專(zhuān)利名稱(chēng)：肌細(xì)胞增殖抑制因子Fwa267的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最新鑒定的多核苷酸和由其編碼的多肽，這種多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法以及這些多核苷酸和多肽的用途。本發(fā)明的多肽已被鑒定為肌細(xì)胞抑制因子，下文有時(shí)稱(chēng)為“Fwa267”。本發(fā)明的多核苷酸和多肽是人類(lèi)來(lái)源的。
心腦血管病是威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有260萬(wàn)中國(guó)人死于此病，平均每12秒就有一位同胞被該病奪去生命。在中國(guó)，心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率從1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。據(jù)世界銀行預(yù)測(cè)到2020年，全世界心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率將從1990年的28.9％升至36.3％，其中70％的心腦血管病發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)現(xiàn)有高血壓患者1億多人，并以每年350萬(wàn)人的速度遞增；腦中風(fēng)致殘者600萬(wàn)人，并以每年150萬(wàn)的速度遞增；冠心病患者100萬(wàn)人，并以每年50萬(wàn)的速度遞增；此外，還有心肌病患者300萬(wàn)人。因此，心腦血管病的防治對(duì)減輕人類(lèi)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，確保人體健康具有十分重要的意義。
心腦血管病的治療經(jīng)歷了四個(gè)大的階段1920年代，循環(huán)動(dòng)力學(xué)的研究揭示了心臟是一個(gè)“泵”，由此奠定了心力衰竭的治療基礎(chǔ)；60-70年代，對(duì)心血管病危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)及處理，使西方國(guó)家心臟病的發(fā)病率下降了近40％；1970年，對(duì)心肌細(xì)胞電生理學(xué)的研究，提供了抗心律失常、電生理檢查及治療的新方法；80年代末到90年代初，對(duì)血管生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，產(chǎn)生了心臟介入治療的新方法。
心衰、抗心律失常、及介入治療對(duì)搶救心腦血管病人的生命，提高其生活質(zhì)量起到了積極作用。然而，由于這些方法僅針對(duì)癥狀進(jìn)行治療，沒(méi)有從根本上觸及病因，所以治療針對(duì)性不強(qiáng)。雖然延長(zhǎng)了病人的壽命，但沒(méi)有真正達(dá)到預(yù)防和治愈的目的。因此，在分子生物學(xué)的水平進(jìn)行研究，查明心腦血管病的致病因素及發(fā)病機(jī)理，有望在該病的治療方面取得突破性進(jìn)展，達(dá)到從根本上遏制心腦血管病的目的。
cDNA文庫(kù)是生物工程領(lǐng)域的重要研究工具之一。通常從細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的DNA拷貝(即cDNA，Complementary DNA)。單鏈cDNA分子在DNA聚合酶的作用轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子，然后再插入載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌中長(zhǎng)成克隆。這樣的每個(gè)克隆只包含特定的mRNA信息，這樣的一套克隆就稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。
由于cDNA不含內(nèi)含子，從cDNA文庫(kù)中可以直接篩選到相應(yīng)的表達(dá)基因，故相對(duì)基因庫(kù)而言，cDNA文庫(kù)具有操作簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。人體不同細(xì)胞表達(dá)基因的差異決定了其組織和器官表型的差異，從人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中分離和鑒定特異表達(dá)基因，特別是分離和鑒定疾病相關(guān)基因，是研究遺傳性心血管病的有效方法之一。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的成熟多肽Fwa267以及具有生物學(xué)活性并在診斷或治療上有用途的Fwa267的片段、類(lèi)似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人類(lèi)來(lái)源的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA，以及具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用途的該核酸分子的片段、類(lèi)似物和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用重組技術(shù)生產(chǎn)Fwa267多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了將Fwa267多肽或編碼Fwa267多肽的多核苷酸用于治療的方法。例如，治療心血管增生性疾病，抑制腫瘤形成。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了所述多肽的拮抗劑，其可用來(lái)抑制這些多肽的作用。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了與本發(fā)明核酸序列中的突變、以及與本發(fā)明的多肽異常表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了將本發(fā)明的多肽或編碼這種多肽的多核苷酸、在體外用于科學(xué)研究、DNA合成以及人工構(gòu)建DNA載體的方法。
根據(jù)本文的教導(dǎo)，上述方面及相關(guān)方面對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)。從文庫(kù)中獲取Fwa267的基因片段，通過(guò)EST拼接得到Fwa267的全長(zhǎng)cDNA序列。進(jìn)而研究Fwa267基因在不同組織的表達(dá)與分布，研究Fwa267多肽的活性與功能。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)序列，其編碼具有推定的、如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從成人主動(dòng)脈的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。其定位于人體細(xì)胞的第11號(hào)染色體上。其包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框架，可以編碼具有370個(gè)氨基酸殘基的多肽。同源性分析表明Fwa267多肽僅與分泌性生長(zhǎng)因子fallotein顯示出46％的同源性。
推測(cè)的Fwa267蛋白由370個(gè)氨基酸組成。其序列特征為(A)從276至279Aa(NYSV)為N-糖基化位點(diǎn)；(B)從268至271 Aa(KRYS)為cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶位點(diǎn)；(C)從262至270Aa(RLNDDAKRY)為酪氨酸激酶位點(diǎn)；(D)從1至61Aa(MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDLYRRDETIQVKGN)為T(mén)onB依賴(lài)的受體蛋白信號(hào)1；(E)從100至105Aa GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa(GGNCGC)，304至309Aa(GNCGCG)為豆蔻酰化位點(diǎn)；(F)從17至19Aa(SCR)，29至31Aa(SIK)，66至68Aa(SPR)，80至82Aa(TWR)，150至152Aa(TFK)，243至245Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，243至245Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，320至322Aa(SGK)為蛋白激酶C位點(diǎn)。(G)從17至20Aa(SCRD)，168至171Aa(SLLE)，181至184Aa(TNWE)，199至202Aa(SVTD)，219至222Aa(TVED)，231至234Aa(SWQE)，250至253Aa(SYHD)，256至259Aa(SKVD)為酪蛋白激酶II位點(diǎn)。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以和SIQ ID NO1(全長(zhǎng)3739個(gè)核苷酸)所示的編碼序列(107至1219位核苷酸)相同；或者，由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，編碼序列也可以不同與SIQ ID NO1所示的編碼序列。
編碼SIQ ID NO2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如編碼多肽前導(dǎo)序列或分泌序列的多核苷酸；成熟多肽的編碼序列(以及任選的附加編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列5’和/或3’端的非編碼序列。
因此，術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括僅含有多肽編碼序列的多核苷酸以及含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼推定的、具有SIQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽片段、類(lèi)似物及衍生物。所述變異體可以是天然產(chǎn)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或者是非天然產(chǎn)生的變異體。正如本領(lǐng)域已知的，等位基因變異體是一段多核苷酸的另一種形式，其可以帶有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，而實(shí)質(zhì)上不改變所編碼多肽的功能。
因此，本發(fā)明包括能夠編碼與SIQ ID NO2所示成熟多肽具有相同氨基酸序列的多核苷酸，還包括能夠編碼SIQ ID NO2所示成熟多肽之片段、衍生物和類(lèi)似物的多核苷酸變異體。這些變異體包括缺失變異體、取代變異體、添加或插入變異體。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中，與有助于多肽由宿主細(xì)胞表達(dá)及分泌的多核苷酸(如產(chǎn)生前導(dǎo)序列的多核苷酸)相融合。前導(dǎo)序列作為分泌序列而控制多肽從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)。具有前導(dǎo)序列的多肽是前體蛋白(preprotein)，由宿主細(xì)胞切割其前導(dǎo)序列后可以產(chǎn)生成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸也可以編碼蛋白原(proprotein)，蛋白原是具有原序列(prosequence)的成熟蛋白，是5’端附加了氨基酸殘基的成熟蛋白，是一種無(wú)活性形式。切除原序列后，可以產(chǎn)生有活性的成熟蛋白。
因此，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一種成熟蛋白，也可以編碼具有原序列的蛋白，還可以編碼既有原序列(prosequence)又有前導(dǎo)序列(presequence)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸還包括在同一讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，標(biāo)記序列可用于純化本發(fā)明的多肽。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞為細(xì)菌時(shí)，標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的、用于純化融合產(chǎn)物的六組氨酸。或者，當(dāng)宿主為哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)，HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于從流感血凝集蛋白衍生的一個(gè)表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指與產(chǎn)生多肽有關(guān)的DNA片段，其包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明全長(zhǎng)基因的片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針，用來(lái)分離全長(zhǎng)基因和與該基因有高度同源性或相似生物活性的其它基因。所說(shuō)的探針優(yōu)選具有至少30個(gè)堿基，并且可以含有50個(gè)或更多個(gè)堿基。所述探針也可以用來(lái)鑒別相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和含有完整基因的一個(gè)或多個(gè)基因組克隆。其中，完整基因包括調(diào)節(jié)序列、啟動(dòng)子序列、外顯子和內(nèi)含子。例如可以根據(jù)已知的DNA序列合成寡核苷酸探針，進(jìn)而分離出基因的編碼部分。與本發(fā)明基因序列互補(bǔ)的、標(biāo)記的寡核苷酸探針可以用來(lái)從人類(lèi)cDNA、基因組DNA或mRNA文庫(kù)中篩選與其雜交的文庫(kù)成員。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的多核苷酸雜交的核酸序列。條件是兩個(gè)序列間具有至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選具有至少97％的同源性時(shí)雜交才會(huì)發(fā)生。與上述序列雜交的多核苷酸可以編碼與本發(fā)明成熟多肽具有相同生物學(xué)功能或活性的多肽。
此外，與本發(fā)明的多核苷酸具有同源性并能夠雜交的多核苷酸可以具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選至少50個(gè)堿基，其可以保留或不保留活性。這樣的多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的探針，用于回收多核苷酸、作為診斷探針或作為PCR引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2所示多肽的多核苷酸具有至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同源性的多核苷酸及其片段(所述片段具有至少30個(gè)堿基，優(yōu)選至少50個(gè)堿基)，以及由這些多核苷酸編碼的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明，本發(fā)明涉及推定的、具有SIQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”，當(dāng)涉及由SIQ ID NO1編碼的多肽或者具有如SIQID NO2所示氨基酸序列的多肽時(shí)，是指基本上保留了所述多肽生物學(xué)功能或活性的多肽。所說(shuō)的類(lèi)似物可以包括蛋白原，蛋白原經(jīng)部分切除后可以產(chǎn)生有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
所說(shuō)的多肽(SIQ ID NO2)及其片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代，并且被取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼子編碼的，或者(ii)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基，或者(iii)一種多肽，其中成熟多肽與另一種化合物融合，如與增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)融合，或者(iv)一種多肽，其中成熟多肽與附加氨基酸殘基融合，例如與前導(dǎo)或分泌序列融合，又如與用來(lái)純化成熟多肽的序列融合。通過(guò)本文的教導(dǎo)，這樣的片段、衍生物及類(lèi)似物可視為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離形式提供的，并且優(yōu)選將其純化成均一(同質(zhì))物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指所述物質(zhì)脫離了原始環(huán)境(例如，如果該物質(zhì)是天然存在的，則指天然環(huán)境)。例如，一種在活體動(dòng)物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分離的，但從天然系統(tǒng)中部分或全部共存物質(zhì)中分離出同樣的多核苷酸或多肽則是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，只要這種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQ ID NO2的多肽具有至少85％的同源性，更優(yōu)選90％的同源性，最優(yōu)選95％的同源性的多肽。本發(fā)明還包括上述多肽的片段，多肽片段通常包含至少30個(gè)，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所熟知的，兩個(gè)多肽之間的“同源性”是通過(guò)將一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與另一個(gè)多肽比較而確定的。
通過(guò)多肽合成，本發(fā)明的多肽片段(或部分多肽)可用于生產(chǎn)全長(zhǎng)多肽。此片段可用作產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽的中間體。同樣的，本發(fā)明的多核苷酸片段可以用于合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體基因工程化的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)而產(chǎn)生的。所說(shuō)的載體可以是克隆或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可以在經(jīng)改良適于激活啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增本發(fā)明Fwa267基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(如溫度和pH值)是由不同的宿主細(xì)胞決定的，這些對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
通過(guò)重組技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸可以用于生產(chǎn)多肽。多核苷酸可以包含在任何一種適于表達(dá)多肽的載體中。這樣的載體包括染色體來(lái)源的、非染色體來(lái)源的和合成的DNA序列。例如SV40衍生物，細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體DNA，桿狀病毒，酵母質(zhì)粒，從質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合得到的載體，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。此外，還可以使用其它載體，只要其可以在宿主中復(fù)制并存活。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來(lái)說(shuō)，是用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)中。
表達(dá)載體中的DNA序列可以與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連接，以指導(dǎo)mRNA的合成。啟動(dòng)子的例子有LTR或SV 40啟動(dòng)子，大腸桿菌的lac或trp，噬菌體λPL啟動(dòng)子，以及已知其它的、控制原核或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體也以包含指導(dǎo)翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以包含用于擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。
此外，優(yōu)選的表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便為轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞的篩選提供表型特征。例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者如用于大腸桿菌的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
含有上述合適的DNA序列以及合適的啟動(dòng)子或者調(diào)控序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳎允蛊浔磉_(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子有細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過(guò)本文的教導(dǎo)，選擇合適的宿主可視作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明還包括含有以上廣泛描述的一種或多種序列的重組構(gòu)建體。構(gòu)建體包括正向或反向插入了本發(fā)明核酸序列的載體，如質(zhì)粒或病毒載體。在更為理想的實(shí)施方案中，構(gòu)建體還包含了可操作地與所述序列連接的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子。許多合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。例如，細(xì)菌載體pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核載體pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。此外，還可以使用其它的質(zhì)粒或載體，只要它們能夠在宿主中復(fù)制并存活。
可以用帶有CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)或其它選擇標(biāo)記的載體從基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩個(gè)合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，SV胸苷激酶，早期和晚期SV40、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。選擇適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子可視作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔法可以實(shí)現(xiàn)構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以經(jīng)由常規(guī)方式產(chǎn)生由重組序列編碼的產(chǎn)物。而且，本發(fā)明的多肽可以用常規(guī)的多肽合成儀合成。
在合適啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或其它細(xì)胞中表達(dá)。用來(lái)源于本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，通過(guò)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以產(chǎn)生目的蛋白。Sambrook等人在《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中(1989，第二版，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室)描述了可用于原核和真核宿主的、合適的克隆及表達(dá)載體。
通過(guò)向載體中插入增強(qiáng)子序列，可以提高高等真核生物細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，一般約10至300bp，它作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子的例子有復(fù)制起點(diǎn)上游100至270bp的SV40增強(qiáng)子、多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
一般地，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)記基因(如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母的TRP1基因)，以及從高度表達(dá)的基因中得到、能夠指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以從編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等的操縱子中得到。異源序列以恰當(dāng)?shù)姆绞脚c翻譯起始序列及終止序列裝配。優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)蛋白向細(xì)胞周質(zhì)或細(xì)胞外培養(yǎng)基分泌的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以編碼含有N-末端識(shí)別肽的融合蛋白，該識(shí)別肽具有理想的特征，如穩(wěn)定表達(dá)的重組產(chǎn)物或者簡(jiǎn)化純化步驟。
將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，合適的翻譯起始和終止信號(hào)，以及有功能的啟動(dòng)子一起插入，可以構(gòu)建適用于細(xì)菌的表達(dá)載體。所說(shuō)載體包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以維持載體并在必要時(shí)在宿主中擴(kuò)增載體。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的多個(gè)種。
作為代表性但非限制性的例子，用于細(xì)菌的表達(dá)載體可以含有源自市售載體的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，這些市售載體包含公知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件。這樣的市售載體包括，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322“骨架”部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株，待其生長(zhǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用恰當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。常用離心法收獲細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保留得到的粗產(chǎn)物以進(jìn)一步純化。可以用任一種常規(guī)的方法破碎微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融法、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子有由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和能夠表達(dá)相容載體的其它細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從SV40病毒基因組中得到的DNA序列，如SV40復(fù)制起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接及多聚腺苷酸化位點(diǎn)可用來(lái)提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、植物凝集素層析和高效液相色譜層析(HPLC)。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的，或是化學(xué)合成的，或是用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)制備的。根據(jù)重組方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包含一個(gè)起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作人類(lèi)疾病的治療和診斷的研究試劑和材料。Fwa267可以抑制心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。在正常情況下，其可能參與維持心肌細(xì)胞的終末分化。過(guò)渡表達(dá)Fwa267可能會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞調(diào)亡壞死(如室壁瘤)，低水平表達(dá)則可能導(dǎo)致肌細(xì)胞增生。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定本發(fā)明多肽激活劑或拮抗劑的方法。方法之一是在某種化合物存在的情況下，將表達(dá)Fwa267受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制劑與Fwa267多肽一起培養(yǎng)，檢測(cè)該化合物增強(qiáng)或阻斷Fwa267多肽與受體相互作用后產(chǎn)生第二信使的能力。第二信使系統(tǒng)包括但不限于蛋白酪氨酸激酶系統(tǒng)(PTK)、cAMP鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解作用。鑒定多肽拮抗劑的另一種方法是競(jìng)爭(zhēng)抑制法。該法將某化合物不存在時(shí)，與受體結(jié)合的Fwa267多肽分子數(shù)設(shè)為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)該化合物存在時(shí)，與受體結(jié)合的Fwa267多肽分子數(shù)的變化來(lái)確定潛在的拮抗劑。
潛在的拮抗劑包括抗體，或者在某些情況下包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的寡肽，它們與所述多肽結(jié)合并有效地消除其功能。
另一個(gè)潛在的拮抗劑化合物是用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。通過(guò)三股螺旋形成反義DNA或RNA從而控制基因的表達(dá)，上述方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，可以依據(jù)編碼本發(fā)明成熟多肽的核酸序列5’端，設(shè)計(jì)長(zhǎng)約10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA。又如設(shè)計(jì)一種與轉(zhuǎn)錄涉及的基因區(qū)互補(bǔ)的DNA(三螺旋-參見(jiàn)Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，從而阻止轉(zhuǎn)錄以及本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。反義RNA在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為本發(fā)明的多肽(反義-Okano，J.神經(jīng)化學(xué)雜志，56560(1991)；作為基因表達(dá)反義抑制劑的脫氧寡核苷酸(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))?？梢詫⑸鲜龉押塑账醾魉椭良?xì)胞，從而在體內(nèi)表達(dá)反義RNA和DNA以抑制本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。
拮抗劑還包括一些小分子，這些小分子通過(guò)與本發(fā)明的多肽結(jié)合而阻止多肽與其受體的相互作用，從而阻斷其正常的生物活性。小分子包括但不限于小肽或類(lèi)肽分子。
本發(fā)明的多肽、其激活劑和拮抗劑可以與合適的載體結(jié)合形成藥物組合物。這樣的組合物包含治療有效量的多肽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及上述物質(zhì)的組合。其配方應(yīng)與給藥的方式相宜。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有本發(fā)明藥物組合物的一種或多種組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷(xiāo)售的信息。本發(fā)明的藥物組合物還可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以按常規(guī)方式給藥，如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。以治療和/或預(yù)防特定疾病有效的劑量施用藥物組合物。通常以至少大約10微克/千克體重的量給藥。在大多數(shù)情況下，以不超過(guò)每天約8毫克/千克體重的量給藥。在大多數(shù)情況之下，考慮到用藥途徑和癥狀等因素，給藥劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)的方式使用本發(fā)明的多肽及其激活劑和拮抗劑，這種方式常被稱(chēng)作“基因治療”。
因此，可以在體外用編碼本發(fā)明多肽的核酸(DNA或者RNA)對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行基因工程化處理，再將工程化的細(xì)胞提供給需要治療的患者。上述方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程化處理。
類(lèi)似的，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)基因工程化細(xì)胞，以便在體內(nèi)表達(dá)多肽。例如，用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，以使其能夠產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒顆粒。將這種生產(chǎn)細(xì)胞用于患者，從而在體內(nèi)工程化細(xì)胞并表達(dá)所說(shuō)的多肽。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，通過(guò)上述方法或其它方式施用本發(fā)明的多肽對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
可以得到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。
所述載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？墒褂玫暮线m啟動(dòng)子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV 40啟動(dòng)子；人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它啟動(dòng)子(例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可采用的病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。通過(guò)本文的教導(dǎo)，選擇載體上合適的啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列應(yīng)當(dāng)有合適的啟動(dòng)子控制?？梢允褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子)；或者異源啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子)；熱休克啟動(dòng)子；清蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人類(lèi)珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(如單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和人類(lèi)生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是編碼所述多肽的基因的天然啟動(dòng)子。
可以用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞以產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DNA細(xì)胞系(Miller、人類(lèi)基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)。載體可以用任何本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包埋在脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到脂類(lèi)上，然后引入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，該顆粒包含能夠編碼所述多肽的核酸序列。可以用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎莖干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血莖干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及Fwa267基因在診斷或檢測(cè)中的用途，通過(guò)檢測(cè)Fwa267核酸序列中的突變可以診斷出相關(guān)疾病或?qū)膊〉囊赘行浴?br> 可以用多種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)出攜帶Fwa267基因突變的個(gè)體?？梢詮幕颊叩募?xì)胞，如來(lái)自血液，尿，唾液，活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)，或者在分析前可以用PCR擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于相同目的。例如，與本發(fā)明多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可于鑒別和分析突變。如通過(guò)與正常的基因型相比較，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小改變來(lái)檢測(cè)缺失及插入?？梢越?jīng)與可以用放射性標(biāo)記的RNA或反義DNA與擴(kuò)增后的核酸序列雜交，以鑒別點(diǎn)突變。用RNaseA消化或通過(guò)解鏈溫度的差異，可以辨別完全配對(duì)序列和錯(cuò)配的雙鏈。
通過(guò)DNA測(cè)序可以直接揭示對(duì)照基因和攜帶突變基因之間的序列差異。此外，克隆的DNA片段可以作為探針檢測(cè)特異的DNA區(qū)段。當(dāng)與PCR結(jié)合使用時(shí)，這種方法的靈敏性大大提高，例如，將測(cè)序引物和雙鏈PCR產(chǎn)物、或者由改良的PCR法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。常規(guī)的自動(dòng)測(cè)序法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來(lái)確定核酸序列。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過(guò)檢測(cè)在含有或不含變性劑的凝膠中，DNA片段電泳遷移率的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)其特定的熔點(diǎn)或部分解鏈溫度，不同的DNA片段將停滯在凝膠的不同位置(參見(jiàn)Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
用RNase和S1保護(hù)的核酸酶保護(hù)分析法或化學(xué)裂解法也可以檢測(cè)特殊位置上的序列變化，(如Cotton等，PNAS，美國(guó)，854397-4401(1985))。
因此，可以用雜交、核糖核酸酶保護(hù)、化學(xué)裂解、直接DNA測(cè)序、或使用限制酶(如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法來(lái)檢測(cè)DNA序列的差異。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序之外，突變也可以用原位分析法檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)檢測(cè)不同組織中Fwa267多肽含量的改變而進(jìn)行的診斷分析方法。這是基于與正常對(duì)照組織相比，某組織中該多肽的過(guò)量表達(dá)可以檢測(cè)疾病或疾病易感性的存在。檢測(cè)取自宿主的樣品中本發(fā)明多肽之含量的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定和“夾心”測(cè)定，優(yōu)選ELISA檢測(cè)。ELISA測(cè)定包括首先制備本發(fā)明多肽的特異性抗體，優(yōu)選單克隆抗體。然后制備該單克隆抗體的報(bào)導(dǎo)抗體。將報(bào)導(dǎo)抗體與一種可檢測(cè)試劑相結(jié)合，所說(shuō)試劑如放射性試劑、熒光試劑或者辣根過(guò)氧化物酶。從宿主取樣，并將其在與樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過(guò)和非特異性蛋白質(zhì)(如牛血清清蛋白)一起溫育，將覆蓋皿中任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接下來(lái)，在單克隆抗體和結(jié)合到聚苯乙烯皿上的本發(fā)明任何多肽結(jié)合期間，將單克隆抗體在皿中溫育。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。此時(shí)，將和辣根過(guò)氧化物酶連接的受體抗體放入皿中，結(jié)果導(dǎo)致受體抗體和任何結(jié)合到本發(fā)明多肽上的單克隆抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。接著向皿中加入過(guò)氧化物酶底物，和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的蛋白質(zhì)的量。
也可以用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法檢測(cè)多肽含量。方法包括將Fwa267多肽的特異性抗體結(jié)合到固相支持物上，然后標(biāo)記(如放射性標(biāo)記)本發(fā)明的多肽，將取自宿主的樣品通過(guò)固相支持物，然后通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記量，確定樣品競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體的量，從而確定樣品中本發(fā)明多肽的含量。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體的鑒別也極有價(jià)值。該序列特異性地靶向于人染色體的特定位置，并與之雜交。目前，僅有少數(shù)幾種基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多形性)的染色體標(biāo)識(shí)試劑可用于標(biāo)記染色的體位置?；诒景l(fā)明DNA的染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因關(guān)聯(lián)的首要的步驟。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)由cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)可以進(jìn)行序列的染色體定位。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析基因的3’非翻譯區(qū)，可以快速選擇引物。引物不應(yīng)跨越基因組DNA的第一個(gè)外顯子，否則將使擴(kuò)增復(fù)雜化。然后，將引物用于PCR以篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜和體。只有含有與該引物相應(yīng)的基因的雜和體才會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的快捷方法。根據(jù)本發(fā)明，用相同的寡核苷酸引物和來(lái)自特定染色體或大基因組克隆的一組片段，依照類(lèi)似方法可以完成亞定位?？梢杂糜谌旧w作圖的其它作圖方法包括原位雜交、用標(biāo)記的、經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及用雜交進(jìn)行預(yù)篩選，從而構(gòu)建染色體特異性的cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以實(shí)現(xiàn)更精確的染色體位置。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長(zhǎng)短的cDNA。詳見(jiàn)Verma等人的綜述，人類(lèi)染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦完成了基因在染色體上的精確定位，則可以將該基因在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。這些數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，人類(lèi)孟德?tīng)柺竭z傳中找到(可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)在Johns Hopkins大學(xué)的Welch醫(yī)學(xué)文庫(kù)中得到)。然后通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)，確定基因與已定位到染色體相同區(qū)域的疾病之間的關(guān)系。
隨后需要確定患病個(gè)體和正常個(gè)體之間cDNA或者基因組序列的差異。如果在部分或全部患病個(gè)體中觀察到突變，但在正常個(gè)體中觀察不到，則所述突變可能是疾病的病因。
所說(shuō)的多肽、其片段、其衍生物或類(lèi)似物，或表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可用作免疫原而產(chǎn)生抗體?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法均可用于產(chǎn)生這些抗體和片段。
通過(guò)向動(dòng)物體(優(yōu)選非人體)直接注射或者施用本發(fā)明的多肽可以獲得相應(yīng)的抗體。這樣獲得的抗體會(huì)與所述多肽結(jié)合。這樣，即使是編碼多肽片段的序列也可以產(chǎn)生能夠結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。進(jìn)而用這種抗體從表達(dá)該多肽的組織中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)而生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例如雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、三體雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Co1e，等，1985，單克隆抗體和癌癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將所述生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,946,778)加以改進(jìn)，以生產(chǎn)抗本發(fā)明多肽(具免疫原性)的單鏈抗體。也可以用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)抗本發(fā)明多肽(具免疫原性)的人源化抗體。
為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，現(xiàn)參照下列附圖和實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行解釋。附圖和實(shí)施例是為了說(shuō)明而不以任何方式限制本發(fā)明。
在以上所述的教導(dǎo)下，本發(fā)明的許多改良和變化是可能的，因此，在附屬權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以以不同于以上特定描述的方式實(shí)施本發(fā)明。


圖1顯示了fwa267在正常組織的分布。
圖2顯示了fwa267在不同腫瘤細(xì)胞系中的分布。
圖3顯示了同型半胱氨酸的濃度對(duì)平滑肌細(xì)胞表達(dá)Fwa267的影響。
圖4為Fwa267在成人及胎兒心臟中的表達(dá)。
圖5為Fwa267在成人、胎兒及法樂(lè)氏四聯(lián)癥肥厚心肌細(xì)胞中的表達(dá)。
圖6顯示了Fwa267在正常和亞急性心衰動(dòng)物主動(dòng)脈，以及在慢性心衰動(dòng)物心臟中的表達(dá)情況。
圖7顯示了Fwa267在正常心肌組織和心肌梗塞室壁瘤組織中的表達(dá)情況。
圖8為Fwa267的蛋白電泳及Westen印跡雜交結(jié)果。
實(shí)施例一、成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1.1 RNA的提取RNA gentsTotal RNA Isolation System kit購(gòu)自美國(guó)Promega公司(Cat No.Z5110)。操作如下稱(chēng)取0.3g液氮中保存的成人主動(dòng)脈組織，加入10ml變性液(4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸三鈉)和1ml 2M乙酸鈉(pH4.0)勻漿。加入等體積水飽和酚和0.2倍體積氯仿，劇烈振蕩15秒，冰上放置15分鐘。10,000rpm，4℃離心20分鐘。取上清，加等體積異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，離心。再用變性液5ml懸浮沉淀，重復(fù)上述步驟。用1ml冰預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，室溫下蒸發(fā)痕量乙醇5-10分鐘，用焦碳酸二乙脂(diethyl pyrocarbonate，以下簡(jiǎn)稱(chēng)DEPC)處理的去離子水溶解RNA。1.2mRNA的分離成熟的mRNA的3′端有一條由20-250個(gè)腺苷酸組成的Poly(A)。根據(jù)該特征，可用親和層析法分離mRNA和其它的RNA。本實(shí)驗(yàn)使用的oligo(dT)纖維素含有12-18個(gè)核苷酸(T)的多聚鏈。在多鹽條件下，帶有oligo(A)尾巴的mRNA與oligo(dT)結(jié)合并留在柱子上，而無(wú)oligo(A)尾巴的rRNA與tRNA被洗掉，然后用低鹽液洗脫掛在柱子上的mRNA。
Quick prepmicro mRNA purification kit購(gòu)自瑞典Pharmacia公司。在1.5ml無(wú)RNA酶的離心管1#內(nèi)加入1ml oligo(dT)纖維素懸液；另取1.5ml離心管2#，加入用上樣緩沖液稀釋的總RNA 1ml；管2#和管2#室溫離心1分鐘，12000rpm；吸去管1#上清，將管2#的上清加入管1#，輕搖5-10分鐘；室溫離心10秒，12000rpm；用1ml高鹽緩沖液(10mMTris-HClpH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗滌5次，離心；用1ml低鹽緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mMEDTA，0.1M NaCl)洗滌5次，離心；用0.3ml低鹽緩沖液懸浮oligo(dT)沉淀并轉(zhuǎn)移到微量離心柱，12000rpm，離心5秒；用0.5ml低鹽緩沖液洗滌3次，離心；用2×0.2ml洗脫液收集mRNA；用分光光度計(jì)測(cè)定光密度，計(jì)算OD260/280的比值；得到300μl mRNA，加入7.5μl糖原，30μl 2.5M乙酸鉀(pH5.0)，750μl無(wú)水乙醇在-70℃保存?zhèn)溆?；使用前離心5分鐘，75％乙醇洗滌，DEPC處理的水溶解mRNA。1.3 cDNA的合成合成步驟參照Z(yǔ)AP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNA Gigapack IIGold Cloning Kit*(美國(guó)Stregene公司，Catalog No.200403和200404)的說(shuō)明書(shū)。
在0.5ml離心管中依次加入5μl 10×第一鏈緩沖液，3μl甲基化的dNTP混合物，2μlXho I連接子oligo(dT)18引物(1.4μg/μl)，32.5μl用DEPC處理的去離子水，1μl RNA酶抑制劑(40u/μl)，5μg mRNA，置室溫10分鐘。再加入1.5μl莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶(50u/μl)，總反應(yīng)體積50μl。從中取出5μl轉(zhuǎn)入另一離心管，加入0.5μl α-32P三磷酸脫氧腺苷(dATP)(800ci/mmol)以鑒定第一鏈合成質(zhì)量。上述反應(yīng)均在37℃進(jìn)行。
得到的DNA/RNA雜交分子在DNA聚合酶I的作用下，以第一鏈為模板合成第二鏈。在冰浴中依次加入45μl第一鏈cDNA，20μl 10X第二鏈緩沖液，6μl dNTP混合物，114μl去離子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，1μl DNA聚合酶I(9.0u/μl)，總體積200μl?；靹?，16℃孵育2.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用酚∶氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀。1.4 cDNA與載體的連接從試劑盒中取出9μl EcoRI連接子(序列分別為5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’-GCCGTGCTC-5’)溶解沉淀。取1μl電泳，鑒定第一和第二鏈合成質(zhì)量。在剩余的8μl第二鏈cDNA中依次加入1μl 10X連接酶緩沖液，1μl 10mmol/L γ-三磷酸腺苷(γ-ATP)，1μlT4 DNA連接酶(4u/μl)，8℃水浴16小時(shí)后，70℃孵育30分鐘。用限制酶XhoI消化1.5小時(shí)。瓊脂糖凝膠(Sepharose)Cl-2B過(guò)柱分離，除去小于400堿基的核苷酸，以提高全長(zhǎng)cDNA在cDNA文庫(kù)中的比例。1.5 cDNA克隆入ZAP噬菌體載體ZAP噬菌體載體(美國(guó)Stratagene公司)上的多克隆位點(diǎn)允許插入長(zhǎng)達(dá)10Kb的核酸片段，進(jìn)入宿主后質(zhì)粒部分可從載體上切開(kāi)，形成質(zhì)粒載體Bluescript。該載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T7和T3噬菌體的啟動(dòng)子，可以用于序列分析和探針合成。插入載體的cDNA片段可以表達(dá)具抗原性和生物活性的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)詳述如下在離心管內(nèi)加入100ng cDNA，0.5μl 10X連接酶緩沖液，0.5μl 10mmol/L γ-ATP(pH7.5)，1ul ZAP噬菌體載體(1ug/ul)，o.5ul T4 DNA連接酶(4u/ul)，加去離子水至總體積5μl。12℃連接16小時(shí)。
連接產(chǎn)物需包裝外殼蛋白以產(chǎn)生有轉(zhuǎn)染活性的重組噬菌體?？焖?gòu)?70℃取出包裝蛋白，溶解后，在25ul包裝蛋白內(nèi)加1ul連接反應(yīng)物，混勻，22℃反應(yīng)2小時(shí)，加入500ul SM緩沖液(0.1M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.05M Tris-HCl，0.01％明膠)，20ul氯仿。此混合物即為原始的cDNA文庫(kù)。1.6 計(jì)算陽(yáng)性克隆的效價(jià)取5ul原始的cDNA文庫(kù)，用45ul SM緩沖液稀釋。將10ul稀釋后的溶液，加入200ul感受態(tài)XL1-Blue MRF′宿主菌中(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分鐘，加入3ml上層瓊脂糖，混勻，鋪于NZY(0.09M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.5％酵母提取液，1％NZ胺A)平板上，倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算平板上的克隆數(shù)。
cDNA文庫(kù)的效價(jià)用噬菌斑成斑數(shù)(pfu/ml)表示。pfu/ml＝(噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù))×1000/稀釋液用量(ul)。容量大于1×106個(gè)克隆的cDNA文庫(kù)，能夠保證其中含有每一個(gè)單拷貝的mRNA.本發(fā)明成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量為2.4×106個(gè)獨(dú)立重組克隆。1.7 cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增和保存構(gòu)建的cDNA文庫(kù)可直接用于篩選，但不穩(wěn)定。因?yàn)榉且吧偷氖删w易失活，故需要擴(kuò)增以方便多次篩選。取5×104個(gè)噬菌體轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′宿主菌，鋪板，37℃孵育8-10小時(shí)，然后在150mm平皿中加入8ml SM緩沖液，4℃培養(yǎng)過(guò)夜。離心，收集上清，即得到擴(kuò)增后的cDNA文庫(kù)。加入0.3％氯仿，4℃保存。長(zhǎng)期保存需加入7％的二甲基亞砜(DMSO)，-70℃凍存。實(shí)施例二、新全長(zhǎng)cDNA的克隆2.1 隨機(jī)克隆的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增cDNA文庫(kù)鋪盤(pán)，噬菌斑密度為200-500個(gè)克隆/培養(yǎng)皿(150mm)，挑取清亮的單個(gè)噬菌斑轉(zhuǎn)入含有75ul SM緩沖液和5ul氯仿的無(wú)菌離心管中，置于4℃。用前混勻離心，取上清液5ul，用ZAP噬菌體載體3′端引物(5′CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3′)和5′端引物(5′CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50ul。擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性3分鐘；再94℃45秒，55℃30秒，72℃3分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5-10分鐘。根據(jù)1％瓊脂糖凝膠中電泳帶的亮度估算PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。2.2 表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的序列測(cè)定ABI377自動(dòng)測(cè)序儀(ABI PRISMTM377DNA sequencer)和自動(dòng)測(cè)序試劑盒(BigDyeTMTerminator Ready Reaction Mix)購(gòu)自美國(guó)PE公司。依照推薦的使用條件，用雙脫氧鏈終止法測(cè)序。
用非放射性CY5熒光素(CY5-fluoroscein)作標(biāo)記物，通用測(cè)序引物T3(5′ATT AAC CCTCAC TAA AGG GA 3′)和T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3′)進(jìn)行測(cè)序，每份樣品中引物用量為5pmol/ul。測(cè)序模板為PCR產(chǎn)物，用量約30-100ng。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 3-5分鐘；再94℃ 30秒，50℃ 15秒，72℃ 1分鐘，20個(gè)循環(huán)；94℃ 30秒，72℃ 1分鐘，15個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。DNA產(chǎn)物在8mol/L尿素、6％聚丙烯酰胺凝膠板上電泳。電壓1500V，功率34W，電泳250-300分鐘(ALF ExpressTMDNA sequence，瑞典Pharmacia公司)。2.3 EST的生物信息學(xué)分析用美國(guó)生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將每個(gè)cDNA克隆的EST與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較(http//www.ncbi.nlm.nih.gov).根據(jù)BLAST的判斷標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的通用標(biāo)準(zhǔn))同源序列小于100-200個(gè)堿基，Score值小于100的序列為新的EST。本發(fā)明Fwa267的EST為新EST。2.4 EST引物步移法測(cè)序2.4.1 ZAP噬菌體的體內(nèi)環(huán)化ZAP噬菌體載體能將目的片段在宿主內(nèi)直接從λ噬菌體載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒，環(huán)化為PBK-CMV(帶有CMV病毒早期啟動(dòng)子)噬菌粒。環(huán)化步驟參照說(shuō)明書(shū)(ZAP Express cDNASynthesis kit and ZAP Express cDNA GigapacktmGold Doning kit)。
用3ul保存在4℃攜帶新EST的噬菌體和1ul輔助噬菌體(一類(lèi)自身復(fù)制能力極低的噬菌體突變體，可以為寄主細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的復(fù)制與包裝提供蛋白酶和外殼蛋白質(zhì))共轉(zhuǎn)染300ul大腸桿菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)。獲得單鏈DNA后，再轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLOLR株(試劑盒提供)，在試管內(nèi)加5ml LB培養(yǎng)液，25ul卡那霉素，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。2.4.2 質(zhì)粒的提取和鑒定用德國(guó)QIAGEN公司的“QIAPrep Spin Miniprep kit″提取質(zhì)粒。2400rpm，4℃離心10分鐘，收集過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌。棄上清，加入25ul緩沖液P1(100ul/ml RNaseA，50mM Tris/HCl，10mM EDTA，pH8.0)懸浮細(xì)菌，移至滅菌的1.5ml離心管內(nèi)。加250ul緩沖液P2(200mMNaOH，1％SDS)，顛倒上清幾次，充分混勻。加350ul緩沖液P3(3.0M Kac，pH5.5)，立刻搖管4-6次。12,000rpm，離心10分鐘(SORVALLMc12V臺(tái)式離心機(jī))。收集上清，將其移至底部套有收集管的微型純化柱(QIA prep Spin Miniprep)內(nèi)，12000rpm，離心30-60秒。加0.75ul緩沖液TE(10mMTris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)，離心30-60秒。去掉收集管，在QLAprep微型純化柱底部套一個(gè)滅菌的離心管，加50ul緩沖液EB(10mM Tris-HCl pH8.5)或去離子水，在柱床內(nèi)保留1分鐘后離心1分鐘，收集純化的DNA。
在離心管內(nèi)加入3ul酶切緩沖液(10×)，1ul NotI內(nèi)切酶(15u/ul)，1ul ECoRI內(nèi)切酶(15u/ul)，1ul BSA，2ul DNA，22ul去離子水，總體積30ul。37℃溫育4-6小時(shí)。酶切后鑒定質(zhì)粒大小。2.4.3 新的全長(zhǎng)cDNA的測(cè)定用美國(guó)PE公司的ABI377自動(dòng)測(cè)序儀和測(cè)序試劑盒BigDyeTMTerminator Ready ReactionMix測(cè)定PBK-CMV陽(yáng)性克隆的序列。
反應(yīng)液中有BD4ul，BOB2ul(400mM Tris-HCl，pH9.0，10mM MgCl2)，引物2ul(5pmol/ul)，DNA模板30-100ng，用H2O補(bǔ)足至終體積20ul。用步移法(逐級(jí)引物法)測(cè)定cDNA全長(zhǎng)序列，即下一輪的測(cè)序引物由上輪測(cè)序所得產(chǎn)物的末端堿基確定。用oligo 14.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。
結(jié)果如SEQ ID NO1所示，F(xiàn)wa267 cDNA全長(zhǎng)3739個(gè)堿基對(duì)。根據(jù)kozak規(guī)律，推測(cè)其起始密碼子為107至109核苷酸(ATG)。編碼序列為107至1219位核苷酸，終止密碼子為1217至1219位核苷酸。BLAST分析表明該基因定位與11號(hào)染色體。
蛋白同源性分析表明Fwa267蛋白與分泌性生長(zhǎng)因子fallotein的同源性為46％。推測(cè)的Fwa267蛋白由170個(gè)氨基酸組成。其序列特征為(A)從276至279 Aa(NYSV)為N-糖基化位點(diǎn)；(B)從268至271Aa(KRYS)為cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶位點(diǎn)；(C)從262至270Aa(RLNDDAKRY)為酪氨酸激酶位點(diǎn)；(D)從1至61Aa(MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDLYRRDETIQVKGN)為T(mén)onB依賴(lài)的受體蛋白信號(hào)1；(E)從100至105Aa GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa(GGNCGC)，304至309Aa(GNCGCG)為豆蔻?；稽c(diǎn)；(F)從17至19Aa(SCR)，29至31Aa(SIK)，66至68Aa(SPR)，80至82Aa(TWR)，150至152Aa(TFK)，243至245 Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，243至245Aa(TPR)，273至275Aa(TPR)，320至322Aa(SGK)為蛋白激酶C位點(diǎn)。(G)從17至20Aa(SCRD)，168至171Aa(SLLE)，181至184Aa(TNWE)，199至202Aa(SVTD)，219至222Aa(TVED)，231至234Aa(SWQE)，250至253Aa(SYHD)，256至259Aa(SKVD)為酪蛋白激酶II位點(diǎn)。實(shí)施例三、Fwa267在正常組織的分布3.1 實(shí)驗(yàn)材料含12種組織的多組織膜(MTN膜)購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，用其檢測(cè)Fwa267基因在正常組織中的分布。β-actin是一種管家基因，在多種組織中表達(dá)均一，本實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照。3.2 Northern雜交方法參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟主編，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，第二版，1999)147-149，202-205，207-213頁(yè)。詳述如下3.2.1 總RNA提取稱(chēng)取0.5g組織于50ml離心管中，加入10ml GTC，勻漿。加等體積水飽和酚及0.2體積氯仿，劇烈振蕩15秒，冰上放置20分鐘。4℃，12,000rpm離心25分鐘。取上清置于另一離心管，加等體積異丙醇，-20℃沉淀1小時(shí)。4℃ 12,000rpm離心25分鐘，棄上清。用5ml GTC重新溶解沉淀后，重復(fù)其它操作。用1ml預(yù)冷的75％乙醇洗滌，晾干，用DEPC處理過(guò)的水溶解。測(cè)OD(光密度)260及OD280。3.2.2 甲醛變性凝膠電泳稱(chēng)取0.6g瓊脂糖凝膠加入52.2ml DEPC處理過(guò)的水中，加熱溶解，待膠冷到65℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，灌膠。取4.5ul(40-60ug)總RNA，加入2.0ul10×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混勻，65℃變性15分鐘，冰上冷卻2分鐘。加入2.0ul上樣緩沖液，混勻。50伏預(yù)電泳5分鐘，上樣。待染料全部進(jìn)入膠后，電壓降為40伏，每10分鐘混合電泳緩沖液1次。3.2.3 轉(zhuǎn)膜待溴酚蘭泳動(dòng)到凝膠底部，停止電泳，照相。用DEPC處理過(guò)的水洗膠數(shù)次，用50mM NaOH處理45分鐘，用20×SSC處理45分鐘。尼龍膜先用去離子水浸濕，再用20×SSC處理45分鐘。在膠托上鋪一層濾紙，用20×SSC浸濕，除去氣泡；將膠倒置于膠托上，其上面放一中間挖空的塑料薄片。小心將膜置于膠上，除去氣泡，在膜上鋪兩張20×SSC浸濕的濾紙，除去氣泡。在濾紙上鋪上10cm高的吸水紙，壓一500克的重物。轉(zhuǎn)膜16小時(shí)，中間換吸水紙2-3次。小心取下膜，照相，用6×SSC泡膜5分鐘。紫外交聯(lián)，80℃烤膜1小時(shí)，4℃保存?zhèn)溆谩?.2.4 制備雜交模板上游引物5’-CC GAATTCATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，斜體所示為保護(hù)堿基，黑體所示為EcoRI酶切位點(diǎn)，劃線(xiàn)部分與fwa267核酸序列107-127位互補(bǔ)；下游引物5’-GCCTCGAGTCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’，斜體所示為保護(hù)堿基，黑體所示為XhoI酶切位點(diǎn)，劃線(xiàn)部分與fwa267核酸序列1198-1221位互補(bǔ)。
PCR反應(yīng)體系10倍緩沖液5.0ul，脫氧核糖核酸2.0ul，上游、下游引物各3.0ul，Taq酶1.0ul，fwa267測(cè)序質(zhì)粒(模板)2.0ul，無(wú)菌水34ul。PCR參數(shù)94℃預(yù)變性3分鐘；94℃ 3分鐘，94℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 80秒，30個(gè)循環(huán)。72℃ 7分鐘。用醋酸銨/乙醇(1∶5)純化PCR產(chǎn)物，溶于50ul TE，用瓊脂糖定量，將其稀釋至25ng/μl。3.2.5 雜交標(biāo)記探針在0.5ml離心管中加入PCR產(chǎn)物(在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)25ng，5×標(biāo)記緩沖液10ul，dNTP(無(wú)dCTP)2.0ul，BSA 2.0ul，Klenow酶1.0ul，[α-32P]dCTP 5.0ul，用無(wú)核酸酶的水補(bǔ)至總體積50ul。室溫反應(yīng)1-3小時(shí)。
預(yù)雜交將膜用6×SSC浸5分鐘，貼于雜交管壁，除去氣泡。加入6ml購(gòu)于Clontech的雜交液，68℃ 1小時(shí)。
雜交倒掉雜交液，加入預(yù)熱的雜交液6ml，加入探針(探針需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)，68℃ 3小時(shí)。
洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％ SDS)在室溫洗膜四次，每次10分鐘。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％ SDS)在50℃洗20分鐘，56℃洗20分鐘。
壓片用濾紙吸去液體，用保鮮膜包好，貼于一張與X光片相同大小的濾紙上，壓片。-70℃曝光適當(dāng)時(shí)間，洗片。
結(jié)果如圖1所示β-actin在多種組織中的表達(dá)水平均一(圖1A)；fwa267選擇性地在心臟中高水平表達(dá)，在胎盤(pán)及腎臟細(xì)胞中也有表達(dá)(圖1B)。實(shí)施例四、fwa267基因在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)4.1 實(shí)驗(yàn)材料含8種腫瘤細(xì)胞系的mRNA的雜交膜購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，用其檢測(cè)Fwa267基因在不同腫瘤細(xì)胞株中的分布。β-actin作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。4.2 Northern雜交參見(jiàn)實(shí)施例3.2。
結(jié)果如圖2所示β-actin在若干種腫瘤組織中的表達(dá)水平均一(圖2A)；Fwa267在被檢測(cè)的幾株腫瘤細(xì)胞系中幾乎不表達(dá)，僅在早幼粒白血病HL-60細(xì)胞系、淋巴母細(xì)胞性白血病MOL-4細(xì)胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞系低水平表達(dá)(圖2B)。
根據(jù)上述結(jié)果，推測(cè)Fwa267是一個(gè)增殖抑制因子。因?yàn)檎３扇说男募〖?xì)胞是無(wú)增殖能力的終末分化細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞是增生失控的細(xì)胞。兩類(lèi)細(xì)胞增殖能力的差異可能是由于Fwa267基因在正常成人心肌細(xì)胞中高度表達(dá)，以維持其高度分化的狀態(tài)；Fwa267基因在腫瘤細(xì)胞中低水平表達(dá)，導(dǎo)致其增生失控。實(shí)例五、Fwa267基因在不同心肌細(xì)胞中表達(dá)的差異5.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自胎兒、成人和法樂(lè)氏四聯(lián)癥患者的心肌細(xì)胞。5.2 Northern雜交參見(jiàn)實(shí)施例3.2。
結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)wa267基因在胎兒心臟中不表達(dá)，。由于正常成人的心肌細(xì)胞是沒(méi)有增殖能力的終末分化細(xì)胞，而胎兒的心肌細(xì)胞仍具有增殖分化的能力，上述結(jié)果提示Fwa267與維持心肌的終末分化有關(guān)。
如圖5所示，fwa267基因在法樂(lè)氏四聯(lián)癥肥厚心肌和成人心臟中的表達(dá)水平相當(dāng)，但均高于在胎兒心臟的表達(dá)。法樂(lè)氏四聯(lián)癥肥厚心肌細(xì)胞壞死纖維化，而Fwa267在其中的表達(dá)也提示fwa267與細(xì)胞增殖抑制有關(guān)。實(shí)施例六、同型半胱氨酸對(duì)平滑肌細(xì)胞表達(dá)Fwa267的影響同型半胱氨酸(Homocysteine)是近年證實(shí)的一個(gè)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、腦中風(fēng)、冠心病、心肌梗塞及周?chē)懿〉莫?dú)立危險(xiǎn)因素。其能刺激細(xì)胞、特別是平滑肌細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的同型半胱氨酸處理在體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)Fwa267表達(dá)的變化。6.1 復(fù)蘇傳代細(xì)胞將來(lái)源于人主動(dòng)脈的平滑肌原代細(xì)胞凍存管從液氮中取出后迅速放入37℃水浴，待其完全融化，將細(xì)胞懸液接種于25cm培養(yǎng)瓶中，瓶?jī)?nèi)預(yù)先加入5ml含10％FBS的RPMI或DMEM。37℃，CO2濃度為5％，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，次日換液，培養(yǎng)液仍為含10％FBS的RPMI或DMEM。6.2 傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本融合(覆蓋率約為80％)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，用1×PBS(pH7.4)沖洗細(xì)胞表面2次，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化5-10分鐘。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓并有部分漂浮時(shí)，加入少許含10％ FBS的培養(yǎng)液終止消化，并用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞表面，收集消化液，1000 RPM離心30秒，棄上清，加入含10％FBS的培養(yǎng)液吹打，混勻，取出0.1ml用1×PBS稀釋至1.0ml，計(jì)數(shù)，按100000個(gè)細(xì)胞每ml將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，瓶?jī)?nèi)預(yù)先加入5ml含10％ FBS的RPMI或DMEM。37℃，CO2濃度為5％，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。按此法將細(xì)胞傳3代至所需數(shù)量。將基本融合(覆蓋率約為80％)的細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，換成含0.4％FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)處于靜止期。6.3 用同型半胱氨酸刺激人平滑肌細(xì)胞配制150mM同型半胱氨酸，用0.22um濾膜過(guò)濾，再用DMEM稀釋成7.5mM、15mM、30mM三種濃度。分別用0.5mM、1.0mM、2.0mM濃度的同型半胱氨酸刺激細(xì)胞18h，在1.0mM組預(yù)先加入100uM的大豆金雀異黃素孵育6h，留取上清后，異硫氰丙酸(GTC)收獲細(xì)胞。6.4 Northern雜交取上述細(xì)胞3瓶，提取mRNA。Northern雜交參見(jiàn)實(shí)施例3.2。
結(jié)果用同型半胱氨酸處理人平滑肌細(xì)胞18小時(shí)，可以抑制Fwa267基因的表達(dá)抑制，抑制的程度隨同型半胱氨酸濃度的升高而增加。
該結(jié)果提示具有同型半胱氨酸的細(xì)胞增殖作用可能抑制Fwa267基因的表達(dá)，從而解除Fwa267對(duì)細(xì)胞增生的抑制。實(shí)施例七、Fwa267基因在正常、慢性心衰和亞急性心衰動(dòng)物心臟中的表達(dá)7.1 慢性心衰模型的建立50只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300克/只)購(gòu)自本院動(dòng)物房。標(biāo)準(zhǔn)塊料由北京動(dòng)物中心提供，飲水為自來(lái)水，水與飼料由動(dòng)物隨意攝取。
稱(chēng)重，根據(jù)體重以氯胺酮和安定腹腔內(nèi)注射全麻大鼠。行氣管內(nèi)插管并接小型動(dòng)物呼吸機(jī)。在心電監(jiān)護(hù)儀的監(jiān)護(hù)下左側(cè)開(kāi)胸，以6-10手術(shù)縫線(xiàn)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)胸。以心電監(jiān)護(hù)儀上有明顯ST段升高為結(jié)扎成功的標(biāo)志。待其蘇醒后撤除呼吸機(jī)。術(shù)后飼養(yǎng)條件同術(shù)前，50天后模型即建成。7.2 亞急性心衰模型的建立10只雄性Wistar大鼠(250克/只)購(gòu)自解放軍301醫(yī)院，飼養(yǎng)條件同慢性心衰模型。
腹腔注射去甲腎上腺素30mg/日/只，連續(xù)注射4天，第5天模型即可以使用。7.3 RNA-RNA原位雜交原位雜交技術(shù)基于堿基互補(bǔ)的原理，通過(guò)探針特異性地與細(xì)胞內(nèi)特定的mRNA或DNA雜交，而顯現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)的基因及表達(dá)產(chǎn)物。該反應(yīng)靈敏度極高，而且可檢測(cè)出組織分化過(guò)程中僅瞬間表達(dá)的基因。雜交試劑盒DIG RNA Labeling kit(Cat.No.1175025)購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司。7.3.1 探針制備用特異引物PCR，將200-300bp的Fwa267核酸片段(222-504位核苷酸)克隆入TVector；重組質(zhì)粒擴(kuò)增，純化；用T7和SP6引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；確定基因插入方向，測(cè)序(mRNA和AntimRNA)。加T7RNA聚合酶合成反義探針，SP6 RNA聚合酶正義探針(檢查雜交系統(tǒng)的可靠性)。7.3.2 探針標(biāo)記先用酚/氯仿抽提被轉(zhuǎn)錄的線(xiàn)形DNA，再用酒精沉淀。將無(wú)RNA酶的離心管置冰上，向管內(nèi)加入1μl純化的線(xiàn)性DNA，2μl NTP標(biāo)記混合液，2μl 10×轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μl RNA酶抑制劑，2μl(40u)SP6或T7 TNA聚合酶，共20μl。混勻，稍加離心，加入20u不含RNA的DNA酶I，37℃15分鐘。加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)以終止聚合反應(yīng)。
在上述物質(zhì)中加入2。5μl 4mol/L Licl、和75μl酒精(-20℃)的充分混勻，-70℃放置至少30分鐘(或-20℃放置至少2小時(shí))。12,000rpm離心，70％冷乙醇洗滌，干燥后。加100μl DEPC水和20u RNase，37℃靜置30分鐘后分裝，-20℃保存。7.3.3 玻片處理及標(biāo)本制備徹底清洗玻片，高壓消毒30分鐘，將玻片在含有多聚賴(lài)氨酸(0.01％)的溶液中浸蘸幾下，干燥，4℃?zhèn)溆谩?br> 新鮮標(biāo)本(取自鼠心臟、主動(dòng)脈)0.4cm×0.4cm，用1×PBS沖洗兩次，置于冰凍切片機(jī)固定頭上。8-10μm切片，置有1mg/ml多聚賴(lài)氨酸的載玻片上晾干，4％多聚甲醛固定15-20分鐘。1×PBS沖冼2次，每次5分鐘。7.3.4 雜交前處理用0.2N HCl浸泡25分鐘。0.3％的Triton X-100浸泡5分鐘。用1×PBS洗兩次，每次5分鐘。用4％的多聚甲醛后固定6分鐘。用1×PBS洗兩次，每次5分鐘。在1000毫升0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)溶液中加入5ml乙酸酐，待其完全溶解將切片置于10分鐘。以上反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行。7.3.5 雜交反應(yīng)雜交液含有5ml去離子甲酰胺，2.5ml 20×SSC，500μl 100×Denhardt’s液(10g聚蔗糖，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白，500ml消毒雙蒸水)，500μl 10％SDS，100μl 10mg/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA，400ul DEPC水。
將切片從乙?；芤褐袚瞥觯脼V紙吸干標(biāo)本四周液體，用在標(biāo)本周?chē)?huà)一小圈。加預(yù)雜交液30ul在小圈內(nèi)，濕盒內(nèi)42℃溫育2小時(shí)。甩去預(yù)雜交液，用25ul雜交液覆蓋Parafilm膜，濕盒內(nèi)42℃溫育16小時(shí)，封閉濕盒。7.3.6 雜交后處理將玻片從溫盒取出，去掉Parafilm膜。2×SSC室溫沖洗三次，每次10分鐘。1×SSC室溫沖洗三次，每次10分鐘。0.1×SSC 50℃沖洗兩次，每次15分鐘。
若本底過(guò)高，將玻片置于含20μg/ml RNA酶的溶液(0.5mol/L NaCl，10mmol/LTris-Cl，pH8.0)中，37℃消化30分鐘。再用不含RNA酶的上述溶液于37℃沖洗30分鐘，洗膜。7.3.7 顯色反應(yīng)玻片浸泡于清洗液(1M順丁烯二酸，0.15M NaCl；0.3％(V/V)Tween-20)。在100ml封閉液(試劑盒中的阻斷劑按10％(W/V)加入順丁烯二酸緩沖液(0.1mol/L順丁烯二酸，0.15mol/LNaCl)，使用時(shí)1∶10稀釋)中溫育30分鐘。加20ml抗體溶液，溫育30分鐘。用100ml清洗液洗兩次，每次15分鐘。加20ml檢測(cè)液(0.1MTris-HCl，0.1MNaCl，pH9.5)平衡2-5分鐘。在10ml新配制的顯色液(10ml檢測(cè)液中加200ul NBT/BCIP)中溫育，避光，勿搖動(dòng)。用消毒雙蒸水或TE沖洗。
結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)wa267在正常主動(dòng)脈的表達(dá)較低；亞急性心衰、慢性心衰動(dòng)物主動(dòng)脈Fwa267的表達(dá)明顯增高。實(shí)例八、免疫組織化學(xué)8.1 實(shí)驗(yàn)材料人急性心肌梗塞并發(fā)癥室壁瘤組織。8.2 免疫組織化學(xué)分析用重組正確的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli Bl 21感受態(tài)細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，經(jīng)10％變性聚丙烯酰胺電泳，確定目的基因條帶，選用超聲和電洗脫法，從包涵體中獲取融合蛋白經(jīng)Western印跡鑒定目的蛋白后，免疫動(dòng)物所獲得的血清即為本實(shí)驗(yàn)的一抗。
石蠟切片5微米，貼附于包被有多聚賴(lài)氨酸的APES玻片上，75℃烤片2小時(shí)。二甲苯脫蠟后經(jīng)梯度酒精后切片入水。3％ H2O2內(nèi)10分鐘。蒸餾水洗三遍，放入EDTA抗原修復(fù)液內(nèi)(pH8.0)，置微波爐中烘烤(96℃-98℃)10分鐘。室溫冷卻20-30分鐘，蒸餾水洗三遍。入1×PBS緩沖液5分鐘。10％正常兔血清20分鐘。加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃內(nèi)孵育過(guò)夜。1×PBS洗三次后，加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫10分鐘。1×PBS洗三次，加酶聯(lián)鏈霉親和素三抗，室溫10分鐘。1×PBS洗三次，DAB顯色。蒸餾水三次，蘇木素淺染胞核、脫水、封片。
結(jié)果如圖7所示，正常心肌細(xì)胞低水平表達(dá)Fwa267，而室壁瘤組織則高表達(dá)Fwa267。實(shí)施例九、Fwa267基因的體外重組及蛋白表達(dá)9.1 構(gòu)建重組載體9.1.1 酶切載體為pGEX-5X-1。取2.0ul pGEX-5x-1載體，5.0ul緩沖液，2.0ul XhoI，2.0ul EcoRI，39ul無(wú)菌水，37℃酶切16小時(shí)。純化酶切產(chǎn)物。
PCR引物(上游引物5’-CCGAATTCATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，下游引物5’-GCCTCGAGTCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’)同Northern雜交，PCR反應(yīng)同實(shí)施例3.2.4。取10 ul PCR純化產(chǎn)物，5.0ul緩沖液，2.0ul XhoI，2.0ul EcoRI，31ul無(wú)菌水，37℃酶切16小時(shí)。純化酶切產(chǎn)物。9.1.2 連接2.0ul pGEX-5x-1酶切產(chǎn)物，2.0ul PCR酶切產(chǎn)物，2.0ul 10X緩沖液，1.0ul T4連接酶，13ul無(wú)菌水，16℃連接6小時(shí)。9.1.3 轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物1.0ul，加入200ul E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞?；靹颍糜诒?0分鐘。42℃60秒，冰上2分鐘。加入800ul SOC培養(yǎng)基37℃搖菌(小于225RPM)45分鐘。取100ul涂于含Amp(氨卞青霉素)抗性的LB平板上。37℃30分鐘以充分吸收液體。37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑單克隆置于5ml含50ugAmp的LB培養(yǎng)基中37℃搖16小時(shí)。9.1.4 質(zhì)粒提取菌液2000RPM離心10分鐘，棄上清。沉淀中加預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，pH8.0，2.0mM EDTA，50mM glucose)140ul，懸浮細(xì)菌。用280ul新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％ SDS)裂解細(xì)菌。再加入450ul預(yù)冷的溶液III(4.0M Potassium acatate)，混勻。離心4000RPM 10分鐘，12000RPM 10分鐘。取上清，加入0.6倍體積的異丙醇，同上離心。用100ul TE(10mMTris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)和20ug/ml的RNA酶溶解沉淀，37℃30分鐘。加600ul醋酸銨/乙醇(1∶5)，-70℃放置30分鐘。離心后用75％乙醇洗滌。用TE 100ul溶解提取的質(zhì)粒，測(cè)OD260/280定量。9.1.5 挑選陽(yáng)性克隆用PCR的方法鑒定陽(yáng)性克隆。9.2 在原核系統(tǒng)中的表達(dá)用重組正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)細(xì)菌。按1∶100比例取上面菌液加入50ml2X YTA培養(yǎng)基中。37℃搖菌4-6小時(shí)使其OD600為0.6-0.8。加入IPTG，使其濃度為0.4mM，繼續(xù)搖4小時(shí)。7700g離心10分鐘，棄上清。用冰上預(yù)冷的1×PBS(50ul/ml菌液)懸浮細(xì)菌。超聲破碎細(xì)胞。10000g離心10分鐘。在上清及沉淀中加入上樣緩沖液，95℃-100℃煮5分鐘變性。在10％的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，待溴酚蘭到最底端。染色，脫色，確定目的條帶。
結(jié)果如圖8A所示，用上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司的低分子量marker作參照，F(xiàn)wa267蛋白的分子量約為40KD。9.3 包涵體分離收集菌液，按5菌液1裂解液(體積比)的比例加入裂解緩沖液(1M PMSF，1mg/ml溶菌酶溶于PBS)，冰浴20分鐘。加入Triton-X 100終濃度為1％，冰浴10分鐘。20HZ超聲30秒，4℃ 15,000RPM離心25分鐘，留少量上清備用。在沉淀中加入5倍體積的包涵體洗液，重懸包涵體，20HZ超聲30秒，4℃15,000 RPM離心25分鐘。重復(fù)該過(guò)程4-5次。3,000RPM離心10分鐘，棄上清。15,000RPM離心15分鐘，重懸沉淀于變性緩沖液I(2mM DTT，2mM EDTApH8.0)(10ml/g)中，超聲30秒。重懸沉淀于變性緩沖液II(40mM NaOH((10ml/g)中，超聲1分鐘。重懸沉淀于1/4體積的變性緩沖液III(40％甘油，50mM Tris-Cl，pH8.0，1ul PMSF)中，冰浴5分鐘。4℃15,000RPM離心1小時(shí)，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?.4 Western印跡雜交電泳分離粗產(chǎn)物。切下目的條帶，裝入透析袋，50伏電泳12-16小時(shí)，100伏2小時(shí)，倒轉(zhuǎn)電極一分鐘。棄膠，PEG濃縮，1×PBS透析16小時(shí)，4小時(shí)換液一次。
取純化的蛋白20ul加5ul 5×上樣緩沖液在12％的SDS-PAGE膠上電泳，100V伏2小時(shí)。取下膠，將膠泡在電轉(zhuǎn)液中30分鐘。剪六張與膜同樣大小的濾紙，一張硝酸纖維素膜。將膠置于負(fù)極，硝酸纖維素膜置于正極，兩側(cè)各加三張濾紙，置于半干式轉(zhuǎn)膜儀中，11mA轉(zhuǎn)膜一小時(shí)(0.65mA/cm2)。取下膜，將膜置于10ml封閉液中室溫封閉一小時(shí)。倒出封閉液，加20ml TBST洗膜5分鐘，再重復(fù)一次。按1∶20,000的比例稀釋一抗，加1ul一抗加20ml封閉液，室溫一小時(shí)。倒出封閉液，洗膜。按1∶1,000稀釋二抗，加10ul兔抗羊IgG/AP+10ml封閉液，室溫一小時(shí)。倒出封閉液，洗膜。加20ml PBS洗膜5分鐘，再重復(fù)一次。加20ml堿性磷酸酶緩沖液洗膜5分鐘。33ul NBT加5ml堿性磷酸酶緩沖液加16.5ul BCIP，室溫顯色5分鐘。終止顯色。加20ml高壓水洗5分鐘。
結(jié)果如圖8B所示，在40KD左右有Fwa267蛋白的雜交帶。本發(fā)明并不限于上述具體的實(shí)施例，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。功能上等同的方法和物質(zhì)已包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)本文的描述和附圖，基于本發(fā)明的各種改變對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。這樣的改變已包括在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表一般信息(i)申請(qǐng)人中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院心血管病研究所(ii)發(fā)明名稱(chēng)肌細(xì)胞增殖抑制因子Fwa267(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人惠汝太(B)街道西城區(qū)北禮士路167號(hào)(C)城市北京(D)國(guó)家中國(guó)(E)郵編100037(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介體類(lèi)型3.5英寸軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)奔騰166MMX(C)操作系統(tǒng)WINDOWS 95(D)軟件WORD 97(1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)序列類(lèi)型核苷酸(B)長(zhǎng)度3739個(gè)堿基對(duì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)來(lái)源成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)(iv)在基因組中的定位11號(hào)染色體(v)序列描述 1321 CTGCAATGCA ATGAACACAA GTGGTTGCTG AGTCTCAGCC TTGCTTTGTT AATGCCATGG1381 CAAGTAGAAA GGTATATCAT CAACTTCTAT ACCTAAGAAT ATAGGATTGC ATTTAATAAT1441 AGTGTTTGAG GTTATATATG CACAAACACA CACAGAAATA TATTCATGTC TATGTGTATA1501 TAGATCAAAT GTTTTTTTTG GTATATATAA CCAGGTACAC CAGAGCTTAC ATATGTTTGA1561 GTTAGACTCT TAAAATCCTT TGCCAAAATA AGGGATGGTC AAATATATGA AACATGTCTT1621 TAGAAAATTT AGGAGATAAA TTTATTTTTA AATTTTGAAA CACAAAACAA TTTTGAATCT1681 TGCTCTCTTA AAGAAAGCAT CTTGTATATT AAAAATCAAA AGATGAGGCT TTCTTACATA1741 TACATCTTAG TTGATTATTA AAAAAGGAAA AATATGGTTT CCAGAGAAAA GGCCAATACC1801 TAAGCATTTT TTCCATGAGA AGCACTGCAT ACTTACCTAT GTGGACTATA ATAACCTGTC1861 TCCAAAACCA TGCCATAATA ATATAAGTGC TTTAGAAATT AAATCATTGT GTTTTTTATG1921 CATTTTGCTG AGGCATGCTT ATTCATTTAA CACCTATCTC AAAAACTTAC TTAGAAGGTT1981 TTTTATTATA GTCCTACAAA AGACAATGTA TAAGCTGTAA CAGAATTTTG AATTGTTTTT2041 CTTTGCAAAA CCCCTCCACA AAAGCAAATC CTTTCAAGAA TGGCATGGGC ATTCTGTATG2101 AACCTTTCCA GATGGTGTTC AGTGAAAGAT GTGGGTAGTT GAGAACTTAA AAAGTGAACA2161 TTGAAACATC GACGTAACTG GAAATTAGGT GGGATATTTG ATAGGATCCA TATCTAATAA2221 TGGATTCGAA CTCTCCAAAC TACACCAATT AATTTAATGT ATCTTGCTTT TGTGTTCCCG2281 TCTTTTTGAA ATATAGACAT GGATTTATAA TGGCATTTTA TATTTGGCAG GCCATCATAG2341 ATTATTTACA ACCTAAAAGC TTTTGTGTAT CAAAAAAATC ACATTTTATT AATGTAAATT2401 TCTAATCGTA TACTTGCTCA CTGTTCTGAT TTCCTGTTTC TGAACCAAGT AAAATCAGTC2461 CTAGAGGCTA TGGTTCTTAA TCTATGGAGC TTGCTTTAAG AAGCCAGTTG TCAATTGTGG2521 TAACACAAGT TTGGCCCTGC TGTCCTACTG TTTAATAGAA AACTGTTTTA CATTGGTTAA2581 TGGTATTTAG AGTAATTTTT TCTCTCTGCC TCCTTTGTGT CTGTTTTAAA GGAGACTAAC2641 TCCAGGAGTA GGAAATGATT CATCATCCTC CAAAGCAAGA GGCTTAAGAG AGAAACACCG2701 AAATTCAGAT AGCTCAGGGA CTGCTAACAG AGAACTACAT TTTTTCTTAT TGCCTTGAAA2761 GTTAAAAGGA AAGCAGATTT CTTCAGTGAC TTTGTGGTCC TACTAACTAC AACCAGTTTG2821 GGTGACAGGG CTGGTAAAGT CCCAGTGTTA GATGAGTGAC CTAAATATAC TTAGATTTCT2881 AAGTATGGTG CTCTCAGGTC CAAGTTCAAC TATTCTTAAG CAGTGCAATT CTTCCCAGTT2941 ATTTGAGATG AAAGATCTCT GCTTATTGAA GATGTACCTT CTAAAACTTT CCTAAAAGTG3001 TCTGATGTTT TTACTCAAGA GGGGAGTGGT AAAATTAAAT ACTCTATTGT TCAATTCTCT3061 AAAATCCCAG AACACAATCA GAAATAGCTC AGGCAGACAC TAATAATTAA GAACGCTCTT3121 CCTCTTCATA ACTGCTTTGC AAGTTTCCTG TGAAAACATC AGTTTCCTGT ACCAAAGTCA3181 AAATGAACGT TACATCACTC TAACCTGAAC AGCTCACAAT GTAGCTGTAA ATATAAAAAA3241 TGAGAGTGTT CTACCCAGTT TTCAATAAAC CTTCCAGGCT GCAATAACCA GCAAGGTTTT3301 CAGTTAAAGC CCTATCTGCA CTTTTTATTT ATTAGCTGAA ATGTAAGCAG GCATATTCAC3361 TCACTTTTCT TTGCCTTTCC TGAGAGTTTT ATTAAAACTT CTCCCTTGGT TACCTGTTAT3421 CTTTTGCACT TCTAACATGT AGCCAATAAA TCTATTTGAT AGCCATCAAA GGAATAAAAA3481 GCTGGCCGTA CAAATTACAT TTCAAAACAA ACCCTAATAA ATCCACATTT CCGCATGGCT3541 CATTCACCTG GAATAATGCC TTTTATTGAA TATGTTCTTA TAGGGCAAAA CACTTTCATA3601 AGTAGAGTTT TTTATGTTTT TTGTCATATC GGTAACATGC AGCTTTTTCC TCTCATAGCA3661 TTTTCTATAG CGAATGTAAT ATGCCTCTTA TCTTCATGAA AAATAAATAT TGCTTTTGAA3721 CAAAAAAAAA AAAAAAAAA(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)序列類(lèi)型氨基酸(B)長(zhǎng)度370個(gè)氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)來(lái)源成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)(iv)推測(cè)蛋白的序列特征(A)從276至279Aa(NYSV)為N-糖基化位點(diǎn)(B)從268至271Aa(KRYS)為cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶位點(diǎn)(C)從262至270Aa(RLNDDAKRY)為酪氨酸激酶位點(diǎn)(D)從1至61Aa(MHRLIFVYTLICANFCSCRDTSATPQSASIKALRNANLRRDESNHLTDLYRRDETIQVKGN)為T(mén)onB依賴(lài)的受體蛋白信號(hào)1(E)從100至105Aa(GLEEAE)，192至197Aa(GVSYNS)，303至308Aa(GGNCGC)，304至309Aa(GNCGCG)為豆蔻酰化位點(diǎn)(F)從17至19Aa(SCR)，從29至31Aa(SIK)，從66至68Aa(SPR)，從80至82Aa(TWR)，從150至152Aa(TFK)，從243至245Aa(TPR)，從273至275Aa(TPR)，從243至245Aa(TPR)，從273至275Aa(TPR)，從320至322Aa(SGK)為蛋白激酶C位點(diǎn)(G)從17至20Aa(SCRD)，從168至171Aa(SLLE)，從181至184Aa(TNWE)，從199至202Aa(SVTD)，從219至222Aa(TVED)，從231至234Aa(SWQE)，從250至253Aa(SYHD)，從256至259Aa(SKVD)為酪蛋白激酶II位點(diǎn)(v)序列描述
5 1015|| |1 Met His Arg Leu Ile Phe Val Tyr Thr Leu Ile Cys Ala Asn Phe16 Cys Ser Cys Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile31 Lys Ala Leu Arg Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His46 Leu Thr Asp Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly51 Asn Gly Tyr Val Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg76 Asn Leu Leu Leu Thr Trp Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg91 Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu106 Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser121 Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly Arg Trp Cys Gly His Lys Glu136 Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asn Gln Ile Lys Ile Thr151 Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys Pro Gly Phe Lys Ile166 Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala Ala Ala Ser Glu181 Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly Val Ser Tyr196 Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp Ala Leu211 Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu Lys226 Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr241 Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys256 Ser Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr271 Ser Cys Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu286 Lys Leu Ala Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln301 Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser316 Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val331 Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys346 Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys361 Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，它包括選自下列組中的一個(gè)成員(a)一種多核苷酸，其編碼如SEQ ID NO2所示的多肽；(b)一種多核苷酸，其是(a)天然存在的多核苷酸變異體；(c)一種多核苷酸，其能夠與(a)雜交，并且與(a)具有至少85％的同源性。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，所說(shuō)的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的序列。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，所說(shuō)的多核苷酸包含如SEQ ID NO1所示的從107至1219位核苷酸。
7.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼如SEQ ID NO2所示的多肽。
8.一種載體，所說(shuō)的載體包含權(quán)利要求2的DNA。
9.一種宿主細(xì)胞，所說(shuō)的宿主細(xì)胞由權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染過(guò)。
10.一種產(chǎn)生多肽的方法，所說(shuō)的方法包括在權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
11.一種多肽，它包含選自下列組中的一個(gè)成員(a)一種多肽，其具有推定的如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(b)一種多肽，其是(a)的活性片段、類(lèi)似物或衍生物；(c)一種多肽，其與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性。
12.一種權(quán)利要求11之多肽的抗體。
13.一種化合物，所說(shuō)的化合物抑制權(quán)利要求11之多肽的激活。
14.一種藥物組合物，所說(shuō)的藥物組合物包含有效量的權(quán)利要求11的多肽或其活性片段，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
15.權(quán)利要求11的多肽在制備治療心腦血管疾病的藥物組合物中的用途。
16.一種治療需要Fwa267之患者的方法，所說(shuō)的方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求11的多肽。
17.權(quán)利要求16的方法，所說(shuō)的方法包括向患者提供編碼所述多肽的DNA，并在患者體內(nèi)表達(dá)所述的多肽。
18.一種診斷疾病或者對(duì)疾病的易感性的方法，所說(shuō)的方法包括測(cè)定權(quán)利要求1的多核苷酸中的突變。
19.一種診斷方法，所說(shuō)的方法包括分析來(lái)源于宿主細(xì)胞的樣品中是否存在權(quán)利要求11的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了肌細(xì)胞增殖抑制因子Fwa267多肽和編碼這種多肽的多核苷酸。本發(fā)明也公開(kāi)了用重組技術(shù)生產(chǎn)Fwa267多肽的方法和針對(duì)這種多肽的抗體和拮抗劑。本發(fā)明還公開(kāi)了含有Fwa267多肽的藥物組合物以及Fwa267在治療心血管增生性疾病、抑制腫瘤形成等方面的用途。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)樣品中Fwa267核酸序列中的突變,或者Fwa267多肽含量及Fwa267基因產(chǎn)物自身抗體水平的改變而進(jìn)行診斷和測(cè)定的方法。本發(fā)明的肌細(xì)胞增殖抑制因子是人類(lèi)來(lái)源的。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1373216SQ01109260
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者惠汝太, 陳敬洲, 劉寶華, 劉玉清 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院