專利名稱：玉米mip合酶啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供在植物遺傳工程中有用的DNA序列和構(gòu)件。更具體而言，本發(fā)明提供一種編碼玉米肌醇-1-磷酸合酶(MIP合酶)的分離的DNA序列和來自MIP合酶基因的新型調(diào)節(jié)序列，它們能用來驅(qū)動(dòng)多種核酸序列在轉(zhuǎn)基因植物的胚組織中的表達(dá)。
在植物遺傳工程中需要使用多種啟動(dòng)子。特別是，需要驅(qū)動(dòng)在胚組織中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO1是玉米MIP合酶的DNA序列。
SEQ ID NO2是玉米MIP合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是胚特異的玉米MIP合酶啟動(dòng)子的DNA序列。
另一方面，本發(fā)明提供對(duì)應(yīng)于或來自于SEQ ID NO3的胚特異的玉米MIP合酶啟動(dòng)子。
另一方面，本發(fā)明提供一種DNA構(gòu)件，其含有從5’到3’方向有效連接的a)玉米MIP合酶啟動(dòng)子；b)目的DNA序列；和
c)3′UTR。
另一方面，本發(fā)明提供一種質(zhì)粒，其含有玉米MIP合酶啟動(dòng)子，優(yōu)選地是SEQ ID NO3的bp 7-2064。
另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化的植物，其含有至少一種含有本發(fā)明的DNA構(gòu)件的植物細(xì)胞。該植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選的植物是玉米、稻、棉花和煙草。
另一方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的DNA構(gòu)件的種子或谷粒。發(fā)明詳述在本發(fā)明的構(gòu)件中使用的目的DNA序列可以是希望在植物中表達(dá)或下調(diào)的任何基因。特別有用的基因是賦予除草劑、昆蟲或病毒耐受性的基因，和提供改進(jìn)的植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或加工特性的基因。在農(nóng)業(yè)上有用的合適的基因的例子包括賦予昆蟲抗性的來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的殺蟲基因，和賦予草甘膦除草劑耐受性的5’-烯醇丙酮酸-3’-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)基因及其任何變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解，能使用賦予希望的性狀或產(chǎn)生重要蛋白質(zhì)的在農(nóng)業(yè)上重要的任何基因。
在本發(fā)明的構(gòu)件中使用的3′UTR(或3’非翻譯區(qū))導(dǎo)致mRNA的有效加工，保持信息的穩(wěn)定性，引導(dǎo)腺苷核糖核苷酸向轉(zhuǎn)錄的mRNA序列3’端加入。3′UTR可以與啟動(dòng)子區(qū)域同源，與結(jié)構(gòu)基因同源，或者可以來自其它來源。多種終止區(qū)是可以利用的，它們可以獲自能在植物宿主中表達(dá)的基因，如細(xì)菌、冠癭堿(opine)、病毒和植物基因，合適的3′UTR包括但不限于例如per5 3′UTR(WO98/56921)、胭脂堿合酶(nos)基因的3′UTR、tmL 3’或acp 3’。
本發(fā)明普遍適用于結(jié)構(gòu)基因在單子葉植物和雙子葉植物中的表達(dá)。本發(fā)明特別適用于單子葉植物家族的任何成員，包括但不限于玉米、稻、大麥、燕麥、小麥、高梁、黑麥、甘蔗、菠蘿、薯蕷、洋蔥、香蕉、椰子和椰棗(dates)。本發(fā)明的一種優(yōu)選用途是轉(zhuǎn)基因玉米植物的產(chǎn)生。本發(fā)明特別適用于禾本科(Graminaceae)，特別是玉米、小麥、稻、燕麥、大麥和高粱。雙子葉植物種包括煙草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜、大豆和蕓苔(油籽油菜)。
本發(fā)明也包括與特別公開的調(diào)節(jié)序列有基本序列同源性的DNA序列，使得它們對(duì)表達(dá)能具有公開的作用。
當(dāng)在本申請(qǐng)書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本序列同源性”是指一種核苷酸序列(對(duì)于DNA或RNA)或氨基酸序列(對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽)顯示與另一種核苷酸或氨基酸序列基本的功能或結(jié)構(gòu)相當(dāng)。具有基本序列同源性的序列之間的任何功能或結(jié)構(gòu)差異將是de minimis；即，它們將不影響該序列如本申請(qǐng)書所述起作用的能力。與此處公開的序列具有基本序列同源性的序列通常是所公開的序列之變體，如突變，但也可以是合成序列。
在大多數(shù)情況中，與此處特別公開的序列有95％同源性的序列將作為相當(dāng)物，在許多情況中，大大降低的同源性，如75％或80％是可以接受的。定位這些序列的不太關(guān)鍵的部分可能是耗費(fèi)時(shí)間的，但在本領(lǐng)域技術(shù)中是常規(guī)且熟知的。
預(yù)計(jì)在來自野生型的序列中對(duì)應(yīng)于上述序列的序列可能含有一種或多種修飾，但仍將使各自的元件與本發(fā)明所述相當(dāng)。例如，如上所述，可以使用片段?？梢韵蚍蛛x的序列中引入修飾，包括添加、缺失或有限數(shù)量的不同核苷酸的非保守置換，或多個(gè)核苷酸的保守置換。此外，這些DNA分子的構(gòu)建能使用可使置于其調(diào)節(jié)控制下的異源基因表達(dá)增強(qiáng)的來源。修飾寡核苷酸序列的典型技術(shù)包括利用多核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變。參見，Zoller等人(1984)，DNA，3479-488；Higuchi等人(1988)，Nucl.Acids Res.，167351-7367；Ho等人(1989)，Gene，7751-59；Horton等人(1989)，Gene，7761；《PCR技術(shù)DNA擴(kuò)增的原理與應(yīng)用》，Erlich編寫(1989)。
向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入生物物質(zhì)的常規(guī)技術(shù)包括電穿孔(參見Shigekawa和Dower(1988)，Biotechniques，6742；Miller等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85856-860；Powell等人(1988)Appi.Environ.Microbiol.，54655-660)；直接DNA攝取機(jī)制(參見Mandel和Higa(1972)，J.Mol.Biol.，53159-162；Dityatkin等人(1972)，Biochimica et Biophysica Acta，281319-323；Wigler等人(1979)，Cell，1677；Uchimiya等人(1982)，于《第五屆國(guó)際植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)大會(huì)論文集》，A.Fujiwara(編)，日本植物組織培養(yǎng)學(xué)會(huì)，東京，第507-508頁(yè))；融合機(jī)制(參見Uchidaz等人(1980)，于《大分子向活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的導(dǎo)入》，Baserga等人(編)Wistar Symposium Series，1169-185)；傳染物(參見，F(xiàn)raley等人(1986)，CRC Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；Anderson(1984)，Science，226401-409)；顯微注射機(jī)制(參見，Crossway等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202179-185)；高速發(fā)射機(jī)制(參見，授予Miller，Schuchardt，Skokut和Gould的EPO 0 405 696(Dow化學(xué)公司))。
可以根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)化所選宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法。根據(jù)迄今為止的經(jīng)驗(yàn)，在插入細(xì)胞后，基因的表達(dá)似乎沒有不同，這可歸因于轉(zhuǎn)化方法本身。在導(dǎo)入植物組織后，可以在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中測(cè)定結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，或者可以在根據(jù)植物基因組內(nèi)的穩(wěn)定整合篩選后測(cè)定。
植物組織的體外培養(yǎng)技術(shù)眾所周知，在許多情況中，再生為整個(gè)植物的技術(shù)也已知?？梢愿鶕?jù)所使用的植物種選擇產(chǎn)生成熟轉(zhuǎn)基因植物的適當(dāng)方法。再生在植物的種與種之間不同。有效的再生依賴于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)歷史。在獲得整個(gè)植物以后，它們能以在后代細(xì)胞中存在至少一個(gè)拷貝的序列的方式有性或無性繁殖。能收集再生的植物的種子用于未來的用途，并由該種子長(zhǎng)成植物。將導(dǎo)入的基因從最初轉(zhuǎn)化的植物向商業(yè)上有用的栽培品種轉(zhuǎn)移的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。
一方面，本發(fā)明被認(rèn)為包括MIP合酶啟動(dòng)子的任何缺失形式，它們提供功能性植物啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包含于術(shù)語(yǔ)“MIP合酶啟動(dòng)子”中。當(dāng)如實(shí)施例4檢測(cè)時(shí)，如果一種序列引起高于背景水平的瞬時(shí)GUS表達(dá)，則認(rèn)為該序列為該用途提供“功能性”啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能在不破壞序列作為啟動(dòng)子的功能性的情況下，進(jìn)行2058bp序列(SEQID NO3的bp 7-2064)的不同缺失。缺失實(shí)驗(yàn)在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動(dòng)子可包含200個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，它們與SEQ ID NO3的bp 7-2064所限定的序列的200個(gè)連續(xù)堿基對(duì)相同。更優(yōu)選的是含有500個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的啟動(dòng)子，它們與SEQ ID NO3的bp 7-2064所限定的序列的500個(gè)連續(xù)堿基對(duì)相同。
在下列實(shí)施例中，使用DNA純化、限制酶消化、瓊脂糖凝膠分析、DNA片段分離、連接和轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)方法，如下所述Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)；《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，(冷泉港冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.，Moore，D.，Smith，J.，Seidman，J.和Struhl，K.編(1987)；和《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(紐約John Wiley and Sons)。
實(shí)施例1編碼MIP合酶的玉米cDNA的克隆A.玉米MIP合酶探針利用簡(jiǎn)并引物的分離利用根據(jù)酵母MIP合酶氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，通過PCR擴(kuò)增玉米胚cDNA分離探針?，F(xiàn)在只有酵母MIP合酶序列是已知的(Johnson，M.和Henry，S.(1989)，酵母中的肌醇生物合成肌醇-1-磷酸合酶(EC 5.5.1.4)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和其結(jié)構(gòu)基因INO1基因座的功能分析。J.Biol.Chem.2641274-1283)，鑒定MIP合酶蛋白質(zhì)序列的“保守”區(qū)是不可能的。另外，由僅一個(gè)或兩個(gè)密碼子編碼的氨基酸在酵母蛋白質(zhì)序列中鑒定。選擇5個(gè)或5個(gè)以上的低豐度氨基酸的區(qū)段作為引物設(shè)計(jì)區(qū)。
鑒定一種克隆(MP18)，它能被翻譯為與酵母MIP合酶有同一性的蛋白質(zhì)。凝膠純化MIP18的插入片段，用32P標(biāo)記，用來探查λ玉米胚cDNA文庫(kù)。
B.玉米MIP陽(yáng)性cDNA的分離噬菌體平板接種、噬斑純化和體內(nèi)切割方法如廠商(Stratagene，LaJolla CA)推薦。進(jìn)行一些改變，如下所述。
大腸桿菌XL-1 blue在含有0.2％麥芽糖的NZY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至520nm下的光密度為1.0。低速離心收集細(xì)胞，在10mM MgSO4中重懸浮為相同密度。細(xì)胞在4℃下貯存幾天，噬斑形成率沒有損失。噬菌體在Falcon 2059管中在室溫下預(yù)吸附于200μL細(xì)胞15分鐘，隨后在37℃下15分鐘。細(xì)胞在48℃下接種于NZY平板上的3mL NZY瓊脂糖中。平板在37℃下溫育過夜。
冷卻平板，向平板上輕輕加上0.22微米尼龍濾紙，使其吸附噬菌體2分鐘。將濾紙轉(zhuǎn)移到用0.5M NaOH、1.5M NaCl飽和的吸水紙上5分鐘。使濾紙干燥5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到用0.5M Tris pH7.6、1.5M NaCl中和溶液飽和的吸水紙上15分鐘。用Stratagene UV交聯(lián)劑在“自動(dòng)”設(shè)置下交聯(lián)濾紙。濾紙用2×SSC、0.1％ SDS洗滌2次。預(yù)雜交在42℃下在6×SSC、10×Denhardt’s溶液、0.1％ SDS、200mg/mL DNA中至少進(jìn)行6小時(shí)。
用Qiagen Inc.(Chatsworth，CA)的Qiaex純化法分離DNA片段。Boehringer Mannheim隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Indianapolis.IN)按照廠商說明書使用。按照廠商建議，通過Stratagene PUSH柱凝膠過濾除去未摻入的核苷酸。
用于低嚴(yán)格雜交的雜交溶液是6×SSC、10×Denhardt’s溶液、0.1％SDS、200mg/mL DNA，42℃，6小時(shí)。低嚴(yán)格性洗滌是40℃，6×SSC、1％ SDS，4次，總共2升。高嚴(yán)格性的雜交溶液除了調(diào)節(jié)為50％去離子甲酰胺以外同上。洗滌條件是0.1％ SSC、0.1％ SDS，60℃，4次，總共2升。
初級(jí)篩選得到許多陽(yáng)性噬斑，它們?cè)趶?fù)本濾紙上出現(xiàn)。陽(yáng)性噬斑的頻率接近1％，表明該基因在胚中高效表達(dá)。挑取幾個(gè)噬斑，進(jìn)行第二次和第三次篩選。從純貯存物中挑取8個(gè)單噬斑，拯救質(zhì)粒進(jìn)行cDNA插入分析。
8個(gè)MIP合酶陽(yáng)性克隆用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和XhoI消化，從載體中釋放插入片段。根據(jù)酵母序列，預(yù)期大約2kb的cDNA插入片段，這包括有編碼能力的500個(gè)氨基酸和非翻譯序列的幾百個(gè)堿基對(duì)。兩個(gè)克隆含有與2kb標(biāo)記物共遷移的插入片段。另外6個(gè)克隆含有明顯較小的插入片段，沒有進(jìn)一步表征。選擇含有約2kb的cDNA插入片段的一個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列分析，它被稱為克隆pMIP-7。
C.玉米MIP合酶cDNA的DNA序列分析玉米MIP合酶的DNA序列和推斷的氨基酸序列示于SEQ ID NO1。cDNA長(zhǎng)度為1959個(gè)核苷酸。5′ATG位于位點(diǎn)137，產(chǎn)生推斷的136個(gè)核苷酸的5’非編碼區(qū)。一個(gè)較大的開放閱讀框從位點(diǎn)137的ATG延伸到位點(diǎn)1667處的終止密碼子。該閱讀框編碼510個(gè)氨基酸的多肽。終止密碼子位于位點(diǎn)1667處，之后是3’非翻譯區(qū)的248個(gè)核苷酸。短poly(A)尾位于位點(diǎn)1918處。
實(shí)施例2種子中組織特異模式和發(fā)育模式的分析Mycogen專有的玉米基因型CS608、HO1、CQ806、OQ414和HiII和常用的近交系B73在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長(zhǎng)。為了分析MIP合酶啟動(dòng)子的組織特異性基因表達(dá)，在目的發(fā)育時(shí)間收獲組織，凍存于-70℃下直到RNA提取。為了確定MIP在種子胚中的時(shí)間表達(dá)模式，在授粉不同天數(shù)之后(DAP)從CQ806和HO1的穗上剖下谷粒。收獲后，立即剖開谷粒，收集胚，并冷凍于干冰上的50ml錐形管中。提取RNA，準(zhǔn)備用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Northern分析。通過用EcoRI和XhoI消化，隨后凝膠純化約1950bp的插入片段，由質(zhì)粒pMIP7(描述見實(shí)施例1)制備MIP合酶雜交探針。根據(jù)廠商說明，利用READY-TO-GO標(biāo)記珠(Pharmacia)，用50μCi[α-32P]-dCTP(NEN Research Products)標(biāo)記25納克凝膠純化的片段，過NUCTRAP push柱(Stratagene)純化。標(biāo)記的探針通過煮沸5分鐘變性，在冰上冷卻5分鐘，直接加到預(yù)雜交印跡上。雜交在42℃下在SEAL-A-MEAL袋(DAZEY Corp.，Industrial Airport，KA)中進(jìn)行16小時(shí)。印跡在60℃下用預(yù)溫的過量(500mL)洗滌溶液[20mM磷酸鈉pH6.5，50mM NaCl，1mM EDTA，0.1％ SDS]洗滌6次，30分鐘。雜交結(jié)果表明，MIP合酶在所檢測(cè)的每一種玉米基因型的胚組織中表達(dá)。在18-27 DAP時(shí)觀察到胚中的最大表達(dá)。在葉或根中沒有觀察到明顯的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)提示，MIP合酶的表達(dá)在胚組織中優(yōu)先調(diào)節(jié)。
實(shí)施例3玉米MIP合酶基因的5’非翻譯區(qū)的克隆從玉米基因組DNA var.OQ414(Agrigenetics Inc.的專有系，d/b/aMycogen種子)中分離玉米MIP合酶5’側(cè)翼序列。DNA測(cè)序如廠商所述(Perlin Elmer/Applied Biosystems Division，F(xiàn)oster City，CA)用含有AmpliTaq聚合酶FS的ABI Prism DNA測(cè)序試劑盒完成。測(cè)序反應(yīng)在Applied Biosystems 373A DNA測(cè)序儀(Perkin Elmer/Applied BiosystemsDivision)上進(jìn)行。MIP合酶啟動(dòng)子的DNA序列示于SEQ ID NO3。載體描述構(gòu)建4種表達(dá)載體，它們?cè)趐UC19骨架上的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因上游摻入了MIP合酶啟動(dòng)子。
pMipGP339-1和pMipGN345-1設(shè)計(jì)用來在瞬時(shí)測(cè)定中檢測(cè)GUS表達(dá)。這兩種載體之間的不同在于用不同的3’非翻譯序列作為轉(zhuǎn)錄終止子。pMipGP339-1使用per5 3’UTR；pMipGN345-1使用nos 3’UTR。
pMipGP341和pMipGN350-1是pMipGP339-1和pMipGN345-1的衍生物，它們加入了由雙增強(qiáng)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的選擇性標(biāo)記基因(吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(BAR)基因(White等人(1989)Nucleic Acids Res.181062))。pMipGP341和pMipGN350-1用來檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米胚中的MIP合酶啟動(dòng)子/GUS融合。
質(zhì)粒UGP232-4在瞬時(shí)表達(dá)研究中用作陽(yáng)性對(duì)照。除了GUS基因由遍在蛋白1(ubi)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和來自玉米的內(nèi)含子I代替MIP合酶啟動(dòng)子外，UGP232-4類似于pMipGP339。
質(zhì)粒pDAB305在瞬時(shí)表達(dá)研究中作為對(duì)照，用來使多次實(shí)驗(yàn)之間的GUS表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。pDAB305類似于pMipGN345-1，但利用pMipGN350-1中使用的雙增強(qiáng)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。
由不同啟動(dòng)子控制的基因產(chǎn)生GUS蛋白通常與產(chǎn)生熒火蟲螢光素酶的內(nèi)部控制基因相比較(De Wet等人(1987)Mol.Cell.Biol.7(2)，725-37)。一種含有螢光素酶(LUC)編碼區(qū)的質(zhì)粒(pT3/T7-1 LUC)購(gòu)自CLONTECH(Palo Alto，CA)，該編碼區(qū)用標(biāo)準(zhǔn)方法在其5’和3’端修飾，使得在NocI和BglII消化后能在1702bp片段上分離完整的螢光素酶編碼區(qū)。用該片段替換質(zhì)粒pDAB305的GUS基因，使螢光素酶編碼區(qū)從增強(qiáng)35S啟動(dòng)子開始表達(dá)，產(chǎn)生質(zhì)粒pDeLux。
實(shí)施例4Mip合酶-Gus構(gòu)件的瞬時(shí)檢測(cè)A.胚中的瞬時(shí)組織化學(xué)GUS表達(dá)用3種單基因質(zhì)粒檢測(cè)玉米胚中MIP合酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS瞬時(shí)表達(dá)。pUGP232-4(編碼與含per5 3’UTR的GUS融合的玉米遍在蛋白啟動(dòng)子)作為陽(yáng)性對(duì)照。pMipGP339-1和pMipGN345-1含有MIP合酶啟動(dòng)子-GUS融合，它們分別含有per5和nos 3’端。在授粉后12、18和20天(DAP)收獲“Hi-II”基因型的未成熟合子胚(Armstrong等人(1991)Maize Genet.Coop.News Lett.6592-93)。胚在15Ag10愈傷組織起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2天，該培養(yǎng)基由N6鹽和維生素(Chu等人(1978)N6培養(yǎng)基及其在谷類作物花藥培養(yǎng)中的用途。Proc.Symp.Plant TissueCulture，Peking Press，43-56)、1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、25mM L-脯氨酸、100mg/L酪蛋白水解物、10mg/L AgNO3、2.5g/LGELRITE(Schweizerhall，South Plainfield，NJ)和20g/L蔗糖組成，在高壓滅菌之前pH為5.8。在轉(zhuǎn)化前，將胚轉(zhuǎn)移到15Ag10+SM培養(yǎng)基(含0.2M山梨糖醇和0.2M甘露醇的15Ag10)中進(jìn)行4小時(shí)的滲透預(yù)處理。為進(jìn)行氦沖擊，將12個(gè)胚在沖擊培養(yǎng)基上排列于約1cm2的靶區(qū)域內(nèi)，并覆蓋一個(gè)230μm的不銹鋼網(wǎng)篩。沖擊培養(yǎng)基不同于15Ag10+SM培養(yǎng)基，它缺少硝酸銀，只含有6mM L-脯氨酸，并用20g/L TC瓊脂(PhytoTechnology Laboratories，LLC，Shawnee Mission，KS)凝固。
用等摩爾量的GUS質(zhì)粒DNA制備DNA用于沖擊?？偣?0μg DNA，待測(cè)DNA+BluescriptTMDNA(Stratagene，La Jolla，CA)，在必要時(shí)用無菌水稀釋到150μL的體積。將DNA和水加到30mg表面滅菌的1.0μm球形金顆粒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。短暫振蕩混合物(約15秒)，之后加入37μL 2.5M氯化鈣和15μL 0.1M亞精胺(游離堿)。在振蕩30秒后，使DNA和金從溶液中沉淀。棄去上清液，加入1mL乙醇。在用于轉(zhuǎn)化之前將DNA/金混合物1∶4稀釋。
氦沖擊促進(jìn)懸浮的DNA包被的金顆粒趨向和進(jìn)入制備的組織靶標(biāo)。使用的裝置是美國(guó)專利號(hào)5,141,131(在此引用作為參考)描述的一種早期樣機(jī)。組織置于裝置室中25英寸Hg柱的部分真空下。用1500psi的氦壓加速DNA包被的金顆粒，每個(gè)胚靶標(biāo)一次，每一次沖擊輸送20μLDNA/金懸液。在沖擊后，胚移回15Ag10+SM培養(yǎng)基中，并在27℃下，在暗處溫育18-24小時(shí)，之后進(jìn)行GUS組織化學(xué)測(cè)定。
對(duì)胚進(jìn)行組織化學(xué)GUS分析(Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5387-405)，方法是將其置于每孔含有250-500μL測(cè)定緩沖液
的24孔微量平板中。部分抽真空2-15分鐘，之后在37℃下在暗處溫育24-48小時(shí)。表3總結(jié)了與玉米遍在蛋白對(duì)照相比，檢測(cè)MIP合酶啟動(dòng)子的瞬時(shí)GUS表達(dá)的3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在每次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)構(gòu)件沖擊3-5個(gè)靶標(biāo)(12個(gè)胚/靶標(biāo))。盡管不象對(duì)照那樣強(qiáng)烈，含有per5 3’UTR的MIP合酶構(gòu)件導(dǎo)致在12、18和20 DAP收獲的胚中的GUS表達(dá)。含有nos 3’端的MIP合酶質(zhì)粒在20 DAP的胚中也證明有GUS活性。結(jié)論是，在未成熟的玉米合子胚中，用MIP合酶啟動(dòng)子觀察到中等水平的瞬時(shí)表達(dá)。
表3玉米胚中MIP合酶-GUS構(gòu)件的瞬時(shí)GUS表達(dá)
nt＝未檢測(cè)B.玉米可再生愈傷組織中的瞬時(shí)定量GUS表達(dá)在可再生玉米愈傷組織中檢測(cè)質(zhì)粒pMipGP339-1和pMipGN345-1，指示MIP合酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)組成型表達(dá)的水平。修飾的35S啟動(dòng)子/GUS構(gòu)件(pDAB305)作為對(duì)照，它在玉米中高度表達(dá)。pMipGP339-1或pMipGN345-1GUS驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)測(cè)定為pDAB305驅(qū)動(dòng)的GUS的百分?jǐn)?shù)。
pMipGP339-1和pMipGN345-1均導(dǎo)致pDAB305表達(dá)3％，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于對(duì)照。結(jié)合以上的胚數(shù)據(jù)，不顯著的組成型表達(dá)強(qiáng)烈表明MIP合酶是一種胚特異的啟動(dòng)子。
實(shí)施例5穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織的產(chǎn)生II型愈傷組織培養(yǎng)物來源于基因型“Hi-II”的未成熟合子胚(Armstrong等人(1991)Maize Genet.Coop.Newslett.6592-93)。從Hi-II親本A與Hi-II親本B的雜交后代在溫室生長(zhǎng)的穗中分離胚，或者從Hi-II植物自花授粉或近緣授粉產(chǎn)生的F2胚中分離。未成熟的胚(1.5-3.5mm)在如此處所述的15Ag10愈傷組織起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)。4-6周后，將愈傷組織傳代培養(yǎng)到愈傷組織保持培養(yǎng)基上(不含AgNO3、L-脯氨酸減為6mM的起始培養(yǎng)基)。II型愈傷組織的選擇進(jìn)行約12-16周。
用質(zhì)粒pMipGN350-1和pMipGP341獨(dú)立轉(zhuǎn)化胚發(fā)生愈傷組織。為準(zhǔn)備氦沖擊，通過向300μL質(zhì)粒DNA和H2O中加入74μL 2.5M CaCl2H2O和30μL 0.1M亞精胺(游離堿)，將140μg質(zhì)粒DNA沉淀到60mg酒精漂洗的球形金顆粒(直徑1.5-3.0μm，Aldrich Chemical Co.，Inc.，Milwaukee，WI)上。立即振蕩溶液，使DNA包被的金顆粒沉淀。棄去得到的澄清上清液，將金顆粒在1ml無水乙醇中重懸浮。該懸液用無水乙醇稀釋，獲得15mg/mL DNA包被的金。使約600mg胚發(fā)生愈傷組織分布于如此處所述的II型滲透培養(yǎng)基表面。在4小時(shí)的預(yù)處理后，將組織轉(zhuǎn)移到含有此處所述的沖擊培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。利用此處所述的氦沖擊裝置，用DNA/金混合物個(gè)別地沖擊靶標(biāo)。組織上覆蓋不銹鋼篩(104μm孔)，并置于裝置室中在15英寸Hg柱的部分真空下。DNA包被的金顆粒在沖擊之前再次用無水乙醇1∶1稀釋，用1500psi的氦壓加速愈傷組織靶標(biāo)4次，每次沖擊輸送20μL DNA/金懸液。在每次沖擊后靶標(biāo)旋轉(zhuǎn)180°。組織也在暴露未沖擊的愈傷組織的過程的中途混合。沖擊后立即將組織轉(zhuǎn)移回II型滲透培養(yǎng)基中保持16-24小時(shí)的恢復(fù)期。之后，將組織分成小片，轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(缺少酪蛋白水解物和L-脯氨酸但含有30mg/LBASTA(AgrEvo，柏林，德國(guó))的保持培養(yǎng)基)中。在3個(gè)月中每4周將組織片不加選擇地轉(zhuǎn)移到新鮮選擇培養(yǎng)基中。在選擇9周到21周后，取出并分離對(duì)于生長(zhǎng)抑制的組織背景增殖的愈傷組織部分。每?jī)芍軐⒌玫降腂ASTA-抗性組織傳代培養(yǎng)到新鮮選擇培養(yǎng)基上。
實(shí)施例6成熟體細(xì)胞胚的發(fā)育和轉(zhuǎn)基因植物的再生在這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中，通過在含有60g/L蔗糖的Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基(下文稱為MS培養(yǎng)基)(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.(1962)15473-497)上培養(yǎng)胚發(fā)生愈傷組織，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)育為種子胚。愈傷組織生長(zhǎng)7天，然后將體細(xì)胞胚個(gè)別地轉(zhuǎn)移到含有60g/L蔗糖和10mM脫落酸(下文稱為ABA)的MS培養(yǎng)基中，持續(xù)7天。成熟14天后，除了不抽真空之外，如此處所述，通過置于約400μLGUS溶液中，測(cè)定來自不同轉(zhuǎn)基因系的體細(xì)胞胚的GUS基因的組織化學(xué)表達(dá)。鑒定GUS表達(dá)系和非GUS表達(dá)系，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中。通過將胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到基于細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、30g/L甘露醇、5mg/L 6-芐氨基嘌呤(下文稱為BAP)、0.025mg/L 2，4-D、30mg/L BASTA和2.5g/LGELRITE的MS培養(yǎng)基，pH5.7)中起始再生。培養(yǎng)物置于低照度(125英尺-燭光)下1周，隨后置于高照度(325英尺-燭光)下1周。在2周誘導(dǎo)期之后，將組織不加選擇地轉(zhuǎn)移到不含激素的再生培養(yǎng)基中，并保持在高照度下，該培養(yǎng)基除了不含2，4-D和BAP外與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。取出小的(3-5cm)小植物，置于含有Schenk和Hildebrandt鹽和維生素(下文稱為SH培養(yǎng)基)(Schenk和Hildebrandt，(1972)Can.J.Bot.50199-204)、10g/L蔗糖、100mg/L肌醇和2.5g/L GELRITE，pH5.8的150×25mm培養(yǎng)管中。每個(gè)可再生系至少用一個(gè)小植物進(jìn)行組織化學(xué)GUS測(cè)定。完整的小植物(3-10cm)置于15mL錐形離心管中，浸沒于約5-10mL GUS測(cè)定緩沖液中，如此處所述溫育。未測(cè)定的小植物一旦顯示生長(zhǎng)并發(fā)育足夠的根系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)移到溫室中含有約0.25kg METRO-MIX 360(The Scotts Co.Marysville，OH)的12cm圓罐中。它們?cè)诟邏衡c燈和鹵化金屬燈組合提供的16小時(shí)光周期下生長(zhǎng)，需要時(shí)施以3種獨(dú)立Peters Excel肥料的組合(Grace-Sierra Horticultural Products Company，Milpitas，CA)。在6-8葉階段，將植物移植到含有約4kg METRO-MIX 360的5加侖罐中，生長(zhǎng)成熟。
初級(jí)再生物與原種近交系OQ414遠(yuǎn)交。在授粉約6周后收集R1種子。
總共312個(gè)II型愈傷組織靶用pMipGN350-1和pMipGP341沖擊。選擇回收36個(gè)Basta抗性愈傷組織分離株，然而，只誘導(dǎo)29個(gè)形成如此處所述的成熟體細(xì)胞胚。24個(gè)這些事件在如此處所述的組織化學(xué)GUS測(cè)定后產(chǎn)生一定水平的藍(lán)色染色，從極淺的藍(lán)色到深靛藍(lán)。再生13個(gè)這樣的表達(dá)株，加1個(gè)玉米遍在蛋白/GUS/Nos陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)(非GUS)轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。由這些系的每一個(gè)再生約16株R0植物。13個(gè)MIP再生株中的10個(gè)產(chǎn)生R1種子。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因植物的GUS分析A.胚的GUS分析在授粉后10-30天(DAP)以5天的間隔收獲來自pMipGP341-06.06、pMipGN350-05.01、pMipGN350-14.01、1817-02.11(轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照)、Whisker-12.12和Whisker-12.14(玉米遍在蛋白-GUS陽(yáng)性對(duì)照)的胚。在每次收獲時(shí)，根據(jù)R0植物的種子穗(seed set)，每個(gè)穗能收獲可達(dá)10個(gè)谷粒。按照如此處所述的Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5387-405的方法，組織化學(xué)檢測(cè)胚的GUS表達(dá)。
在轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照(1817-02.11)的胚中沒有觀察到GUS表達(dá)。出乎意料的，在遍在蛋白陽(yáng)性對(duì)照(Whisker-12.12和Whisker-12.14)的胚中沒有檢測(cè)到GUS。這些植物的生長(zhǎng)受到阻礙，種子組較少。然而，3個(gè)MIP合酶事件的每一個(gè)都證明了R1胚中的GUS表達(dá)。在pMipGP341-06.06中，早在10 DAP時(shí)即觀察到表達(dá)。對(duì)于p350事件，在15 DAP時(shí)第一次檢測(cè)到GUS。所有系中的表達(dá)延續(xù)到30 DAP的成熟。分離通常遵循孟德爾遺傳模式。
B.根和葉的GUS分析每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件2株植物，以及2株未轉(zhuǎn)化的對(duì)照(OQ414)、轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照(1817-02植物)和表達(dá)玉米遍在蛋白驅(qū)動(dòng)的GUS的陽(yáng)性對(duì)照(Whisker-12事件)在不同的發(fā)育階段處理。在V6(6葉)和VT(出現(xiàn)纓)期，每個(gè)事件收獲一株植物，分別合并葉和根進(jìn)行分析。另外，在V6期收獲每個(gè)事件幾株植物的第6片葉，個(gè)別評(píng)估GUS表達(dá)。
在未轉(zhuǎn)化的(OQ414)和轉(zhuǎn)化的陰性(1817-02)對(duì)照的葉或根中沒有檢測(cè)到GUS活性。在陽(yáng)性對(duì)照(Whisker-12事件，7株植物)中觀察到變化的但是顯著的GUS表達(dá)，在葉中為0.45-2.34ng GUS相當(dāng)物/μg蛋白質(zhì)，在根中為0.28-0.47。MIP合酶-GUS轉(zhuǎn)基因事件證明在葉或根中沒有明顯的GUS活性，得出MIP合酶啟動(dòng)子是胚特異性的結(jié)論。
序列表<110>Armstrong，KatherineHey，Timothy DFolkerts，OttoSmith，Kelley AHopkins，Nicole L<120>玉米MIP合酶啟動(dòng)子<130>50597<140><141><150>US 60/168,612<151>1999-12-02<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1959<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<220><221>CDS<222>(137)..(1699)<400>1gaattcggca caagcaaagg agcgcggcgg cccctccttc cttcctccca cttctctcgc 60gcggcgctcg cttacctcgc ctcgcattcc gttcgagcag gggagcggca gtgagaaggg 120agggaattaa ggcaag atg ttc atc gag agc ttc cgc gtc gag agc ccc cac 172Met Phe Ile Glu Ser Phe Arg Val Glu Ser Pro His1 5 10gtg cgg tac ggc ccg acg gag atc gag tcg gag tac cgg tac gac acg 220Val Arg Tyr Gly Pro Thr Glu Ile Glu Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp Thr15 20 25acg gag ctg gtg cac gag gcc aag gac ggc gcc tcc cgc tgg gtc gtc 268Thr Glu Leu Val His Glu Ala Lys Asp Gly Ala Ser Arg Trp Val Val30 35 40cgc ccc aag tcc gtc aag tac aac ttc cgg acc agc acc gcg gtc ccc 316Arg Pro Lys Ser Val Lys Tyr Asn Phe Arg Thr Ser Thr Ala Val Pro45 50 55 60aag ctc ggg gtc atg ctt gtg ggg tgg gga ggc aac aac ggg tcc acg 364Lys Leu Gly Val Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr65 70 75ctg acg gct ggg gtc att gcc aac agg gag ggg atc tca tgg gcg acc 412Leu Thr Ala Gly Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr80 85 90aag gac aag gtg cag caa gcc aac tac tac ggc tcc ctc acc cag gct 460Lys Asp Lys Val Gln Gln Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Leu Thr Gln Ala95 100 105tcc acc atc aga gta ggc agc tac aac ggg gag gag ata tat gcg ccg 508Ser Thr Ile Arg Val Gly Ser Tyr Asn Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro110 115 120ttc aag agc ctc cta ccc atg gtg aac cca gac gac ctt gtg ttt gga 556Phe Lys Ser Leu Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Leu Val Phe Gly125 130 135 140ggc tgg gac atc agc agc atg aac ctg gca gat gcc atg acc agg gcc 604Gly Trp Asp Ile Ser Ser Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Thr Arg Ala145 150 155aag gtg ctg gac att gac ctg cag aag cag ctc agg ccc tac atg gag 652Lys Val Leu Asp Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu160 165 170tcc atg gtg cca ctt ccc ggt gtc tat gat ccg gac ttc atc gcc gct 700Ser Met Val Pro Leu Pro Gly Val Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala175 180 185aac cag ggc tct cgt gcc aac aat gtc atc aag ggc acc aag aaa gaa 748Asn Gln Gly Ser Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Lys Glu190 195 200cag gtg gag cag atc atc aaa gat atc agg gag ttt aag gag aag aac 796Gln Val Glu Gln Ile Ile Lys Asp Ile Arg Glu Phe Lys Glu Lys Asn205 210 215 220aaa gtg gac aag gta gtt gtg ctg tgg act gca aac act gaa agg tac 844Lys Val Asp Lys Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr225 230 235agc aat gta tgt gct ggt ctc aac gac aca atg gag aat ctg ctg gca 892Ser Asn Val Cys Ala Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala240 245 250tct gtg gac aag aac gag gcg gag atc tcg cca tca aca cta tat gcc 940Ser Val Asp Lys Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala255 260 265att gcc tgt gtc acg gag ggg gtg ccg ttc atc aat ggg agc ccc cag 988Ile Ala Cys Val Thr Glu Gly Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln270 275 280aac act ttt gtg cct ggg ctg att gat ctt gct atc aag aac aac tgc 1036Asn Thr Phe Val Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Lys Asn Asn Cys285 290 295 300ctg atc ggt ggt gac gac ttc aag agt ggg cag acc aag atg aaa tcg 1084Leu Ile Gly Gly Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser305 310 315gtc ctg gtt gat ttt ctt gtt ggt gct gga ata aag ccc acc tcg att 1132Val Leu Val Asp Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile
320 325 330gtg agc tac aac cac ttg gga aac aac gac ggc atg aac ctg tct gcc 1180Val Ser Tyr Asn His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala335 340 345cct caa aca ttc agg tcc aag gag atc tcc aag agc aac gtg gtg gat 1228Pro Gln Thr Phe Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp350 355 360gac atg gtc tca agc aat gcc att ctc tat ggg ccc ggc gag cat ccc 1276Asp Met Val Ser Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Gly Pro Gly Glu His Pro365 370 375 380gat cat gtt gtt gtc atc aag tat gtg ccg tat gtg gga gac agt aag 1324Asp His Val Val Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys385 390 395agg gct atg gac gag tac aca tca gag atc ttc atg ggc ggc aag agc 1372Arg Ala Met Asp Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser400 405 410acc atc gtg ctg cac aac acc tgc gag gac tcg ctc ctc gcc gca ccg 1420Thr Ile Val Leu His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro415 420 425atc atc ctc gat ctg gtg ctc ctg gct gag ctc agc acc agg atc cag 1468Ile Ile Leu Asp Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Gln430 435 440tta aaa cct gag gga acg gac aag ttc cac tcc ttc cac ccg gtg gcc 1516Leu Lys Pro Glu Gly Thr Asp Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala445 450 455 460acc atc ctt agc tac ctc acc aag gca cca ctg gtt cca ccc ggc aca 1564Thr Ile Leu Ser Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr465 470 475ccg gtg gtg aac gct ctt gca aag cag agg gcg atg ctg gag aac atc 1612Pro Val Val Asn Ala Leu Ala Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile480 485 490atg agg gct tgc gtt ggc ctg gcc cca gag aac aac atg atc ctg gag 1660Met Arg Ala Cys Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu495 500 505tac aag tga gcg aag tgg cgt ggc ctg cag cta gat atg gaggaggctg1709Tyr Lys510cacgaagggg actagagagg cgagattagc tgtggaattg tgttggcttc tcgtgttttc 1769ttttgcgttc ttttcctggt catcgctgtg gcgcttttgt attttatttg ttggacccgt 1829aacactatca gggctctgct attagcgctt gaagcctgta atggcattgg catcgtatga 1889taatgtgatc gagggtgcta gttcccctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tcgagggggg 1949gcccggtacc1959<210>2<211>510<212>PRT<213>玉米<400>2Met Phe Ile Glu Ser Phe Arg Val Glu Ser Pro His Val Arg Tyr Gly1 5 10 15Pro Thr Glu Ile Glu Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Val20 25 30His Glu Ala Lys Asp Gly Ala Ser Arg Trp Val Val Arg Pro Lys Ser35 40 45Val Lys Tyr Asn Phe Arg Thr Ser Thr A la Val Pro Lys Leu Gly Val50 55 60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Ala Gly65 70 75 80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Val85 90 95Gln Gln Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Thr Ile Arg100 105 110Val Gly Ser Tyr Asn Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu115 120 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Leu Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile130 135 140Ser Ser Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Thr Arg Ala Lys Val Leu Asp145 150 155 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Val Pro165 170 175Leu Pro Gly Val Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Gly Ser180 185 190Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Lys Glu Gln Val Glu Gln195 200 205Ile Ile Lys Asp Ile Arg Glu Phe Lys Glu Lys Asn Lys Val Asp Lys210 215 220Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Val Cys225 230 235 240Ala Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ser Val Asp Lys245 250 255Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val260 265 270Thr Glu Gly Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val275 280 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Lys Asn Asn Cys Leu Ile Gly Gly
290 295 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305 310 315 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn325 330 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe340 345 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Ser355 360 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Gly Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val370 375 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp385 390 395 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser Thr Ile Val Leu405 410 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp420 425 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Gln Leu Lys Pro Glu435 440 445Gly Thr Asp Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser450 455 460Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465 470 475 480Ala Leu Ala Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys485 490 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys500 505 510<210>3<211>2069<212>DNA<213>玉米<400>3tctagatttt ttttcaattc accccgagta aatatccaat cacaatctaa aaatcaggag 60aaattatatg gccatattat agaagcaact aaataaaatg tgcgttgtat tgaaaaaaaa 120acctatttat aacaaacatc tgccaagaat acaattcttt tatacacaac ttatatgtga 180gttctttttc tcttgtaact cttattaata aaacattttt ggctattaaa taatggcaac 240taagttagca ccactgtaat tagattttgt ctggaacaat ttctctgact aagaagctat 300ttggactgtc cttttgccaa acaagtagaa aatggaaccg ctccttaaaa aaccattctc 360acatcgctgg gtgctgaata aaactgaaaa cattagcttt ttatagctct cgctctctgc 420tagtatgtgt tataaaatca ttttaccaat taccttttta aataactgta cgtagtttca 480tcagtagaac tactcacgga gctaaaacaa aaaaagttgt tctactgata aaagcagaga 540tgatgtatga ccgtgaccgt gagctaaagt ccaaaaaaaa aaactgctcc acaataacga 600caaaacaaag ttgtattgta tggcctaaat tacagcacac tgacaccaca cgtatattat 660tctctctcca ttatcacagg atgtaactgt aaaaattttg tatgttaaac atttgtagta 720aatattgcta gcatttacgt ctacggaatt tattgaaaaa atgtagtatt gttttatata 780attttaataa aactgtaaat cgtctggctt cgtttctgga tggaggataa atagtgaata 840cgaatgggaa acaccacaac aaccacgccg ctgcgttctg cgaatcacat gagcgatcag 900tgccttgctg ttccgtgaac ttgcacgcaa ggacgagagc ctttctgcct ttgcatgcaa 960ggacaagagt ctttacatgc aaggacaaat aactcccacg cgccccaccg tgctttggca 1020agccacatgg caccctgccg atcacaattc acaggcccag gcttccggtg gtcgcgtgcc 1080gtgagtctga caccgcacca catggccgcc gtaggccgtg cctacgcacc aaggcgactc 1140gtggtgccag gctctcggcg gctttggagt cggtgccatg ccgcggggtc cgtggaccgc 1200tcctaggggc caggacgaag ctgcaccgca caagcgggcc gcgcgtgact ccgtgaccgt 1260gaggcgggcg taaccaggag cttccgccac gcttgagacc acgtgacggc gcagaggagc 1320tccacgcgat caaaagcgcc cgccacttct aaaggtcagg ggtcttgcgt tctgcccctc 1380gtgcttcctt caaattctgg acctagtgga tcaatttacg tacacctcag caaccgatgc 1440agccagtatg atgagcacga ttgtgacgtg ttgggggtca tggtcaatgg caaccgagca 1500cgaattggta gtgtctgctt tttgtacacg tgatagcatt tgattcgttc attcaatttg 1560aactgtttaa acttatatat gtagagaaat tagtccaact catgcttaat aaaaagtata 1620aaacccatcg aatttatgaa ttatgatagc aggtatccta tccattgtca tcgctcacag 1680tcacagaggt agccactgcc gacggccgac ggcctcccat ttcgctcccc tcctactcct 1740atgctgcggt ccagcaaaag ttcgggcctt ccggcaatcc gccggcgccc gtcggctcaa 1800atcgcatcta ccgcggctag aagctctctc ttcctccctc cgatccggtg gggtccattt 1860ccttcaattg tggcagtggc cgtctcgaac cctctataaa tcccccaccc cggacaccct 1920tccccgacca cacagcccaa caacaaggag cgcggcggcc cctccttcct tcctcccact 1980tctctcgcgc ggcgctcgct tacctcgcct cgcattccgt tcgagcaggg gagcggcagt 2040gagaagggag ggaattaagg caaccatgg 2069
權(quán)利要求
1.一種含有MIP合酶啟動(dòng)子的分離的DNA分子。
2.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其含有SEQ ID NO2的堿基對(duì)7-2064，或該序列的片段、遺傳變體或缺失體，它保留在植物細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的能力。
3.權(quán)利要求3的分子的片段、遺傳變體或缺失體，其含有至少200個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，它們與SEQ ID NO2的堿基對(duì)7-2064所確定的序列的200個(gè)連續(xù)堿基對(duì)相同。
4.一種分離的DNA分子，其含有在序列上與SEQ ID NO2的堿基對(duì)7-2064所示序列的20個(gè)連續(xù)堿基對(duì)部分所相同的20個(gè)堿基對(duì)核苷酸部分。
5.一種DNA構(gòu)件，其含有與異源核酸序列有效連接的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子可與SEQ ID NO2選擇性雜交。
6.權(quán)利要求5的DNA構(gòu)件，其中該啟動(dòng)子含有SEQ ID NO2的堿基對(duì)7-2064。
7.一種在植物中表達(dá)異源核酸序列的方法，包括a)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種含有與該異源核酸序列有效連接的MIP合酶啟動(dòng)子的載體；和b)由該細(xì)胞再生為植物。
8.一種產(chǎn)生種子的方法，包括a)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種含有與異源核酸序列有效連接的MIP合酶啟動(dòng)子的載體；b)由該細(xì)胞再生為植物；和c)將與該異源核酸序列有效連接的MIP合酶啟動(dòng)子性傳播給后代。
9.產(chǎn)生權(quán)利要求8的種子的方法，還包括收集后代產(chǎn)生的種子的步驟。
10.一種轉(zhuǎn)化的植物，其含有至少一種含有權(quán)利要求5的DNA構(gòu)件的植物細(xì)胞。
11.含有權(quán)利要求5的DNA構(gòu)件的種子或谷粒。
全文摘要
玉米肌醇－1－磷酸合酶(MIP合酶)基因和來自MIP合酶基因的新型胚特異性調(diào)節(jié)序列在植物遺傳工程中有用。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1413254SQ00817487
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月2日
發(fā)明者K·阿姆斯特朗, T·D·海, O·福爾克茲, K·A·史密斯, N·L·霍普金斯 申請(qǐng)人:道農(nóng)業(yè)科學(xué)公司