專利名稱：一種制備重組脫氧核糖核酸酶i的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組脫氧核糖核酸酶類制備方法，特別是用原核宿主細(xì)胞制備重組脫氧核糖核酸酶I(以下簡(jiǎn)稱為DNase I)的制備方法。由本發(fā)明方法所制備的脫氧核糖核酸酶I可用于制備治療呼吸系統(tǒng)疾病、減少患者痰的粘度、通暢呼吸道的藥物。
脫氧核糖核酸酶(以下簡(jiǎn)稱為DNase)是一種可水解脫氧核糖核酸(DNA)的磷酸二酯酶，包括DNase-I和DNase-II，與限制性內(nèi)切酶需要識(shí)別特定序列相比，其可以非特異降解DNA。DNase-I的最適pH值接近中性，必須有二價(jià)陽(yáng)離子參與水解反應(yīng)，產(chǎn)生5’-磷酸核苷酸和5′磷酸寡聚核苷酸。
來(lái)自許多物種的DNase已經(jīng)被分離純化，牛DNase A、B、C和D最早于1973年純化并測(cè)序(Liao等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2492354，1973)，豬和綿羊的DNase也已經(jīng)分離純化并測(cè)序(Paudel等，生物化學(xué)雜志，26116006，1986)和(Paudel，生物化學(xué)雜志，26116012，1986)。
已知DNase有多種功能，并且可用于醫(yī)藥目的。其最主要的醫(yī)藥應(yīng)用是降低肺粘性分泌物即痰的粘度，例如在治療肺炎過(guò)程中，它可以幫助清潔呼吸道。由粘性分泌物引起的呼吸道阻塞可以導(dǎo)致呼吸不適，甚至導(dǎo)致窒息死亡。
從天然牛胰腺中提取制備的DNase曾經(jīng)以Domavae為商品名出售，但是使用DNase引起部分患者明顯的并發(fā)癥如肺腫和過(guò)敏性反應(yīng)(Raskin，美國(guó)呼吸系統(tǒng)疾病綜述(Am.Rev.Resp.Dis.)，98697，1986)，最終從市場(chǎng)中撤回。產(chǎn)生這種并發(fā)癥的原因是因?yàn)樵撎烊粊?lái)源的產(chǎn)品中含有引起上述不適的雜質(zhì)蛋白酶。此外，諸多疾病產(chǎn)生粘稠的肺分泌物的癥狀通常是慢性的和復(fù)發(fā)性的，長(zhǎng)期使用牛胰DNase來(lái)治療此類疾病也不合適。為解決這個(gè)問(wèn)題，可利用基因工程的方法，用原核或真核細(xì)胞制備重組人或牛DNase，從而避免蛋白酶的污染。
盡管第一個(gè)哺乳動(dòng)物DNase的全長(zhǎng)序列于1973年就已經(jīng)獲得，直到許多年以后才有了有關(guān)克隆和表達(dá)此類酶的工作的報(bào)道。1994年美國(guó)Genetic公司的特異性作用于大分子DNA的重組人脫氧核糖核酸酶(rhDNase)祛痰藥物問(wèn)世，用于降低痰液中的大分子DNA含量和縮短細(xì)胞外DNA分子的長(zhǎng)度(從0.6-2.6kbp縮短到0.3-0.5kbp)，從而明顯降低痰液的粘稠度，改善阻塞性等肺疾病的肺功能(FEV1和FVC均提高10％以上)，提高病人的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)了病人的生命期。因而rhDNase可用于制備治療慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、支氣管哮喘及其它呼吸道疾病的有效藥物。
由于DNase對(duì)宿主細(xì)胞有毒性，重組表達(dá)尤其是在原核細(xì)胞中表達(dá)DNase的成功實(shí)例并不多。為了在原核細(xì)胞中特別是在大腸桿菌中重組表達(dá)特定目標(biāo)蛋白質(zhì)，目前一般的方法是將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入適當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒，然后用所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，得到重組工程菌，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所得重組工程菌，分離純化表達(dá)的目標(biāo)蛋白。但是，對(duì)于諸如DNase這樣的對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的目的蛋白質(zhì)而言，使用通常所述的重組表達(dá)方法，非常少量的DNase的表達(dá)就會(huì)殺死宿主細(xì)胞，因而無(wú)法得到需要量的目標(biāo)產(chǎn)物。因此，需要采用一種特殊的重組表達(dá)策略，通過(guò)利用嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)，即在重組宿主細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中不表達(dá)重組基因，當(dāng)重組宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到恰當(dāng)濃度時(shí)，加入合適的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。本領(lǐng)域周知的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如lac啟動(dòng)子，可在加入誘導(dǎo)物ITPG后在原核宿主細(xì)胞中啟動(dòng)重組蛋白質(zhì)表達(dá)。但lac啟動(dòng)子并不是一種嚴(yán)格的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在沒(méi)有ITPG加入的情況下仍會(huì)有少量的本底表達(dá)。由于本發(fā)明的DNase I少量的本底表達(dá)對(duì)所得重組表達(dá)宿主來(lái)說(shuō)都是致命的，所以需要特別設(shè)計(jì)一種非常嚴(yán)格的誘導(dǎo)表達(dá)體系。利用一般的表達(dá)策略，不僅在表達(dá)時(shí)很難得到產(chǎn)物，而且在獲得重組菌株的過(guò)程中就會(huì)遇到很大的困難，例如由于菌種的急速退化，菌種的篩選、保存和性質(zhì)分析等工作都將很難進(jìn)行。Sheild等人利用溫度誘導(dǎo)的方法在大腸桿菌克隆了牛DNase-I基因片段，并鑒定了融合蛋白表達(dá)克隆具有DNase生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性(Biochem.Soc.Trans.16195，1988)。然而由于DNase具有的毒性，即使在低溫啟動(dòng)子處于抑制狀態(tài)也很難從克隆中提取出質(zhì)粒。這極大地限制了DNase在原核細(xì)胞中表達(dá)的應(yīng)用。所以目前只有在動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)人DNase的報(bào)道(Genentech，INC.EP 0449968B1，02/24/1999)。但是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)DNase產(chǎn)率低、成本高，極大的限制了DNase作為藥物的應(yīng)用。人DNase在原核細(xì)胞中重組表達(dá)一直沒(méi)有成功的報(bào)道。
為了解決上述重組表達(dá)脫氧核糖核酸酶的問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)了獨(dú)特的表達(dá)策略，利用一種嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)，即噬菌體誘導(dǎo)的T7-RNA聚合酶啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)(該表達(dá)系統(tǒng)只有在含T7-RNA聚合酶基因的噬菌體誘導(dǎo)后才能表達(dá)DNase)，成功地在T7-RNA聚合酶缺陷型大腸桿菌中表達(dá)了人和牛的DNase I，實(shí)現(xiàn)了重組DNase I生產(chǎn)，為DNase的廣泛藥物應(yīng)用鋪平了道路。這種表達(dá)方法不僅有效地解決了DNase對(duì)細(xì)胞的毒性問(wèn)題，而且由于DNase本身的特性不易在細(xì)菌細(xì)胞中形成包涵體，解決了外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高表達(dá)過(guò)程中常見(jiàn)的包涵體形成及包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性工藝復(fù)雜、復(fù)性率低等問(wèn)題。
本發(fā)明一方面涉及一種制備具有生物學(xué)活性的重組脫氧核糖核酸酶I(DNase I)的方法，其包括(1)用含有編碼脫氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞；(2)在適于所選原核細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(3)在適于脫氧核糖核酸酶I表達(dá)的條件下誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶I；(4)從所得經(jīng)轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)液中回收脫氧核糖核酸酶I。
本發(fā)明另一方面涉及一種含有用如上所述的方法制備的脫氧核糖核酸酶I的酶制劑。
本發(fā)明的又一方面涉及用如上所述的方法制備的脫氧核糖核酸酶I用于制備治療呼吸系統(tǒng)疾病、減少患者痰的粘度、通暢呼吸道的藥物的用途。


圖1、本發(fā)明采用的表達(dá)載體pBGI-2的圖譜。
圖2、用pBGI-2構(gòu)建的含有人DNase I編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pBGI-2-hDNase的圖譜。
圖3、用pBGI-2構(gòu)建的含有牛DNase I編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pBGI-2-bDNase的圖譜。
本發(fā)明一方面涉及一種制備具有生物學(xué)活性的重組脫氧核糖核酸酶I的方法，其包括(1)用含有編碼脫氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞；(2)在適于所選原核細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(3)在適于脫氧核糖核酸酶I表達(dá)的條件下誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶I；(4)從所得經(jīng)轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)液中回收脫氧核糖核酸酶I。
此處所用術(shù)語(yǔ)“活性”是指具有非特異性水解脫氧核糖核酸(DNA)的磷酸二酯鍵，引起糖-磷酸DNA骨架的3’磷酸基脫氧的性質(zhì)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的嚴(yán)謹(jǐn)型誘導(dǎo)表達(dá)，所選表達(dá)系統(tǒng)一般包括帶有適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體，可有效誘導(dǎo)所述啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物，以及與所選表達(dá)載體及誘導(dǎo)物相適應(yīng)的適當(dāng)表達(dá)宿主?？捎糜诒景l(fā)明的表達(dá)載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如，細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合的載體、病毒DNA。不過(guò)，只要能在宿主中復(fù)制和存活，其它載體也可以利用。表達(dá)載體中的DNA序列被有效地與一個(gè)合適的表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連在一起，從而指導(dǎo)mRNA的合成。本領(lǐng)域周知，可用多種適當(dāng)?shù)姆椒?，例如溫度轉(zhuǎn)變、化學(xué)藥品誘導(dǎo)、噬菌體誘導(dǎo)等方法誘導(dǎo)所選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，本發(fā)明可用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于，例如大腸桿菌的lac、trp或tac啟動(dòng)子、噬菌體的PL啟動(dòng)子、T5、T7啟動(dòng)子以及已知控制原核細(xì)胞中基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以具有增強(qiáng)表達(dá)的合適序列。此外，為了便于篩選得到的重組表達(dá)載體，其優(yōu)選包含能提供表型特征的一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選，例如大腸桿菌可用四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素、新霉素或卡那霉素抗性。
本發(fā)明的所述載體上還應(yīng)當(dāng)含有適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，以利于目的蛋白質(zhì)編碼序列的插入。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的使用帶有T7-RNA聚合酶啟動(dòng)子的表達(dá)載體，例如本發(fā)明構(gòu)建的含T7啟動(dòng)子的重組表達(dá)質(zhì)粒pBGI-2(如
圖1所示)。一旦將人或牛的DNase基因插入到可受T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的位置中，只有當(dāng)體系中含有T7-RNA聚合酶時(shí)，受所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的目的基因才能被轉(zhuǎn)錄并在所選宿主中表達(dá)。
為了實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)型誘導(dǎo)表達(dá)，所選宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是非天然存在或產(chǎn)生可誘導(dǎo)所選啟動(dòng)子表達(dá)的誘導(dǎo)物的菌株。如本領(lǐng)域周知，可選用多種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主，只要該宿主的生長(zhǎng)不會(huì)自主誘導(dǎo)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選用一種T7-RNA聚合酶缺陷型大腸桿菌，特別是對(duì)含T7 RNA聚合酶基因、并含相應(yīng)啟動(dòng)子的噬菌體敏感的菌株，如T7-RNA聚合酶缺陷型大腸桿菌JM109。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的嚴(yán)謹(jǐn)型誘導(dǎo)表達(dá)，可以采用多種方式引入可誘導(dǎo)所選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)所需的誘導(dǎo)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，所選誘導(dǎo)物的引入取決于所選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及采用的表達(dá)宿主，只要可實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)型誘導(dǎo)表達(dá)，任何方法均可使用。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用λCE6噬菌體感染所選宿主菌株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用含有編碼DNase I的核苷酸序列之重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T7-RNA聚合酶缺陷型大腸桿菌JM109，在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所得重組工程菌，在宿主菌生長(zhǎng)期間，由于不存在內(nèi)源性T7聚合酶，受T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的目標(biāo)DNase I基因不能表達(dá)。當(dāng)發(fā)酵液中重組基因工程菌的密度達(dá)到一定期望值，且其中所含質(zhì)?？截悢?shù)也達(dá)到期望數(shù)量時(shí)，加入λCE6噬菌體，誘導(dǎo)表達(dá)DNase I。不拘泥于特定的理論，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的所述條件下，盡管DNase I的產(chǎn)生對(duì)菌體具有毒性作用，會(huì)導(dǎo)致溶菌現(xiàn)象發(fā)生，但是在溶菌現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，本發(fā)明所述的重組表達(dá)宿主細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了大量的DNase I。由于DNase I的表達(dá)引發(fā)宿主細(xì)胞的裂解，大量目標(biāo)蛋白質(zhì)存在于培養(yǎng)液中，不同于利用大腸桿菌高效表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的常規(guī)操作，無(wú)需變性、重折疊等多步費(fèi)時(shí)費(fèi)力的后處理，就可直接從培養(yǎng)本發(fā)明重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)液中回收具有生物學(xué)活性的脫氧核糖核酸酶。
本發(fā)明所述的脫氧核糖核酸酶I可以是任何來(lái)源的，包括但不限于人、牛、豬、小鼠、大鼠等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選使用人或牛脫氧核糖核酸酶I。
為了獲得DNase I，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的PCR擴(kuò)增技術(shù)和重組DNA技術(shù)。依據(jù)公開(kāi)的DNase I編碼序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，分別從人或牛的胰腺cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增上述人或牛的DNase。將所得PCR產(chǎn)物通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法導(dǎo)入合適的表達(dá)載體，構(gòu)建重組DNA構(gòu)建體。用所得DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在適于目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并通過(guò)本領(lǐng)域周知的技術(shù)回收并純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。
合適的DNA序列可以通過(guò)許多方法插到載體中。通常，DNA序列用本領(lǐng)域中已知的方法插入到合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上。這些方法相信處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
包含上述合適的DNA序列、合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，讓宿主表達(dá)該蛋白。
將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法有氯化鈣轉(zhuǎn)化、氯化鎂轉(zhuǎn)化、電穿孔或基因槍方法、TSS轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法等。
通常，重組表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)和用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，例如大腸桿菌的卡那霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，還包含來(lái)自高效表達(dá)基因的啟動(dòng)子，從而介導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。異源的結(jié)構(gòu)序列以適當(dāng)?shù)姆轿慌c翻譯起始和終止序列以及其它優(yōu)選的序列裝配在一起?？蛇x擇的情況是，DNA序列可以編碼一個(gè)融合蛋白，該蛋白含有一個(gè)N末端或C末端確認(rèn)肽，表現(xiàn)出預(yù)期的特征，例如所表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定化和簡(jiǎn)化提純步驟。所融合的肽或蛋白可以是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST、麥芽糖結(jié)合蛋白MBP、金黃色葡萄球菌蛋白A、硫氧還蛋白Trx A、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶CAT、β-半乳糖苷酶、Flag肽、Intein標(biāo)簽、多聚組氨酸標(biāo)簽、多聚精氨酸標(biāo)簽及其它多聚氨基酸標(biāo)簽等。由于6×組氨酸標(biāo)簽使得目標(biāo)蛋白質(zhì)易于通過(guò)金屬螯合層析純化、不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性和抗原性而不必除去等，本發(fā)明優(yōu)選在DNase I的N末端或C末端加入6×組氨酸標(biāo)簽。細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體可這樣來(lái)構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)插入到帶有功能啟動(dòng)子的可操縱的閱讀框中。載體應(yīng)包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)保證了載體在宿主中能保留下來(lái)，更理想的是能使載體得到擴(kuò)增。適于轉(zhuǎn)化的原核宿主有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種細(xì)菌，其它的宿主也可以被選擇。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)已知人和牛DNase-I基因序列，設(shè)計(jì)合成上下游引物，用PCR法擴(kuò)增，從人胰腺cDNA庫(kù)中獲得成熟DNase基因序列，從牛胰腺cDNA庫(kù)中獲得全長(zhǎng)基因序列，重組到表達(dá)質(zhì)粒pBGI-2中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，一定條件下經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)后，采用λCE6噬菌體誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白人或牛DNase-I。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從胰腺中提取總RNA并純化mRNA，在每個(gè)cDNA的5′末端加上一個(gè)特定的連接子(adaptor)，得到人胰或牛胰的、帶有特定連接子、可用于快速擴(kuò)增cDNA末端法(RACE-PCR)的人胰或牛胰cDNA庫(kù)。根據(jù)已公布的DNase-I序列，設(shè)計(jì)含有DNase I基因的特定5′引物和3′引物。然后用設(shè)計(jì)合成的5′引物和3′引物及連接子引物，采用RACE-PCR擴(kuò)增基因，分別得到DNase I的3′RACE片段和5′RACE片段。分別與克隆載體pGEM-T連接。轉(zhuǎn)化并選取抗Amp+的陽(yáng)性克隆。提取分別含DNase I5′片段和3′片段的兩個(gè)重組克隆載體，酶切后用DNA連接酶連接兩個(gè)片段，得到全長(zhǎng)序列DNase I基因。將DNase I基因片段與克隆載體pGEM-T連接，得到攜帶完整DNase I基因的重組克隆。根據(jù)DNase I的基因序列和需加入的內(nèi)切酶序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出帶有內(nèi)切酶序列的DNase I基因，酶切后與同組酶切的表達(dá)載體pBGI-2連接，得到重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化并選取抗Kan+的陽(yáng)性克隆。并對(duì)所得含有插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和活性鑒定。pBGI-2表達(dá)載體除含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T7終止子外，含有f1復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因(Kan+)，且含有His標(biāo)簽的編碼序列。
采用檢測(cè)發(fā)酵液光密度值法檢驗(yàn)宿主菌株的生長(zhǎng)情況，確定噬菌體的加入時(shí)間。加入噬菌體的時(shí)間可以為重組宿主菌采用間歇培養(yǎng)法培養(yǎng)至O.D.600為0.6-2時(shí)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知可通過(guò)流加培養(yǎng)、高密度培養(yǎng)等方法培養(yǎng)重組宿主菌，其加入噬菌體時(shí)的培養(yǎng)液O.D.600應(yīng)相應(yīng)增高。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)重組宿主菌在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至O.D.600＝0.4-0.8時(shí)，加入λCE6噬菌體，誘導(dǎo)DNaseI表達(dá)。
通?？稍诩尤胨稣T導(dǎo)物后繼續(xù)培養(yǎng)宿主菌株約0.5-20小時(shí)，優(yōu)選地約1-10小時(shí)，更優(yōu)選地約1.5-5小時(shí)，直至培養(yǎng)液中的菌體O.D.值開(kāi)始明顯下降，然后收集培養(yǎng)液，采用本領(lǐng)域周知的方法如下所述從培養(yǎng)液中和重組菌菌體中回收DNase I。
通常用離心或膜過(guò)濾的方法收獲細(xì)胞，用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞的破碎可以用任何便捷的方法，通常用物理、化學(xué)的或生物的方法破碎細(xì)胞，包括凍融循環(huán)、超聲波破碎、機(jī)械破碎如高壓勻漿、高速珠磨，或者使用化學(xué)滲透法、酶溶法，這些方法都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。再通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的離心、過(guò)濾等方法除取細(xì)胞破碎液中的細(xì)胞碎片及其它雜質(zhì)，得到破碎上清液。如重組菌培養(yǎng)液中含有DNase I，則可將細(xì)胞破碎液與培養(yǎng)液合并得DNase I粗提液，備下一步純化。調(diào)整離子強(qiáng)度和pH值等溶液性質(zhì)后，可用如下純化方法沉淀法如硫酸胺、乙醇、聚乙二醇沉淀法、親和沉淀法；層析方法如離子交換層析、疏水相互作用層析、凝膠過(guò)濾層析、羥基磷灰石層析、反相層析、層析聚焦、親和層析如DNase I抗體層析法直接回收DNase I。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于用重組表達(dá)質(zhì)粒pBGI-2-DNase轉(zhuǎn)化的DNase I粗提液，采用金屬螯和層析純化表達(dá)的含有His標(biāo)簽的DNase I，采用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫方式如用咪唑洗脫，純化DNase I。還可以采用膜過(guò)濾法如微濾、超濾、親和膜以及雙水相萃取法、反膠束法等對(duì)DNase進(jìn)行純化。在整個(gè)純化過(guò)程中微量Ca2+的存在將有利于Dnase I活性的保持。經(jīng)純化后的DNaseI不含蛋白酶。
本發(fā)明的又一方面，涉及一種含有利用本發(fā)明所述方法制備的脫氧核糖核酸酶I的酶制劑。所述酶制劑任選地還包括保持DNase I生物學(xué)活性所需的輔因子。本發(fā)明所述的酶制劑任選地包括與保持DNaseI生物學(xué)活性相容的穩(wěn)定劑。本發(fā)明所述的酶制劑可以呈液體、固體、氣霧劑或冷凍干燥品形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的酶制劑為氣霧劑。當(dāng)呈氣霧劑形式時(shí)，溶液DNase制品中含有50-300mM NaCl和0.01-10.0mM Ca2+。以含有150mM NaCl和1.0mMCa2+為佳。pH的范圍為4-10。冷凍干燥品為溶液DNase制品的冷凍干燥品。DNase制品中還可以含有少量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑如人血白蛋白、單糖如葡萄糖、聚乙二醇等；可以含有蛋白酶等其它的成分。
本發(fā)明所述的酶制劑中的DNase I任選地還可經(jīng)大分子修飾，經(jīng)修飾后的DNase其活性保持不變，而穩(wěn)定性得到提高、半衰期延長(zhǎng)、抗原性被遮蓋。用于修飾DNase的大分子可以是聚乙二醇、聚丙二醇等線性的或分枝聚醇類化合物，也可以是葡聚糖等多糖類化合物。
本發(fā)明另一方面涉及如本發(fā)明所述方法制備的DNase I用于制備治療和/緩解患有伴隨異常的、粘性的或者含膿的濃縮分泌物的肺部疾病患者的藥物的用途。在例如急性的或者慢性的肺支氣管疾病(感染性的肺炎、支氣管炎或者氣管支氣管炎、支氣管擴(kuò)張癥、肺囊腫性纖維化病變(屬遺傳性胰腺病)、肺氣腫、哮喘癥、肺結(jié)核或者真菌引起的阻塞性肺疾病)、或由于氣管、支氣管的影響引起的肺膨脹不全或者支氣管切開(kāi)術(shù)引起的并發(fā)癥中尤其的有效。所述DNase I降解粘痰中的DNA，從而減少病人痰的粘度、清除呼吸道的阻塞物。經(jīng)本發(fā)明制備的DNase I對(duì)于膿腫或者嚴(yán)重閉和性的感染(例如積膿癥、腦膜炎、膿腫、腹膜炎、竇炎、耳炎、牙周炎、心包炎、胰腺炎、膽石病、心內(nèi)膜炎以及感染性的關(guān)節(jié)炎)的輔助性治療也是有效的，同樣對(duì)于例如皮膚感染性傷口或者黏膜炎、外傷傷口以及潰爛性傷口等多種膿腫或者感染傷口的局部治療也是非常有效的。人的DNase I在保持與體腔連接的包括外科的排泄導(dǎo)管、排尿?qū)Ч?、腹腔膜透析端口、以及氣管?nèi)的輸氧管等醫(yī)療用的管道的流速方面起到很好的作用。DNA酶可能會(huì)提高抗菌劑在治療感染過(guò)程中的效率。
如本發(fā)明方法所述制備的DNase I除了用于醫(yī)療外，溶液制品或凍干制品還可以用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)的研究和需要除去脫氧核糖核酸的過(guò)程如藥物制備過(guò)程中核酸的去除。DNase I在此類應(yīng)用中可以游離形式(在溶液中)或以固定化的形式(固定在固相介質(zhì)上)起到降解DNA的作用。此處所提到的固相介質(zhì)是指用于層析的各種凝膠介質(zhì)、硅膠介質(zhì)、有機(jī)合成大分子介質(zhì)，并包括各種無(wú)機(jī)膜、有機(jī)膜，包括用于動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的各種微載體包括磁性微載體等。
實(shí)施例實(shí)施例1人胰腺DNase的克隆根據(jù)已公布的人胰腺DNase的基因序列(SEQ ID NO.1，編碼區(qū)位于核苷酸序列的160 1008位，信號(hào)肽的編碼區(qū)位于核苷酸序列的160--225位，SEQ ID NO.3為含信號(hào)肽的氨基酸序列)(Shak，S.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87(23)9188，1990)設(shè)計(jì)引物5′正向引物
5′-GCAGCCTTCAACATCCAGACATTTGGGGAG-3′3′反向引物5′-GCTTGTCCACAGGCGGATGGATGACCACTG-3′取冷凍人胰，采用RNeasy Midi系統(tǒng)(Qiagen，美國(guó))從胰腺中提取總RNA。再用Oligotex mRNA系統(tǒng)(Qiagen，美國(guó))純化mRNA。為了得到用于RACE-PCR克隆技術(shù)的人胰cDNA庫(kù)，還必須在每個(gè)cDNA的5′末端加上一個(gè)特定的連接子，應(yīng)用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，美國(guó))得到了人胰的帶有特定連接子的cDNA庫(kù)。然后用如上所述設(shè)計(jì)合成的5′正向引物和3′反向引物及連接子引物(MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒，Clontech)，采用快速擴(kuò)增cDNA末端法(RACE-PCR)擴(kuò)增基因，PCR反應(yīng)條件為95℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)3分鐘。進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。然后72℃保持7分鐘。4℃保存。分別得到DNase I 3′RACE片段和5′RACE片段。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)片段的存在和大小后，分別與pGEM-T Easy Vector(Promega，美國(guó))連接。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。選取抗Amp+的陽(yáng)性克隆，提取重組的克隆載體并進(jìn)行酶切鑒定。并對(duì)所得含有插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序，確證在PCR過(guò)程中目的基因片段的存在且未發(fā)生變異或出現(xiàn)差錯(cuò)。提取分別含DNaseI5′片段和3′片段的兩個(gè)重組T載體，用Nco I和Eco47 III切割DNase I的3′片段，用EcoR I和Eco47 III切割DNase I的5′片段。然后用Qiaquick Gel Extraction(Qiagen)純化酶切的兩個(gè)片段，用DNA連接酶連接兩個(gè)片段，得到全長(zhǎng)序列DNase I基因。然后用T4DNA連接酶連接從瓊脂糖凝膠電泳回收并純化的全長(zhǎng)DNase基因片段和用Nco I和EcoR I切割過(guò)的pGEM-T Easy Vector(Promega，美國(guó))，得到重組克隆載體pT-DNase-h1。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。選取抗Amp+的陽(yáng)性克隆，提取重組的克隆載體并進(jìn)行酶切鑒定。并對(duì)所得含有插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序，確證在PCR過(guò)程中目的基因片段未發(fā)生變異或出現(xiàn)差錯(cuò)。測(cè)序所用的方法為雙脫氧終止法。確認(rèn)所插入的基因片段長(zhǎng)度為849bp，為人胰腺DNase I基因(包括信號(hào)肽序列)。實(shí)施例2牛胰腺DNase的克隆根據(jù)已公布的牛胰腺DNase的基因序列(SEQ ID NO.2，編碼區(qū)位于核苷酸序列的27-812位，SEQ ID NO.4為氨基酸序列)(Worrall和Connolly，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26521889，1990)設(shè)計(jì)牛DNase I引物5′正向引物5′-GCAGCCTTCAACATCCGCACCTTTGGGGAG-3′3′反向引物5′-GCTCGTACGCAGGCGGATGGATGACCACTG-3′取冷凍牛胰，采用RNeasy Midi系統(tǒng)(Qiagen，美國(guó))從胰腺中提取總RNA。再用Oligotex mRNA系統(tǒng)(Qiagen，美國(guó))純化mRNA。為了得到用于RACE-PCR克隆技術(shù)的人胰或牛胰cDNA庫(kù)，還必須在每個(gè)cDNA的5′末端加上一個(gè)特定的連接子，應(yīng)用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，美國(guó))得到了人胰或牛胰的帶有特定連接子的cDNA庫(kù)。然后用設(shè)計(jì)合成的5′正向引物和3′反向引物及連接子引物(Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒，Clontech)，采用快速擴(kuò)增cDNA末端法(RACE-PCR)擴(kuò)增基因，PCR反應(yīng)條件為95℃變性1分鐘，55C退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)3分鐘。進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。然后72℃保持7分鐘。4℃保存。分別得到DNase I3′RACE片段和5′RACE片段。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)片段的存在和大小后，分別與pGEM-T EasyVector(Promega，美國(guó))連接。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。選取抗Amp+的陽(yáng)性克隆，提取重組的克隆載體并進(jìn)行酶切鑒定。并對(duì)所得含有插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序，確證在PCR過(guò)程中目的基因片段的存在且未發(fā)生變異或出現(xiàn)差錯(cuò)。提取分別含DNase I5′片段和3′片段的兩個(gè)重組T載體，用Nco I和Eco47 III切割DNase I的3′片段，用EcoR I和Eco47 III切割DNase I的5′片段。然后用QiaquickGel Extraction(Qiagen)純化酶切的兩個(gè)片段，用DNA連接酶連接兩個(gè)片段，得到全長(zhǎng)序列DNase I基因。然后用T4DNA連接酶連接從瓊脂糖凝膠電泳回收并純化的全長(zhǎng)DNase基因片段和用Nco I和EcoR I切割過(guò)的pGEM-T Easy Vector(Promega，美國(guó))，得到重組克隆載體pT-DNase-b1。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。選取抗Amp+的陽(yáng)性克隆，提取重組的克隆載體并進(jìn)行酶切鑒定。并對(duì)所得含有插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序，確證在PCR過(guò)程中目的基因片段未發(fā)生變異或出現(xiàn)差錯(cuò)。測(cè)序所用的方法為雙脫氧終止法。確認(rèn)所插入的基因片段長(zhǎng)度為786 bp，為牛胰腺DNase I基因。實(shí)施例3含有人DNase I編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)人DNase I的基因序列和加入的內(nèi)切酶序列Nde I(5′引物)和Xho I(3′引物)設(shè)計(jì)引物5′正向引物5′-CATATGACTGCAGGTGCCGTGTCC-3′3′反向引物5′-CTCGAGTCACTTCAGCATCACCTCCACTGG-3′從pT-DNase-b1中用PCR法擴(kuò)增DNase I基因，用1％瓊脂糖凝膠電泳回收純化DNase I基因片段，然后將DNase I基因片段與pGEM-TEasy Vector(Promega，美國(guó))連接，得到重組質(zhì)粒pT-DNase-h2。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。提取pT-DNase-h2，用內(nèi)切酶Nde I和Xho I酶切，再用1％瓊脂糖凝膠電泳回收純化DNase I基因片段。然后用T4 DNA連接酶將人DNase I基因片段與Nde I和Xho切割后的表達(dá)載體pBGI-2連接。所述表達(dá)載體pBGI-2是通過(guò)利用SphI和HpaI(Promega，美國(guó))以廠商推薦的條件將pET28表達(dá)載體(Novagen，美國(guó))中598-1629位核苷酸切除后重新連接獲得的，由此破壞了其中的lac I基因。pBGI-2表達(dá)載體除含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T7終止子外，還含有f1復(fù)制起點(diǎn)、卡那霉素抗性基因(Kan+)和His標(biāo)簽的編碼序列。將DNase基因與載體用T4DNA連接酶連接后，得到重組表達(dá)載體pBGI-2-hDNase。hDNase I表示人DNase I基因。CaCl2法轉(zhuǎn)化T7 RNA聚合酶基因缺陷的宿主菌如大腸桿菌JM109。經(jīng)Kan+抗性篩選，獲得陽(yáng)性克隆。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和活性鑒定。實(shí)施例4含有牛DNase I編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)牛DNase I的基因序列和加入的內(nèi)切酶序列Nde I(5′引物)和Xho I(3′引物)設(shè)計(jì)引物5′正向引物5′-CATATGAGGGGCACCAGGCTGATG-3′3′反向引物5′-CTCGAGTTATGTCAGCGTCACCTCCACCGG-3′從pT-DNase-b1中用PCR法擴(kuò)增DNase I基因，用1％瓊脂糖凝膠電泳回收純化DNase I基因片段，然后將DNase I基因片段與pGEM-TEasy Vector(Promega，美國(guó))連接，得到重組質(zhì)粒pT-DNase-b2。用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化克隆載體大腸桿菌DH5α。提取pT-DNase-b2，用內(nèi)切酶Nde I和Xho I酶切，再用1％瓊脂糖凝膠電泳回收純化DNase I基因片段。然后用T4 DNA連接酶將牛DNase I基因片段與Nde I和Xho切割后的表達(dá)載體pBGI-2連接。所述表達(dá)載體pBGI-2是通過(guò)利用SphI和HpaI(Promega，美國(guó))以廠商推薦的條件將pET28表達(dá)載體(Novagen，美國(guó))中598-1629位核苷酸切除后重新連接獲得的，由此破壞了其中的lac I基因。pBGI-2表達(dá)載體除含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T7終止子外，還含有f1復(fù)制起點(diǎn)、卡那霉素抗性基因(Kan+)和His標(biāo)簽的編碼序列。將DNase基因與載體用T4DNA連接酶連接后，得到重組表達(dá)載體pBGI-2-bDNase。bDNase I表示牛DNase I基因。CaCl2法轉(zhuǎn)化T7 RNA聚合酶基因缺陷的宿主菌如大腸桿菌JM109。經(jīng)Kan+抗性篩選，獲得陽(yáng)性克隆。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和活性鑒定。實(shí)施例5DNase I的誘導(dǎo)表達(dá)及初步純化挑取經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和DNase I活性鑒定為DNase I高表達(dá)的重組菌落，接入含有10-50μg/ml卡那霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，37℃下280轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過(guò)夜。以1％的接種量接入含有卡那霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。當(dāng)重組菌培養(yǎng)液的O.D.600為0.6時(shí)，加入1ml的1M MgSO4、1ml的20％的麥芽糖(配制時(shí)需用0.45μm濾膜濾菌)和2ml準(zhǔn)備好的λCE6噬菌體菌液進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)5個(gè)小時(shí)，直至有溶菌現(xiàn)象出現(xiàn)(O.D.值明顯下降)。
將誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)液4℃、5,000g離心10分鐘收集細(xì)胞，將上清液調(diào)pH和離子強(qiáng)度至與層析平衡緩沖液相同或很相近后備用。加入下步層析的平衡緩沖液，如下步是金屬螯和層析則用4℃預(yù)冷的10ml上樣緩沖液(5mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris-HCl，pH＝7.9)懸浮細(xì)胞，冰浴超聲破碎(JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科器研究所)，超聲破碎的條件是400W、工作時(shí)間8秒、間歇時(shí)間10秒、80個(gè)循環(huán)。4℃、10,000g離心20分鐘，收集上清液，并與調(diào)過(guò)離子強(qiáng)度和pH值的細(xì)胞培養(yǎng)上清液合并，即可準(zhǔn)備用層析純化。如實(shí)施例9所述用Kunitz法測(cè)定合并液的DNase I活性，人DNase I的表達(dá)量為2.06×105Kunitz Unit/每升發(fā)酵液，牛DNase I的表達(dá)量為2.6×105Kunitz Unit/每升發(fā)酵液。
λCE6噬菌體菌液的制備方法如下將LE392(一種帶有hdsR514(rk-mk+)基因型的大腸桿菌菌株)接種于含0.2％麥芽糖和10mMMgSO4的LB培養(yǎng)基中，37℃，280轉(zhuǎn)/分直至O.D.＝1.0。取5ml菌液加入2×108的λCE6噬菌體(購(gòu)自Novagen公司)并混合。37℃下保溫15分鐘(不能搖動(dòng))。將以上宿主/噬菌體混合液加入500ml含10mMMgSO4的LB培養(yǎng)基中，37℃，250轉(zhuǎn)/分直至溶菌現(xiàn)象發(fā)生。加入5ml氯仿并且再搖10分鐘。4℃、10,000g離心10分鐘，仔細(xì)移出上清液，加入DMSO至終濃度7％。實(shí)施例6金屬鏊合層析對(duì)粗品DNase I的純化分離純化帶有His標(biāo)簽的DNase I可采用金屬鏊合層析方法。層析介質(zhì)為瑞典安法碼西亞生物技術(shù)公司的Chelating SepharoseTMFastFlow，層析設(shè)備為AKTA Purifier(Pharmacia Biotech AB，瑞典)。
用3倍柱體積的無(wú)菌水預(yù)平衡填裝好的層析柱，再用五倍柱體積的Charging Buffer(50mM NiSO4)平衡層析柱，然后用3倍柱體積的Binding Buffer(5mM咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)平衡層析柱。實(shí)施例2中細(xì)胞超聲破碎后離心的上清和調(diào)過(guò)離子強(qiáng)度和pH值的細(xì)胞培養(yǎng)上清液為上樣樣品，流速30cm/小時(shí)。上樣后，用10倍柱體積的Binding Buffer淋洗，然后用6倍柱體積的WashingBuffer(20mM咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)除去結(jié)合弱的雜蛋白。用6倍柱體積的Elute Buffer(0.5M咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)，收集洗脫峰，即得表達(dá)蛋白DNase I。最后用6倍柱體積Strip Buffer(10mM EDTA、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)脫去Ni2+，用20％乙醇平衡后4℃保存。當(dāng)層析時(shí)流速明顯減低或?qū)游鼋橘|(zhì)經(jīng)填充Ni2+后卻不再顯藍(lán)綠色時(shí)，柱子需再生。經(jīng)金屬鏊合層析純化的DNase I的純度大于85％?；厥章蚀笥?7％。實(shí)施例7凝膠過(guò)濾層析對(duì)DNase I的精制將凝膠過(guò)濾層析柱Supredex 75 HR 10/30(瑞典安法瑪西亞生物技術(shù)公司)用酶制劑溶液(150mM NaCl和10mM Ca2+，pH7.0)充分進(jìn)行平衡，將經(jīng)金屬螯合層析純化的人或牛DNase I按小于層析柱柱體積5％的上樣，流速為30cm/小時(shí)，上樣后繼續(xù)用酶制劑溶液洗脫，收集DNase活性峰。本步層析回收率大于95％。經(jīng)金屬鏊合層析和凝膠過(guò)濾層析純化的重組人DNase I的比活為3200u/mg，純化的重組牛DNase I的比活為4000u/mg，純度均大于95％。實(shí)施例8DNase I的PEG修飾溶解5克甲氧基聚乙二醇(mPEG)或在聚乙二醇(PEG)在25毫升無(wú)水二氧己環(huán)中。攪拌加入6mmol溶解于10ml無(wú)水丙酮中的N-琥珀酰亞胺氯甲酸酯或N，N-N-二琥珀酰亞胺碳酸酯。再加入6mmol溶解于無(wú)水丙酮中的4-二甲基氨基吡啶。繼續(xù)攪拌反應(yīng)2或6小時(shí)。過(guò)濾除沉淀，收集上清。加入二乙基乙酯，得到琥珀酰亞胺碳酸酯化的聚乙二醇(SC-PEG)。將經(jīng)純化的重組牛DNase I或人DNase I溶解于0.1M，pH7.5的磷酸鹽緩沖液，濃度為1-10mg/ml。攪拌中加入SC-PEG，過(guò)夜反應(yīng)，即得到PEG化的DNase I。經(jīng)凝膠過(guò)濾層析Superdex 75 HR選擇具有一定修飾度的PEG-DNase I。實(shí)施例9DNase I的活性鑒定(Kunitz，M，1950.普通生理學(xué)雜志(J.Gen.Physiol.)33349-362)。
將500μl2倍反應(yīng)緩沖液(8mM CaCl2、8mM MgCl2、20mM Tris-HCl，pH8.0)、10μl底物(50μg/ml的小牛胸腺DNA鈉鹽(SigmaD3664，美國(guó)))和440μl雙蒸水加入比色杯中，室溫下混勻。加入50μl待測(cè)樣品并快速混勻，迅速置入分光光度計(jì)中測(cè)260nm的光吸收值。以A260對(duì)時(shí)間作圖，得到活性曲線。DNase的活力單位的定義為利用如上所述反應(yīng)緩沖液和底物，在光程1cm及260nm條件下每分鐘使反應(yīng)物的A260增加0.001的DNase的量定義為1 Kunitz單位。實(shí)施例10DNase降低病人痰粘度的實(shí)驗(yàn)通過(guò)樣品的流動(dòng)性測(cè)試，分別對(duì)重組的人DNase I和重組牛DNaseI治療患有肺囊腫性纖維化病變的患者產(chǎn)生的膿痰的效果進(jìn)行了體外測(cè)試。100微升痰樣品在Eppendorf測(cè)試管中分別與10微升0.01mg/ml、比活為3200u/ml的重組人DNase I和10微升0.01mg/ml、比活為4000u/ml的重組人DNase I進(jìn)行了溫育。在37℃下經(jīng)過(guò)不同時(shí)間周期的溫育，顛倒試管，在0分(不流動(dòng))到5分(沿著管壁順暢的流動(dòng))的測(cè)量數(shù)值范圍內(nèi)對(duì)痰沿著測(cè)試管壁流下的能力進(jìn)行了評(píng)估。加入重組人DNase I的痰在10分鐘溫育后產(chǎn)生3-4分的結(jié)果。加入重組牛DNase I的痰在10分鐘溫育后產(chǎn)生4-5分的結(jié)果。未加入DNase I的痰未顯示出流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)證明純的不含蛋白酶的重組DNase I能夠迅速降解含膿的痰。因此，純的DNA酶在降低痰的粘性方面是非常有效的。
序列表SEQ ID NO.11 tcctgcacag gcagtgcctt gaagtgcttc ttcagagacc tttcttcata gactactttt61 ttttctttaa gcagcaaaag gagaaaattg tcatcaaagg atattccaga ttcttgacag121 cattctcgtc atctctgagg acatcaccat catctcagga tgaggggcat gaagctgctg181 ggggcgctgc tggcactggc ggccctactg cagggggccg tgtccctgaa gatcgcagcc241 ttcaacatcc agacatttgg ggagaccaag atgtccaatg ccaccctcgt cagctacatt301 gtgcagatcc tgagccgcta tgacatcgcc ctggtccagg aggtcagaga cagccacctg361 actgccgtgg ggaagctgct ggacaacctc aatcaggatg caccagacac ctatcactac421 gtggtcagtg agccactggg acggaacagc tataaggagc gctacctgtt cgtgtacagg481 cctgaccagg tgtctgcggt ggacagctac tactacgatg atggctgcga gccctgcggg541 aacgacacct tcaaccgaga gccagccatt gtcaggttct tctcccggtt cacagaggtc601 agggagtttg ccattgttcc cctgcatgcg gccccggggg acgcagtagc cgagatcgac661 gctctctatg acgtctacct ggatgtccaa gagaaatggg gcttggagga cgtcatgttg721 atgggcgact tcaatgcggg ctgcagctat gtgagaccct cccagtggtc atccatccgc781 ctgtggacaa gccccacctt ccagtggctg atccccgaca gcgctgacac cacagctaca841 cccacgcact gtgcctatga caggatcgtg gttgcaggga tgctgctccg aggcgccgtt901 gttcccgact cggctcttcc ctttaacttc caggctgcct atggcctgag tgaccaactg961 gcccaagcca tcagtgacca ctatccagtg gaggtgatgc tgaagtgagc agcccctccc1021 cacaccagtt gaactgcagSEQ ID NO.21 aattcgattc ctaggaggtg agctctatgc ttaagatcgc tgctttcaac atacgtacct61 tcggtgaatc taaaatgtct aacgctacgc tagcatctta catcgtacgc atcgtacgcc121 gttacgatat cgttctgatc caggaagttc gcgactctca cctggttgca gttggtaaac181 ttctagacta cctgaaccag gacgacccga acacctacca ctacgttgtt tctgaacccc241 tcgggcgtaa ctcttacaaa gaacggtacc tgttcctgtt ccgtccgaac aaagtttcag301 tactggatac ctaccagtac gacgacggat gcgaatcttg cggtaacgac tctttctccc361 gggaaccggc tgttgttaaa ttctcgagcc actctaccaa ggttaaagag ttcgctatcg421 ttgctctgca cagcgcgccg tctgacgctg ttgctgaaat caactctctg tacgacgttt481 acctggacgt tcagcagaaa tggcacctga acgacgtcat gctgatgggt gacttcaacg541 ctgactgctc ttatgtaacc tcttctcagt ggtcatcgat tcgtctgcgc acctcgtcga601 ccttccagtg gctgatcccg gactccgctg acaccaccgc tactagtacc aactgcgctt661 acgaccgtat cgttgttgct ggatccctgc tgcagtcttc tgttgtaccg ggtagcgcgg721 ccccgttcga cttccaggct gcatatggtc tttcgaacga aatggcgctg gccatctctg781 atcactaccc ggttgaggta accctgacct aatagaSEQ ID NO.31 MRGMKLLGAL LALAALLQGA VSLKIAAFNIQTFGETKMSN ATLVSYIVQILSRYDIALVQ
61 EVRDSHLTAV GKLLDNLNQD APDTYHYVVS EPLGRNSYKE RYLFVYRPDQ VSAVDSYYYD121 DGCEPCGNDT FNREPAIVRF FSRFTEVREF AIVPLHAAPG DAVAEIDALY DVYLDVQEKW181 GLEDVMLMGD FNAGCSYVRP SQWSSIRLWT SPTFQWLIPD SADTTATPTH CAYDR1VVAG241 MLLRGAVVPD SALPFNFQAA YGLSDQLAQA ISDHYPVEVM LKSEQ ID NO.41 MLKIAAFNIR TFGESKMSNA TLASYIVRIV RRYDIVLIQE VRDSHLVAVG KLLDYLNQDD61 PNTYHYVVSE PLGRNSYKER YLFLFRPNKV SVLDTYQYDD GCESCGNDSF SREPAVVKFS121 SHSTKVKEFA IVALHSAPSD AVAEINSLYD VYLDVQQKWH LNDVMLMGDF NADCSYVTSS181 QWSSIRLRTS STFQWLIPDS ADTTATSTNC AYDRIVVAGS LLQSSVVPGS AAPFDFQAAY241 GLSNEMALAI SDHYPVEVTL T
權(quán)利要求
1.一種制備重組脫氧核糖核酸酶I活性多肽的方法，其包括(1)用含有編碼脫氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞；(2)在適于所選原核細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(3)在適于脫氧核糖核酸酶I表達(dá)的條件下誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶I；(4)從所得經(jīng)轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)液中回收脫氧核糖核酸酶I。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼脫氧核糖核酸酶I的核苷酸序列如SEQ ID NO1中核苷酸序列226-1008位或SEQ ID NO2中核苷酸序列27-812位所示。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述原核宿主細(xì)胞為T(mén)7 RNA聚合酶缺陷型大腸桿菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中從經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)脫氧核糖核酸酶I的大腸桿菌菌體和/或培養(yǎng)液中回收脫氧核糖核酸酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組表達(dá)載體中還含有T7啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述在所述宿主細(xì)胞中脫氧核糖核酸酶I的表達(dá)需要通過(guò)含有T7 RNA聚合酶基因并具有獨(dú)立表達(dá)T7 RNA聚合酶基因的啟動(dòng)子的噬菌體誘導(dǎo)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述噬菌體為λCE6噬菌體。
8.一種含有如權(quán)利要求1的方法制備的脫氧核糖核酸酶I的酶制劑。
9.權(quán)利要求8的酶制劑，其中所述脫氧核糖核酸酶I是水溶性的單體、PEG化修飾物或其它衍生物。
10.如權(quán)利要求1的方法制備的脫氧核糖核酸酶I用于制備治療呼吸系統(tǒng)疾病、減少患者痰的粘度、通暢呼吸道的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備具有生物學(xué)活性的重組脫氧核糖核酸酶I的方法,其包括(1)用含有編碼脫氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞;(2)在適于所選原核細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(3)在適于脫氧核糖核酸酶I表達(dá)的條件下使宿主細(xì)胞產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶I;(4)從所得大腸桿菌菌體和/或培養(yǎng)液中回收脫氧核糖核酸酶。由本發(fā)明方法所制備的脫氧核糖核酸酶I可用于制備治療呼吸系統(tǒng)疾病、減少患者痰的粘度、通暢呼吸道的藥物。
文檔編號(hào)C12N9/18GK1366042SQ0110165
公開(kāi)日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者劉斯奇, 馮小黎, 王超, 李寶華, 郝丕良, 任艷, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:北京華大基因研究中心