專利名稱：棉鈴蟲增效蛋白基因工程菌株的構建及其增效蛋白的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在大腸桿菌中表達棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)增效蛋白，含有HaGV增效蛋白的基因的表達載體，在大腸桿菌中表達HaGV增效蛋白的方法。
目前，已在9種顆粒體病毒、舞毒蛾(Lymantria dispar)NPV和4種痘病毒中發(fā)現(xiàn)了昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)[1.2]。昆蟲病毒增效蛋白是病毒基因編碼的一種金屬蛋白酶，分子量為89-10KD，具有一個典型的金屬蛋白酶鋅-結合域HEXXH，位置十分保守，且對中腸圍食膜的降解作用受到金屬螯合劑的抑制。[3.4]昆蟲病毒增效蛋白可以提高昆蟲的敏感性，加速核型多角體病毒NPV的感染進程，[5]同時能提高蘇云金桿菌伴孢晶體對幼蟲的毒力。[6]增效蛋白的作用機制有二種一種是增效蛋白能與中腸細胞膜上的特異位點結合，介導病毒囊膜與細胞質膜之間的融合，促進桿狀病毒進入宿主細胞內(nèi)，從而增加病毒感染的效果。[7-9]但增效蛋白與中腸細胞膜上的特異位點結合并不是增進病毒感染所必需的。[10，11]另一種機制是增效蛋白通過降解腸粘蛋白IIM而破壞昆蟲幼蟲中腸圍食膜，使病毒粒子更容易進入中腸細胞，同時提高了某些必須穿透圍食膜而發(fā)生作用的生物殺蟲劑的效能。
目前，昆蟲病毒增效蛋白實施的基因工程主要有三種方式1.將增效蛋白基因重組在AcMNPV等廣譜高效的病毒中，構建含增效蛋白基因的重組AcMNPV。2.構建含增效蛋白基因的轉基因植物，提高害蟲對NPV的敏感性。3.在原核細胞中表達增效蛋白。表達產(chǎn)物形成包涵體晶體，穩(wěn)定且易純化。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有HaGV增效蛋白基因的工程菌株、該菌株的構建方法，以及利用該菌株生產(chǎn)增效蛋白的方法。該工程菌株含有HaGV增效蛋白的基因的表達載體，并能有效表達HaGV增效蛋白。該工程菌株命名為Escherichia coli M15(pEHa)，已于2000年4月11同保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊號為CCTCC NOM 201010，該載體由下列DNA元件組成。
(1)棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白基因3′端2.1Kb片段。
(2)大腸桿菌質粒復制起始點。
(3)氨卡青霉素抗性基因。
(4)6個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
本發(fā)明用于構建HaGV增效蛋白的工程菌株的原材料有如下幾種(1)HaGV，由美國湯姆·杰弗遜大學微生物學及免疫學系Zailin Yu博士贈送。
(2)pQE-30、E.coli M15(pREP4)，購自QIAGEN公司。
(3)T4DNA連接酶購自華美生物技術公司。
采用基因工程方法構建含HaGV增效蛋白基因的工程菌株，方法如下1.HaGV增效蛋白基因的擴增(1)HaGV DNA的提取取HaGV懸液100ul，加等體積0.04mol/L NaOH堿解液及終濃渡為1％SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚、氯仿，異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液抽提HaGV DNA各一次，用預冷無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗，干燥沉淀，將DNA溶于TE(10mMTris.1mMEDTA pH8.0)緩沖液中，-20℃保存。(2)HaGV增效蛋白基因的PCR擴增設計引物如下P15′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′P25′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′上述引物由上海生工公司合成。按B.M.公司Taq DNA Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱DNA多聚酶)操作手冊，依次加入①10×PCR反應緩沖液10μl；②兩種引物各2μl；③10mol/L dNTPs 2μl；④Taq DNA Polymerase(5U/μl)1μl；⑤補去離子水至100μl反應體積；⑥加石蠟油覆蓋液面。
進行PCR擴增。反應條件為94℃預變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃、60秒；56℃、90秒，72.5℃、180秒，循環(huán)30次，最后一次循環(huán)在72.5℃延伸7min。經(jīng)0.7％ Agarose電泳檢測，得到單一的長約2.7Kb的HaGV增效基因片段。2.重組表達質粒pEHa的構建和酶切鑒定用Sac I/Pst I雙酶切質粒pQE-30和PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)Sac I/Pst I雙酶切，產(chǎn)生0.6kb(HaGV enhancin gene 5′端片段)和2.1kb(HaGV enhancin gene 3′端片段)的兩個片段，0.7％低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收2.1kb的片段和雙酶切消化的質粒片段。用T4DNA連接酶于16℃水浴連接4h，轉化感受態(tài)細胞Ecoli M15(pREP4)，經(jīng)Ampcillin和Kanamycin雙抗平板篩選得到陽性轉化子。此構建的重組質粒命名為pEHa。
重組質粒pEHaDNA分別經(jīng)Pst I，Sac I單酶切，BamHI/HindIII，KpnI/HindIII雙酶切，0.7％瓊脂糖電泳照相。
pEHa經(jīng)PstI單酶切，得5.5kb的片段，宿主菌自身攜帶有質粒，pREP4(3.7kb)，pREP 4上具有Pst I的兩個識別位點，經(jīng)Pst I單酶切，得2.8kb和0.9kb片段；pEHa經(jīng)Bam HI/HindIII雙酶切，得3.4kb和2.1kb的片段，pREP4具有HlindIII單一酶切位點，無BamHI酶切位點，經(jīng)HindIII單酶切，得3.7kb的片段，pEHa經(jīng)Kpn I/HindIII雙酶切，應得4.6kb和0.9kb的片段，pREP4上無Kpn I酶切位點，有HindIII單一酶切位點，凝膠電泳結果與預期相符，見圖3。3.棉鈴蟲增效蛋白的表達及其純化挑取重組子單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基中(Ampcillin 100μg/mL和Kanamycin 25μg/mL，下同)活化過夜?；罨阂?∶20稀釋接種到10mL LB中，37℃培養(yǎng)3h，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃誘導5h，取誘導5h和未誘導培養(yǎng)物各1mL，收集菌體進行SDS-PAGE。離心收集誘導后菌體，加裂解液(50mmol/L Tris-HCl PH8.0，0.1mol/L NaCl，2mg/g溶菌酶菌體蛋白)，溶菌酶37℃1h，水浴超聲波破碎10min，處理液上蔗糖梯度30-60％，4000(r/min)×40min，取出白色包涵體帶，洗糖3次，將包涵體樣品稀釋后于透射電鏡下觀察并照相，剩余樣品4℃保存?zhèn)溆谩?br> 表達產(chǎn)物的10％ SDS-PAGE見圖4，結果表明，含重組質粒的EscherichiacoliM15(pEHa)菌表達了含增效蛋白C-端702個氨基酸，共720個氨基酸的融合蛋白。根據(jù)氨基酸序列推算的融合蛋白分子量為78.17×103D(命名為pHEaP78)，SDS-PAGE結果顯示融合蛋白的分子量約為78KD。
外源蛋白在大腸桿菌中高水平表達，常導致形成包涵體。溶菌酶-超聲波處理誘導表達菌體，經(jīng)蔗糖梯度離心得白色包涵體帶，洗糖離心得純凈的包涵體，在透射電鏡下可見形狀不規(guī)則的包涵體，結果見圖5。
圖面說明

圖1重組表達質粒pEHa。
圖2重組表達質粒pEHa構建示意圖。
圖3重組質粒pEHa酶切鑒定；圖中符號代表MλHindIII marker；1pEQ/EnC+PstI；2pEHa+SacI；3pEHa+BamHI/HindIII；4pEHa+KpnI/HindIII；5pQE(pREP4)+PstI.
圖4 HaGV增效蛋白在大腸桿菌中的表達。圖中符號代表MProtein marker；1、2、3Bacterial protein；4Punified occlusion body；5、6、7IPTG induced 5h.
圖5HaGV增效蛋白包涵體。
權利要求
1.一種工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)，該工程菌株已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC NOM 201010
2.根據(jù)權利要求所述的工程菌株，其特征在于它含有重組質粒pEHa由下列DNA元件構成。(1)棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白基因3’端2.1Kb片段。(2)大腸桿菌質粒復制起始點。(3)氨芐青霉素抗性基因。(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
3.根據(jù)權利要求所述的工程菌株，其特征在于該工程菌株攜帶棉鈴蟲顆粒體病毒N未端截短增效蛋白的基因，具有卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因，能夠使HaGV增效蛋白在大腸桿菌中獲得表達。
4.一種構建權利要求1-4所述的工程菌株的方法，其特征在于用SacI、Pst I分別雙酶切質粒pQE和PCR法擴增的2.1Kb HaGV增效蛋白基因片段，用T4 DNA連接酶連接、轉化感受態(tài)細胞E.coli M15，經(jīng)氨芐霉素和卡那霉素雙抗平板篩選，獲得Escherichia coli M15(pEHa)的工程菌株。
5.一種構建權利要求1-3所述工程菌株的方法。其特征在于以HaGV基因組DNA為模板，設計引物P15′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′P25′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′PCR法擴增棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白基因，獲得2.1Kb HaGV N端截短的增效蛋白基因片段。
6.一種利用權利要求1、2、3、4、5所述的工程菌株生產(chǎn)HaGV增效蛋白的方法。其特征在于將工程菌株CCTCC NOM 201010單菌落挑到含100μg/ml的的氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，次日以1∶4比例接種到含上述雙抗的500ml2YT培養(yǎng)基中，當其濃度達計OD600＝0.3時，加入異丙基-β-D-硫代單乳糖苷至終濃渡1mM，于37℃，200rpm誘導表達5h，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法獲得表達的HaGV增效蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因工程方法構建獲得工程菌株:CCTCC NO:M201010 Escherichia coli M15(pEHa)工程菌株的構建方法和工程菌株的用途。該菌株是以棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)DNA為模板,通過PCR擴增產(chǎn)生HaGV增效蛋白基因,再經(jīng)酶切,酶連接構建含HaGV增效蛋白基因的重組載體pQEHa,轉化E.coli M15(pREP4)而獲得。該工程菌株所攜帶的重組載體pQEHa,含HaGV增效蛋白基因,并能夠高效表達HaGV增效蛋白。圖1為本發(fā)明含HaGV增效蛋白基因的重組表達質粒pEHa示意圖。
文檔編號C12N1/21GK1384189SQ0111467
公開日2002年12月11日 申請日期2001年5月9日 優(yōu)先權日2001年5月9日
發(fā)明者孟小林, 徐進平 申請人:深圳萬德?；蚬こ逃邢薰?br>