專利名稱：一全合成培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法。
甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(Methylotrophic yeast Pichia pastoris)已經(jīng)被公認(rèn)為外源分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白生產(chǎn)的一優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)，并且由于其強(qiáng)勁的生長和一些獨(dú)特的特性已開發(fā)成外源蛋白商業(yè)生產(chǎn)的重組表達(dá)系統(tǒng)。由于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在釀造上的地位和歷史原因，人們對其遺傳學(xué)和生物學(xué)方面了解的比較全面，且其安全性也被人們?nèi)菀捉邮?，但隨著人們對甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母的研究，認(rèn)為該菌在以下方面比釀酒酵母更具優(yōu)勢(1)具有日益成熟的高密度發(fā)酵工藝。已經(jīng)有了大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，且細(xì)胞密度達(dá)到150g(DCW)/L，以及廉價的原料配方。
(2)具有甲醇精確調(diào)控的強(qiáng)啟動子(PAOX)。它受甘油、乙醇或葡萄糖等碳源的阻遏，而受甲醇的誘導(dǎo)且誘導(dǎo)準(zhǔn)確。
(3)外源蛋白分泌的高效率性。為了使表達(dá)的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，需要一信號肽序列(Signal Sequence)。最方便的是利用外源蛋白本身的信號序列，但大多數(shù)情況下，甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母不能有效地識別這些信號肽以指導(dǎo)分泌，而采用了釀酒酵母α交配因子(α-mating factor)前89個氨基酸殘基引導(dǎo)或用酸性磷酸酶1(PH01)中21個氨基酸殘基的信號肽融合到外源蛋白的N端，均能極有效地指導(dǎo)外源蛋白分泌，還有采用間質(zhì)金屬蛋白酶(NMP)/間質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)信號序列等。據(jù)報道用釀酒酵母的交配因子信號序列可使甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母分泌人血清蛋白達(dá)10g/L的水平。
(4)外源蛋白基因遺傳高穩(wěn)定性。由于外源目的蛋白載體以線性質(zhì)粒整合到甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，因此外源目的基因在世系傳代中異常穩(wěn)定，不易丟失。
(5)外源目的蛋白的高表達(dá)率。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)下迅速形成過氧化物酶體(Peroxisome)，它是一種合成儲存蛋白質(zhì)的區(qū)域化結(jié)構(gòu)，可使表達(dá)的外源蛋白免受蛋白酶的降解，且不對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，從而提高了目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。
甲醇加入畢赤酵母的培養(yǎng)基后，能迅速誘導(dǎo)合成大量的醇氧化酶(AlcoholOxidase,AOX)，而AOX的合成在含甘油培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中受到抑制。AOX是甲醇利用途徑的第一個酶，它催化甲醇氧化成甲酸，進(jìn)而氧化釋放出二氧化碳。
由于AOX與氧的親和力低，所以畢赤酵母代償性產(chǎn)生大量的AOX，約占全部可溶性蛋白質(zhì)的30％。畢赤酵母含有兩個醇氧化酶基因，分別為AOX1、AOX2基因(aox1,aox2)，二者的編碼序列相似，有92％同源性，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物則有97％的同源性。aox1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在氧化過程中起主要作用。aox1的轉(zhuǎn)錄水平大大高于aox2，且aox1在轉(zhuǎn)錄水平上受到嚴(yán)格的雙重調(diào)控甲醇誘導(dǎo)AOX合成，一般的碳分解代謝產(chǎn)物抑制AOX產(chǎn)生。在碳饑餓狀態(tài)下，只有在甲醇誘導(dǎo)后，才能啟動aox1的信號轉(zhuǎn)錄、翻譯。
以甲醇誘導(dǎo)強(qiáng)啟動子PAOX1而起動基因轉(zhuǎn)錄這一特性對于利用畢赤酵母生產(chǎn)外源蛋白是十分重要的。由于重組蛋白對細(xì)胞有毒性作用，在大容量、高密度培養(yǎng)過程中，需要將細(xì)胞繁殖階段與表達(dá)階段分開。其它表達(dá)系統(tǒng)需極高濃度的抑制物來阻遏表達(dá)，誘導(dǎo)前又需將之除去。對于畢赤酵母的生物量增長階段，只需少量的抑制物，通常為甘油，即可滿足細(xì)胞生長并有效地抑制外源基因的表達(dá)；在表達(dá)階段，只需讓細(xì)胞耗盡剩余的甘油，再加入甲醇誘導(dǎo)即可，這樣高密度連續(xù)培養(yǎng)可以使表達(dá)產(chǎn)量提高。
大多數(shù)研究者一般使用美國Invitrogen公司提供的方法來進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)，其中含有蛋白胨，YNB等有機(jī)復(fù)合培養(yǎng)基，與在發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵的合成培養(yǎng)基相差甚遠(yuǎn)，這對采用搖瓶發(fā)酵表達(dá)外源蛋白優(yōu)化條件來應(yīng)用于發(fā)酵罐上發(fā)酵，其指導(dǎo)意義不大，甚至結(jié)果大相徑庭。而最近一些研究者采用SM合成培養(yǎng)基，如Kaoru K等培養(yǎng)基(Journ.of Biosci.Bioeng.2000,Vol.89(5),479-484)，來進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化研究，其主要缺點(diǎn)是1碳源(甲醇等)一次性加入，當(dāng)甲醇濃度過高時，造成細(xì)胞甲醇中毒，不利于表達(dá)；而當(dāng)甲醇適當(dāng)時，因碳源不足發(fā)酵時間不能足夠長，影響搖瓶發(fā)酵結(jié)果。2其沒有采用pH緩沖系統(tǒng)。因?yàn)椴煌耐庠吹鞍谆钚砸笠欢ǖ膒H條件，如鼠表皮生長因子(EGF)表達(dá)時，要求pH為3.0左右，而重組人血清白蛋白表達(dá)的較適pH范圍是5.5～6.4。當(dāng)細(xì)胞生長時其pH必定下降，這對目的蛋白的表達(dá)是不利的。
為了使在小量培養(yǎng)基中(如搖瓶規(guī)模)與大批量發(fā)酵(如發(fā)酵罐規(guī)模)的外源蛋白表達(dá)發(fā)酵工藝相一致，避免繁瑣的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和/或重新的探索試驗(yàn)，小量培養(yǎng)基必須有充足的緩沖能力、保證最大通氣量和與大批量發(fā)酵培養(yǎng)基相同或極近似的培養(yǎng)基等發(fā)酵條件。為此，提供一種新的畢赤酵母培養(yǎng)基是基因工程所十分期望的。
本發(fā)明的目的在于公開一種根據(jù)在FUS-50(A)多參數(shù)全自動發(fā)酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數(shù)據(jù)和根據(jù)細(xì)胞代謝物流平衡的原理、適用于基因工程巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)搖瓶表達(dá)外源蛋白的全合成培養(yǎng)基，它既能滿足把搖瓶發(fā)酵結(jié)果放大到發(fā)酵罐上的需要，也克服了許多研究者采用Invitrogen Kit提供的與發(fā)酵罐發(fā)酵不同的復(fù)合搖瓶培養(yǎng)基的困難，同時為在搖瓶發(fā)酵規(guī)模優(yōu)化表達(dá)外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
本發(fā)明的目的之二在于公開上述培養(yǎng)基在基因工程方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的(1)通過優(yōu)化培養(yǎng)基pH值的范圍和選擇合適的緩沖系統(tǒng)，使蛋白質(zhì)降解減到最低程度；(2)通過添加充足的碳源、氮源和磷源，以利于外源蛋白的高表達(dá)；(3)通過添加充足的無機(jī)鹽、維生素、生物促進(jìn)劑等，以利于外源蛋白的高表達(dá)；實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案本發(fā)明所說的培養(yǎng)基包括碳源、氮源、磷源、無機(jī)鹽、PTM1和pH緩沖溶液，其含量為碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源磷酸根(PO43-)濃度為0.01-1.0moL/L無機(jī)鹽 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/L
pH緩沖溶液的加入量使培養(yǎng)基的pH保持為2.5-9.0。
所說的碳源為甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油等；所說的氮源為(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4等；所說的磷源為磷酸和磷酸鹽，包括磷酸鉀、磷酸二氫鉀(鈉)、磷酸氫二鉀(鈉)等；所說的無機(jī)鹽為鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、鐵(Fe2+,Fe3+)、銅(Cu2+)或鋅(Zn2+)的無機(jī)鹽，如氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化(亞)鐵、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、氯化銅、氯化鋅或硫酸鋅等中的一種或一種以上；所說的SO42+選自硫酸鹽，包括硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸等中的一種或一種以上；所說的PTM1是采用Invitrogen公司產(chǎn)品(貨號Cat.No.Q300-12或Q300-13其中含有CuSO4,NaI,MnSO4,Na2MoO4,H3BO3,CoCl2,ZnCl2,FeSO4,H2SO4和生物素。
所說的pH緩沖可采用檸檬酸緩沖系統(tǒng)、克拉克-盧勃斯(Clark-Lubs)緩沖液和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)等。
本發(fā)明優(yōu)選的含量為碳源0.1-4.0％(v/v)，較優(yōu)為0.1-1.0％；氮源0.1-20g/L，較優(yōu)為5-10g/L；磷源磷酸根(PO43-)濃度為0.01-2.0moL/L，較優(yōu)為0.1-1.0moL/L；無機(jī)鹽 0.002-3.0g/L，較優(yōu)為0.1-1.5g/L；SO42+0.001-0.5mol/L，較優(yōu)為0.1-0.1moL/L；PTM11-16mL/L，較優(yōu)為4-12mL/L；pH緩沖溶液的加入量使培養(yǎng)基的pH保持為3.0-7.5，較優(yōu)為5.0-7.0。
本發(fā)明所說的培養(yǎng)基的制備是一種常規(guī)的方法。
本發(fā)明的培養(yǎng)基適用于①基因工程甲醇營養(yǎng)型酵母(Methylotrophic yeastPichia pastoris)的不同遺傳表型(Mut+His+,MutsHis+等)、不同的啟動子(PAOX1、PAOX2)、不同的表達(dá)載體(如PIC4.5等)以及載體的不同存在方式(如附加型、整合型等)；②采用PAOX1、PAOX2啟動子等的其它基因工程酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、漢遜酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等的外源蛋白表達(dá)搖瓶培養(yǎng)。
本發(fā)明的畢赤酵母適用菌株包括(以下菌株Invitrogen公司均有售或構(gòu)建方法)(1)NRRL Y-11430-SC5(Mut+)；(2)GS115(his4)或GTS115(3)KM71(his4,aox1::ARG4)；(4)PPF1(his4,arg4)；(5)SMD1163(his4,pep4,prB1)；(6)SMD1165(his4,prB1)；(7)SMD1168(his4,pep4)；(8)其它采用PAOX1或PAOX2啟動子構(gòu)建的基因工程菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母、漢遜酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等。
畢赤酵母常用表達(dá)載體由于畢赤酵母是廣泛應(yīng)用的宿主細(xì)胞，至今已構(gòu)建了許多表達(dá)載體來使用，常用表達(dá)載體見下表。載體名稱克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記 特點(diǎn)pPIC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠ His4 多克隆位點(diǎn)載體G418EcoRⅠAvrⅢ.NotⅠpPSC3 BamHⅠ.NcoⅠSnaBⅠHis4 Kan 多克隆位點(diǎn)載體，并可EcoRⅠ AvrⅢ.NotⅠ 用選擇多拷貝克隆pPSC3 EcoRⅠ His4 His4 KanpHIL-D1 EcoRⅠ His4 原始構(gòu)建的載體pAO815 EcoRⅠ His4 用于體外構(gòu)建多拷貝的載體pPIC9 EcoRⅠ AvrⅡXhoⅠSnaBⅠ His4 分泌表達(dá)NotⅠpPIC9K XhoⅠ SnaBⅠHis4 Kan 分泌表達(dá)和并可用G418EcoRⅠ AvrⅡ NotⅠ 選擇多拷貝克隆表達(dá)載體構(gòu)建巴氏畢赤酵母表達(dá)載體通常是穿梭質(zhì)粒(Shuttle plasmid)，典型的表達(dá)載體含有醇氧化酶基因(5′AOX1啟動子、3′AOX1終止序列、3′AOX1序列)，其中含多克隆位點(diǎn)(如BamHⅠ,NcoⅠ,SnaBⅠ,EcoRⅠ,AvrⅢ,NotⅠ,XhoⅠ等)供外源基因插入；以組氨酸脫氫酶基因(his4)作為互補(bǔ)性篩選標(biāo)志或其它篩選標(biāo)記，如eptone,Zeocinr,his6等；如作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322或pUC18、pUC19、pBR329、pKK232-3等)的序列。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母宿主系統(tǒng)有二種方式，即附加型(Episome)和整合型(Integration)。附加型的重組質(zhì)粒存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，則重組質(zhì)粒在構(gòu)建時要插入自主復(fù)制序列(Autonomous Replication Sequence,ARS)，如大腸桿菌的復(fù)制序列(CoIE1 ori)，以利于在酵母胞內(nèi)自主復(fù)制。整合型表達(dá)載體中無酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。將表達(dá)載體用不同的酶切(如BglⅡ、NotⅠ或SalⅠ、StuⅠ等)后線性化，使之整合于酵母基因組中的aox1或his4的位點(diǎn)。整合的方式通常有四種一是雙位點(diǎn)互換(Double Cross-over),發(fā)生在染色體阿AOX1位點(diǎn)和表達(dá)載體的PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，含PAOX1、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達(dá)單元置換染色體上有完整功能的aox1，產(chǎn)生的菌株表型為MutsHis+(aox1-aox2-)。當(dāng)酵母的aox1基因被替換而丟失后，就產(chǎn)生了Muts表型(Methanol utilization slow)，此時它們將利用弱的aox2基因啟動合成AOX，故在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。二是aox1單位點(diǎn)互換(Single Cross-over)，發(fā)生在染色體aox1位點(diǎn)和表達(dá)載體的aox1區(qū)。外源基因的表達(dá)盒插在aox1基因的上游或下游，aox1基因仍然有活性，菌株的表型為Mut+His+(aox1+aox2+)，這種轉(zhuǎn)化子仍然利用甲醇；三是his4單位點(diǎn)置換，發(fā)生在染色體his4位點(diǎn)和表達(dá)載體的his4位點(diǎn)，使得一個或多個表達(dá)盒插入在his4位點(diǎn)，獲得的菌株表型是Mut+His+(aox1+aox2+)；四是His4雙交換，結(jié)果菌株表型為Mut+His+(aox1+aox2+)，不過這種轉(zhuǎn)化子不能被檢出而已。


圖1為搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)外源目的蛋白電泳圖。
圖2為不同甲醇濃度搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)惡性瘧原蟲融合抗原電泳圖。
本發(fā)明根據(jù)在FUS-50(A)多參數(shù)全自動發(fā)酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數(shù)據(jù)和根據(jù)細(xì)胞代謝物流平衡的原理提出的適用于基因工程巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)搖瓶表達(dá)外源蛋白的全合成培養(yǎng)基，既能滿足把搖瓶發(fā)酵結(jié)果放大到發(fā)酵罐上的需要，也克服了許多研究者采用Invertogen Kit提供的與發(fā)酵罐發(fā)酵使用的復(fù)合搖瓶培養(yǎng)基的困難，同時為在搖瓶發(fā)酵規(guī)模優(yōu)化表達(dá)外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
實(shí)施例1將0.5％甲醇(體積)、150g/L(NH4)2SO4、0.5g/L氯化鈣、30g/L硫酸鉀(SO42+)、4mL/L PTM1和pH為6.0的磷酸緩沖液置于去離子水中，即獲得所說的培養(yǎng)基。
實(shí)施例2基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶培養(yǎng)表達(dá)重組人血清白蛋白1.1菌株巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115 HSA-1菌株，遺傳表型為Mut+his+，啟動子為PAOX1，表達(dá)載體pPIC9K，蛋白信號肽序列為來自釀酒酵母的α-雜交因子AMF，外源基因?yàn)槿搜灏椎癱DNA，載體呈線型整合在染色體上(基因構(gòu)建方法和重組菌株篩選按有關(guān)的克隆手冊進(jìn)行)。1.2搖瓶培養(yǎng)方法以在YPD培養(yǎng)基平板30度培養(yǎng)5至7天的單菌落挑至MGY種子培養(yǎng)基(20mL/250mL三角瓶)中，MGY培養(yǎng)基組分及含量見下表，30℃，220r/min培養(yǎng)22h，OD600約20左右。離心搖瓶生長培養(yǎng)基，棄去上清液，按搖瓶生長培養(yǎng)基體積與本發(fā)明全合成培養(yǎng)基之比為1∶1，接入實(shí)施例1的全合成培養(yǎng)基(20mL/250mL三角瓶)，30℃,200-220r/min培養(yǎng)120h。每24h補(bǔ)加100％甲醇(A.R)至一定終濃度。放瓶離心后，取上清液進(jìn)行分析，總蛋白為考馬斯亮蘭染色法，目的蛋白分析方法為SDS-PAGE凝膠電泳，然后電泳膠經(jīng)計算機(jī)掃描根據(jù)電泳帶染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析(GIS-1000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，2.0版本，按說明書操作，背景消除按自動進(jìn)行，低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白為上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
MGY種子培養(yǎng)基
注生物素單獨(dú)過濾除菌，其它混勻后8磅滅菌15分鐘。1.3搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)外源目的蛋白結(jié)果從電泳結(jié)果(
圖1)可明顯看出以本發(fā)明的全合成搖瓶表達(dá)培養(yǎng)基在不同的誘導(dǎo)的時間內(nèi)目的蛋白即重組人血清白蛋白(rHSA)的表達(dá)是十分明顯的，在不同的搖瓶培養(yǎng)時間有不同的目的蛋白表達(dá)量。雖然從搖瓶培養(yǎng)12小時到72小時均有目的蛋白表達(dá)，但不同的目的蛋白(如分子量大小、氨基酸組成以及蛋白質(zhì)的立體空間結(jié)構(gòu)的不同)就應(yīng)有不同的搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)時間，最好為48h-120h。
實(shí)施例3基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶培養(yǎng)表達(dá)惡性瘧原蟲融合抗原1.1菌種畢赤氏酵母GS115/pfcp菌株，遺傳表型為Mut+His-,啟動子為PAOX1，重組質(zhì)粒為pPIC3.5/pfcp，外源蛋白為惡性瘧原蟲融合cDNA，線性整合在染色體上。1.2搖瓶培養(yǎng)方法同實(shí)施例2.1.3搖瓶培養(yǎng)不同甲醇濃度誘導(dǎo)表達(dá)惡性瘧原蟲融合抗原蛋白電泳分析根據(jù)本發(fā)明的全合成培養(yǎng)基在不同的甲醇誘導(dǎo)濃度搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)惡性瘧原蟲融合抗原蛋白，甲醇濃度范圍為0.5％-3.0％均有目的蛋表達(dá)，但最好的甲醇濃度范圍為1.5-2.0％。由甲醇?xì)埩魸舛群图?xì)胞菌濃可知，當(dāng)甲醇濃度較低時，因甲醇限制了細(xì)胞的能量代謝和碳源代謝，而引起目的蛋白表達(dá)量不高；當(dāng)甲醇濃度較高時，有可能是甲醇使細(xì)胞代謝有抑制作用，從而導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)濃度下降。其結(jié)果見下表及圖2。
不同甲醇濃度搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)惡件瘧原蟲融合抗原
權(quán)利要求
1．一全合成培養(yǎng)基，其特征在于組分和含量包括碳源0.1-3.0％(v/v)氮源0.1-12g/L磷源(PO43-)濃度為0.01-1.0moL/L無機(jī)鹽 0.002-3.0g/LSO42+0.001-0.4mol/LPTM11-16mL/LpH緩沖溶液的加入量使培養(yǎng)基的pH保持為2.5-9.0；所說的無機(jī)鹽為鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、鐵(Fe2+,Fe3+)、銅(Cu2+)或鋅(Zn2+)的無機(jī)鹽；所說的SO42+選自硫酸鹽或硫酸；所說的PTM1為Invitrogen公司產(chǎn)品貨號Cat.No.Q300-12或Q300-13。
2．如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，組分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；無機(jī)鹽 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L；pH緩沖溶液的加入量使培養(yǎng)基的pH保持為3.0-7.5。
3．如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，組分和含量包括碳源0.1-1.0％；氮源5-10g/L；磷源0.1-1.0moL/L；無機(jī)鹽 0.1-1.5g/L；SO42+0.1-0.1moL/L；PTM14-12mL/L。pH緩沖溶液的加入量使培養(yǎng)基的pH保持為5.0-7.0。
4．如權(quán)利要求1、2或3任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所說的碳源為甲醇、甲醇混含山梨醇或甘油；所說的氮源為(NH4)SO4、NH4Cl、NH4NO3、NH4OH、尿素或CH3COONH4；所說的磷源為磷酸或磷酸鹽；所說的無機(jī)鹽為氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化(亞)鐵、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、氯化銅、氯化鋅或硫酸鋅等中的一種或一種以上；所說的SO42+選自硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸(亞)鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鈉或硫酸鉀中的一種或一種以上；所說的pH緩沖系統(tǒng)可采用檸檬酸緩沖系統(tǒng)、克拉克-盧勃斯(Clark-Lubs)緩沖液和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。
5．如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，磷酸鹽為磷酸鉀、磷酸二氫鉀(鈉)或磷酸氫二鉀(鈉)。
6．如權(quán)利要求1～3任一所述的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養(yǎng)型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達(dá)搖瓶培養(yǎng)。
7．如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養(yǎng)型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達(dá)搖瓶培養(yǎng)。
8．如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，可用于基因工程甲醇營養(yǎng)型酵母或采用PAOX1、PAOX2啟動子的基因工程酵母的外源蛋白表達(dá)搖瓶培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種一全合成培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法。本發(fā)明根據(jù)在FUS－50(A)多參數(shù)全自動發(fā)酵罐上對C、N、P、O源等在線檢測數(shù)據(jù)和根據(jù)細(xì)胞代謝物流平衡的原理,通過優(yōu)化培養(yǎng)基pH值的范圍和選擇合適的緩沖系統(tǒng)、通過添加充足的碳源、氮源和磷源、通過添加充足的無機(jī)鹽、維生素、生物促進(jìn)劑等方法以利于外源蛋白的高表達(dá)的適用于基因工程巴氏畢赤酵母搖瓶表達(dá)外源蛋白的全合成培養(yǎng)基,為搖瓶發(fā)酵規(guī)模優(yōu)化表達(dá)外源蛋白條件提供了更簡單、更有效的方法。
文檔編號C12N15/81GK1309178SQ01105699
公開日2001年8月22日 申請日期2001年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月20日
發(fā)明者張嗣良, 郭美錦, 儲炬, 莊英萍, 杭海峰 申請人:華東理工大學(xué)