專利名稱：使用新的耐熱型酵母從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過同時(shí)進(jìn)行的糖化和發(fā)酵過程從木素纖維素生物質(zhì)中獲得乙醇的改進(jìn)工藝。更具體說，本發(fā)明涉及在初期階段對(duì)木素纖維素生物質(zhì)進(jìn)行熱水蒸氣爆炸預(yù)處理，隨后同時(shí)進(jìn)行水解(使用市售的纖維素酶)和用新的馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromyces marxianus)耐熱型菌株進(jìn)行發(fā)酵的工藝。
從生物質(zhì)中獲得乙醇燃料可給能量的提供帶來安全性，因?yàn)樗纱婊瘉碓吹娜剂?。從生物質(zhì)中獲得乙醇燃料還有利于地區(qū)的發(fā)展，同時(shí)得到與就業(yè)有關(guān)的益處。與其它可再生能源一樣，在運(yùn)輸工業(yè)中生產(chǎn)和使用生物乙醇優(yōu)于得自油的燃料，這是因?yàn)闇p少了污染物的排放并且不增加溫室效應(yīng)。
從可再生原料中生產(chǎn)乙醇可以使用各種大量的底物。用來生產(chǎn)這種乙醇類型的原料是含有糖或淀粉的烴化產(chǎn)物，它們易經(jīng)歷發(fā)酵，或者是直接發(fā)酵(蔗糖)或者是在水解后(淀粉、菊粉)。諸如甜菜根和甘蔗的作物(第一組)和諸如玉米的谷物(第二組)是目前用來生產(chǎn)生物乙醇的原料的一些實(shí)例。也可以使用木素纖維素材料(有機(jī)物和森林的殘余物以及草本類和木素類作物)作為生產(chǎn)生物乙醇的原料。
對(duì)含糖底物和含淀粉底物來說，工藝的總成本取決于原料的價(jià)格，其占產(chǎn)品總成本的60-70％。為提高生物乙醇燃料超過油基燃料的競爭能力，就需要開發(fā)一種新的工藝從較便宜的底物如某些木素纖維素原料中獲得產(chǎn)品。
在被轉(zhuǎn)變成乙醇之前，木素纖維素材料的纖維素部分需要經(jīng)過水解，變成微生物可發(fā)酵的葡萄糖。這個(gè)可以通過酸或酶式催化劑來進(jìn)行的階段，由于木素提供了纖維素鏈的化學(xué)穩(wěn)定性和植物組織的保護(hù)，從而使得該過程在經(jīng)濟(jì)和能量方面存在費(fèi)用大的問題。
纖維素的酶水解比酸催化劑工藝具有至少三項(xiàng)潛在的優(yōu)勢·產(chǎn)率較大，·設(shè)備費(fèi)用較低。因?yàn)樗诔汉偷蜏叵逻M(jìn)行，·沒有因糖的分解而產(chǎn)生可以妨礙發(fā)酵的毒性物質(zhì)。
然而，由于木素纖維素材料的結(jié)構(gòu)，碳水化合物不易直接被水解酶所接近，因而需要一系列的在先處理來改進(jìn)水解的產(chǎn)率。纖維素酶嚴(yán)重抑制反應(yīng)最終產(chǎn)物的積累(主更是指纖維二糖和葡萄糖)，是限制水解產(chǎn)率的另一個(gè)因素。
通常來說，從木素纖維素生物質(zhì)中獲得乙醇的方法包括以下階段預(yù)處理、纖維素的水解和葡萄糖的發(fā)酵。預(yù)處理階段的目的是促進(jìn)酶和微生物的滲入和擴(kuò)散。預(yù)處理自1919年以來(當(dāng)時(shí)Beckmann取得關(guān)于堿預(yù)處理的專利權(quán)，該預(yù)處理以用氫氧化鈉浸滲為基礎(chǔ)，改善了稻草可消化性)，開發(fā)了很多針對(duì)木素纖維素材料的預(yù)處理。
在所測試的預(yù)處理中，熱水工藝似乎對(duì)改進(jìn)木素纖維素材料的可接近性最有效。熱水工藝的一個(gè)實(shí)例可見Shell International Research的西班牙專利ES87/6829，其在氣密型反應(yīng)器中使用了200-250℃的蒸汽來處理預(yù)先粉碎的生物質(zhì)。在此工藝中，將生物質(zhì)處理之后，將反應(yīng)器逐漸冷卻至常溫。然而，盡管其改進(jìn)了生物質(zhì)的可接近性，以致最終可被酶所酶解，但包括反應(yīng)器突然減壓的熱水處理的變型(稱為蒸汽爆炸處理)，據(jù)顯示是有助于纖維素酶最終作用的最有效的手段之一。蒸汽爆炸是一種熱學(xué)-力學(xué)-化學(xué)過程，其結(jié)合了熱(如蒸汽)、機(jī)械力(剪切效果)和化學(xué)作用(水解)。結(jié)果是改變了細(xì)胞壁內(nèi)的微絲堆積并使纖維斷裂，造成纖維素對(duì)水解酶的可接近性增加。最佳溫度和反應(yīng)時(shí)間條件取決于材料的類型而不同。
Mason于1929年取得了關(guān)于不連續(xù)蒸汽爆炸處理的專利權(quán)(美國專利US1655618)，用于生產(chǎn)木料板，其結(jié)合了蒸汽熱處理和木素纖維素纖維的機(jī)械結(jié)構(gòu)破壞。在此工藝中，用3.5MPa或更高壓力的蒸汽于立式鋼筒中處理木制碎片。當(dāng)處理完成后，將材料從鋼筒的底部猛然地卸放出來。該過程將高壓和高溫對(duì)木素纖維素材料的作用與最終突然的減壓結(jié)合起來。該處理的效果是物理改良(木素纖維素纖維的隔開和斷裂)和化學(xué)改性(C-O-C鍵的解聚和斷裂)的組合。在蒸汽處理期間，大部分半纖維素被水解成可溶于水的低聚物或游離的糖。
蒸汽爆炸處理有非常不同的用途。例如，美國專利US4136207(1979)描述了這種類型的預(yù)處理為增加硬質(zhì)木材(如楊木和樺木)被反芻動(dòng)物消化性的用途。在此用途中，使用了STAKE技術(shù)，在高壓管狀反應(yīng)器中連續(xù)操作，溫度200-250℃并且處理時(shí)間不同。
在IOTECH公司開發(fā)的間歇式蒸汽爆炸工藝(已知為″閃式水解″)中，將木材粉碎成小顆粒尺寸并且在接近230℃和500psi的溫度和壓力下處理，并且當(dāng)達(dá)到這些條件時(shí)，突然從反應(yīng)器中卸料。木材的有機(jī)酸控制pH并且廢氣中一直存在有乙酸。公知為IOTECH法中的反應(yīng)器的設(shè)計(jì)描述于美國專利US4461648中。
作為蒸汽爆炸處理木素纖維素材料的另一個(gè)用途，加拿大專利CA1212505描述了結(jié)合STAKE和IOTECH蒸汽爆炸工藝來從硬質(zhì)木材中高產(chǎn)量獲得紙漿的用途。
在本發(fā)明中，使用蒸汽爆炸處理來增加纖維素的可消化性，以便在同時(shí)進(jìn)行的糖化和發(fā)酵過程(SSF)中被微生物纖維素酶水解。這種將蒸汽爆炸處理用作SSF過程中的預(yù)處理是這種處理的一種新用途，并且是本發(fā)明的新穎性之一。
該預(yù)處理的基本目的是減少纖維素的結(jié)晶度并且離解半纖維素-纖維素復(fù)合體。纖維素的可消化性隨預(yù)處理的深度而增加，并且可消化性的增加與纖維素纖維的可利用表面積(ASA)的增加有直接關(guān)系，其有助于纖維素酶的最終酶解。ASA的增加是半纖維素和木素被部分或總體消除的結(jié)果。
關(guān)于蒸汽爆炸處理之后底物可接近性增加的研究集中于對(duì)與底物有關(guān)的一系列因素的研究，例如孔度的分布、結(jié)晶度、聚合度或剩余木聚糖的含量，它們決定了其最終的有效性(K.K.Y.Wong等，Biotechnol Bioeng.31，447(1988)；H.L.Chum等，Biotechnol Bioeng.31，643(1988))。他們最初的研究集中于在高溫(220-270℃)短時(shí)(40-90秒)處理的實(shí)驗(yàn)中，突然的減壓對(duì)纖維素?cái)嗔训淖饔?。較近來的研究(Wright，J.D.SERI/TP-231-3310，1988；Schwald等蒸汽爆炸技術(shù)，基本原理和工業(yè)應(yīng)用，F(xiàn)acher，Marzetti和Crecenzy(eds.)，308-320頁(1989))表明使用較低溫度(不超過200-220℃)和較長處理時(shí)間(5-10分鐘)可產(chǎn)生適宜的溶解速率，還可避免產(chǎn)生一定程度高溫分解的可能性，這種高溫分解可產(chǎn)生抑制性產(chǎn)物。該應(yīng)用中所用的條件按照這些規(guī)定，并且據(jù)測定他們可在剩余物中獲得較多的葡萄糖回收率(Ballesteros等用于能源、環(huán)境、農(nóng)業(yè)和工業(yè)的生物質(zhì)，Chartier、Beenackers和Grassi(eds.)，第3卷，1953-1958頁(1995))。纖維素的酶水解和葡萄糖的發(fā)酵，同時(shí)進(jìn)行的糖化和發(fā)酵過程(SSF)
纖維素的酶水解是由已知為纖維素水解酶或纖維素酶類的酶活性混合物來完成。其中的酶之一，叫做內(nèi)切葡聚糖酶，被吸附在纖維素的表面并且酶解聚合物鏈的內(nèi)部，破壞其某一點(diǎn)。然后，第二種酶，叫做外切葡聚糖酶，從鏈的非還原末端釋放兩個(gè)單元的葡萄糖，叫做纖維二糖。在此反應(yīng)中產(chǎn)生的纖維二糖可以積聚在介質(zhì)中并且明顯抑制外切葡聚糖酶的活性。第三種酶，β葡萄糖苷酶，使這些兩個(gè)糖單元分裂成游離的葡萄糖(其隨后被發(fā)酵成乙醇)。同樣，葡萄糖可以積聚在介質(zhì)中并且抑制β葡萄糖苷酶的作用，從而引起纖維二糖的積聚，正如我們前面提到，這樣會(huì)抑制外切葡聚糖酶的活性。
盡管可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物有不同類型，包括細(xì)菌和不同品種的真菌，但通常使用的是絲狀真菌Trichoderma ressei的基因改變菌株，因?yàn)樗鼈兙哂休^大的產(chǎn)率。傳統(tǒng)的纖維素酶生產(chǎn)方法是間歇式的，使用碳的不溶性來源既作為誘導(dǎo)物又作為底物，用于真菌的生長和酶的產(chǎn)生。在這些體系中，生長的速度和纖維素酶的產(chǎn)生速率受到限制，因?yàn)檎婢坏貌环置诶w維素酶并且對(duì)固體進(jìn)行緩慢的酶水解來獲得所必須的碳。通常在間歇式進(jìn)料的操作中可獲得最好的結(jié)果，其中將固體底物(如Solka Floc或預(yù)處理的生物質(zhì))緩慢添加到發(fā)酵貯器中，以便它不含太多的底物(Warson等，Biotech.Lett.，6，667，1984)。根據(jù)Wright，J.D.(SERI/TP-231-3310，1988)，使用Solka Floc和預(yù)處理的農(nóng)業(yè)剩余物的平均生產(chǎn)率為大約50IU/l.h。提高生產(chǎn)率并且增加這些酶的比活性是本發(fā)明研究的主要目的所在，其中酶的天然比活性是極其低的。
在由木素纖維素材料生產(chǎn)乙醇的常規(guī)方法中，是將纖維素酶添加到在反應(yīng)器中預(yù)處理過的材料中，以便使纖維素糖化成葡萄糖，并且當(dāng)該反應(yīng)完成后，在第二個(gè)反應(yīng)器中將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。該工藝叫做分開糖化和發(fā)酵，在獲得乙醇的過程中包含兩個(gè)不同的階段。使用該方法，纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率是低的，這是因?yàn)槠咸烟呛屠w維二糖的積聚造成了對(duì)酶復(fù)合物作用的抑制，結(jié)果獲得較大量的非水解的纖維素剩余物，和低產(chǎn)量的乙醇。事實(shí)上，根據(jù)Wright，J.D.(SERI/TP-231-3310，1988)，這種對(duì)最終產(chǎn)品的抑制是分開糖化和發(fā)酵工藝的最大缺陷，并且是其成本高的主要原因，因?yàn)橐獓L試解決這個(gè)問題就得使用大量的纖維素水解酶。
英國專利GB2186289B描述了一種多步分開糖化和發(fā)酵以便從豆科草本植物中獲得乙醇的工藝。這些步驟是將植物性材料勻漿、用無機(jī)堿水解該材料讓預(yù)處理的材料與β纖維素酶反應(yīng)，過濾反應(yīng)介質(zhì)，用微生物體系發(fā)酵濾出物來生產(chǎn)乙醇并且分離所產(chǎn)生的乙醇。
對(duì)前述方法來說，最感興趣的選擇之一是同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)法。在此方法中，酵母與纖維素水解酶一起存在，減少了糖在反應(yīng)器中的積聚并因此可以獲得比分開水解和發(fā)酵工藝更大的產(chǎn)率和糖化率。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在整個(gè)過程中只使用一個(gè)發(fā)酵貯器，由此減少了所要投資的費(fèi)用。介質(zhì)中存在乙醇還使混合物中不太容易侵入不期望的微生物(Wyman，C.E.生物資源技術(shù)，50，3-16，1994)。
在同時(shí)水解和發(fā)酵工藝中，發(fā)酵和糖化必須相容并且具有相近的pH、溫度和最佳底物溫度。SSF工藝中的一個(gè)問題是糖化和發(fā)酵的最佳溫度不同。由于最佳糖化溫度為45-50℃范圍，因此推薦在同時(shí)SSF工藝中使用耐熱型酵母。
近些年來，人們對(duì)能夠在40℃以上溫度生長的酵母的不同菌株進(jìn)行了研究并且撰寫了文章，但關(guān)于使用這些微生物高產(chǎn)率乙醇發(fā)酵的文獻(xiàn)并不太多。Szczodrak和Targonski(生物技術(shù)和生物工程，第31卷，300-303頁，1988)從12個(gè)科的酵母中試驗(yàn)了總共58種菌株，測試它們?cè)?0-46℃下生長和發(fā)酵糖的能力。從酵母屬、克魯維氏酵母屬和豆孢酵母屬中根據(jù)它們分別在40、43和46℃下發(fā)酵葡萄糖、半乳糖和甘露糖的能力選擇了幾種菌株。發(fā)現(xiàn)脆弱豆孢酵母和脆壁克魯維氏酵母的兩株菌株的乙醇產(chǎn)率最大，其在43和46℃下從140g/l葡萄糖中分別生產(chǎn)了56和35g/l的乙醇。
在本發(fā)明中，我們使用了通過化學(xué)誘變并且接下來篩選獲得的馬克斯克魯維氏酵母的新菌株，CECT10875，其能夠在42℃下將纖維素水解產(chǎn)生的葡萄糖發(fā)酵成乙醇，并且與原始菌株相比，其產(chǎn)率得到改進(jìn)。
近年來對(duì)SSF工藝的研究導(dǎo)致了乙醇產(chǎn)量的明顯改進(jìn)，這也是很多專利的目標(biāo)。這些研究主要是基于微生物的篩選、酶的最佳濃度和不同的底物預(yù)處理，但大部分是針對(duì)間歇式工藝。例如，MAXOL & C.B.的專利WO96/37627描述了一種從植物材料中生產(chǎn)乙醇的間歇式SSF方法，其中糖化過程使用半纖維素酶和市售纖維素酶的混合物，并且使用來自假絲酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬和酵母屬的酵母或其混合物來發(fā)酵所產(chǎn)生的不同糖。在此方法中，用酸或堿對(duì)植物材料進(jìn)行預(yù)處理，但其缺點(diǎn)是材料預(yù)先要被粉碎成大約1mm大小，這代表了高能量消耗。所用的植物來源的材料是非常雜的，并且當(dāng)使用與本發(fā)明類似的材料時(shí)，如飼料稻草，所獲得的產(chǎn)量比本發(fā)明所述使用耐熱酵母工藝所獲得的產(chǎn)率低差不多10倍，這種低產(chǎn)率可歸因于此方法使用的溫度為35℃，這個(gè)溫度對(duì)用所選的酵母進(jìn)行發(fā)酵來說是足夠的，但超出了糖化過程所需的最佳范圍。
獲得乙醇的SSF工藝的其它實(shí)例可見Wyman等的文章(Biotech Bioeng.Symp.，21-238頁，1998)和Spindler等的文章(Appl.Biochem.Biotechnol.，28/29，773頁，1991)，其使用的介質(zhì)是克勞森酒香酵母(Bretanomyces clousenii)和釀酒酵母的混合物，它們發(fā)酵由水解纖維素所產(chǎn)生的纖維二糖和葡萄糖。該過程在37℃下進(jìn)行，處理時(shí)間為7天，可以認(rèn)為其對(duì)這樣類型的方法來說是非常高了。
本發(fā)明描述的SSF方法是對(duì)先前所述方法的改進(jìn)，因?yàn)楸景l(fā)明引入使用了耐熱型菌株，該菌株可以允許在42℃下進(jìn)行水解和發(fā)酵過程，該溫度接近于纖維素水解復(fù)合物的最佳溫度。它還顯著縮短了處理時(shí)間。
對(duì)連續(xù)SSF系統(tǒng)來說，慣常的設(shè)計(jì)是連續(xù)搖動(dòng)的罐式反應(yīng)器，以串聯(lián)或級(jí)聯(lián)的形式排列。這種類型系統(tǒng)的最大缺陷是其成本昂貴，因?yàn)樗枰L的處理時(shí)間和劇烈的搖動(dòng)，會(huì)導(dǎo)致酶變性并且必需要經(jīng)常更換它們。Nguyen，Q.A.的專利WO98/30710描述了一種塔式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其以流動(dòng)-活塞反應(yīng)器技術(shù)為基礎(chǔ)，使發(fā)酵貯器的體積和搖動(dòng)所需要的能量大大減少。該系統(tǒng)允許使用高含量的懸浮固體混合料，如預(yù)處理的木素纖維素材料，因?yàn)樵谇笆龅南到y(tǒng)中它們僅可適用于含水混合料。雖然如此，文獻(xiàn)中仍沒有包含關(guān)于獲得高產(chǎn)率和生產(chǎn)率的連續(xù)SSF法發(fā)展的描述。
本發(fā)明所包括的工藝是從木素纖維素生物質(zhì)中獲得乙醇的間歇式工藝，其包括蒸汽爆炸預(yù)處理以及使纖維素變成乙醇的同時(shí)進(jìn)行的糖化(通過市售纖維素酶)和發(fā)酵(使用新的耐熱型酵母，具體說是馬克斯克魯維氏酵母CECT10875)。該過程在42℃下進(jìn)行。搖動(dòng)在150rpm下進(jìn)行并且處理時(shí)間為72小時(shí)。在預(yù)處理之后，1,000g的纖維素含量為30-40％的生物質(zhì)(不易受酶水解)得到270-360g容易被水解的纖維素。通過SSF工藝將該纖維素轉(zhuǎn)變成90-120g的乙醇。
為實(shí)現(xiàn)前面的描述，并且更好地理解本發(fā)明的特征，以下將詳細(xì)描述優(yōu)選的實(shí)施方案，其以一組定向性但非限制性的說明書附圖為基礎(chǔ)

圖1顯示了本發(fā)明的工藝流程。
本發(fā)明中所用的原料是主要含有纖維素的物料，如林業(yè)和農(nóng)業(yè)殘余物、紙漿、木素纖維素作物生物質(zhì)和家庭垃圾的有機(jī)部分。正常來說，這種材料已被風(fēng)干并且含有10-15％水分。
盡管在預(yù)處理前需要將材料粉碎，但所需要的顆粒大小(15-30mm)相當(dāng)?shù)卮笥谄渌磻?yīng)器設(shè)計(jì)中所用的粒度，從而減少了粉碎相關(guān)的能量消耗。這種蒸汽熱處理導(dǎo)致冷凝并且產(chǎn)生濕的木素纖維素物質(zhì)。由于溫度足夠高到可熱力學(xué)迫使液體水的離解，因而發(fā)生自身水解，產(chǎn)生酸性介質(zhì)，克服了水解的能量屏障。由于蒸汽相的擴(kuò)散大于液體相的擴(kuò)散，因而保證了蒸汽引入木素纖維素材料的結(jié)構(gòu)中。蒸汽首先滲入，然后冷凝。這種毛細(xì)管水由于高壓而處于平衡。當(dāng)材料被減壓時(shí)，毛細(xì)管水迅速蒸發(fā)，其具有分離和破壞一些纖維的機(jī)械作用，可能對(duì)最弱的區(qū)域(非晶形纖維素)的作用最大。這種機(jī)械作用顯然是由內(nèi)部水分的迅速蒸發(fā)引起的。這種蒸發(fā)產(chǎn)生了剪切力，造成纖維分離。
本發(fā)明中預(yù)處理所用的設(shè)備由三個(gè)裝置組成蒸汽蓄積器(1)、蒸汽爆炸反應(yīng)器(2)和卸料旋風(fēng)分流器(3)，其特征如下所述。參見圖1。
蒸汽蓄積器(1)為蒸汽爆炸反應(yīng)器(2)提供245℃和a-3MPa壓力的蒸汽。它由壓力接收器組成，其中裝配有許多電阻(6)。在蒸汽出口處，有一大氣壓通氣口，被兩個(gè)活閥(8)關(guān)閉，以便在初期的裝料過程中有空氣脫逸(當(dāng)其被設(shè)定至操作壓力和溫度時(shí))。在壓力刻度測量之處設(shè)置作用于電阻(6)上的壓力開關(guān)(7)，并且每個(gè)壓力開關(guān)作用于一個(gè)電阻(6)上，根據(jù)是否達(dá)到所設(shè)定的值來關(guān)或開之。
蒸汽爆炸反應(yīng)器(2)是將木素纖維素生物質(zhì)在其中壓縮和突然減壓的反應(yīng)室。它由3″直徑的不銹鋼316垂直管構(gòu)成，兩端為兩個(gè)3″直徑的不銹鋼316節(jié)流閥。反應(yīng)室頂部的入口閥(4)通過手來打開和關(guān)閉，并且用于向反應(yīng)器(2)中裝填粉碎木素纖維素生物質(zhì)。出口閥(5)位于反應(yīng)室的底部，由觸發(fā)和彈簧裝置在1秒種之內(nèi)打開。由此將蒸汽和生物質(zhì)混合物猛然排放出去，并且經(jīng)過管道被帶往旋風(fēng)分流器(3)。反應(yīng)室(2)、閥門和卸料管道用70mm厚的石纖維保溫，以便在壓縮-膨脹過程中盡可能地減少蒸汽的冷凝。
卸料旋風(fēng)分流器(3)由不銹鋼316制成并且具有直徑為16″的圓柱形部分和一個(gè)圓錐形部分，其中圓錐形部分由圓柱形部分向下并且呈60度角，末端為DN-80和PN-16凸緣頸，其上有一熱固型閥門，通過其將反應(yīng)器中膨脹的物料除去。旋風(fēng)分流器圓柱部分上邊緣的末端為一16″凸緣，其上裝配有鎖定拉環(huán)(lockingtab)和緊固件，該緊固件壓制有眼螺栓，而所說的有眼螺栓將起旋風(fēng)分流器蓋作用的堵頭盲板(blind flange)拴緊。旋風(fēng)分流器裝有溫度計(jì)和壓力計(jì)。
在SSF中使用發(fā)酵貯器(10)，用不銹鋼制成并且裝配有機(jī)械搖動(dòng)、pH和溫度控制。在入口處有一壓濾器(9)。
工藝如下將粉碎的物料引入蒸汽爆炸裝置(2)中，并且通過注射入來自蒸汽蓄積器(1)的飽和蒸汽進(jìn)行1-3MPa壓力和190-230℃的處理，并且根據(jù)所用的原料進(jìn)行1-10分鐘。當(dāng)預(yù)處理結(jié)束后，讓排出的蒸汽和木素纖維素生物質(zhì)的混合物以水平地并且切線方向地進(jìn)入卸料旋風(fēng)分流器(3)，在其中除去揮發(fā)性成分并且將其過濾，以便將液體部分與固體部分分離。液體部分基本上含有大部分的半纖維素糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)、這些糖的降解產(chǎn)物(糠醛、羥甲基糠醛)、有機(jī)酸(主要是乙酸)和因木素溶解而產(chǎn)生的酚類化合物。固體部分基本上含有纖維素和木素，并且將其用作纖維素水解生產(chǎn)葡萄糖的原料。該葡萄糖是發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的底物。
在離開壓濾器(9)之后，將物料以8-15％(w/v)的固/液比引入發(fā)酵貯器(10)中，其中所說的固/液比根據(jù)構(gòu)成木素纖維素生物質(zhì)的物料而不同。當(dāng)將物料引入發(fā)酵貯器中并且被充分稀釋后，加入濃度為15濾紙單位(Unit of Filter Paper，UFP)/克纖維素的市售纖維素水解化合物(如CELLUCLAST 1.5L，NOVO-NORDISK公司出品)和12.6國際單位/克纖維素的β葡萄糖苷酶(如NOVOZYME 188，NOVO-NORDISK公司出品)，兩者均再懸浮于pH4.8的檸檬酸鹽緩沖劑中。按照國際IUPAC(純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)國際聯(lián)盟)描述、由Ghose，T.K.(純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)，第59卷，第2號(hào)，257-268頁，1987)描述的方法測定酶的活度。
由于前述的最終產(chǎn)品抑制纖維素水解復(fù)合物，因此諸如本發(fā)明所述的SSF工藝(其中當(dāng)葡萄糖產(chǎn)生時(shí)即從介質(zhì)中去除)，可對(duì)水解的產(chǎn)率帶來明顯的改進(jìn)。出于此目的，本發(fā)明使用一種新的馬克斯克魯維氏酵母耐熱型菌株(CECT10875)，由于它使酶復(fù)合物的作用與發(fā)酵相容在接近兩種情況的最佳溫度，因而提供了本質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。這種新的菌株通過化學(xué)誘變DER-26馬克斯克魯維氏酵母菌株獲得，所說的DER-26馬克斯克魯維氏酵母菌株屬于可再生能源CIEMAT部門的收集品。按照應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)，第39/40卷，201-211頁(1993)中所述，用不同劑量的烷基化劑甲磺酸乙酯處理這種原始菌株，然后根據(jù)在42-45℃范圍內(nèi)生長和將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的能力進(jìn)行篩選。這種菌株于1998年7月2日保藏于西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Universidad de Valencia，Edificio deInvestigacion，Campus de Burjasot，46100 Burjasot，Valencia)，保藏號(hào)為10875。
在屬于本發(fā)明的SSF方法中，將馬克斯克魯維氏酵母CECT 10875在42℃下生長16小時(shí)的培養(yǎng)物的懸浮液以10％濃度(v/v)接種于前述的含有預(yù)處理過的生物質(zhì)和纖維素水解復(fù)合物的發(fā)酵貯器(10)中。在42℃下，將該混合物于150rpm下?lián)u動(dòng)72小時(shí)。在此時(shí)間之后，顯示乙醇的濃度不再增加，所以認(rèn)為72小時(shí)后該過程結(jié)束，通過HPLC測定乙醇的最終濃度和介質(zhì)中的剩余糖的濃度。
權(quán)利要求
1.從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所說的方法包括以下步驟將木素纖維素生物質(zhì)粉碎；對(duì)粉碎的木素纖維素生物質(zhì)進(jìn)行蒸汽爆炸預(yù)處理，根據(jù)所用材料的類型保持1-3MPa的壓力和190-230℃的溫度1-10分鐘的時(shí)間，之后引發(fā)迅速減壓；收集預(yù)處理過的物料并且通過過濾分離液體和固體部分，并且將固體部分引入發(fā)酵貯器(10)中；向發(fā)酵貯器(10)添加濃度為15UFP/克纖維素的纖維素酶和12.6國際單位的β-葡萄糖苷酶；給發(fā)酵貯器(10)接種馬克斯克魯維氏酵母CECT 10875耐熱型酵母培養(yǎng)物的懸浮液；將混合物在42℃下?lián)u動(dòng)72小時(shí)；當(dāng)反應(yīng)完成之后，測定混合物中乙醇和剩余糖的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于木素纖維素生物質(zhì)粉碎后的顆粒大小為15-30mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于馬克斯克魯維氏酵母CECT10875的培養(yǎng)物通過化學(xué)誘變馬克斯克魯維氏酵母的DER-26菌株來獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于木素纖維素生物質(zhì)的含水量為10-15％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于引入發(fā)酵貯器中的固體部分的固/液比為在8-15％(w/v)之間變化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于纖維素酶是NOVO-NORDISK公司出品的CELLUCLAST 1.5L，并且β-葡萄糖苷酶是NOVO-NORDISK公司出品的NOVOZYME 188。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于纖維素酶和β-葡萄糖苷酶溶解于pH4.8的檸檬酸鹽緩沖液中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于馬克斯克魯維氏酵母CECT0875的接種物的濃度為10％v/v。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的從木素纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于將混合物在150rpm下?lián)u動(dòng)。
全文摘要
本發(fā)明包括以下階段:將木素纖維素生物質(zhì)粉碎至15－30mm的大小,對(duì)所獲得的產(chǎn)物在反應(yīng)器(2)中于190－230℃下進(jìn)行1－10分鐘的蒸汽爆炸預(yù)處理,在旋風(fēng)分流器(3)中收集預(yù)處理過的物料并且在壓濾器(9)中通過過濾分離液體和固體部分,將固體部分引入發(fā)酵貯器(10)中,添加濃度為15UFP/克纖維素的纖維素酶和12.6國際單位的β－葡萄糖苷酶,所說的纖維素酶和β－葡萄糖苷酶溶解于pH4.8的檸檬酸鹽緩沖液中,給發(fā)酵貯器(10)接種馬克斯克魯維氏酵母CECT10875耐熱型菌株的培養(yǎng)物,該菌株通過化學(xué)誘變馬克斯克魯維氏酵母的DER－26菌株來獲得,并且將混合物在42℃下?lián)u動(dòng)72小時(shí)。
文檔編號(hào)C12P7/10GK1340627SQ0111649
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月24日
發(fā)明者I·B·伯戴希斯, M·M·B·伯戴希斯, J·M·O·多明戈茲, J·C·加西亞 申請(qǐng)人:能源環(huán)境和技術(shù)研究中心