DNA的探針。
附圖簡述
圖1圖示圍繞Hd6區(qū)的連鎖圖譜，以及YAC和PAC排列的物理圖譜。
圖2圖示基因組中候選基因座上的假基因。
圖3圖示圍繞Hd6區(qū)的精確基因圖譜。
圖4比較了Nipponbare和Kasalath中候選基因CKII的核苷酸序列。
圖5顯示了Nipponbare和Kasalath中候選基因區(qū)的基因組核苷酸序列的對比排列。
圖6續(xù)圖4。
圖7續(xù)圖5。
圖8續(xù)圖6。
圖9續(xù)圖7。
圖10續(xù)圖8。
圖11續(xù)圖9。
圖12續(xù)
圖10。
圖13顯示Nipponbare和Kasalath中預(yù)測的氨基酸序列的對比排列。
圖14是一個電泳圖譜，它顯示經(jīng)RT-PCR分析的候選基因CKIIα的表達(dá)模式。“M”表示標(biāo)志(λ/HindIII+ΦX174/HaeIII)。每個泳道所用模板如下泳道1，6，和11，Nipponbare的總DNA；泳道2，7，和12，Hd6 NIL的總DNA；泳道3，8，和13，Nipponbare的總RNA；泳道4，5，9，10，14，和15，Hd6 NIL的總RNA。泳道1-5中用于擴(kuò)增的PCR引物是用于擴(kuò)增肌動蛋白基因的；泳道6-10中的引物是用來擴(kuò)增C10214(與Hd6位于相同基因座的CKIIα)的；泳道11-15中的引物是用來擴(kuò)增R2856(與Hd6位于不同基因座的CKIIα)的。
圖15是電泳圖譜，顯示通過CAPS法檢測到的Nipponbare和Kasalath的基因組DNA之間的多態(tài)性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明參照以下實(shí)施例舉例說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。
通過連鎖分析對Hd6基因進(jìn)行的排列以及酵母人工染色體(YAC)克隆在田間栽培Nipponbare和Kasalath的較晚回交后代群(1180個植株)，選出那些在Hd6基因座附近發(fā)生了重組的植株用于分離Hd6區(qū)。用CAPS標(biāo)志進(jìn)行有效篩選(Konieczny和Ausubel，Plant J.4403-410(1993))。
首先，從RFLP標(biāo)志R2404和C1329構(gòu)建側(cè)翼于Hd6基因區(qū)的CAPS標(biāo)志。當(dāng)用特異于cDNA克隆R2404的引物“SEQ ID NO6/5′-GCAAAATGCCACTTTGTGGC-3和“SEQ ID NO7/5′-AACTTACGCTCAAATCAAAA-3′(反義)”在下述條件下經(jīng)PCR擴(kuò)增R2404時，所得產(chǎn)物顯示多態(tài)性，其中所述條件為94℃2分鐘；40輪“94℃，30秒；58℃，30秒；和72℃，1分鐘”；和72℃7分鐘。另一方面，用特異于C1329的引物“SEQ ID NO8/5′-TGTTGCCCTCATTATCTGCT-3和“SEQ ID NO9/5′-GGAGGTCGGAGTAAAGGAAA-3′(反義)”在下列條件下經(jīng)PCR擴(kuò)增，然后用限制酶Eco T22I消化，可檢測C1329的多態(tài)性，其中所述PCR條件為94℃2分鐘；35輪“94℃，1分鐘；60℃，2分鐘；和72℃，3分鐘”；和72℃7分鐘。PCR所用模板DNA根據(jù)Manner和Tenning(Plant Mol.Biol.Reptr.1538-45(1997))的改良方法來提取。更具體地，將2-3cm長的葉切片在提取緩沖液(100mM Trsi-HCl(pH8.0)，50mM Na-EDTA，1.25％SDS，0.38％硫酸氫鈉，200μg/ml蛋白酶K)中碾碎；將該溶液于65℃保溫2小時后離心。上清液用異丙醇處理，然后使沉淀物干燥并溶于合適量的水中。共選出40株植株作為重組體，其中的重組發(fā)生在CAPS標(biāo)志R2404和C1329之間。
從選出的植株中提取DNA，用Hd6基因附近的RFLP標(biāo)志構(gòu)建一個詳細(xì)的連鎖圖譜。Hd6基因座的基因型通過后代檢驗(yàn)來確定。更具體地，使所選植株的自花授粉后代在田間生長，根據(jù)每種品系中不同植株的抽穗期的分布來確定基因型。經(jīng)證實(shí)，Hd6基因位于RFLP標(biāo)志R2404和G1015之間，并與R2856共分離。
在水稻基因組研究(Rice Genome Research)中制備的YAC克隆的排列圖譜基礎(chǔ)上，利用上述連鎖圖譜構(gòu)建一個詳細(xì)的排列圖譜。該連鎖圖譜中使用的所有標(biāo)志通過Southern雜交和利用每種標(biāo)志各自的STS引物進(jìn)行的PCR證實(shí)都分別包含在每種YAC克隆中。此外，對位于Hd6區(qū)上的YAC克隆的DNA末端片段以及位于各自YAC克隆上的cDNA也進(jìn)行類似的分析。
在該分析期間，與其它標(biāo)志不同，R2856經(jīng)Southern雜交檢測是位于Hd6區(qū)的YAC克隆中，但根據(jù)PCR的結(jié)果，它不出現(xiàn)在該YAC上。這一結(jié)果提示，在Hd6基因的候選區(qū)中存在一個與R2856標(biāo)志高度相似的區(qū)，它能與R2856標(biāo)志雜交；但其中不存在編碼cDNA克隆R2856的基因。即，R2856是這樣一種RFLP標(biāo)志，它與Hd6區(qū)中的序列高度同源，但最初是由基因組其它區(qū)的基因編碼。
利用R2856特異性引物“SEQ ID NO10/5′-AGCACTCAAAAACACCAAGC-3和“SEQ ID NO11/5′-AACAAAGATACAAACAGCAC-3’(反義)”進(jìn)行PCR，條件如下94℃ 2分鐘；30輪“94℃ 1分鐘，60℃ 2分鐘，和72℃ 3分鐘”；和72℃ 7分鐘。
C10214(Ac.No.D22035)作為一個克隆被鑒定為高度同源于來自Nipponbare的EST克隆的R2856(DDBJ(DNA Data Bank of Japan)，后一克隆是在水稻基因組研究計劃中分析的。在如上所述的相同條件下使用C10214特異性引物“SEQ ID NO12/5′-CTTGATCCTCAGCTTGAAGCT-3和“SEQ IDNO13/5′-TGCAAGGCTACAAGCACATTC-3′(反義)”進(jìn)行PCR，以便證實(shí)Hd6區(qū)中編碼C10214的基因的存在。結(jié)果證實(shí)，該基因由位于Hd6區(qū)中的克隆編碼。
此外，在YAC克隆的詳細(xì)排列圖譜的基礎(chǔ)上，利用每種YAC DNA末端片段和位于YAC克隆上的cDNA克隆作為RFLP標(biāo)志構(gòu)建了一個更詳細(xì)的連鎖圖譜。結(jié)果證實(shí)，Hd6基因區(qū)位于標(biāo)志E11893和Y3626L之間(
圖1)。
用衍生自人工染色體(PAC)克隆的P1來排列Hd6基因區(qū)從EST的核苷酸序列和鄰近Hd6的YAC末端片段C10214，E11893，Y3626L，C63403，C11482，和C60478制備STS引物，用來篩選Nipponbare PAC基因組克隆文庫(8352個克隆，平均插入長度112kb)。用針對C10214的引物SEQ ID NO12和13(如上述)；針對E11893的引物“SEQ ID NO14/5′-TCGTCGCGCTCATAGCTAGA-3和“SEQ ID NO15/5′-ACTTCCTCGCTATGCCACAG-3′(反義)”；和針對Y3626L的引物“SEQ ID NO16/5′-GCCCATAATGATACGATATACT-3和“SEQ ID NO17/5′-TGGTGGTGGTTGCTGTTCGA-3實(shí)施向STS的轉(zhuǎn)化。針對C63403，C11482，和C60478的引物用水稻基因組研究計劃制備的用于EST作圖的引物。PCR條件如下94℃ 2分鐘；35輪“94℃ 30秒，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘”；和72℃ 7分鐘。結(jié)果選出7個預(yù)計包括了Hd6附近的基因組片段的克隆。而且，用這些克隆的末端片段作為探針進(jìn)行RFLP分析發(fā)現(xiàn)，PAC克隆P0689D1含有Hd6的所有候選基因區(qū)。
通過核苷酸序列分析確定候選基因區(qū)對預(yù)計含有Hd6基因的PAC克隆P0689D1進(jìn)行核苷酸序列分析。為了分析核苷酸序列，將P0689D1的插入DNA(包括載體)經(jīng)超聲處理而片段化，以此制備出平均插入長度為2kb-5kb的亞文庫。分析隨機(jī)選取的2000個克隆的核苷酸序列，并用計算機(jī)軟件Phred/Phrap裝配。根據(jù)由連鎖分析顯示的候選基因區(qū)的核苷酸序列信息產(chǎn)生新的CAPS標(biāo)志，以便將出現(xiàn)候選基因的候選區(qū)限定在一段約47kb的區(qū)。通過對候選區(qū)核苷酸序列的GENSCAN和BLAST同源性檢索來預(yù)測基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個與擬南芥的CKIIα基因高度同源的區(qū)。而且，該區(qū)的核苷酸序列與EST克隆C10214的核苷酸序列一致(圖2)。經(jīng)證實(shí)，擬南芥的CKIIα基因能影響多種基因的受光照調(diào)節(jié)的表達(dá)(Lee et al.PlantPhysiol.119989-1000(1999))，還能通過磷酸化作用而活化晝夜節(jié)律鐘基因CCA1蛋白(Sugano et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9511020-11025(1998))。
高精度(Fine-scale)連鎖分析對一個大的群體進(jìn)行連鎖分析以便更精確地確定Hd6基因候選區(qū)。按照上述方法從另一個1627棵植株的群體中新選出在側(cè)翼于Hd6基因的CAPS標(biāo)志R2404與G1015之間發(fā)生了重組的植株。用G1015特異性引物“SEQ ID NO18/5′-CTGCAAGTTCAAGCCGATCA-3和“SEQ ID NO19/5′-TTGCAATTGGCTAAGCAAGAC-3在以下條件下進(jìn)行PCR40輪“94℃ 40秒，65℃ 40秒，和72℃ 90秒”，和72℃ 7分鐘；然后將所得擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶Hae III消化，從而分析上述克隆的多態(tài)性。選出11棵植株作為在Hd6候選基因區(qū)中(在E11893和Y3626L之間)發(fā)生了重組的植株。從這些植株中提取DNA，用CAPS標(biāo)志和4棵由前一項(xiàng)連鎖分析鑒定的重組植株制備出一個詳細(xì)的遺傳圖譜。CAPS標(biāo)志根據(jù)下述核苷酸序列分析來制備。Hd6基因座的基因型如上述通過后代檢驗(yàn)來確定。結(jié)果證實(shí)Hd6基因位于CAPS標(biāo)志cnt13GNheI和cnt13BbglII之間；并與cnt13CRsaI，cnt912HindIII，和A5M7AluI共分離(圖3)。Hd6基因的候選區(qū)經(jīng)作圖位于26.4kb的一個基因組區(qū)。
Kasalath和Nipponbare的CKIIα基因的核苷酸序列比較Kasalath的CKIIα基因的基因組核苷酸序列利用Nipponbare CKIIα基因的核苷酸序列信息來確定，而后者則通過分析PAC克隆來確定。更具體地，制備能擴(kuò)增候選基因特定區(qū)域的引物，以Kasalath的基因組DNA為模板擴(kuò)增一些片段，對這些片段進(jìn)行克隆以便分析核苷酸序列。核苷酸序列如下分析改變引物，使得與鄰近序列雜交，以此確定CKIIα基因周圍的完整核苷酸序列。對Kasalath和Nipponbare的CKIIα基因的比較顯示有多處核苷酸取代、缺失和插入，但只有一個核苷酸取代發(fā)生在ORF中。該取代導(dǎo)致在Nipponbare中出現(xiàn)一個終止密碼子，而在Kasalath中該位點(diǎn)編碼賴氨酸(圖4-13；SEQ IDNO2)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，CKIIα基因在Kasalath中編碼一種有333個氨基酸的功能蛋白，而在Nipponbare中由于存在終止密碼子，它不能翻譯出功能性產(chǎn)物。
候選基因CKIIα的表達(dá)模式分析在Nipponbare(被認(rèn)為缺乏光周期敏感性基因Hd6)和Nipponbare的近似純合系(帶有Kasalath的Hd6基因)中候選CKIIα基因的表達(dá)水平的差異通過RT-PCR進(jìn)行分析。用上述SEQ ID NO7和8所示的核苷酸作為引物。PCR條件如下94℃ 2分鐘；25輪“94℃ 30秒，62℃ 40秒，和72℃ 1分鐘”；和72℃7分鐘。結(jié)果，測不出肌動蛋白基因和位于除Hd6以外的其它區(qū)中的CKIIα基因在表達(dá)水平上有差異，但候選CKIIα因在Nipponbare中的表達(dá)水平顯著低于在Hd6近似純合系中的(
圖14)。
評估水稻品種的光周期敏感性的方法在已通過遺傳學(xué)方法證實(shí)了存在的光周期敏感性基因中，E3基因被認(rèn)為位于3號染色體上。故利用鑒定Nipponbare和Kasalath的Hd6編碼區(qū)核苷酸序列差異的簡單方法來證實(shí)E3和Hd6之間的關(guān)系。Nipponbare和Kasalath的Hd6基因中突變的核苷酸位點(diǎn)(SEQ ID NO2中第2815位核苷酸由“A”取代為“T”)位于限制酶Hind III的識別位點(diǎn)內(nèi)部，本發(fā)明人指出，Hd6基因在Kasalath中被消化但在Nipponbare中沒有。因此，使用引物“SEQ ID NO20/5′-ACCTGGC AGCATGTTATGAC-3′(有義鏈，第一內(nèi)含子)”和“SEQ ID NO21/5′-CTACAG ATCCACAGAACAGG-3′(反義鏈，第三內(nèi)含子)”擴(kuò)增543bp的一段DNA片段，它包括上述突變的核苷酸位點(diǎn)，當(dāng)所擴(kuò)增的DNA片段含有Kasalath序列(不含終止密碼子)時，該片段可被Hind III消化為329bp和214bp的兩種片段；而那些帶有另一種序列的片段則不被消化(
圖15)。這說明，該方法可用于鑒定能賦予植物以光周期敏感性的基因。然后，用已通過遺傳分析證實(shí)了E3基因的存在或缺乏的那些品種檢驗(yàn)該方法的有效性(Okumotoet al.International Rice Research Institute，Rice genetics II pp.778-780 1991)。從8個證實(shí)缺乏E3基因的品種的基因所擴(kuò)增的片段不被消化，而從另外8個顯示有E3基因的品種的基因所擴(kuò)增的片段可被消化(表1)。
表1品種 基因型 CAPS分析KinmazeE3 +Koshihikarie3 -Manryo e3 -Nipponbare e3 -Nakateshinsenbon E3 +Hoyoku E3 +AkebonoE3 +Norin 6e3 -Fujiminori E3 +Fujisaka 5 E3 +Kiyonishikie3 -Norin 1e3 -Norin 8e3 -Shiranui E3 +Norin 22 e3 -Zuiho E3 +基因型E3光周期敏感性基因E3基因型e3缺乏光周期敏感性基因E3CAPS分析+包括Hind III識別位點(diǎn)，可被Hind III消化CAPS分析-缺乏Hind III識別位點(diǎn)，不被Hind III消化因此，Hd6基因?qū)?yīng)于E3基因的可能性很高，并且可以想象，新開發(fā)的檢測本發(fā)明終止密碼子的方法是評估Hd6或E3基因的光周期敏感性的有效工具。
能表達(dá)Hd6基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生及其抽穗期將含有Kasalath的CK2基因(被認(rèn)為是Hd6的候選基因)的基因組片段(Nhe I-Bgl II 8.9kb)插入二元載體pPZP2H-lac，產(chǎn)生質(zhì)粒pPZPCKII-10A。然后 用該質(zhì)粒經(jīng)擬南芥介導(dǎo)來轉(zhuǎn)化Nipponbare。在轉(zhuǎn)化代(TO)中未檢測出明顯差異，因?yàn)閮H被載體轉(zhuǎn)化的植株與被pPZPCKII-10A轉(zhuǎn)化的植株之間莖干再生的時間不一致。因此，將兩種轉(zhuǎn)化植物的自花授粉后代，以及Nipponbare，Hd6的近似純合系[NIL(Hd6)]，和僅被載體轉(zhuǎn)化的植物的自花授粉后代于5月16日播種在密閉的培養(yǎng)室(Tsukuba，Ibaraki)中，以便研究每種植物的抽穗期。每2天計數(shù)一次出現(xiàn)了第一個圓錐花序的植物的數(shù)量(表2)。
用候選基因轉(zhuǎn)化的植物，其后代的抽穗期顯示分離性，抽穗期早的植物帶有轉(zhuǎn)基因，抽穗期晚的植物不帶轉(zhuǎn)基因。抽穗期早和晚的植物的抽穗期分別幾乎與Nipponbare和NIL(Hd6)的相同。僅用載體轉(zhuǎn)化的植物，其后代的抽穗期與Nipponbare的相同。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，候選的CK2基因具有Hd6基因在自然田間條件下延遲抽穗期的功能。
表2抽穗期93 9597 99 101 103 105 107 109 111 113 115 117Nipponbare 3 6 1NIL(Hd6) 134單獨(dú)的載體 3 6 2pPZPCKII-10A1*1*83轉(zhuǎn)化體1pPZPCKII-10A1*1211 1轉(zhuǎn)化體2*表示不含pPZPCKII-10A的植株工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了水稻品種中的光周期敏感性基因。本發(fā)明的基因賦予植物以光周期敏感性并可用于控制水稻的抽穗期。因此，這些基因?qū)τ谂嘤苓m應(yīng)特定區(qū)域和季節(jié)的水稻品種從而進(jìn)行品種改良十分有效。此外，用本發(fā)明的基因改良水稻品種的方法與傳統(tǒng)方法相比具有優(yōu)勢，其優(yōu)勢在于可在短期內(nèi)獲得非?？煽康哪繕?biāo)植物。
本發(fā)明還提供了評估植物的光周期敏感性的方法。傳統(tǒng)評估方法需要2-3年的繁重勞動來確定一個品種的光周期敏感性，它包括將目標(biāo)品種與待檢植物品系雜交，鑒定特定基因的存在；然后通過分離植物后代的抽穗期來確定所述基因的存在。根據(jù)本發(fā)明的方法，植物的光周期敏感性可如下測定僅需(1)播種約2周后收獲秧苗的一部分；(2)從中提取DNA；(3)以所述DNA為模板進(jìn)行PCR并進(jìn)行限制酶處理來確定。植物后代的光周期敏感程度可在雜交前，根據(jù)所述基因的存在與否來確定，這種基因是對選擇并篩選將要雜交的親本植物而言有價值的信息。而且，光周期敏感性基因在選出的每種植物中的存在與否可利用上述方法輕易測定。因此，所述基因還可以作為選擇標(biāo)志。
序列表<110>農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所所長代表的日本國(JAPAN as represented byDirector General of Ministry of Agriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries，NationalInstitute of Agrobiological Resources)生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)(Bio-oriented Technology Research AdvancementInstitution)社團(tuán)法人農(nóng)林水產(chǎn)先端技術(shù)產(chǎn)業(yè)振興中心(Society for Techno-innovation ofAgriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries)<120>植物的光周期敏感性基因及其用途<130>MOA-102PCT<140><141><150>JP 1999-312589<151>1999-11-02<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>333<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)Kasalath<400>1Met Ser Lys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Val Asn Val Leu Arg Pro Lys1 5 10 15Glu Tyr Trp Asp Tyr Glu Ala Leu Thr Val Gln Trp Gly Glu Gln Asp20 25 30Asp Tyr Glu Val Val Arg Lys Val Gly Arg Gly Lys Tyr Ser Glu Val35 40 45Phe Glu Gly Ile Asn Val Asn Asn Asn Glu Lys Cys Ile Ile Lys Ile50 55 60Leu Lys Pro Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Arg Glu Ile Lys Ile Leu65 70 75 80Gln Asn Leu Cys Gly Gly Pro Asn Ile Val Lys Leu Leu Asp Ile Val85 90 95Arg Asp Gln His Ser Lys Thr Pro Ser Leu Ile Phe Glu Tyr Val Asn100 105 110Asn Thr Asp Phe Lys Va1 Leu Tyr Pro Thr Leu Thr Asp Tyr Asp Ile115 120 125Arg Tyr Tyr Ile Tyr Glu Leu Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Cys His Ser130 135 140Gln Gly Ile Met His Arg Asp Val Lys Pro His Asn Val Met Ile Asp145 150 155 160His Glu Leu Arg Lys Leu Arg Leu Ile Asp Trp Gly Leu Ala Glu Phe165 170 175Tyr His Pro Gly Lys Glu Tyr Asn Val Arg Val Ala Ser Arg Tyr Phe180 185 190Lys Gly Pro Glu Leu Leu Val Asp Leu Gln Asp Tyr Asp Tyr Ser Leu195 200 205Asp Met Trp Ser Leu Gly Cys Met Phe Ala Gly Met Ile Phe Arg Lys210 215 220Glu Pro Phe Phe Tyr Gly His Asp Asn His Asp Gln Leu Val Lys Ile225 230 235 240Ala Lys Val Leu Gly Thr Glu Ala Leu Asn Ala Tyr Leu Asn Lys Tyr245 250 255His Ile Glu Leu Asp Pro Gln Leu Glu Ala Leu Val Gly Arg His Ser260 265 270Arg Lys Pro Trp Ser Lys Phe Ile Asn Ala Asp Asn Gln His Leu Val275 280 285Ser Pro Glu Ala Val Asp Phe Leu Asp Lys Leu Leu Arg Tyr Asp His290 295 300Gln Asp Arg Leu Thr Ala Arg Glu Ala Met Ala His Pro Tyr Phe Leu305 310 315 320Gln Val Arg Ala Ala Glu Asn Ser Arg Ala Arg Pro Gln325 330<210>2<211>6930<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)Kasalath<400>2cacactattg gcctggcctt agtgccagaa cctgtttatt tcttctgttt tatagtctga 60tgcatttttg ttaatggaaa tggagggcct ttttcccttc gataaaaaaa atgtatgaga 120ttattagtta attatggtag tattgaaaaa tataccacga taaaaaaaac ttaaaatcaa 180attaaaatta attttcaaca tttatatttt agctacgggt gataagtcaa aacacaaaca 240acggtctttg tacgtaagtc tttttcaaaa cttgtggtaa acattcttcg ttcagttatt 300aatatttgat gtttaggaca agatctgatc aaacttctaa aattctaaca aatcaattcc 360atattaaatt aagtttatga agcgctataa gcttgtgatt ttatgatagc acttgttgag 420ataaatatat gtatatcttt tatcttatct ttaaactaag tagaggtatt tgttaaatta 480ttgatgatca gaaatttaaa aagttcgacc atatcttgta ctagtactaa acgtaaaata 540tttttgacta aaggaagtaa ttaaaattta agaggcaaaa ttacgtgtga atttgagaag 600acttccaatt caacagctca atgatcggga cacattctta aaaaagaaaa aaaagaaaca 660aaaaagatcc ggacacgcat gcgcaaatgg agctttcata ggcagaaggc gtaatcaact 720ggaaggcgtc ttctcctgga gggaaaggtc gggcccacgt aagggaacaa aaccacctgt 780cagtgaccaa aagccagcag attccagagt cgccgtccca cgccgcctct atctatctcc 840acgtgaaata aaaaaaaaac aaagctcccg aaaatattct ctctccccca cccccgaaac 900cctagcgcga cctcgccgcc ggcaatggcc gcatgaccga tgcgcctccg ccgaggagcc 960gcccgcaccc acccagcagc agcgtcgccg tgcccgccgc cgcggcggca gtgatcgcag 1020ccgccctcgc gtcctccttc ctcgccctgc tgcagccgcc ccggcgcgcc ccggtcgccg 1080cgggatccag ggtcggcatg tcgaaggcga gggtctacgc cgacgtcaac gtgctgcgcc 1140ccaaggagta ctgggactac gaggcgctca ccgttcaatg ggggtaggta gcacagccag 1200ccagctgacg tcaccttcct gagccccctg atcagcggcc gtagcttgta ttctccagat 1260ttagttcgcg atccgtatcc cgtacacctg ggctgggttt gcttattggg attaggttgg 1320attattgggt tatgcgtagg tttgcttgtg cctgtagatt ttggttttgg tcagggaatt 1380gggaatttat tgtggcttga aggttagatt gaattgcttc tgtttctatt aggacgaact 1440caataccgaa gactgcttta gtagttttac atgtttgtac tataggagta ggggacacat 1500gtttaccgaa tggttgaaga aactgttatg aatttgcaag gttatgattt taattttgga 1560atcaatctca ctatatcttc cttttaaagt tgatactagt gttgttcagt taagagcctt 1620tgtttgattg tgaatggcaa gctgtaggta ttgatcctat ttttgttggg gataaaatct 1680aagttaaggc aaaattaggc agttttatgt ttaatcattg gaacaaagta agttggtgat 1740gggtttctgg gtgtttcttt tgcatcatct gataaccaag attgatgagt aaagcataac 1800ttggtagtat agtgctttgg gcctaatctt ctttagcact gaacattcac caagttctat 1860gcttttatgt aatctcaatt ttaacattgt gttttccttc actcacccta gaatatacta 1920cctgaaagca atcaatgaaa tcaaatataa cttcgtttct acctatatga ttgtaacatg 1980ctgagtaata tggtgccaaa caactcaaca catataatac tgtccttaac aacccatctt 2040cttttccctg tagaagttgc agccctagta tattctgtac atgtcatgct acctagatga 2100caattgaggc ctggtaggag tgtgcttgtt taattttggt actccaaaag tgcactgttt 2160ttctcaatct gactctgtta ccagttgtgt ttcctctaga tgtattcctt atctatggtg 2220aattattaaa taagttgtct ggtgacaaaa aagaaaaaga aaaagaaaag aagagatgaa 2280caatatgtag ctcattgatg atcccttgtc tgcttgaact ttatgagaaa ctatagaaag 2340cagtggtgtt ttccctgacc tgatgttaaa tacttgttaa gaattgagct ttcttcgaag 2400tttgttcagt ttacacacca acactaagaa ttgccatata tctccatctt ttgtccattt 2460aattcttgtt acctcaagtc attgagggac ctggcagcat gttatgactt acacaatacc 2520tcgctaacta ttatggtgca tctttaacag tgagcaggat gactatgaag ttgtcaggaa 2580agttggaaga ggtaaatata gtgaagtctt tgaaggcatc aatgttaaca acaatgagaa 2640atgcatcatc aagatactca agcctgtgaa gaaaaagaag gtatttaatt gatcttattg 2700actgtttttt ttaattgcta gtgttgaagt tcttaaccta cctttcatat gtttgaacag 2760atcaaaaggg agattaaaat acttcagaat ctttgtggag gtccaaacat tgtgaagctt 2820cttgatattg tcagagatca acattctaag actcctagct tgatctttga atatgtcaac 2880aatacagact tcaaagtgct gtaccccacg ttgacagatt atgatatccg ctactacata 2940tatgagctac tcaaggtctt cattgagcct tcattgtcat ccctatttat ttactctatt 3000cagtaaaaca tcctgttctg tggatctgta gaatgatgta tctcttatag aaattgtttc 3060acaattactt tcctattatg tgaagatcca actaaacaca cttgtaatat atcctagaca 3120aatatcacca ttctcactgc ttgcaagttg caacatatct ttaattattt atgtatgtat 3180gaacttgatt attttctaag ttacatggct taaaacttgt cacaatctca agcagtttat 3240ggatcagttt tgttttgagt tttaattata gtagcatctt 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20<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>22CTTTGTGGAG GTCCAAACAT TGTC 2權(quán)利要求
1.一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA選自(a)編碼含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；(c)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中該DNA來自水稻。
3.一種DNA，其編碼與權(quán)利要求1或2的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA。
4.一種DNA，其編碼具有特異性消化權(quán)利要求1或2所述DNA之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
5.一種DNA，其編碼能通過在植物細(xì)胞中表達(dá)而利用共抑制效應(yīng)來抑制權(quán)利要求1或2所述DNA的表達(dá)的RNA。
6.權(quán)利要求1或2的DNA，其中所述DNA用于提高植物的光周期敏感性。
7.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。
8.一種載體，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA。
9.一種植物細(xì)胞，其被權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)化。
10.一種植物轉(zhuǎn)化體，其含有權(quán)利要求9的植物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
12.一種植物轉(zhuǎn)化體，它是權(quán)利要求10或11的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求10或11所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，它包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1或2的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，和(b)從該植物細(xì)胞再生植物。
15.一種提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在該植物體中表達(dá)權(quán)利要求1或2的DNA的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中依賴于光周期的植物花期通過提高該植物的光周期敏感性而延遲。
17.一種降低植物的光周期敏感性的方法，該方法包括抑制該植物體的細(xì)胞中權(quán)利要求1或2的DNA表達(dá)的步驟，其中所述DNA為該植物細(xì)胞的內(nèi)源性DNA。
18.權(quán)利要求17的方法，其中權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述DNA是在該植物體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中依賴于光周期的該植物的花期通過降低該植物的光周期敏感性而提前。
20.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是水稻。
21.一種評估植物的光周期敏感性的方法，它包括檢測該植物中權(quán)利要求1的DNA存在與否的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述植物是水稻。
23.權(quán)利要求22的方法，其中檢測核苷酸序列SEQ ID NO2中第2815位的核苷酸“A”是否被“T”取代。
24.權(quán)利要求23的方法，還包括以下步驟(a)以水稻基因組DNA為模板，用針對由SEQ ID NO2的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA的引物對進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中所述引物對被設(shè)計成能夾住核苷酸序列SEQ ID NO2中第2815位的核苷酸“A”；(b)將步驟(a)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所擴(kuò)增的DNA片段與限制性酶Hind III反應(yīng)，(c)檢測所述DNA片段是否被限制酶Hind III消化。
25.一種宿主細(xì)胞，其中已插入了攜有權(quán)利要求1或2所述DNA的載體。
26.由權(quán)利要求1或2的DNA編碼的蛋白。
27.一種產(chǎn)生權(quán)利要求26所述蛋白的方法，它包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求25所述宿主細(xì)胞，和(b)從該宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收蛋白。
28.與權(quán)利要求26所述蛋白結(jié)合的抗體。
29.一種DNA，其中至少15個核苷酸與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明人從水稻中通過連鎖分析成功地分離出一種光周期敏感性基因Hd6。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，植物的光周期敏感性可通過導(dǎo)入該基因或控制該基因的表達(dá)而得到改變。本發(fā)明還證實(shí)，植物的光周期敏感性可通過檢測該功能性基因的存在或缺乏來評估。
文檔編號C12N15/29GK1409763SQ00817170
公開日2003年4月9日 申請日期2000年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月2日
發(fā)明者矢野昌裕, 佐佐木卓治, 高橋裕治 申請人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)