專利名稱：一種轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域和植物基因工程領(lǐng)域。
本發(fā)明的研究背景植物遺傳轉(zhuǎn)化(Genetic transformation)或稱轉(zhuǎn)化是指把外源核苷酸片段轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織，使其在受體細(xì)胞或再生植株中穩(wěn)定保留和表達(dá)，并通過有性或無性繁殖傳遞給后代。通過轉(zhuǎn)化，可把控制特定性狀的基因轉(zhuǎn)入現(xiàn)有植物品種，打破原有種屬的生殖障礙，大大縮短育種周期，創(chuàng)造出常規(guī)育種技術(shù)很難得到的新型優(yōu)良品種。
要成功地把外源基因引入某一植物，提高轉(zhuǎn)化頻率，就必須找到適合該種植物的最佳轉(zhuǎn)化方法。理想的植物轉(zhuǎn)化方法應(yīng)具備如下特點(diǎn)(1)DNA轉(zhuǎn)移效率高；(2)能以相當(dāng)高的頻率再生出可育植株；(3)基因型依賴性??；(4)程序簡單、高效、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)；(5)方便篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株；(6)組織培養(yǎng)需要的時間短或不經(jīng)過組織培養(yǎng)，以減少體細(xì)胞無性系變異的發(fā)生。
采用常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊法和原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化)能有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，但能否從所需的基因型再生大批量的轉(zhuǎn)基因植株則依賴于受體體系。因此，建立能夠不受基因型制約的高效轉(zhuǎn)基因受體體系，就是植物基因工程育種領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。
對植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究已有30多年的歷史。1980年代中期，隨著多種原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的成功，以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化工作得到迅速發(fā)展。在1980年代后期和1990年代初，用電激法、PEG誘導(dǎo)法等分別獲得了多種轉(zhuǎn)基因植株。選用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，雖具有操作簡單、轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生于單細(xì)胞克隆和協(xié)同轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，但由于原生質(zhì)體再生植株受基因型限制很大，因此很難用生產(chǎn)上所用的基因型為材料，也就因而導(dǎo)致該方法不能被普遍采用。
1985年，Horsch等(Horsch,R.B.等，1985,Science,227:1229-1231)首創(chuàng)由根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法(1eaf disc transformation)。該方法的意義在于(1)不必利用原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或愈傷組-織作為基因轉(zhuǎn)移的受體，可以直接用植物組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(2)建立了利用天然T-DNA從農(nóng)桿菌細(xì)胞向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移目的基因的簡便方法。
在此之后，不同植物組織的轉(zhuǎn)化研究相繼開展。分別以植物葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖、花莖、匍匐莖、塊莖、莖尖分生組織、芽根、塊根、合子胚或體細(xì)胞胚、甚至成熟種子等作外植體，都已成功獲得轉(zhuǎn)化組織或/和植株。由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法曾主要用于雙子葉植物(Hawes,M.C.等，1987,Plant Cell Rept.,6:287-290)。但伴隨著對T-DNA轉(zhuǎn)移機(jī)理的認(rèn)識，人們近年來在單子葉植物特別是禾谷類作物上做了大量研究，該技術(shù)已發(fā)展成為禾谷類作物轉(zhuǎn)化的主要技術(shù)。
1987年，康乃爾大學(xué)的研究者首先設(shè)計出一種基因槍，Sanford等(Wang,Y.-C.等,1988,Plant Mol.Biol.,11:433-439)用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞獲得成功。這一技術(shù)很快被用于禾谷類作物和豆科植物的遺傳轉(zhuǎn)化(Wang,YC.等,Plant Mol Biol,11:433-439)，主要受體材料為胚性愈傷組織。從1980年代末到1990年代中期，采用此種方法已在玉米、水稻、小麥及大豆等作物上獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而使禾谷類作物及難于用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化取得較大突破(Saito等，Europe Patent Application 672752)。
相對于直接轉(zhuǎn)化法來講，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)量和育性都較高，且外源基因整合入受體基因組更為精確(Hansen等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:11726-11730)，通常為單拷貝或低拷貝，并基本符合孟德爾遺傳定律；轉(zhuǎn)移的DNA片段具有特定末端，基因重排較小；可轉(zhuǎn)移大片段的DNA。因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化倍受重視。
在對于重要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化研究中，學(xué)者采用了多種方法，試圖建立理想的受體體系，但到目前為止，雖然已獲得了多種轉(zhuǎn)基因植株，但絕大多數(shù)農(nóng)用品種仍未建立起效率較高的轉(zhuǎn)基因體系。或者說，針對主要農(nóng)產(chǎn)品植物品種的轉(zhuǎn)化方法仍未得到有效建立。
用農(nóng)桿菌感染向日葵的研究早在1970年代就開始。1983年，Mrai等獲得了轉(zhuǎn)菜豆貯藏蛋白基因的向日葵愈傷組織。繼后，Matzke及Goldsbrough相繼用類似方法獲得了向日葵轉(zhuǎn)化細(xì)胞。1987年，Everett等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化向日葵，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。1992年，Bidney等取離體的向日葵頂端分生組織為受體，先用基因槍轟擊，再用農(nóng)桿菌感染，顯著提高了轉(zhuǎn)化頻率，但缺點(diǎn)是取材不便，技術(shù)難度大。由于向日葵多數(shù)品種不易從培養(yǎng)組織和細(xì)胞再生植株，因而建立新的轉(zhuǎn)化體系十分必要(Takeuchi,Y.等，1992,Plant Mol.Biol.,18:835-839)。
棉花易受農(nóng)桿菌感染，但組織和細(xì)胞培養(yǎng)難度大。1987年，F(xiàn)iroozabady等和Umbech等分別以棉花子葉和下胚軸為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NPTⅡ基因?qū)肱囵B(yǎng)細(xì)胞并獲得轉(zhuǎn)基因植株。1990年代初，轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉花進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)。1991年，McCabe等(McCabe,DE.等，1991,Ⅲ International Congress of Plant Mol.Biol.Tuscen,AZ)用基因槍轟擊棉花莖尖分生組織，得到轉(zhuǎn)基因植株。其具體方法是種子消毒后，去掉無菌苗的胚軸，露出分生組織，過夜培養(yǎng)后用基因槍轟擊，然后培養(yǎng)成株。
大豆轉(zhuǎn)基因工作在1988年取得突破性進(jìn)展，Agracetus公司(McCabe,DE.等,1988,Bio/technol.,6:923-926)和Monsanto公司分別獲得轉(zhuǎn)基因植株。Agracetus公司采用的是基因槍轟擊法，靶組織為大豆胚的初生分生組織和腋生分生組織，該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于較易獲得再生植株，但獲得完全轉(zhuǎn)化體的頻率較低。Monsanto公司利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，外植體為剛發(fā)芽種子的子葉切段，將NPTⅡ、GUS和草甘磷耐性基因?qū)爰?xì)胞并再生植株。由于許多大豆品種不易受農(nóng)桿菌感染(Owens,LD.等,1985,Plant Physiol.77:87-94；Owens,LD.等,1988,Plant Physiol.88:570-573；Delzer,BW.等,1990,CropSci.30:320-322；Mauro,AO.等,1995,Crop Sci.35:1152-1156)，因此Monsanto公司的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)僅適用于少數(shù)大豆品種。
此后，Christou等(Christou,P.等,1990,Trends in Biotech.,8:145-151)用專用的基因槍轉(zhuǎn)化大豆莖尖，F(xiàn)iner等(Finer,JJ.等，1990,Plant Mol.Rep.,9:189-194)用Biolistics_基因槍轉(zhuǎn)化胚性懸浮細(xì)胞，Sato等用Biolistics_基因槍轉(zhuǎn)化未成熟胚莖尖及長期分裂的大豆懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物均獲成功。此外，Dhir等(Dhir,SK.等，1991,Plant Cell Rep.10:106-110.)用電擊法轉(zhuǎn)化大豆原生質(zhì)體也獲得完整的轉(zhuǎn)化植株，Chee等(Chee等，1994，美國專利5376543)分別在1992年和1994年兩次申請“采用農(nóng)桿菌中介法轉(zhuǎn)化植物萌發(fā)種子”的美國發(fā)明專利。在該專利的說明書中，只報道了采用野生型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化萌發(fā)24-48小時的大豆和菜豆種子獲得結(jié)瘤植株的工作。該專利稍后被放棄。2000年，F(xiàn)iner等報道了采用超聲處理-農(nóng)桿菌感染法轉(zhuǎn)化大豆子葉可獲得良好效果的結(jié)果(Finer,KR.等，2000,Lett Appl Microbiol.,30:406-410)。
花生遺傳轉(zhuǎn)化難度大。直到1991年,Lacorte等(Lacorte等,1991,Plant Cell Rep.10:354-357)才利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花生外植體獲得轉(zhuǎn)基因的愈傷組織。1993年，Ozias-Akins等(Ozias-Akins等,1993,Plant Sci.,93:185-194)以胚性愈傷組織為受體獲得了轉(zhuǎn)基因植株。1997年，Cheng等(Cheng等，1997,Plant Physiol.,115:971-980)和Eapen等分別獲得花生轉(zhuǎn)基因植株，但植株再生困難，受基因型制約大。在近年的研究報道中，所用的花生轉(zhuǎn)基因受體體系仍存在植株再生難度大、再生植株育性差等缺點(diǎn)。
以原生質(zhì)體為受體的水稻轉(zhuǎn)化工作在1980年代中期已獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但直到1988年，Zhang等(Zhang,W.等，1988,Theor.Appl.Genet.,76:835-840)才采用電擊法獲得轉(zhuǎn)基因植株。此后，同類報道很多，但獲得轉(zhuǎn)基因植株的工作效率不高。1992年，Cao等(Cao,J.等，1992,Plant Cell Rept.,11:586-591)采用基因槍轟擊法獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。此后，以幼胚為受體，采用基因槍轟擊法獲得轉(zhuǎn)化植株的工作在多個實(shí)驗(yàn)室都獲得成功，該方法也成為1990年代中期水稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法。
利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的研究始于1980年代后期。1990年，Raineri等用乙酰丁香酮預(yù)處理具有廣寄主范圍的野生型農(nóng)桿菌，然后感染水稻盾片，在誘導(dǎo)的愈傷組織中檢測到T-DNA在水稻細(xì)胞中整合。1993年，Chan等用農(nóng)桿菌侵染粳稻的幼胚，得到轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化頻率較低。次年，Hiei等(Hiei,Y.等，1993，歐洲專利申請604662；1997，美國專利5591616；1994,The Plant J.,6:271-277)構(gòu)建了高效轉(zhuǎn)化載體，結(jié)合使用乙酰丁香酮，建立了農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化粳稻的方法，并對大群體的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了分子生物學(xué)和遺傳學(xué)分析，研究了水稻中T-DNA旁側(cè)序列。此后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻成功的報道不斷增多，成為粳稻遺傳轉(zhuǎn)化的常規(guī)技術(shù)。
玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展在很大程度上依賴于受體體系的改進(jìn)。1980年代后期，玉米原生質(zhì)體再生植株成功，以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化工作迅速展開。1988年,Rhodes等(Rhodes等,1988,Science,240:204-207)用電擊法獲得轉(zhuǎn)基因植株，但該植株不育。1990年，Gordon-Kamm等(Gordon-Kamm,WJ.等，The Plant Cell,2:603-618)用基因槍轟擊法獲得能育的轉(zhuǎn)基因玉米。此后，基因槍轟擊法在玉米轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用較多。該方法受體廣泛，可以是外植體(幼穗、幼胚或成熟胚等)、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等，操作較簡單，效果也較好，被廣泛采用。
玉米農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化雖開始較早，但至今技術(shù)尚待改進(jìn)。1987年，Grimsley等(Grimsley等，1987,Nature,325:177-179)報道將玉米條斑病毒(maize streak virus,MSV)的cDNA通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入玉米，使植株發(fā)生系統(tǒng)感染。但是，該研究并未表明MSV cDNA能穩(wěn)定整合到玉米基因組中。1991年，Gould等(Gould等，1991,Plant Physiol,95:426-434)用農(nóng)桿菌侵染玉米芽尖，得到轉(zhuǎn)基因植株。但是，剝離0.1mm×0.3mm的芽尖需要的技巧很高，工作量也很大，并且，以后的一些研究者沒能重復(fù)成功。
1993年，Hiei等報道了一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。該方法采用正在脫分化或已經(jīng)脫分化的(水稻和玉米)外植體作為受體，將HPT和GUS基因轉(zhuǎn)入玉米(A188)或水稻(japonica rice)。1996年，Ishida等(Ishida等，1996,Nature Biotechnol.,14:745-750)報道了用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚，A188自交系的轉(zhuǎn)化率為12-30％。但是，來源于A188的單交種的轉(zhuǎn)化率要比A188的(5.3％)低得多。然而Ishida在A188以外的品系中沒有得到轉(zhuǎn)化體。1999年，先鋒種子公司Zhao等(Zhao,ZY等，1999，美國專利5981840)獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米骨干自交系幼胚方法的專利。該轉(zhuǎn)化方法與Ishida等方法相近，但以A188和其它自交系雜交產(chǎn)生的單交種為材料，轉(zhuǎn)化率從Ishida等的0.4-5.3％提高到6.9-50.5％；用玉米骨干自交系PHJ90、PHN46HE和PHP38為材料，轉(zhuǎn)化率為0.9-9.0％，而用Ishida等的方法未獲得這3個自交系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。
同年，我國黃璐等報道了采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米單交種胚性愈傷組織成功并再生植株的工作(黃璐等，1999，《實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報》，32(4):381-389)。盡管玉米轉(zhuǎn)基因研究已有大量報道，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米已大面積推廣，但以自交系為材料再生大量轉(zhuǎn)基因植株的工作仍是玉米基因工程育種中的制約環(huán)節(jié)。從大批量獲得轉(zhuǎn)基因植株的角度出發(fā)，尚需建立起經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)方法和體系。以生產(chǎn)骨干自交系為材料，玉米組織和細(xì)胞培養(yǎng)難度大，不易再生出大量植株，且再生植株自交結(jié)實(shí)更難。因此，克服基因型障礙，發(fā)展高效的玉米培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因方法尤為重要。這是玉米基因工程育種能否高效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
1990年代初，Sautter等(Sautter,C.等，1991,Bio/Technology,9:1080-1085)和Vasil等(Vasil,V.等,1991,Bio/Technology,9:743-747；1992,Bio/Technology,10:667-674)分別采用基因槍轟擊法獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株，郭光慶等(郭光慶等，1993，《科學(xué)通報》，38:1226-1231)采用PEG誘導(dǎo)法獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株。這些工作依賴于材料的基因型，且轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株的頻率均不高。此后，Altpeter等(Altpeter,F.V.等，1996,Nature Biotechnology,14:1155-1159)和Barro等(Barro,F.等，1997,Nature Biotechnology,15:1295-1299)分別將高分子量麥谷脘亞基基因轉(zhuǎn)入小麥中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出新特性。1997年，Cheng等(Cheng等，1997,PlantPhysiol.,115:971-980)首次報道了采用農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化小麥的工作，該項工作得到了分子生物學(xué)證據(jù)，并對后代進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。上述這些工作都是以春性或半冬性小麥為材料進(jìn)行的。其它麥類作物的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展也不快(Pawlowski等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95:12106-12110)。截止到目前為止，麥類作物遺傳轉(zhuǎn)化仍是公認(rèn)的難題。
在以上報道中，除少數(shù)工作外，轉(zhuǎn)基因植株的獲得都依賴于器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；絕大多數(shù)具有重要經(jīng)濟(jì)價值的基因型，其組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化能否成功在很大程度上取決于基因型，特別是禾谷類作物和大粒豆科作物；只有少數(shù)基因型材料能通過組織和細(xì)胞培養(yǎng)再生出大批植株。此外，轉(zhuǎn)化效率也很低。尤其是，從以上報道還可看出，利用離體莖尖或胚芽進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，不僅操作難度大，效率低，而且轉(zhuǎn)化條件不易掌握，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。因此，發(fā)展不受基因型制約的簡單有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法和體系具有重大意義(Hansen等，1999,Trends Plant Sci.,4(6):226-231)。
本發(fā)明的用語、轉(zhuǎn)化載體和培養(yǎng)基在本發(fā)明中，“大粒種子植物”主要是指(1)玉米、小麥、水稻、高粱、大麥、燕麥、黑麥等禾谷類作物；(2)大豆、花生、綠豆、菜豆、四季豆等豆科作物；(3)棉花、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物；(4)兩瓜、黃瓜、南瓜等瓜類作物；(5)杏、桃、李、櫻桃等果樹和一些經(jīng)濟(jì)林木?！扒o尖”是指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristemetic)和大到幾十毫米的芽端(shoot tip)，“莖尖分生組織”是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基。
在本發(fā)明中，農(nóng)桿菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序基本上同Ishida等(Ishida等，1996,NatureBiotechnol.,14:745-750)報道的。在轉(zhuǎn)染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)等酚類化合物和中性單糖。
在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)染所用的農(nóng)桿菌含有改造后的Ti-質(zhì)粒，該質(zhì)粒可攜帶或不攜帶除草劑抗性基因或其它選擇劑抗性基因。
在本發(fā)明中，所用的除草劑抗性基因或其它抗性基因只要在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中活躍表達(dá)并賦予植株抗性即可，不限制基因的來源、大小、所用啟動子和所抗除草劑(或其它選擇劑)的種類，也不受農(nóng)桿菌菌株的限制。
在本發(fā)明中，基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)用熱壓滅菌；抗生素等活性成分用過濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。
在本發(fā)明中，除草劑等篩選劑用中性自來水溶解后噴灑。
在本發(fā)明中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)一般采用YEP培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l,NaCl 5g/l,pH7.0，固體培養(yǎng)基加入15g/l瓊脂)培養(yǎng)。
禾谷類作物種子萌發(fā)和胚培養(yǎng)采用的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基KNO31900mg/l、NH4NO31650mg/l、CaCl2·2H2O 440mg/l、MgSO4·7H2O 370mg/l、KH2PO4·H2O 170mg/l、FeSO4·7H2O 27.8mg/l、ZnSO4·7H2O 10mg/l、MnSO4·H2O 22mg/l、H3BO310mg/l、Na2MoO40.5mg/l、CuSO4·5H2O 0.05mg/l、CoCl2·2H2O 0.05mg/l、鹽酸硫胺素10mg/l、鹽酸吡哆醇1mg/l、煙酸1mg/l、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、生物素0.05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、蔗糖30g/l、瓊脂粉7g/l、pH5.8-6.0。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度因培養(yǎng)材料的基因型而調(diào)整。
豆科作物和瓜類種子萌發(fā)和胚培養(yǎng)采用的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基(同上)或改良B5培養(yǎng)基。后種培養(yǎng)基成分為KNO32500mg/l、(NH4)2SO4134mg/l、CaCl2·2H2O 150mg/l、MgSO4·7H2O 250mg/l、NaH2PO4·H2O 150mg/l、FeSO4·7H2O 27.8mg/l、ZnSO4·7H2O 2mg/l、MnSO4·H2O 10mg/l、H3BO310mg/l、Na2MoO40.5mg/l、CuSO4·5H2O0.05mg/l、CoCl2·2H2O 0.05mg/l、鹽酸硫胺素10mg/l、鹽酸吡哆醇1mg/l、煙酸1mg/l、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、生物素0.05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、蔗糖20g/l、瓊脂粉7g/l、pH5.8-6.0。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度因培養(yǎng)材料的基因型而調(diào)整。
在本發(fā)明中，移栽苗隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽溶液或1/2改良B5培養(yǎng)基無機(jī)鹽溶液，pH6.0-7.0。本發(fā)明的技術(shù)方案1．建立受體體系根據(jù)植物種類的不同可分別選擇以下途徑。
(1)通過萌發(fā)成熟種子獲得轉(zhuǎn)基因受體植株。
取飽滿干凈的種子(利用雜種優(yōu)勢的作物選用套袋獲得的自交系種子、有堅硬種皮或外絨毛的種子去掉種皮或外絨毛)，用70％乙醇浸泡1-15分鐘(因種子種類和帶菌情況確定)，再用0.1％氯化汞浸泡10-15分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后在黑暗條件(15-35℃)下萌發(fā)，并注意晃動種子。萌發(fā)溫度和時間因種子種類而定。待種子萌動(露白)后，將其放在培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。待胚芽或胚軸伸長至3-5厘米、胚根2-7厘米時，剝離胚芽鞘或子葉及2-3片幼葉，暴露莖尖分生組織用于轉(zhuǎn)化。操作時應(yīng)避免對根系造成損傷。
(2)通過成熟種子胚萌發(fā)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因受體植株。
種子表面滅菌(有堅硬種皮或外絨毛的種子去掉種皮或外絨毛)時，先用70％乙醇浸泡1-15分鐘(因種子種類和帶菌情況確定)，再用0.1％氯化汞浸泡10-15分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后在黑暗條件(22-30℃)下放置12-24小時(確切時間因種子種類和溫度而定)。待種子充分吸漲后，用鑷子取胚接種在培養(yǎng)基上，在黑暗條件下萌發(fā)，萌發(fā)溫度一般為22-30℃。培養(yǎng)基具體成分因植物種類而有差異。待胚芽或胚軸伸長到3-5厘米、胚根2-4厘米時，剝離胚芽鞘或子葉及2-3片幼葉，暴露莖尖分生組織用于轉(zhuǎn)化。操作時應(yīng)避免對根系造成損傷。
(3)培養(yǎng)未成熟胚獲得轉(zhuǎn)基因受體植株。
未成熟果實(shí)或果穗用70％乙醇浸泡1分鐘左右，再用0.1％氯化汞侵泡6-15分鐘(因材料種類和帶菌情況確定)，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動，以保證表面滅菌徹底。然后取球形胚以后時期的未成熟胚進(jìn)行離體培養(yǎng)。未成熟胚接種在附加6-BA(6-芐基嘌呤)0.05-0.8mg/l、蔗糖濃度3-5％的改良MS培養(yǎng)基或改良B5培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度22-30℃，散射光或黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基其它附加成分因植物種類而變化。待胚芽或胚軸伸長至3-5厘米、胚根2-4厘米時，剝離胚芽鞘或子葉及2-3片幼葉，裸露莖尖的小苗用于轉(zhuǎn)化。操作時應(yīng)避免對根系造成損傷。
(4)將雙子葉植物的種子播種在苗圃或花盆中。
小苗出土后避光生長，待子葉展開后，剝?nèi)プ尤~，暴露生長點(diǎn)，用毛細(xì)滴管或注射器向生長點(diǎn)導(dǎo)入農(nóng)桿菌。
2．轉(zhuǎn)化試管苗或苗圃苗取暴露莖尖分生組織的種子苗或胚發(fā)育的小苗為轉(zhuǎn)化受體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因轉(zhuǎn)入受體植株莖尖的分生組織細(xì)胞。具體步驟為
(1)制備轉(zhuǎn)化用載體。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒，帶有目的基因和/或除草劑抗性基因和/或其它選擇標(biāo)記基因)或共整合載體(T-DNA區(qū)含有目的基因和/或除草劑抗性基因和/或其它選擇標(biāo)記基因)的根瘤農(nóng)桿菌(如EHA101、AGL1和LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期；然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液，菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基(即改良MS培養(yǎng)基基本成分減半)洗滌，再離心收集；再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
(2)采用農(nóng)桿菌中介法轉(zhuǎn)化目的基因。
可采用以下任一程序進(jìn)行轉(zhuǎn)化A、將無菌苗裸露的莖尖分生組織放入農(nóng)桿菌液中浸泡0.5-8分鐘(其它部位盡量避免接觸農(nóng)桿菌)，用滅菌濾紙吸去莖尖的多余菌液，再將植株根部插入固體培養(yǎng)基(一般用原培養(yǎng)基)中，放在黑暗條件下培養(yǎng)(22℃左右)2-4天，然后在光照下培養(yǎng)(22-25℃)2-3天，此時植株頂端已有小葉出現(xiàn)。再將植株移栽到鋪有上層蛭石和下層壤土的花盆中。
B、將無菌苗裸露的莖尖分生組織放入農(nóng)桿菌液中浸泡0.5-8分鐘(其它部位盡量避免接觸農(nóng)桿菌)，用滅菌濾紙吸去莖尖的多余菌液，然后將其移栽到鋪有上層蛭石和下層壤土的花盆中或其它無土介質(zhì)中，植株頂部覆蓋2厘米厚度的蛭石，使其處于避光狀態(tài)，并保持濕度。在適宜溫度(18-23℃)下，植株一周后長出新葉。
C、將花盆或苗圃中的小苗剝?nèi)プ尤~，暴露出生長點(diǎn)，然后用帶有毛細(xì)玻管或4號(中華人民共和國注射針標(biāo)準(zhǔn))注射針的注射器將農(nóng)桿菌液注入生長點(diǎn)。注射后用吸水紙吸去多余液滴，然后在植株頂部覆蓋2厘米厚度的蛭石或其它無土介質(zhì)，使其處于避光狀態(tài)，并保持濕度。在適宜溫度(18-23℃)下，植株在一周后長出新葉。
(3)轉(zhuǎn)化植株的篩選、移栽和管理。
對于花盆或苗圃中的轉(zhuǎn)化小苗，隔天澆灌1/2改良MS或1/2改良B5培養(yǎng)基無機(jī)鹽，長出3片新葉后，噴灑適宜濃度的除草劑或其它類型的選擇劑。未轉(zhuǎn)化的植株缺乏特定抗性性狀，噴灑除草劑或其它類型的選擇劑后逐漸死亡。轉(zhuǎn)基因植株因?qū)Τ輨┗蚱渌x擇劑有抗性，在噴灑除草劑或其它選擇劑后仍能存活和生長。若用除草劑抗性基因als(乙酰乳酸合成酶基因)為選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)化后的玉米植株在噴灑除草劑后，抗性個體的比例可達(dá)30％以上?？剐灾仓觊L到5葉期，將其定植到土壤肥沃的溫室或田間。適宜生長條件(因植物種類、品種或生態(tài)型而變化)下，轉(zhuǎn)基因植株正常發(fā)育和結(jié)實(shí)。對于非嚴(yán)格白花授粉的植物，要注意適時套袋和自交。
(4)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和子代抗性分析。
取轉(zhuǎn)化植株的葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因檢測。對獲得的PCR陽性植株采用Southern blotting方法鑒定以確定轉(zhuǎn)基因植株。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，若用除草劑抗性基因als(乙酰乳酸合成酶基因)為選擇標(biāo)記，80％以上的抗除草劑植株為轉(zhuǎn)基因個體。如果不用除草劑或其它選擇劑篩選經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理的植株，直接采用PCR技術(shù)檢測，在轉(zhuǎn)化處理個體中，轉(zhuǎn)基因植株比例為20-40％。
一般認(rèn)為，遺傳轉(zhuǎn)化只能使幼胚或分生組織中少數(shù)細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化，若不利用選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，細(xì)胞分裂形成嵌合體，只有當(dāng)嵌合體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成配子，轉(zhuǎn)化性狀才能傳遞給后代。為了解轉(zhuǎn)基因植株子代中有多少個體攜帶外源基因，可在子代植株長到3-5葉期時噴灑除草劑或用其它選擇劑處理植株葉片。結(jié)果表明，采用該技術(shù)體系獲得的轉(zhuǎn)基因玉米植株的自交子代，幾乎各株系均存在轉(zhuǎn)基因個體。在60％左右的株系中，外源基因的分離符合孟德爾遺傳規(guī)律。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化程序中雖無篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟，但由于農(nóng)桿菌長時間同分生組織接觸，可能使較多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化；在用除草劑選擇轉(zhuǎn)化小苗時，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增生受到抑制，其比例在頂端分生組織中迅速降低，以致導(dǎo)致組成生殖器官的細(xì)胞幾乎都是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以大粒植物成熟或未成熟種子為起始材料，滅菌后在黑暗條件下萌發(fā)或培養(yǎng)，然后剝?nèi)パ壳驶蜃尤~及幼葉，以農(nóng)桿菌為中介進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明能有效減少基因型障礙，可從絕大多數(shù)基因型中有效獲得轉(zhuǎn)基因植株；并且轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育正常，結(jié)實(shí)性好，其后代也基本能夠保持原基因型的特征特性。
與以胚性愈傷組織和幼胚為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法相比較，本發(fā)明具有的優(yōu)勢在于能夠讓絕大多數(shù)基因型產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株；實(shí)驗(yàn)周期短；成功率高；免去抗生素抗性基因的使用；取材不受季節(jié)限制。對于利用雜種優(yōu)勢的作物，若以自交系為受體，轉(zhuǎn)基因植株絕大多數(shù)無需進(jìn)行多代回交就可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因自交系。
與離體培養(yǎng)芽尖為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法相比較，本發(fā)明具有的優(yōu)勢在于免去莖尖培養(yǎng)再生植株的過程，操作簡單，轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率大幅度提高；重復(fù)性好；免去抗生素抗性基因的使用，有利于食用產(chǎn)品通過安全性鑒定；轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株發(fā)育正常，能大批獲得轉(zhuǎn)基因植株的子代等。
本發(fā)明的實(shí)施例；以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。須說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。實(shí)例一、以農(nóng)桿菌為中介轉(zhuǎn)化玉米自交系無菌苗1．玉米無菌苗的獲得。
套袋獲取玉米骨干自交系或雜交種種子，用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下1-2天。待種子萌動(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上，在黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。待胚芽伸長至3-5厘米時，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐。
2．農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑綠黃隆抗性基因als，該基因來自抗綠黃隆的擬南芥植株并經(jīng)過修飾。李國圣等，2000，《科學(xué)通報》，45:2181-2184)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2 MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
3．玉米無菌苗轉(zhuǎn)化。
(1)把菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，將露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中2-5分鐘(AGLl 2分鐘，LBA4404 5分鐘)。
(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，將根部插入改良MS培養(yǎng)基中于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24℃，然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石和下層壤土的花盆中，蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28℃，夜溫18-23℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
4．轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑20mg/l綠黃隆(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25％)水溶液，以未轉(zhuǎn)化植株為對照。噴灑量以植株掉液滴為宜。對照植株在噴灑后3天停止生長，10天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化處理后的植株，一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體則持續(xù)生長，無明顯變化。存活植株長到5葉期，將其定植到田間。
5．轉(zhuǎn)基因植株的鑒定抗除草劑植株生長到7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。結(jié)果見附圖1、2、3。結(jié)果顯示，約86％的抗除草劑植株為轉(zhuǎn)基因個體。
6．轉(zhuǎn)基因植株的管理和子代分析轉(zhuǎn)基因植株開花后套袋自交或姊妹交結(jié)實(shí)。種子播種在大田或溫室，植株長到4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是否帶有外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。結(jié)果見表1。表1、外源基因als在轉(zhuǎn)基因植株子代中的頻率
數(shù)據(jù)表明，以無菌苗莖尖分生組織為轉(zhuǎn)基因的受體組織，能高效獲得轉(zhuǎn)基因植株，外源基因在子代植株中的分離比例多數(shù)符合孟德爾遺傳定律。實(shí)例二、以農(nóng)桿菌為中介轉(zhuǎn)化由玉米未成熟胚產(chǎn)生的無菌苗1．玉米無菌苗獲得取套袋授粉后15-20天的玉米骨干自交系自交果穗，去掉苞葉后用70％乙醇浸泡5-8分鐘，然后用手術(shù)刀削去種子頂部，用鑷子挑出未成熟胚，接種在附加0.25mg/l 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的改良MS培養(yǎng)基上，在黑暗條件(23-26℃)下培養(yǎng)。待胚芽伸長至3-5厘米時，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，裸露出莖尖生長錐。然后采用農(nóng)桿菌中介法轉(zhuǎn)化莖尖分生組織。
2．其余操作步驟，包括農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化、玉米無菌苗轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化植株篩選、定植和分子生物學(xué)鑒定等皆與實(shí)施例一相同。實(shí)例三、以農(nóng)桿菌為中介轉(zhuǎn)化小麥無菌苗1．小麥無菌苗獲得小麥優(yōu)良品種的種子，用70％乙醇浸泡1-3分鐘，再用0.1％氯化汞侵泡8-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-40毫升/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下1-2天。待種子萌動(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長止3-5厘米時，剝離胚芽鞘及1-2片幼葉，露出莖尖生長錐。
2．農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因bar)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2 MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
3．小麥無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中3-6分鐘。
(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，將根部插入附加200 mg/l谷氨酰胺的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)2-5天，培養(yǎng)溫度為22-24℃。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28℃，夜溫15-21℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
4．轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑phosphinothricin(Sigma公司，St.Louis,M0,USA)2mg/l水溶液，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對照植株在噴灑后5天后停止生長，15天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到7-8葉時，將其定植到田間，并促進(jìn)分蘗。
5．抗除草劑植株經(jīng)春化處理后，在起身-拔節(jié)期取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化植株。PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。在獲得的368株抗除草劑植株中，約80％左右(296/368)為轉(zhuǎn)基因個體。
6．轉(zhuǎn)基因植株子代分析通過春化階段(低溫處理條件因品種而異)的植株在長日照下起身、拔節(jié)、開花結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，在浸水萌動后放冰箱(0-2℃)中進(jìn)行春化處理30-65天。部分春化處理后的種子用phosphinothricin(Sigma公司，St.Louis,MO,USA)2mg/l水溶液處理，觀察統(tǒng)計抗性和敏感性個體的比例。另一部分春化處理后的種子播種在大田或溫室，待植株長到5-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例?？剐院Y選和分子生物學(xué)檢測結(jié)果均表明，在約半數(shù)的株系中，外源基因在子代植株中的分離符合孟德爾遺傳定律。實(shí)例四、以農(nóng)桿菌為中介轉(zhuǎn)化棉花無菌苗1．棉花無菌苗獲得取棉花自交系或優(yōu)良品種的種子，用濃硫酸脫去表面絨毛，用70％乙醇浸泡2分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下1-2天。待種子萌動(露白)后，將其放在銨鹽減半的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸伸長至3-5厘米時，剝?nèi)プ尤~及幼葉，露出莖端生長錐。
2．農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑綠黃隆抗性基因als)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用銨鹽減半的1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的銨鹽減半的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋10-25倍用于轉(zhuǎn)化。
3．棉花無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的苗端浸泡在菌液中2-5分鐘。
(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，把根部插入銨鹽減半的改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為24-26℃。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。
(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28℃，夜溫18-23℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
4．轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑15mg/l綠黃隆(有效成分25％)(沈陽農(nóng)藥廠，中國遼寧省沈陽市)水溶液，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化的對照植株在噴灑后3天停止生長，12天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體有很強(qiáng)抗性，持續(xù)生長。存活植株長到5葉期時，將其定植到田間。
5．抗除草劑植株的分子生物學(xué)鑒定抗除草劑植株長到7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因。PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。在獲得的186株抗除草劑植株中，約80％以上(157/186)的植株為轉(zhuǎn)基因個體。
6．轉(zhuǎn)基因植株子代的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因植株開花后套袋自交或姊妹交結(jié)實(shí)。種子播種在大田或溫室，在植株4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測子代植株是否帶有外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代分離比例。結(jié)果表明，以無菌苗莖尖分生組織為轉(zhuǎn)基因受體組織，能高效獲得轉(zhuǎn)基因植株，并且，在60％左右(23/38)的株系中，外源基因在子代植株中的分離比例符合孟德爾遺傳定律。實(shí)例五、以農(nóng)桿菌為中介轉(zhuǎn)化大豆無菌苗1．大豆無菌苗獲得取優(yōu)良品種的種子，用70％乙醇浸泡2-3分鐘，用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(50-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30℃)下2-3天。待種子萌動(露白)后，將其放在改良B5培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚軸長至3-5厘米時，剝?nèi)プ尤~并露出莖端生長錐。
2．農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑綠黃隆抗性基因als)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良B5液體培養(yǎng)基(即改良B5培養(yǎng)基基本成分減半)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-10倍用于轉(zhuǎn)化。
3．大豆無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中3-6分鐘。
(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，把小苗根端插入改良B5培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)溫度為22-24℃。
(3)將無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，頂部覆蓋3-4厘米厚度的蛭石，自然光照下生長，日溫23-28℃，夜溫20-25℃，隔天澆灌1/2改良B5培養(yǎng)基無機(jī)鹽。
4．轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑20mg/l綠黃隆(有效成分25％)(沈陽農(nóng)藥廠，中國遼寧省沈陽市)水溶液，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化的對照植株在噴灑后4天停止生長，15天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體持續(xù)生長，變化不明顯。存活植株長到5葉期，將其定植到田間。
5．抗除草劑植株生長到7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因。PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。在獲得的253株抗除草劑植株中，約60％以上(156/253)的植株為轉(zhuǎn)基因個體。
6．轉(zhuǎn)基因植株子代的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子，播種在大田或溫室。植株3-4葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。結(jié)果表明，以無菌苗莖尖分生組織為轉(zhuǎn)基因受體組織，能高效獲得轉(zhuǎn)基因植株；并且，在約半數(shù)(16/30)的株系中，外源基因在子代植株中的分離比例符合孟德爾遺傳定律。
說明書


圖1、抗除草劑轉(zhuǎn)基因(als)植株的PCR結(jié)果其中，1、11為GeneRulerTMDNA Ladder Mix,2-8為陽性結(jié)果，9為質(zhì)粒PCR結(jié)(示1.1kb條帶)果，10為陰性對照。圖2抗除草劑轉(zhuǎn)基因(als)植株的Southern雜交結(jié)果其中，1-5為陽性結(jié)果，6為陰性對照，7為質(zhì)粒DNA/EcoRⅠ(示2.5kb條帶)，8為λDNA/HindⅢ。圖3抗除草劑轉(zhuǎn)基因(als)再生植株對轉(zhuǎn)基因小苗噴施濃度為40mg/L的綠黃隆溶液，小苗的生長不受影響，轉(zhuǎn)基因植株對除草劑綠黃隆的耐受性強(qiáng)。
權(quán)利要求
1．一種轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法，其特征是該方法主要包括以下步驟(1)建立受體體系，得到受體植株；(2)以受體植株小苗為材料，在適宜時機(jī)剝?nèi)パ壳驶蜃尤~及幼葉，裸露出莖尖作為轉(zhuǎn)化受體；(3)制備轉(zhuǎn)化用載體；(4)采用農(nóng)桿菌中介法轉(zhuǎn)化目的基因；(5)將轉(zhuǎn)化后的小苗移栽到花盆中，覆蓋無土介質(zhì)，澆灌營養(yǎng)液；(6)待植株長出新葉后噴灑選擇劑，篩選出表現(xiàn)抗性的轉(zhuǎn)基因植株；(7)將轉(zhuǎn)基因植株移植到溫室或田間，在適宜條件下得到該轉(zhuǎn)基因植株的子代植株；(8)鑒定轉(zhuǎn)基因植株及其子代的特性。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是禾谷類作物植物；
3．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是玉米、小麥、水稻、高粱、大麥、燕麥、黑麥；
4．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是豆科作物植物；
5．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是大豆、花生、綠豆、菜豆、豌豆、四季豆、蠶豆、綠豆；
6．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是經(jīng)濟(jì)類作物植物；
7．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是棉花、向日葵、蓖麻；
8．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是瓜類作物植物；
9．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是西瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆、香瓜、番瓜、絲瓜、佛手瓜；
10．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是果樹植物；
11．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是杏、桃、李、櫻桃；
12．權(quán)利要求1的方法，其中所說的大粒種子植物是經(jīng)濟(jì)類林木植物；
13．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“建立受體體系”包括如下途徑(可根據(jù)植物品種的不同分別選擇)(1)通過萌發(fā)成熟種子獲得轉(zhuǎn)基因受體植株；(2)通過萌發(fā)成熟種子胚獲得轉(zhuǎn)基因受體植株；(3)通過培養(yǎng)未成熟胚獲得轉(zhuǎn)基因受體植株；(4)將雙子葉植物的種子播種在花盆或苗圃中。
14．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“適宜時機(jī)”因植物種類而異，且以植物生長點(diǎn)處于最佳感受態(tài)時為最佳；
15．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“農(nóng)桿菌中介法”包括浸泡法、浸蘸法、注射法、超聲波處理-農(nóng)桿菌感染法、射線處理-農(nóng)桿菌感染法、農(nóng)桿菌感染-真空導(dǎo)入法；
16．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“無土介質(zhì)”是蛭石；
17．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“植株長出新葉”是植株長出3-4片新葉；
18．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“選擇劑”是除草劑；
19．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“選擇劑”是綠黃??；
20．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“抗性”是對除草劑的抗性；
21．權(quán)利要求1的方法，其中所說的“抗性”是對綠黃隆的抗性；
22．一種生產(chǎn)大粒種子植物的轉(zhuǎn)基因植株及其子代的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法；
23．一種產(chǎn)生大粒種子植物的轉(zhuǎn)基因自交系的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法；
24．一種避免使用抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法；
25．一種有利于植物轉(zhuǎn)基因操作和轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品通過安全性鑒定的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求24的避免使用抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化大粒種子植物的方法及其應(yīng)用。該方法的步驟主要包括:以無菌種子產(chǎn)生的小苗為材料,剝?nèi)パ壳驶蜃尤~及幼葉,裸露出莖尖為轉(zhuǎn)化受體,采用農(nóng)桿菌中介法導(dǎo)入目的基因;轉(zhuǎn)化后的小苗移栽到花盆中,覆蓋蛭石,澆灌營養(yǎng)液,待植株長出3—4片新葉后噴灑選擇劑,篩選出表現(xiàn)抗性的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明能有效地克服基因型制約,可使通過組織培養(yǎng)途徑不易再生植株的植物成批產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株,對具有重要經(jīng)濟(jì)價值的禾谷類作物、大粒豆科作物、葫蘆科作物、棉花、向日葵、核果類果樹和大粒種子林木的遺傳改良有重要價值。
文檔編號C12N15/87GK1305005SQ01104428
公開日2001年7月25日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月26日
發(fā)明者張舉仁, 張可煒, 楊愛芳, 權(quán)瑞黨, 張岳, 尹小燕 申請人:山東大學(xué)