專利名稱：甲基對硫磷水解酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明甲基對硫磷水解酶基因(亦稱降解基因)，屬于生物高科技技術(shù)領(lǐng)域，專用于農(nóng)作物及土壤中殘留甲基對硫磷殺蟲劑的去除降解，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品。
農(nóng)藥的使用雖然提高了農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)效率及農(nóng)作物產(chǎn)量，但同時帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題，造成生態(tài)失衡農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，并直接影響到人民的身體健康。目前有機(jī)磷農(nóng)藥仍是植物化學(xué)保護(hù)中的主力軍，而甲基對硫磷在有機(jī)磷農(nóng)藥中是使用量居第二位的，這類農(nóng)藥具有高效的殺蟲效果，但對人畜毒性較高使用受到限制。隨著近年來環(huán)境保護(hù)的呼聲越來越高，農(nóng)藥使用帶來的環(huán)境問題日益引起人們的重視。有機(jī)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)的興起就是在這種背景下發(fā)生的。但就目前的形勢而言，人類仍面臨饑餓、貧窮的困擾，全面實行有機(jī)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，禁止農(nóng)藥的使用是不現(xiàn)實的。為了達(dá)到高產(chǎn)高效的目標(biāo)，農(nóng)藥的地位在短期內(nèi)是無法取代的。為了既能充分發(fā)揮農(nóng)藥高效保護(hù)效果，又能夠解決農(nóng)藥殘留，國內(nèi)外進(jìn)行了多方面的研究，提出了化學(xué)方法、物理方法、生物學(xué)方法等多種解決途徑。在這些方法中生物學(xué)方法具有無毒、無殘留、無二次污染的優(yōu)勢。微生物在農(nóng)藥殘留的生物學(xué)解決途徑中有著獨特的作用。利用從微生物中提取的降解酶系來消除農(nóng)藥殘留在國外已有成功的先例，降解酶的來源可以通過直接從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構(gòu)建高效表達(dá)菌株來獲得。
將農(nóng)藥殘留降解基因通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)移到作物中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因作物，可以從根本上防止農(nóng)藥在作物體內(nèi)累積，消除農(nóng)藥殘留的危害。國外已有轉(zhuǎn)抗除草劑基因水稻的報道，甲基對硫磷降解基因在該領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。
本發(fā)明的目的是提供甲基對硫磷水解酶基因，可以用于構(gòu)建工程菌株，高效表達(dá)甲基對硫磷水解酶，生產(chǎn)酶制劑用于土壤、蔬菜、茶葉等的農(nóng)藥殘留去除，及農(nóng)產(chǎn)品深加工中降解農(nóng)藥殘留，提高產(chǎn)品品質(zhì)及增加附加值。并可進(jìn)一步用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因作物徹底解決植株中農(nóng)藥殘留問題。
本發(fā)明所提供的甲基對硫磷水解酶基因其核酸序列如下 甲基對硫磷水解酶產(chǎn)生菌是鄰單胞菌M6(Plesiomonas sp.Strain M6，見崔中利等，兩株聯(lián)合降解甲基一六○五菌的分離及其特性研究，《應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報》，1999,5,117-119)，甲基對硫磷水解酶基因mpd是通過功能克隆的方法獲得的。
本發(fā)明所提供的甲基對硫磷水解酶基因(mpd)，可以高效地在大腸桿菌及假單胞菌中表達(dá)，所產(chǎn)生的重組甲基對硫磷水解酶基因仍具有很強(qiáng)的活力，為大量生產(chǎn)該農(nóng)藥降解酶提供了有利的條件。通過選擇合適的載體質(zhì)粒，可以使該基因在各種農(nóng)藥殘留降解菌及環(huán)境保護(hù)用菌種中表達(dá)，為構(gòu)建多功能降解菌提供了理想的材料，并可以進(jìn)一步克隆到適當(dāng)?shù)闹参锊牧现袠?gòu)建轉(zhuǎn)基因作物。甲基對硫磷降解酶基因還可以用于構(gòu)建多功能農(nóng)藥殘留降解菌株，改善降解菌的性能和降解能力，降低生產(chǎn)和使用成本。并可進(jìn)一步用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物，培育具有自身消除農(nóng)藥殘留的作物品種。
將該基因克隆到廣宿主載體pTR102中，獲得重組質(zhì)粒pMTT，通過三親雜交將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到對硝基苯酚降解菌P3中，得到工程菌PM,PM可以高效表達(dá)甲基對硫磷水解酶基因，并利用甲基對硫磷為唯一碳源進(jìn)行生長，而受體菌P3不能利用甲基對硫磷作為唯一碳源。
pUC19采用堿裂解法抽提，用NH4Ac和LiCl純化。1.2總DNA及載體DNApUC19的酶切M6總DNA采用Sau3AⅠ部分酶切。載體pUC19采用BamHⅠ完全酶切。1.3DNA的回收酶切后的總DNA及載體DNA通過電泳(TAE緩沖液)進(jìn)行純化，采用glassmilk(BIOSTAR,Canada)回收試劑盒進(jìn)行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris.Cl(pH8.0)中，置于-20℃保藏。1.4載體pUC19的脫磷酸化
pUC19用牛小腸堿性磷酸酯酶(CIAP)(2.5U/100pmol末端37℃處理半小時，再加入等量CIAP處理半小時。酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收。1.5酶連建立如下反應(yīng)體系pUC199(脫磷)0.1μg總DNA片段 0.1μg10×連接酶緩沖液1μlT4DNA連接酶 0.5μl加重蒸水至 10μl14℃溫育12小時，然后擴(kuò)大反應(yīng)體系3倍，22℃繼續(xù)溫育3小時。1.6制備大腸桿菌DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞。1.7轉(zhuǎn)化取10μl酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μl感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參照J(rèn).薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。涂含甲基對硫磷100mg/L、AMP100mg/L的SOC培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后挑取有水解圈的轉(zhuǎn)化子，即是含甲基對硫磷水解酶基因的陽性轉(zhuǎn)化子。1.8陽性克隆酶切圖譜建立(圖2)1.9基因核苷酸序列測定陽性克隆以pUC系列通用引物為測序引物，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。2．重組質(zhì)粒pMTT的構(gòu)建2.1載體質(zhì)粒pTR102的提取采用堿裂解法提前，具體方法參見J.薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。2.2DNA的酶切載體質(zhì)粒用BamHⅠ酶切回收，并按1.4的方法脫磷處理。供體質(zhì)粒pMT12(KS(+)+mpd)用BglⅡ部分酶切回收mpd基因片段。2.3酶連脫磷處理的載體與mpd基因片段按摩爾比1∶1混合，按1.5的方法進(jìn)行酶連。2.4轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法按1.7的方法進(jìn)行。2.5電泳和酶切驗證3．降解甲基對硫磷重組基因工程菌的構(gòu)建受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌接種加入相應(yīng)抗生素的3ml LB平板培養(yǎng)過夜，按1∶2∶1的比例混合后離心，用生理鹽水洗滌菌體沉淀，重懸與100μl生理鹽水中，將菌懸液全部涂到一張鋪在LB平板上的無菌濾膜上，培養(yǎng)12小時。刮取菌體進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂相應(yīng)的選擇性平板，培養(yǎng)過夜挑取接合子，驗證并測定其降解性能(圖5)。
結(jié)果分析1．利用功能克隆法從甲基對硫磷降解菌M6中克隆到甲基對硫磷降解酶基因mpd。
2．mpd基因在E.coliDH5α中表達(dá)時不需要IPTG的誘導(dǎo)，并且其插入方向與載體pUC19啟動子方向相反，表明該基因含有表達(dá)所需的全套表達(dá)元件，可以在大腸桿菌中高效表達(dá)具有強(qiáng)活力的降解酶。
3．將mpd基因克隆到pTR102廣譜質(zhì)粒上，通過三親雜交法轉(zhuǎn)移到對硝基苯酚降解菌P3中，獲得了可以甲基對硫磷為唯一碳源進(jìn)行生長的基因工程降解菌PM。
權(quán)利要求
1.甲基對硫磷水解酶基因mpd，其基因序列為
全文摘要
本發(fā)明甲基對硫磷水解酶基因,屬于生物技術(shù)高科技領(lǐng)域,專用于構(gòu)建基因工程菌進(jìn)行降解酶的生產(chǎn)及菌種、作物品種改良,達(dá)到去除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的目的,進(jìn)行綠色食品生產(chǎn)。其方法如下:從鄰單胞菌M6中克隆甲基對硫磷水解酶基因mpd,將其亞克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上,轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移到受體(微生物或植物)中,表達(dá)甲基對硫磷水解酶,達(dá)到去除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的目的。圖為甲基對硫磷水解酶基因克隆路線。
文檔編號C12N15/55GK1302896SQ0110059
公開日2001年7月11日 申請日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月17日
發(fā)明者崔中利, 李順鵬, 沈標(biāo), 顧向陽 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)