專利名稱：短芽孢桿菌菌株及其在脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及短芽孢桿菌菌株及其在脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用。
石油和煤炭是世界上最重要的能源，這些礦物燃料中含有硫化物，燃燒時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量硫氧化物排放到大氣環(huán)境中，形成酸雨，嚴(yán)重污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，直接威脅著地球人類的生存空間。據(jù)有關(guān)報(bào)道，全世界每年排入大氣中的SO2近兩億噸，在中國(guó)SO2的排放量達(dá)到了1795萬噸。同時(shí)硫化物的存在還會(huì)影響燃料及其產(chǎn)品的外觀，腐蝕燃燒及運(yùn)輸設(shè)備。為了避免有毒硫化物存在造成的危害，在燃料燃燒前，燃燒過程中或燃燒后必須把燃料中的硫脫除，這已成為全世界極待解決的重大課題。面對(duì)日益嚴(yán)峻的環(huán)保形勢(shì)，人們的環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，對(duì)于環(huán)保的要求變得越來越嚴(yán)格。因此，發(fā)達(dá)國(guó)家越來越重視燃油質(zhì)量的提高，美國(guó)1990年就通過了清潔空氣法修正案，環(huán)保局提出了使用新配方汽油的要求。從1998年起，美國(guó)環(huán)保局采用復(fù)雜模型，進(jìn)一步降低汽車排放污染，歐洲議會(huì)1998年曾立法要求2000年實(shí)施清潔汽油配方?？傊?，今后10年內(nèi)，運(yùn)輸燃料(特別是汽油和柴油)的組成和質(zhì)量指標(biāo)將會(huì)有較大的改觀，即要求燃料的H/C比有所上升，而硫及芳烴含量要大大降低。北美和歐洲國(guó)家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年汽油、柴油中硫含量要低于30ppm，甚至10ppm。我國(guó)是一個(gè)發(fā)展中國(guó)家，石油生產(chǎn)和燃料消耗已成為世界大國(guó)之一，SO2的排放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過世界平均水平。面對(duì)日益嚴(yán)峻的環(huán)保形勢(shì)，我國(guó)實(shí)施了可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，大力推行清潔生產(chǎn)，并頒布了一系列環(huán)保法規(guī)。初步提出將目前柴油硫含量從5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市車用柴油中硫含量低于500ppm的要求，因此，開發(fā)和加強(qiáng)高效、低成本的燃料燃前脫硫技術(shù)，將對(duì)我國(guó)實(shí)施的環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。
降低石油、石油產(chǎn)品和煤炭中含硫量的方法有物理、化學(xué)和生物法。物理和化學(xué)法的燃前脫硫技術(shù)能有效地脫除燃料中的無機(jī)硫，但是脫除有機(jī)硫的效果很差，因?yàn)榈V物燃料中含有的有機(jī)硫化物成分復(fù)雜，大部分是雜環(huán)化合物，其中的C-S化學(xué)共價(jià)鍵十分牢固，用常規(guī)的物理和化學(xué)方法無法有效去除。
目前常用的加氫催化脫除燃料中有機(jī)硫(HDB)技術(shù)必須在高溫(≥300℃)，高壓(≥100atm)，加氫及金屬催化劑存在的苛刻條件下脫硫，操作費(fèi)用較高，而且金屬催化劑易受底物硫原子周圍取代基空間位阻影響，所以對(duì)于燃料中大量存在的甲基取代苯并噻吩、二苯并噻吩等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜環(huán)硫化物的脫除率較低。(e.g.Houalla，M.，Broderick，D.H.，Sapre，A.V.，Nag，N.K.，de Beer，V.H.J.，Gates，B.C.，Kwart，H.J.Catalt.，61，523-527(1980)).事實(shí)上，在輕汽油和柴油中，仍存在著多種二苯并噻吩的烴基取代物(e.g.Kabe，T.，Ishihara，A.and Tajima，H.Ind.Eng.Chem.Res.，31，1577-1580(1992))。低硫含量的要求使得HDS過程反應(yīng)條件越來越苛刻，設(shè)備和操作費(fèi)用增高，同時(shí)伴隨著烯烴飽和反應(yīng)，造成燃料燃燒值損失。因此，迫切需要尋找一種能從石油或石油產(chǎn)品中脫除硫卻不造成石油燃燒值降低的，經(jīng)濟(jì)可行的新工藝。
生物催化脫硫(BDS)方法，以其具有的選擇性高，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低，投資少，對(duì)燃料熱值影響小，不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為令人矚目的清潔石油燃料生產(chǎn)技術(shù)，有希望成為傳統(tǒng)脫氫過程的輔助途徑來進(jìn)行含硫燃料的精加工，使它們達(dá)到要求水平，所以引起了眾多科學(xué)家和工程師的興趣。
目前，已分離了多種能脫有機(jī)硫的微生物。其中好氧菌或厭氧菌都能代謝柴油中的主要難處理化合物DBT，如硫酸鹽還原細(xì)菌，Desulfovibrio(去磺弧菌屬)desulfuricans M6，厭氧地降解DBT，主要的產(chǎn)物是聯(lián)苯，降解率是42％。據(jù)報(bào)道，其它的硫酸鹽還原細(xì)菌也能厭氧地將DBT轉(zhuǎn)化為聯(lián)苯，但轉(zhuǎn)化率極低。厭氧過程因?yàn)橛胁恍枰醯募尤?，可以直接?yīng)用到油井中的優(yōu)點(diǎn)具有較大的吸引力，但是還未發(fā)現(xiàn)能用于實(shí)際石油脫硫體系的高效厭氧微生物。
通過好氧途徑代謝DBT的微生物有假單孢菌(pseudomonas sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、棒桿菌(Corynebacterium sp.)及短桿菌(Brevibacterium sp.)等。通過對(duì)各種微生物代謝機(jī)制的研究，得知微生物的脫硫途徑主要有三種一種是專一氧化DBT的碳架(C-C鍵)，而C-S鍵依然保留，這一途徑是在從土壤中分離出的假單胞菌(Pseudomonas)，拜葉林克氏菌(Beijerinckia)及不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，代謝過程中DBT的一個(gè)苯環(huán)在斷裂前先變成為羥基化合物，硫原子未被釋放，順式4-[2-(3-羥基)-噻吩基]-2-氧-3-丁烯酸(tran-HTOB)和3-羥基-2-甲?；洁绶?HFBT)在培養(yǎng)基中積累，其它的細(xì)菌如P.eruginosa ERC-8，Beijerinckia sp.，Pseudomonas、Rhizobium melioti和Pseudomonas sp.C18等也有這樣的代謝途徑。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的鐘慧芳研究小組也曾分離到將DBT分解為水溶性有機(jī)硫化物的菌株，可脫除煤中有機(jī)硫22.2％～32.0％，(鐘慧芳等微生物學(xué)報(bào)35(2)130-135，1995)。這種類型的代謝，會(huì)由于含碳結(jié)構(gòu)被脫除，而造成燃料能量的損失。
另一種途徑以DBT為唯一碳源、硫源、能源，直接氧化DBT的C-S鍵生成苯甲酸鹽，已經(jīng)報(bào)道的菌種有短桿菌(Brevibacterium)和節(jié)桿菌(Arthobacter)，它們將DBT-亞砜，DBT-砜脫硫最終生成苯甲酸脂和硫酸鹽，短桿菌(Brevibacterium)可以脫去粗油中DBT的硫而不攻擊非硫碳?xì)浠衔?。這一代謝途徑中，不只脫除了雜環(huán)化合物中的硫，也破壞了烴的碳骨架，同樣引起了燃料熱值的損失。
第三條途徑中，微生物專一氧化斷裂DBT的C-S鍵，而不打開C-C鍵，以特有的酶系統(tǒng)將硫從雜環(huán)中專一性地脫下來，不引起燃料熱值的損失。Atlantic ResearchCorporation最早報(bào)道微生物可從DBT中脫去硫而不改變烴的結(jié)構(gòu)。1989年Kilbane等分離出了紅色紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8(以前稱為R.rhodochrous)，該菌得到了最廣泛的研究，特別是近年來，通過基因工程方法將該類微生物的脫硫基因(dsz)進(jìn)行了克隆、表達(dá)、測(cè)序，并成功地改造和構(gòu)建了重組菌，提高了脫硫效率，使其具有更加廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景(Denome S.A.et al.J Bacteriol.176(21)6707-6716，1994)，而且提出了DBT的脫硫途徑該途徑經(jīng)過DBT5-亞砜(DBTO)，DBT5-砜(DBTO2)和2-羥基聯(lián)苯基-2-亞磺酸鹽(HBPS)，最終將DBT代謝為2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)，因此這一途徑也稱“4S”途徑。專一脫硫的“4S”途徑是目前比較理想，引起大家廣泛關(guān)注的研究領(lǐng)域。繼R.erythropolis IGTS8之后，又報(bào)道了其它幾種細(xì)菌有相似的代謝途徑，如棒桿菌屬細(xì)菌(Corynebacterium)SY1，R.erythropolis D-1，球形諾卡氏菌(Nocardia globelula)，土壤桿菌屬(Agrobacter)MC501，分枝桿菌屬(Mycobaterium)G3，黃單孢菌屬(Xanthomonas)，所有這些細(xì)菌都是革蘭氏陽性菌。
假單胞菌(Pseudomonas)CB1，是Isbister等人從土壤和煤礦樣品中分離出來的，能在以苯甲酸鹽為唯一碳源和能源及高DBT存在的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。用35S-DBT和14C-DBT作CB1專攻DBT雜環(huán)硫示蹤實(shí)驗(yàn)，測(cè)出生成35S硫酸鹽、2-2’-二羥基聯(lián)苯及14CO2。但相當(dāng)遺憾的是他們后來聲稱CB1菌株不穩(wěn)定并且丟失了(e.g.Isbister J.D1993)，所以不能進(jìn)一步證實(shí)該假單胞菌確切的代謝途徑。
本發(fā)明的目的在于克服上述脫除化石燃料中有機(jī)硫技術(shù)存在的缺陷，而提供從自然界中分離出的具有專一性催化斷裂有機(jī)化合物中C-S鍵能力的短芽孢桿菌菌株及其在脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的短芽孢桿菌菌株，其特征在于該菌株為Bacillus brevis R-6，已于2001年4月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.0571；該Bacillus brevis R-6菌株是從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到的；其具體篩選步驟如下從中國(guó)北京門頭溝煤礦礦坑周圍采集土樣樣品，取樣品5克懸浮于無硫基礎(chǔ)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成1000ml水，KH2PO4，2.44g；Na2HPO4·12H2O 14.03g；NH4Cl，2.00g；MgCl2·6H2O，0.36g；CaCl2·2H2O，1；FeCl31mg；MnCl·4H2O，4mg；CuCl2，0.755mg；丙三醇0.8ml或葡萄糖1-3g，20分鐘121℃高壓滅菌)中，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分鐘高壓滅菌)中，置搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時(shí)。吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2-3天后在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離。分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉(zhuǎn)/分30℃作用2-3天。經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.0，在5000轉(zhuǎn)/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取。萃取有機(jī)相回流濃縮至1ml，進(jìn)行GC-MS分析。挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羥基聯(lián)苯HBP的菌株進(jìn)行優(yōu)良菌株的逐步馴化。
該Bacillus brevis R-6菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征R-6為革蘭氏陽性桿菌，專性好氧，抗酸染色陰性。有內(nèi)生芽孢，芽孢中生。孢子囊細(xì)胞微有膨大但不明顯；在一個(gè)細(xì)胞中，只有一個(gè)內(nèi)生孢子；細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于II型；菌株R-6的孢子囊細(xì)胞為短桿狀，其長(zhǎng)度為0.5-0.7×1.2-1.4μm，不形成孢子鏈，無螺旋菌絲體；短桿狀的內(nèi)生孢子使孢子囊細(xì)胞略顯膨脹；內(nèi)生孢子中生，能運(yùn)動(dòng)，有叢生鞭毛。
該Bacillus brevis R-6菌株培養(yǎng)特征該Bacillus brevis R-6菌株可在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、桑塔斯瓊脂、麥芽膏醇母膏瓊脂、牛肉浸汁瓊脂及無機(jī)藍(lán)淀粉瓊脂五種培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-5天。培養(yǎng)特征見表1表1
依照Hasegawa T.等快速薄層層析法進(jìn)行全細(xì)胞水解液分析的結(jié)果表明該Bacillus brevis R-6菌株細(xì)胞壁化學(xué)組份為菌株Bacillus brevisR-6含有meso-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacicl acid)、甘氨酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于II型。
該Bacillus brevis R-6菌株生理生化特征，見表2表2
參照《Bergy’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的內(nèi)容，根據(jù)形態(tài)特征與細(xì)胞壁化學(xué)組份定屬的原則，Bacillus brevis菌株R-6為革蘭氏陽性桿菌，專性好氧，抗酸染色陰性；有內(nèi)生芽孢，芽孢中生；孢子囊細(xì)胞微有膨大但不明顯；在一個(gè)細(xì)胞中，只有一個(gè)內(nèi)生孢子；細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于II型Bacillus brevis R-6菌株的孢子囊細(xì)胞為短桿狀，其長(zhǎng)度為0.5-0.7×1.2-1.4μm，不形成孢子鏈，無螺旋菌絲體；短桿狀的內(nèi)生孢子使孢子囊細(xì)胞略顯膨脹；內(nèi)生孢子中生，能運(yùn)動(dòng)，有叢生鞭毛。
依據(jù)培養(yǎng)特征和生理生化特征定種原則，證明該菌種與短小芽孢桿菌十分相似，故定名為短芽孢桿菌(Bacillus brevis)。與球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus ATCCNo.53969)不同。本發(fā)明的Bacillus brevis R6菌株既可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可在含硫源(MgSO4，二甲基亞砜，DBT或其他有機(jī)硫化合物)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。而前者只能在營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在加有有機(jī)碳源和硫源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。
本發(fā)明的Bacillus brevis R-6菌株應(yīng)用前，在有機(jī)硫源存在的條件下馴化，菌株在25-35℃之間的一適當(dāng)溫度下，進(jìn)行中性好氧培養(yǎng)。
該Bacillus brevis R-6菌株脫硫能力強(qiáng)，脫硫底物范圍廣。
本發(fā)明的Bacillus brevis R-6菌株，可以用新鮮培養(yǎng)的生長(zhǎng)期菌種或有脫硫活性的冷凍非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞及其變異菌株作脫硫生物催化劑，也可用該菌株或其變異菌株的細(xì)胞中得到的有脫硫活性的一個(gè)或幾個(gè)酶作脫硫生物催化劑，還可用吸附或包埋在載體上的固定化細(xì)胞作脫硫生物催化劑。
本發(fā)明提供的Bacillus brevis R-6菌株可作為催化劑選擇性斷裂含硫有機(jī)化合物中C-S鍵，脫除硫原子，尤其適用于化石燃料(如煤炭，石油及其產(chǎn)品)中有機(jī)雜環(huán)硫的脫除；解決了已有石油加氫工藝處理成本高、不易于脫除雜環(huán)化合物中硫等缺點(diǎn)；該菌株通過專一性‘4S’途徑脫除燃料中有機(jī)化合物中的雜環(huán)硫，而不破壞有機(jī)化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃燒熱值，該菌廣泛存在于原油中，具有許多作為工業(yè)應(yīng)用菌株的優(yōu)良特性，耐有機(jī)溶劑的能力強(qiáng)，生長(zhǎng)細(xì)胞脫硫過程中無中間產(chǎn)物的累積，很快就代謝生成最終產(chǎn)物HBP，且未檢測(cè)到無機(jī)硫的存在，產(chǎn)生的硫被認(rèn)為結(jié)合或融合于生長(zhǎng)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)，因此不會(huì)發(fā)生因硫酸根離子累積而抑制菌種脫硫活性的現(xiàn)象，菌株具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用潛力。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明附

圖1為本發(fā)明R-6脫除DBT中硫的結(jié)果-●-分散劑為二甲基酰胺-■-分散劑為十六烷-▲-分散劑為乙醇實(shí)施例1本發(fā)明提供的Bacillus brevis R-6菌株的篩選步驟如下從中國(guó)燕山石油化工公司煉油廠污水處理池中取好氧活性污泥樣品，取樣品5克懸浮于無硫基礎(chǔ)培養(yǎng)基(組成1000ml水，K2HPO4·3H2O，4g；NaH2PO4·2H2O，4.52g；NH4Cl，2.00g；MgCl2·6H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，1mg；FeCl3·6H2O，1mg；MnCl·4H2O，4mg；丙三醇0.2％(v/v)或葡萄糖1-3g，20分鐘121℃高壓滅菌)中，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分鐘高壓滅菌)中，置搖床中以150轉(zhuǎn)/分，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉(zhuǎn)/分，30℃培養(yǎng)2-3天后在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離。分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉(zhuǎn)/分30℃作用2-3天。經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.0，在5000轉(zhuǎn)/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取。萃取有機(jī)相回流濃縮至1ml，進(jìn)行GC-MS分析。挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羥基聯(lián)苯的菌株進(jìn)行優(yōu)良菌株的逐步馴化。
結(jié)果，選擇到了對(duì)二苯并噻吩具有專一性脫硫能力的短芽孢桿菌菌株R-6菌株，并于于2001年4月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.0571；該Bacillus brevis R-6菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征R-6為革蘭氏陽性桿菌，專性好氧，抗酸染色陰性。有內(nèi)生芽孢，芽孢中生。孢子囊細(xì)胞微有膨大但不明顯；在一個(gè)細(xì)胞中，只有一個(gè)內(nèi)生孢子；細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于II型；菌株R-6的孢子囊細(xì)胞為短桿狀，其長(zhǎng)度為0.5-0.7×1.2-1.4μm，不形成孢子鏈，無螺旋菌絲體；短桿狀的內(nèi)生孢子使孢子囊細(xì)胞略顯膨脹；內(nèi)生孢子中生，能運(yùn)動(dòng)，有叢生鞭毛。
實(shí)施例2制備Bacillus brevis R-6菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)短芽孢桿菌Bacillus brevis R-6菌株一鉑環(huán)接種在裝有滅菌的試管中，加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1mmol，于30℃，150轉(zhuǎn)/分下在生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)。吸取培養(yǎng)獲得的菌液1ml接種在裝有100ml基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH＝7.0)的300ml錐形瓶中，再加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1-0.5mmol。將該錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中于30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時(shí)，制得Bacillus brevis菌株R-6細(xì)胞的液體培養(yǎng)液。
實(shí)施例3制備Bacillus brevis R-6菌株的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液將通過實(shí)施例2的方法所獲得的菌株R-6細(xì)胞的液體培養(yǎng)液離心(8000轉(zhuǎn)/分)10分鐘，倒去上層懸浮液。用適量生理鹽水洗滌離心沉淀3次，將所得離心沉淀物懸浮于生理鹽水中，然后冷凍保藏在冰箱中，即制得Bacillus brevis菌株R-6的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液。
實(shí)施例4制備Bacillus brevis R-6菌株的粗酶萃取液將通過實(shí)施例3的方法所獲得的菌株R-6的離心細(xì)胞冷凍干燥，冷凍干燥后的細(xì)胞先在勻漿器中研磨，然后在20Hz下超聲破碎，加入適量生理鹽水后以8000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄去離心沉淀的固體殘?jiān)?，其上層粗酶離心萃取液即為制得的Bacillus brevis菌株R-6的粗酶離心萃取液。
實(shí)施例5制備Bacillus brevis R-6菌株的固定化細(xì)胞物理吸附將清洗、干燥、滅菌后的硅藻土、多孔磚、聚氯乙烯薄片等固體載體加入滅菌培養(yǎng)介質(zhì)，接種新鮮培養(yǎng)的Bacillus brevis菌株R-6，常溫培養(yǎng)，菌種生長(zhǎng)過程中附著在載體之上，形成固定化細(xì)胞凝膠包埋(1)聚丙烯酰胺凝膠包埋3ml新鮮培養(yǎng)的Bacillus brevis菌株R-6細(xì)胞懸液，加入12ml生理鹽水，再加丙烯酰胺2.25g，N，N’-甲叉雙丙烯酰胺0.12g，5％二甲氨基丙晴1.5ml和2.5％過硫酸1.5ml，完成聚合后，得到15％的聚丙烯酰胺凝膠，切成小塊，用蒸餾水和生理鹽水各洗滌兩次，抽干，即制得固定化細(xì)胞。
(2)海藻酸包埋3ml新鮮培養(yǎng)的Bacillus brevis菌株R-6細(xì)胞懸液，加入20ml制備好的2％的海藻酸鈉溶液，把混合物攪勻。用粗針頭擠入到2％的反離子溶液(鈣鹽或鋁鹽)中，放置冰箱10小時(shí)，用蒸餾水和生理鹽水各洗滌兩次，形成包有Bacillus brevis菌株R-6固定化細(xì)胞的均勻、球形、有高度微孔結(jié)構(gòu)的凝膠。
實(shí)施例6本發(fā)明在脫除二苯并噻吩(DBT)中有機(jī)硫的應(yīng)用(1)將已滅菌的DBT配成100mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)儲(chǔ)液；(2)在100ml錐形瓶中依次加入滅菌培養(yǎng)基30ml、DBT-二甲基酰胺儲(chǔ)液0.06ml，使錐形瓶中DBT的濃度為0.2mmol/L；(3)將實(shí)施例2制得的Bacillus brevisR-6菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液，或?qū)嵤├?制得的Bacillus brevis R-6菌株的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液，或?qū)嵤├?制得的Bacillus brevis R-6菌株的粗酶萃取液(粗酶萃取液中加NADH)3ml加入上述步驟(4)錐形瓶中，將錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中，于30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔12小時(shí)取樣測(cè)定。其DBT降解的測(cè)定結(jié)果見圖1，其結(jié)果表明，在不同的DBT分散劑存在的情況下，菌株R-8都可以較好地脫除DBT中的硫，十六烷作為分散劑時(shí)，脫硫速率最快，為0.0037mM/h·g細(xì)胞干重，二甲基酰胺與乙醇作為分散劑時(shí)，脫硫效果相近。這是因?yàn)槭榈拇嬖跁?huì)在DBT表面形成一層膜，有利于與微生物作用。
實(shí)施例7本發(fā)明在脫除二苯并噻吩砜(DBTO2)中的硫的應(yīng)用已滅菌的DBTO2配成100mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)儲(chǔ)液；將實(shí)施例6中的硫源DBT換為DBTO2，其他操作步驟和方法同實(shí)施例6，其DBTO2降解的結(jié)果見表3
表3
實(shí)施例8本發(fā)明在脫除4，6-二甲基二苯并噻吩砜(DMDBT)中的硫的應(yīng)用按實(shí)施例6的方法，將硫源換為DMDBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇或十六烷)溶液，按實(shí)施例6的條件培養(yǎng)后，再按實(shí)施例1的方法隔12小時(shí)取樣測(cè)定，DMDBT降解的測(cè)定結(jié)果見表4表4
實(shí)施例9本發(fā)明在脫除苯并噻吩(TPT)中硫的的應(yīng)用按實(shí)施例6的方法，將催化底物換為苯并噻吩-二甲基酰胺(也可以是乙醇或十六烷)溶液，按實(shí)施例6的條件培養(yǎng)后，再按實(shí)施例1的方法隔12小時(shí)取樣測(cè)定。苯并噻吩降解的測(cè)定結(jié)果見表5表5
實(shí)施例10本發(fā)明在脫除二苯硫化物中硫的應(yīng)用按實(shí)施例6的方法，將硫源換為二苯硫化物-二甲基酰胺(也可以是乙醇或十六烷)溶液，按實(shí)施例6的條件培養(yǎng)后，再按實(shí)施例1的方法隔12小時(shí)取樣測(cè)定。二苯硫化物降解的測(cè)定結(jié)果見表6表權(quán)利要求
1.一株短芽孢桿菌菌株，其特征在于該菌株為Bacillus brevis R-6，于2001年4月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.0571。
2.按權(quán)利要求1所述的短芽孢桿菌菌株，其特征在于該菌株從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到；該菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)；其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征屬革蘭氏陽性桿菌，專性好氧，抗酸染色陰性，有內(nèi)生芽孢，芽孢中生，孢子囊細(xì)胞微有膨大但不明顯，在一個(gè)細(xì)胞中，只有一個(gè)內(nèi)生孢子，細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于II型；該Bacillus brevis R-6菌株的孢子囊細(xì)胞為短桿狀，其長(zhǎng)度為0.5-0.7×1.2-1.4μm，不形成孢子鏈，無螺旋菌絲體；短桿狀的內(nèi)生孢子使孢子囊細(xì)胞略顯膨脹；內(nèi)生孢子中生，能運(yùn)動(dòng)，有叢生鞭毛。
3權(quán)利要求1所述的短芽孢桿菌菌株在脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用，其特征在于該Bacillus brevis R-6菌株通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫。
4.按權(quán)利要求3所述的短芽孢桿菌菌株脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用，其特征在于該Bacillus brevis R-6菌株的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫。
5.按權(quán)利要求3所述的短芽孢桿菌菌株脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用，其特征在于該Bacillus brevis R-6菌株的固定化細(xì)胞通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫。
6.按權(quán)利要求3所述的短芽孢桿菌菌株脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用，其特征在于該Bacillus brevis R-6菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫。
7.按權(quán)利要求3所述的短芽孢桿菌菌株脫除含硫有機(jī)化合物中硫的應(yīng)用，其特征在于該Bacillus brevis R-6菌株的含NADH的粗酶萃取液通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫，Bacillus brevis R-6菌株的粗酶萃取液中含有NADH。
全文摘要
本發(fā)明涉及的短芽孢桿菌菌株為:Bacillus brevisR－6菌株,于2001年4月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”,保藏號(hào)CGMCC NO.0571;從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到的;該Bacillusbrevis R－6菌株及其非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液、固定化細(xì)胞、細(xì)胞液體培養(yǎng)物或粗酶萃取液均可通過氧化斷裂C－S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的硫。
文檔編號(hào)C12S1/00GK1386846SQ01115920
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2001年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月22日
發(fā)明者姜成英, 劉會(huì)洲, 邢建民, 安震濤, 陳家鏞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所