專(zhuān)利名稱(chēng)：D－泛解酸內(nèi)酯的微生物酶法制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用化學(xué)合成DL-泛解酸內(nèi)酯作底物，用微生物菌株串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902(即CGMCCNo.0536)發(fā)酵生產(chǎn)的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶，進(jìn)行酶水解拆分制造D-泛解酸內(nèi)酯的方法。
D-泛解酸內(nèi)酯(pantoyl laetone)是生產(chǎn)泛酸、泛醇以及泛酰巰基乙胺的重要中間體，它與β-丙氨酸反應(yīng)即得到泛酸。泛酸，Pantothenic acid，又稱(chēng)本多生酸、維生素B5、或B3，是一種重要的藥物、食品添加劑和飼料添加劑。其產(chǎn)品形式一般為其右旋體鈣鹽D-泛酸鈣。泛酸是維生素B族物質(zhì)，是輔酶A的組成部分，參與體內(nèi)脂肪酸降解、脂肪酸合成、檸檬酸循環(huán)、膽堿乙?；?一種神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)物質(zhì))、抗體的合成(促進(jìn)對(duì)病原體的抵抗力)等代謝，由于輔酶A的生理功能，泛酸的存在有利于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。臨床上泛酸用于治療一些疾病，與其他B族維生素一起用于補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，用于維生素B缺乏癥、周?chē)窠?jīng)炎、手術(shù)后腸梗阻、鏈霉素中毒及類(lèi)風(fēng)濕等。通常其鈣鹽與其他B族維生素一起用于補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。
泛酸鈣還是一種重要的飼料添加劑，現(xiàn)大量用于飼料工業(yè)。泛酸鈣作為維生素飼料添加劑，在畜禽養(yǎng)殖中具有重要的作用，供應(yīng)不足時(shí)會(huì)使畜禽出現(xiàn)各種代謝、神經(jīng)、腸胃等方面生理機(jī)能的紊亂。許多國(guó)家法定使用D-或DL-泛酸鈣，我國(guó)只批準(zhǔn)使用D-型。生產(chǎn)D-泛酸的中間體泛解酸內(nèi)酯則要求是具有較高光學(xué)純度的D-構(gòu)型。
D-泛醇(維生素原B5)，是重要的化妝品和藥用原料，市場(chǎng)緊缺。D-泛醇的生產(chǎn)不能采用鈣鹽誘導(dǎo)結(jié)晶法，生物拆分法制備D-泛解酸內(nèi)酯更有實(shí)際意義。
D-泛解酸內(nèi)酯的制備方法有以下幾種1，化學(xué)方法拆分，如用奎寧化合物、二甲馬錢(qián)子堿或手性胺等拆分劑拆分泛解酸內(nèi)酯，化學(xué)拆分法的缺點(diǎn)是拆分劑太貴，成本高，分離困難，還有環(huán)境污染和毒性問(wèn)題；2，物理方法拆分，如用誘導(dǎo)結(jié)晶法直接拆分DL-泛酸鈣生產(chǎn)D-泛酸鈣，條件控制要求高，收率低，光學(xué)純度差，成本高，只能用于D-泛酸鈣的生產(chǎn)，而不適合D-泛醇等其它衍生物的生產(chǎn)；3，生物法拆分主要有酶法，微生物法。已報(bào)道的研究有多種技術(shù)路線(xiàn)。如①用微生物徹底降解DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-泛解酸內(nèi)酯，得到未分解的D-構(gòu)型泛解酸內(nèi)酯。(JPA 47-19745)。此方法的缺點(diǎn)是至少損失一半DL-泛解酸內(nèi)酯原料；②用微生物氧化DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-構(gòu)型泛解酸內(nèi)酯成酮基泛解酸內(nèi)酯，再不對(duì)稱(chēng)還原轉(zhuǎn)化為D-泛解酸內(nèi)酯。(JPA 61-293386、JPA 47-19745、JPB 61-14797)。由于基質(zhì)濃度低、反應(yīng)速率低，幾乎沒(méi)有實(shí)際意義；③用微生物選擇性地不對(duì)稱(chēng)水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-泛解酸內(nèi)酯，而得到未水解的D-泛解酸內(nèi)酯。(JPA 57-152895)。也由于基質(zhì)濃度低、反應(yīng)速率低，幾乎沒(méi)有實(shí)際意義，并且只有L-構(gòu)型的內(nèi)酯水解的非常徹底才能得到高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯；④用微生物選擇性地不對(duì)稱(chēng)水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，得到D-泛解酸，用高光學(xué)純度的D-泛解酸進(jìn)行內(nèi)酯化生成D-泛解酸內(nèi)酯，(USPatent 5,275,949,1994；US Patent 5,372,940,1994)，此法為日本FuJi公司(發(fā)明人為日本京都大學(xué)的Sakamoto Keiji等)申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利，已在日本第一制藥公司用于工業(yè)生產(chǎn)。但該法的缺點(diǎn)是菌體酶培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，需要7天，培養(yǎng)的菌體只進(jìn)行一次酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌體利用率低，酶成本高。
還有一些其他酶法、微生物法拆分的報(bào)道，如脂肪酶或酰氨酶水解泛酸酯或泛酸酰氨(JP-A 1-228487,JP-A 1-228488)、用微生物將DL-泛解酸中的D-泛解酸與β-丙氨酸選擇性地合成生成D-泛酸(JP-A 5-23191)、用羥腈水解酶(氧腈酶)的醛醇的不對(duì)稱(chēng)氰醇化路線(xiàn)(Adam,G.,and Seebach,D.,Synthesis,373,1988)等。均由于收率低、產(chǎn)物光學(xué)純度低而缺乏實(shí)用意義。
另外，1996年，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社在中國(guó)申請(qǐng)了“生產(chǎn)D-泛酸鈣的方法”的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?6194779，公告號(hào)1187854)，最近又陸續(xù)有日本和美國(guó)專(zhuān)利(JP-A 6-261772,U S Patent 5,932,457,1999；US Patent 6,013,492,2000)，通過(guò)微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)D-泛酸。他們篩選了能直接發(fā)酵葡萄糖生成D-泛解酸，在發(fā)酵液中添加β-丙氨酸，就可直接得到D-泛酸。但是由于發(fā)酵液組分復(fù)雜，特別是有大約10％的單糖和寡糖，很難用離交、結(jié)晶等方法去除，濃縮、結(jié)晶時(shí)由于粘，操作困難，溶劑消耗大，產(chǎn)品顏色深，提取收率低，規(guī)模性生產(chǎn)放大有困難。
本發(fā)明采用微生物不對(duì)稱(chēng)水解DL-泛解酸內(nèi)酯方法得到D-泛解酸，再經(jīng)過(guò)內(nèi)酯化反應(yīng)生成D-泛解酸內(nèi)酯的方法。與不對(duì)稱(chēng)水解L-泛解酸內(nèi)酯得到未水解D-泛解酸內(nèi)酯法相比，很符合實(shí)用性要求。
若用L-立體專(zhuān)一性?xún)?nèi)酯水解酶水解，將L-泛解酸內(nèi)酯水解為L(zhǎng)-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸內(nèi)酯。但由于要求酶水解必須徹底，方能保證產(chǎn)品的光學(xué)純度。這樣，對(duì)酶及其酶解條件要求很高，反應(yīng)時(shí)間也長(zhǎng)，還可能因長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)帶來(lái)化學(xué)水解引起其他雜質(zhì)。
本發(fā)明用D-立體專(zhuān)一性?xún)?nèi)酯水解酶水解D-泛解酸內(nèi)酯，不要求水解徹底，反應(yīng)時(shí)間短，未水解部分經(jīng)過(guò)消旋化可反復(fù)使用。所篩選得到的微生物酶的立體專(zhuān)一性好(即不水解L-泛解酸內(nèi)酯)，可得到很高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯。
產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌株主要有鐮孢霉菌Fusarium，赤霉菌Gibberella，粘帚霉屬Gliocladium，黑曲霉屬Aspergillus，以及Cylindrocarpon.Volutella等。本發(fā)明篩選并誘變得到了能高產(chǎn)立體專(zhuān)一性D-泛解酸內(nèi)酯水解酶、且不利用不降解泛解酸內(nèi)酯或泛解酸的微生物菌株串珠鐮孢霉菌Fusariummoniliforme.SW-902。
本發(fā)明采用的工藝路線(xiàn)與日本FuJi公司申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利(對(duì)照文獻(xiàn)USPatent 5,275,949,1994；US Patent 5,372,940,1994)相同，但所用的菌株為鐮孢霉屬中的串珠鐮孢霉(稻惡苗霉)Fusarium.moniliforme(SW-902)，屬于赤霉組[Lisola]，此菌能發(fā)酵產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素赤霉素，不引致植物枯腐或蔫萎病(但易引起水稻等植物徒長(zhǎng))。而對(duì)照文獻(xiàn)用的是鐮孢霉屬中的尖鐮孢霉Fusariumoxysporum，屬于綺麗鐮孢霉組[Elegans]，該菌種一般都會(huì)引致植物葉枯、根腐或蔫萎病，是一種植物致病菌，它排放、擴(kuò)散后會(huì)對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生危害(對(duì)照文獻(xiàn)未說(shuō)明)。本發(fā)明所篩選的菌種，是發(fā)酵產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素赤霉素的工業(yè)生產(chǎn)用菌種，它用于本項(xiàng)發(fā)明的產(chǎn)品生產(chǎn)則無(wú)此顧慮。本發(fā)明目前達(dá)到的水平為產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間2～3天；酶一次性轉(zhuǎn)化率25～45％；對(duì)底物總轉(zhuǎn)化率7～90％；酶轉(zhuǎn)化時(shí)間短(5～30小時(shí))，酶可反復(fù)利用多次(6次以上)；用卡拉膠進(jìn)行固定化后，反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化可達(dá)10次以上；對(duì)產(chǎn)物提取收率60％以上；D-泛解酸內(nèi)酯主要質(zhì)量指標(biāo)比旋光[α]D20為-48～51°，光學(xué)純度為99(％e.e)。部分指標(biāo)略?xún)?yōu)于對(duì)照文獻(xiàn)所報(bào)道的水平(產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間5～7天；酶一次性轉(zhuǎn)化率25～30％；酶轉(zhuǎn)化時(shí)間2～3天，酶利用1次；D-泛解酸內(nèi)酯主要質(zhì)量指標(biāo)比旋光[α]D20為-45.6°，光學(xué)純度為91～98％e.e)。
本發(fā)明的目的提供一種高產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解的微生物新菌株，提供一種新的微生物酶法拆分制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法。所得到的酶水解產(chǎn)物中D-泛解酸經(jīng)內(nèi)酯化后提取的D-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)純度達(dá)到99％e.e.以上，滿(mǎn)足D-泛酸鈣及D-泛醇生產(chǎn)中間體的質(zhì)量要求。
本發(fā)明通過(guò)下列方案來(lái)實(shí)現(xiàn)(1)本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室選育并保藏的能高產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌株串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902-CGMCCNo.0536(此菌株已于2001年2月12日保存在中國(guó)北京中關(guān)村中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心)，作為產(chǎn)酶菌株；(2)菌株經(jīng)斜面活化，發(fā)酵產(chǎn)酶，用其濕菌體或其固定化細(xì)胞為酶制劑，作為酶源；(3)以異丁醛為原料，采用甲醛法，氰化鈉路線(xiàn)合成，生產(chǎn)DL-泛解酸內(nèi)酯，精制后作為酶轉(zhuǎn)化底物；(4)將(2)的酶制劑加入(3)的底物中，酶轉(zhuǎn)化生成的D-泛解酸，經(jīng)內(nèi)酯化，溶劑萃取、脫色、濃縮、結(jié)晶，制成D-泛解酸內(nèi)酯。
菌種及其誘變從發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中收集和本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保藏的微生物菌株中，經(jīng)初篩、復(fù)篩及分離純化，獲得一株產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的鐮孢霉菌Fusariumsp.SW-9，該菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定，立體選擇性好，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上搖瓶發(fā)酵的菌絲體作酶源，水解D-泛解酸內(nèi)酯得到的D-泛解酸，經(jīng)內(nèi)酯化后提取得到的D-泛解酸內(nèi)酯光學(xué)純度高，[α]D20=-47°。本方法以該菌作為產(chǎn)酶菌株。
選擇Fusarium sp.SW-9為菌株，按常規(guī)方法進(jìn)行紫外線(xiàn)、Co-60誘變處理。紫外線(xiàn)照射為15W，距離27cm，時(shí)間2～3分鐘Co-60照射為劑量2～8萬(wàn)倫琴，時(shí)間為20～30分鐘。經(jīng)處理的菌絲體移種到含DL-泛解酸內(nèi)酯和DL-泛解酸的基本培養(yǎng)基及完全培養(yǎng)基上，20～40℃培養(yǎng)3～7天，檢出在含DL-泛解酸內(nèi)酯和DL-泛解酸的基本培養(yǎng)基不長(zhǎng)，在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。與此同時(shí)，將上述誘變和篩選的菌絲體移種到含D-泛解酸內(nèi)酯和指示劑的篩選培養(yǎng)基上，20～40℃培養(yǎng)3～7天，檢出變色圈大的生長(zhǎng)菌落。
含DL-泛解酸內(nèi)酯和DL-泛解酸的基本培養(yǎng)基包含Na2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、維生素、微量元素溶液和瓊脂諸組分。
經(jīng)誘變獲得的菌株稱(chēng)為Fusarium sp.SW-902，即CGMCC No.0536。該誘變株與親株相比，外觀(guān)形態(tài)一致，但在含DL-泛解酸內(nèi)酯和DL-泛解酸的基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，不分解DL-泛解酸內(nèi)酯和DL-泛解酸，并且其產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間從7天縮短到2～3天，產(chǎn)酶活力提高了25％，酶轉(zhuǎn)化所需的時(shí)間也從24～48小時(shí)縮短到5～6小時(shí)。該菌株以保存號(hào)CGMCC No.0536保存在中國(guó)北京中關(guān)村中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心。
菌種初步鑒定結(jié)果觀(guān)察了該菌的外貌、生長(zhǎng)形態(tài)、觀(guān)察了它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在馬鈴薯或米飯培養(yǎng)基上，產(chǎn)生大量氣菌絲呈棉絮狀，菌絲在培養(yǎng)基中不產(chǎn)生色素，未見(jiàn)子囊，有性孢子不詳。未見(jiàn)鐮刀形大型孢子。在液體培養(yǎng)基中菌體為絲狀體，有隔膜，有較多小型孢子，多數(shù)孢子單細(xì)胞，圓形，單生，未見(jiàn)串生。此菌能發(fā)酵產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素赤霉素，不引致植物枯腐或蔫萎病。對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》(魏景超遺著，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979，上海p609～638)，按渥侖韋柏和萊因欽(Wollenweber & Reinking)的分類(lèi)系統(tǒng)，我們初步認(rèn)為應(yīng)屬于鐮孢霉屬中的稻惡苗霉Fusarium.moniliforme，屬于赤霉組[Lisola]，擬命名為串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902。
產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖1～10％，馬鈴薯浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％,pH6～9的培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養(yǎng)3～7天。產(chǎn)酶培養(yǎng)配制含丙三醇1～10％，蛋白胨0.5～5％，酵母膏0.5～5％，玉米漿0.5～5％,pH6～9的培養(yǎng)基，裝液量20～200ml/500ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％,20～40℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～220r/min。在上述條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)3-7天，產(chǎn)酶可達(dá)4U/l(1.0U/g干菌體)以上。
D-泛解酸內(nèi)酯水解酶酶活測(cè)定方法取10ml發(fā)酵液，濾取菌絲體，向菌體中加入2％泛解酸內(nèi)酯2.5ml,CaCl250mmol和pH7.5,0.2mol/LTris-HCl緩沖液，28℃,150r/min搖床反應(yīng)30min，抽濾除去菌體，反應(yīng)液用高壓液相色譜分析(HPLC)測(cè)定D-泛解酸。酶活力單位定義在上述條件下，每分鐘水解D-泛解酸內(nèi)酯成D-泛解酸的μmol量的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位(U)。
泛解酸內(nèi)酯和泛解酸的HPLC測(cè)定柱型為ZORBAX SB C185μM 250×4.6mm，流動(dòng)相為乙腈∶KH2PO4(0.02mol/L)=1∶9，用HCl調(diào)pH為3，流速為1ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。
酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)培養(yǎng)后的菌絲體作為酶源，以DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，底物濃度為1～70％，加酶量為0.1～5U/g底物，酶反應(yīng)溫度為20～40℃，酶解時(shí)間為3～30小時(shí)。在此條件下所得的DL-泛解酸內(nèi)酯酶解液進(jìn)行高壓液相色譜分析及比旋光測(cè)定表明，已酶解的主要組分為D-泛解酸。
或者，發(fā)酵產(chǎn)得濕菌絲體，用生理鹽水制成菌絲體懸液，與4～6％,1～5倍量卡拉膠溶液在35℃～60℃下混勻，冷卻后加KCl溶液硬化制得固定化細(xì)胞。以此作為酶源進(jìn)行酶水解。除了卡拉膠作為固定化載體包埋外，還可以用海藻酸鈣、明膠、幾丁質(zhì)等載體包埋的方法。固定化細(xì)胞可反復(fù)回用，進(jìn)行多次酶水解反應(yīng)。
D-泛解酸內(nèi)酯的提取及精制酶水解后所得的酶解液清液，主要成分為L(zhǎng)-泛解酸內(nèi)酯及D-泛解酸，還有未轉(zhuǎn)化的D-泛解酸內(nèi)酯，還含有一些無(wú)機(jī)鹽雜質(zhì)及較深的顏色，可以先用適當(dāng)溶劑萃取去除L-泛解酸內(nèi)酯及未轉(zhuǎn)化的D-泛解酸內(nèi)酯，分離出已轉(zhuǎn)化的D-泛解酸，進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)后，再用適當(dāng)溶劑萃取提取，并進(jìn)行脫鹽和脫色處理，或重結(jié)晶方法來(lái)加以精制，從而得到高純度、高質(zhì)量的D-泛解酸內(nèi)酯產(chǎn)品。
本發(fā)明的工藝流程示意圖見(jiàn)附


圖1。
本發(fā)明克服了誘導(dǎo)結(jié)晶法直接拆分DL-泛酸鈣收率低，光學(xué)純度差，成本高，只能用于D-泛酸鈣生產(chǎn)的局限，克服了化學(xué)拆分法拆分劑貴，成本高，分離困難，有污染和毒性問(wèn)題等缺點(diǎn)。對(duì)其它酶法或發(fā)酵法的缺點(diǎn)，如基質(zhì)濃度低、反應(yīng)速率低、產(chǎn)物光學(xué)純度低等有所改善。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是選育了一株能高產(chǎn)立體專(zhuān)一性D-泛解酸內(nèi)酯水解酶、不利用不降解泛解酸內(nèi)酯或泛解酸的微生物菌株串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme.SW-902-CGMCC No 0536，而且，產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間短(3天)，酶轉(zhuǎn)化時(shí)間短(5～10小時(shí))，酶可反復(fù)利用多次(6次以上)。提供了一種工藝簡(jiǎn)單的微生物酶法拆分制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法。所得到的酶水解產(chǎn)物D-泛解酸經(jīng)內(nèi)酯化后提取得到的D-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)純度達(dá)到99％e.e.以上，可滿(mǎn)足D-泛酸鈣或D-泛醇生產(chǎn)中間體的質(zhì)量要求。
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為馬鈴薯浸汁(20％)100ml，葡萄糖2g，瓊脂2g,pH6.5，加水至1000ml,121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliforme SW-902-CGMCC No.0536,25℃培養(yǎng)5天，作為斜面活化種子。
產(chǎn)酶培養(yǎng)培養(yǎng)基為丙三醇3％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，玉米漿0.5％，pH6.0，裝液量為500ml三角瓶裝液100ml,121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，28℃培養(yǎng)3-7天，作為發(fā)酵酶液。
搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果如下(表1)。由表1可見(jiàn)，培養(yǎng)時(shí)間3天，酶活達(dá)到最高值，以后幾天酶活基本維持恒定。
表1搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果
平均菌體濕重/菌體干重=9.69實(shí)施例2由化學(xué)合成制備的DL-泛解酸內(nèi)酯，用含50mmolCaCl2的水溶液配制成30％濃度為底物；加按實(shí)例1方法制備的濕菌體(D-泛解酸內(nèi)酯水解酶)，加酶量為0.3U/g泛解酸內(nèi)酯，置搖床28℃,150r/min反應(yīng)，每20min取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析及比旋光測(cè)定，并用濃氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為7.0。酶解時(shí)間為5～10小時(shí)。將反應(yīng)結(jié)束后濾出的菌絲體，加入新的反應(yīng)底物繼續(xù)反應(yīng)，如此反復(fù)，重復(fù)利用6次。得到酶水解結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，5～30小時(shí)酶水解后，得到的酶轉(zhuǎn)化率為38％左右，經(jīng)內(nèi)酯化后萃取的產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的比旋光度為[α]D20=-47°。菌體使用6次后，酶轉(zhuǎn)化率仍然沒(méi)有明顯的下降。結(jié)果如表2所示表2反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化結(jié)果
實(shí)施例3按實(shí)例1方法，發(fā)酵產(chǎn)酶。得濕菌絲體100g，加100ml生理鹽水制成菌絲體懸液，30℃保溫；另稱(chēng)取20g卡拉膠，加400ml生理鹽水，加熱溶解后，冷卻到55℃保溫。兩者在50℃以下混勻，倒入平皿，冷卻，加KCl溶液，放冰箱中硬化3hr，稱(chēng)重得約500g固定化細(xì)胞。將此固定化細(xì)胞，按實(shí)例2方法酶水解。反復(fù)分批酶水解10次結(jié)果見(jiàn)表3。
表3固定化細(xì)胞反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化結(jié)果
實(shí)施例4按實(shí)施例2的方法，配制濃度為30％的DL-泛解酸內(nèi)酯底物，加按實(shí)例1方法制備的濕菌體(D-泛解酸內(nèi)酯水解酶)，按實(shí)施例2的方法酶水解。所得的酶解液100ml過(guò)濾所得的清液，用體積比為1∶1～2的二氯甲烷萃取3次，分離出水相，其中主要含已轉(zhuǎn)化的D-泛解酸。水相用HCl調(diào)pH為1進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)后，再用二氯甲烷萃取提取，有機(jī)相進(jìn)行蒸發(fā)回收溶劑，得到D-泛解酸內(nèi)酯粗品12.5g，粗品得率41.67％(對(duì)DL-泛解酸內(nèi)酯計(jì))，測(cè)定比旋光為[α]D20=-48°。粗品用丙酮/異丙醚重結(jié)晶，得D-泛解酸內(nèi)酯純品10.5g，重結(jié)晶收率84％，對(duì)DL-泛解酸內(nèi)酯得率35％，產(chǎn)品比旋光為[α ]D20=-51°，HPLC測(cè)定D-泛解酸內(nèi)酯光學(xué)純度為99％e.e.。
收集L-泛解酸內(nèi)酯及未轉(zhuǎn)化的D-泛解酸內(nèi)酯，蒸發(fā)濃縮回收溶劑后，用NaOH溶液130℃加熱2小時(shí)，進(jìn)行消旋化反應(yīng)?；厥盏玫紻L-泛解酸內(nèi)酯17.8g，直接用于下次酶反應(yīng)。按此計(jì)算，得到的純品D-泛解酸內(nèi)酯對(duì)消耗DL-泛解酸內(nèi)酯底物(酶水解的D-泛解酸內(nèi)酯)的得率為86.07％。
實(shí)施例5按實(shí)例1方法，用15L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶。按實(shí)施例2的方法，配制濃度為30％的DL-泛解酸內(nèi)酯底物，加罐發(fā)酵制備的濕菌體(D-泛解酸內(nèi)酯水解酶)，按實(shí)施例2的方法，用15L反應(yīng)罐進(jìn)行酶水解，自動(dòng)加濃氨水調(diào)節(jié)pH值為6.9～7.0。按實(shí)例3方法進(jìn)行產(chǎn)物提取和未轉(zhuǎn)化底物回收。酶反復(fù)利用5次。結(jié)果為發(fā)酵時(shí)間2天，酶活達(dá)到1.02 U/g(干菌體)，菌體濕重42g/L,6次酶轉(zhuǎn)化平均酶轉(zhuǎn)化率為30.2％，粗品D-泛解酸內(nèi)酯的比旋光度為[α]D20=-47°，粗品對(duì)酶水解的D-泛解酸內(nèi)酯的提取得率90.5％。
權(quán)利要求
1．一種高產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌株，它是串珠鐮孢霉菌(Fusarium moniliforme)SW-902 CGMCC No:0536。
2．制造D-泛解酸內(nèi)酯的方法，包括(1)將權(quán)利要求1所述的菌株SW-902，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)酵，獲得濕菌體或用卡拉膠等載體固定化后做為酶制劑；(2)以異丁醛為原料，采用甲醛法，氰化鈉路線(xiàn)生產(chǎn)DL-泛解酯內(nèi)酯，精制后作為酶轉(zhuǎn)化底物；(3)將(1)的濕菌體或用卡拉膠等載體固定化后加入到(2)的底物反應(yīng)，生成D-泛解酸，經(jīng)內(nèi)酯化，制成D-泛解酸內(nèi)酯。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中底物濃度為1-70％，加酶量為0.1-5U/g底物，酶反應(yīng)溫度為20-50℃，酶解時(shí)間為5-30小時(shí)。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為丙三醇1-10％，蛋白胨0.5-5％，酵母膏0.5-5％，玉米漿0.5-5％,pH6-9，溫度20-40℃，培養(yǎng)2-7天。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物酶水解制造D－泛解酸內(nèi)酯的方法,該方法利用發(fā)明人篩選并保藏的能高產(chǎn)D－泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物菌株串珠鐮孢霉菌Fusariummoniliforme SW－902(即CGMCCNo.0536),在優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)酶,發(fā)酵液酶活達(dá)到3～6U/l,酶制劑0.5～1.5U/g(干菌體);游離酶或其固定化細(xì)胞用于DL－泛解酸內(nèi)酯水解,酶一次轉(zhuǎn)化率25～45%;對(duì)底物總轉(zhuǎn)化率70～90%;酶轉(zhuǎn)化液中的D－泛解酸內(nèi)酯化后得到的純品D－泛解酸內(nèi)酯對(duì)消耗DL－泛解酸內(nèi)酯底物的得率為86.07%;主要質(zhì)量指標(biāo)[α]
文檔編號(hào)C12P7/40GK1313402SQ01104070
公開(kāi)日2001年9月19日 申請(qǐng)日期2001年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者孫志浩 申請(qǐng)人:浙江鑫富生化股份有限公司