專(zhuān)利名稱(chēng)：桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，更具體涉及一種桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法。
在Gene bank對(duì)比分析得到如下結(jié)果與擬南芥同源基因比較，相同核酸254個(gè)bp，期望值為3e-65，在進(jìn)行蛋白質(zhì)比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)OEM1基因序列和擬南芥同源序列推導(dǎo)編碼的氨基酸，其相同性為86％，相似性為91％，gaps為2％，與garden Pea的外膜蛋白比較，其相同性為47％，相似性為55％，gaps為5％，與擬南芥外膜蛋白的類(lèi)似蛋白比較，相同性51％，相似性61％，gaps為12％，與Spinaciaoleraies的葉綠體外膜蛋白比較，相同性為43％，相似性為57％，與garden pea的葉綠體外膜蛋白比較，其相同性為53％，相似性為60％，這些事實(shí)證明，在本發(fā)明被公布之前，尚未有公開(kāi)或報(bào)道過(guò)桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法。
本發(fā)明的目的是提供了一種桂竹香外膜蛋白基因全長(zhǎng)cDNA的克隆的方法，在桂竹香幼葉中提取總RNA，方法易行，操作簡(jiǎn)便?？寺〉墓鹬裣阃饽さ鞍譪DNA序列包括一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，全長(zhǎng)537bp。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施桂竹香外膜蛋白cDNA文庫(kù)的建立，利用同源探針，采用噬菌斑原位雜交的方法從桂竹香苗期cDNA文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，并轉(zhuǎn)入E.coli BM25.8中，經(jīng)限制酶切分析確證為重組子。將重組子送出測(cè)序并在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索獲得結(jié)果.具體步驟如下1)一步法提取桂竹香幼葉總RNA2)利用RNA直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，3)利用同源序列合成探針；4)用地高辛標(biāo)記探針，噬菌斑原位雜交的方法篩選桂竹香苗期cDNA文庫(kù)；5)利用PCR的方法快速確定陽(yáng)性克隆是所篩選的重組子；6)限制酶切分析，Southern雜交分析確定為重組子；7)測(cè)序，并通過(guò)Bioinfo matics分析，確定該基因?yàn)樾碌奈幢豢寺∵^(guò)的桂竹香外膜蛋白基因(cDNA)序列。桂竹香外膜蛋白基因序列是GGCCATTATGGCCGGGGGTTGAAGTGAAGAAGAAACTGCAGCAATGGAGAAATCAGGAGATGATGTCAAATTCCCAAAACTGGAGAAACCTACAGGAAAGAAACAGACAGCGACGGTTGTTGTGGGAGTGTTGGCCGTGGGATGGTTGGCGATAGAGCTCGTGTTTAAGCCATTGTTCAAGAAGCTGAGCTCCGCTAAGGACAAATCCGATTCGGACGATGCCAGTGCCACCGCTCCTCCTCCCGCGTCGGACGCCTGAATTGGTGAGAATTATAAAGTCGACACGTGGAGGTCTTAATTACTTTTTTCTTAATGAAGGCTCATATTAAAAGCAAAATGTTGTGTGTTCTTTCCTTGCTTCGTTTGTAATATCGTTCGGTTTTACTTCTTTTGACGATGTTTTTAATTAATCTCCCTTTCCCTTTTCAATAAAATCCCGAGAGAAGGATTAATAAATCAATGAGATACGATGTACTAATTGGGTTTCACAAAACACCCCCCCCNCCCACCAAAAACCATGTCGGCCGCCCTCGGCCCCA構(gòu)建桂竹香苗期cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)材料是十字花科桂竹香(Cheiranthus cheiri L.)的幼嫩葉片，利用一步法提取葉片總RNA，LD-PCR的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并在噬菌斑原位雜交方法篩選cDNA文庫(kù)的同時(shí)，利用PCR的方法快速篩選cDNA文庫(kù)，使選擇重組子的把握性更大。
本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果
真核生物基因組DNA十分龐大，且含有大量的重復(fù)序列，因此直接以染色體DNA為材料來(lái)克隆目的基因是很困難的，于是人們采用的由mRNA產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行克隆，即建立cDNA文庫(kù)，目前發(fā)現(xiàn)的基因及用來(lái)進(jìn)行研究的目的基因，絕大部分是通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選得到的。
傳統(tǒng)合成的dscDNA的方法是自我引導(dǎo)法，由于S1核酸酶的使用，使得到的cDNA克隆喪失了mRNA5’端的許多信息，因此我們采用不使用S1核酸酶的全長(zhǎng)cDNA的合成技術(shù)，直接以總RNA為原料來(lái)合成dscDNA，而省去了純化mRNA的步驟，在第一條cDNA鏈的合成中，以一已修飾的oligodT為引物，SMARTIII oligo為mRNA5’端的延伸模板，而在第二條鏈的合成，是以它們的互補(bǔ)位點(diǎn)為PCR引物的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)PCR的方法完成。合成中不完整的sscDNA或由polyA-RNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA由于缺乏這兩個(gè)位點(diǎn)，而不被擴(kuò)增成dscDNA，這樣基因組DNA和PolyA-RNA的污染即可消除，從而達(dá)到選擇的目的。
在噬菌斑原位雜交篩庫(kù)的過(guò)程中，我們采用了BoehringerMannheim公司生產(chǎn)的地高辛-11-dUTP標(biāo)記探針，采用抗體復(fù)合物標(biāo)記和顏色反應(yīng)兩步檢測(cè)法，從而避免了操作者會(huì)受同位素輻射需要防護(hù)裝置和監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程等同位素操作的弊端。
在篩庫(kù)的同時(shí)，還使用了PCR反應(yīng)進(jìn)行快速篩選噬菌體克隆的方法，從而節(jié)省篩庫(kù)的時(shí)間。方法易行，操作簡(jiǎn)便，效果好，克隆出桂竹香外膜蛋白cDNA序列，可廣泛應(yīng)用于研究桂竹香細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸，信號(hào)傳遞和細(xì)胞代謝等打好基礎(chǔ)。
基因克隆的具體方法如下1、桂竹香幼葉總RNA的提取(一步法)取0.5g新鮮桂竹香嫩葉，加入液氮研磨，用5ml異硫氰酸胍溶液裂解，在冰上放置2min，按次序加入2m NaAC 0.5ml，水飽和酚5ml氯仿/異戊醇(24∶1)1ml，旋渦振蕩，冰浴5min，4℃10000g離心20min，將上層水相移入1.5ml Ep管中，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃中冰箱沉淀1hr；4℃，10000g離心20min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的70％乙醇洗滌兩次，溶于300ul水中-70℃保存。取5ul RNA于1.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(60v，1hr)取1ul RNA用紫外分光光度劑測(cè)定純度和含量。
2、利用RNA直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并用LD-PCR的方法構(gòu)建桂竹香苗期cDNA文庫(kù)；(1)cDNA文庫(kù)的建立cDNA的合成參考Clontech公司試劑盒的用戶(hù)手冊(cè)，取1ul RNA溶液，稀釋至10ul，再?gòu)闹腥?ul為模板，以已修飾的oligo(dT)為引物，SMARTIII oligo為延伸模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成全長(zhǎng)sscDNA，通過(guò)LD-PCR合成dscDNA，其循環(huán)參數(shù)為95℃1min，22個(gè)循環(huán)(95℃15sec，68℃ 6min)。取5ul PCR產(chǎn)物于1.1％argrose/EtBr膠中電泳檢測(cè)。取50uldscDNA進(jìn)行蛋白酶消化，sfi I酶切，通過(guò)一個(gè)CHROMASPIN-400柱子，收集大于500bp的cDNA。將此cDNA與同樣sfi I酶切過(guò)的入Triplex2TM載體連在包裝提取物中加入4ul cDNA，混勻；稍離心，沉淀碎片，取上清，此為包裝產(chǎn)物。
(2)文庫(kù)質(zhì)量的測(cè)定由于提供的E.coli XL1-blue菌種是保存于-70℃，加有25％甘油的LB培養(yǎng)基中，故應(yīng)先活化菌種。用接種環(huán)取一杯菌環(huán)菌種在LB/tetagar平板上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，此為菌種的儲(chǔ)存平板；從儲(chǔ)存平板上挑取單克隆在LB/MgSO4agar平板上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，此為菌種的工作平板。從工作平板上挑取單個(gè)克隆，接種到裝有15mlLB/MgSO4agar液體培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，37℃，140rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取2ml過(guò)夜培養(yǎng)物+2ml Ep管中，5.000rpm離心5min；去上清，用1ml 10mm MgSO4重懸沉淀。取1ul包裝產(chǎn)物，用1Xlambda dilutlon buffer稀釋至5ul；另取1ul，同樣稀釋至10ul，然后從這兩個(gè)稀釋后的包裝產(chǎn)物中各取1ul，轉(zhuǎn)染200ul MgSO4重懸的XLI-blue過(guò)夜培養(yǎng)物(37℃，30min)，然后與3ml熔化的LB/MgSO4上層瓊脂混合，鋪板(90-mm平板)，37℃培養(yǎng)21hr后計(jì)數(shù)，測(cè)其滴度3、利用同源序列合成探針在Gene bank中比較，獲得該基因保守區(qū)段，以此為據(jù)，并按隨機(jī)引物標(biāo)記法合成用地高辛標(biāo)記的探針，長(zhǎng)約640bp。
4、用地高辛標(biāo)記探針，采用噬菌斑原位雜交的方法篩選桂竹香苗期cDNA文庫(kù)按常規(guī)鋪cDNA文庫(kù)的150mm培養(yǎng)皿平板10個(gè)，用尼龍膜揭膜，變性并在UV-交聯(lián)儀下交聯(lián)固定DNA。在42℃下雜交液中雜交過(guò)夜，常溫洗膜2次，每次5min，68℃洗膜2次，每次15min，在washing buffer中浸1-5min，在10ml blocking solution中溫育30min，在20ml antibody solution中溫育30min，再用washing buffer20ml洗2-5min，最后用NBT/BCIP進(jìn)行顏色反應(yīng)，在黑暗中溫育2-3hr，隨時(shí)觀察尼龍膜上是否出現(xiàn)斑點(diǎn)。挑取藍(lán)色斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的噬菌斑于SM buffer中保存。
5、陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)為了進(jìn)一步確定所挑取的陽(yáng)性克隆是重組子，并確定其堿基序列的長(zhǎng)度，使用PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。分別以克隆載體上兩段序列和探針上兩段序列為引物，進(jìn)行PCR，循環(huán)參數(shù)為72℃ 3min，95℃ 30sec、50℃ 30sec，72℃ 30sec(循環(huán)30次)72℃ 3min，所得PCR產(chǎn)物在0.8％ agrose電泳(80V，1hr)，發(fā)現(xiàn)以載體一段序列為引物進(jìn)行PCR，電泳時(shí)長(zhǎng)度大約在1kb左右，以探針的序列為引物，其PCR產(chǎn)物電泳時(shí)，長(zhǎng)度在500bp-750bp之間。
6限制酶切分析，將經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入E.coliBM25.8中，并提取質(zhì)粒，經(jīng)限制酶切分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與PCR結(jié)果相似。
7、將獲得的重組子送出測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank+EMBL)，所得結(jié)果顯示，沒(méi)有相同基因順序出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法，包括下列步驟(1)一步法提取桂竹香幼葉總RNA；(2)利用總RNA直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并用LD-PCR方法構(gòu)建桂竹香苗期cDNA文庫(kù)；(3)利用同源序列設(shè)計(jì)并合成同源探針；(4)用地高辛標(biāo)記同源探針，噬菌斑原位雜交方法篩選桂竹香苗期cDNA文庫(kù)；(5)利用PCR的方法快速篩選并確定陽(yáng)性克??；(6)限制性酶切分析，Sourthen雜交分析確定為重組子；(7)測(cè)序，并通過(guò)Bioinfomatics分析，確定桂竹香外膜蛋白基因序列。
2.按權(quán)利要求1所述的一種桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法，其特征是桂竹香外膜蛋白基因序列是GGCCATTATGGCCGGGGGTTGAAGTGAAGAAGAAACTGCAGCAATGGAGAAATCAGGAGATGATGTCAAATTCCCAAAACTGGAGAAACCTACAGGAAAGAAACAGACAGCGACGGTTGTTGTGGGAGTGTTGGCCGTGGGATGGTTGGCGATAGAGCTCGTGTTTAAGCCATTGTTCAAGAAGCTGAGCTCCGCTAAGGACAAATCCGATTCGGACGATGCCAGTGCCACCGCTCCTCCTCCCGCGTCGGACGCCTGAATTGGTGAGAATTATAAAGTCGACACGTGGAGGTCTTAATTACTTTTTTCTTAATGAAGGCTCATATTAAAAGCAAAATGTTGTGTGTTCTTTCCTTGCTTCGTTTGTAATATCGTTCGGTTTTACTTCTTTTGACGATGTTTTTAATTAATCTCCCTTTCCCTTTTCAATAAAATCCCGAGAGAAGGATTAATAAATCAATGAGATACGATGTACTAATTGGGTTTCACAAAACACCCCCCCCNCCCACCAAAAACCATGTCGGCCGCCCTCGGCCCCA
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種桂竹香外膜蛋白基因克隆的方法,該方法包括下列步驟:1)一步法提取桂竹香幼葉總RNA;2)利用RNA直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;3)利用同源序列合成探針;4)用地高辛標(biāo)記探針,噬菌斑原位雜交的方法篩選桂竹香苗期cDNA文庫(kù);5)利用PCR的方法快速確定陽(yáng)性克隆是所篩選的重組子;6)限制酶切分析,Southern雜交分析確定為重組子;7)測(cè)序,并通過(guò)Bioinfo matics分析,確定該基因?yàn)樾碌奈幢豢寺∵^(guò)的桂竹香外膜蛋白cDNA序列。本發(fā)明方法易行,操作簡(jiǎn)便,效果好?？寺〕龅墓鹬裣阃饽さ鞍椎腸DNA序列還可應(yīng)用與研究桂竹香細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸,信號(hào)傳遞和細(xì)胞代謝等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1362517SQ0110640
公開(kāi)日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2001年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月2日
發(fā)明者李旭鋒, 劉天艷, 王勁, 袁旭 申請(qǐng)人:成都天友發(fā)展有限公司