国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      使用突變dna聚合酶的高溫逆轉(zhuǎn)錄的制作方法

      文檔序號(hào):597401閱讀:562來源:國(guó)知局
      專利名稱:使用突變dna聚合酶的高溫逆轉(zhuǎn)錄的制作方法
      背景技術(shù)
      發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域,特別是逆轉(zhuǎn)錄和核糖核酸(RNA)序列擴(kuò)增的方法。
      現(xiàn)有技術(shù)狀況術(shù)語(yǔ)“逆轉(zhuǎn)錄酶”是指一類鑒定為RNA依賴性DNA聚合酶的聚合酶。所有已知的逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA模板合成DNA均需引物。長(zhǎng)期以來,逆轉(zhuǎn)錄酶主要用于將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,后者再被克隆到載體中供進(jìn)一步操作。
      術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”是指一類鑒定為DNA依賴性DNA聚合酶的聚合酶。DNA聚合酶強(qiáng)烈地排斥識(shí)別RNA模板,這與其體內(nèi)功能是一致的。但是,有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn),某些DNA聚合酶能夠在體外轉(zhuǎn)錄RNA(Karkas,1973,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 703834-3838;Gulati et al.,1974,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 711035-1039;和Wittig和Wittig,1978,Nuc.Acid Res.51165-1178)。Gulati等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Pol I可用于使用寡聚(dT)10引物轉(zhuǎn)錄Qβ病毒RNA。Wittig和Wittig已經(jīng)證實(shí)大腸桿菌Pol I能被用于已使用寡聚(dA)酶促延長(zhǎng)的tRNA的逆轉(zhuǎn)錄。但是,Gulati等證實(shí),需要的酶量和cDNA產(chǎn)物分子較小的事實(shí)表明大腸桿菌Pol I的逆轉(zhuǎn)錄酶活性幾乎不具實(shí)用價(jià)值。
      水生棲熱菌(T.aquaticus,Taq)DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,已有報(bào)導(dǎo)稱使用鎂離子作為二價(jià)金屬離子時(shí)其合成cDNA效率很低(Jones and Foulkes,1989,Nuc.Acids.Res.1768387-8388)。Tse和Forget(1990,Gene 88293-296)以及Shaffer等(1990,Anal.Biochem.190292-296)已經(jīng)介紹了使用Taq DNA聚合酶和鎂離子擴(kuò)增RNA的方法。但是,該方法效果差且不敏感。
      RNA和DNA核酸序列擴(kuò)增的描述可參見美國(guó)專利4,683,195;4,683,202和4,965,188,所述專利本文引為參考。優(yōu)選的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),該方法一般使用Taq DNA聚合酶等熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行,這些酶能夠經(jīng)受每個(gè)循環(huán)中變性擴(kuò)增產(chǎn)物的溫度。在本領(lǐng)域中,PCR現(xiàn)已廣為人知,在科學(xué)文獻(xiàn)中有大量的描述??蓞⒁娭T如《PCR應(yīng)用》1999(Innis et al.,Academic Press,San Diego),《PCR策略》1995(Innis et al.,Eds.,Academic Press,SanDiego);《PCR方法》1990(Innis et al.,Eds.,Academic Press,San Diego);和《PCR技術(shù)》1989(Erlich,ed.,Stochton Press,New York);所述文獻(xiàn)均引為參考。PE Biosystems(Foster City,CA)等銷售商供應(yīng)PCR試劑并出版PCR方法。擴(kuò)增方法的綜述見Abramson和Myers,1993,“現(xiàn)代生物技術(shù)評(píng)析”441-47,該文獻(xiàn)在此引為參考。
      由于使用鎂離子緩沖液中的Taq DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄效率低至不具實(shí)用價(jià)值,進(jìn)行由RNA模板起始的PCR擴(kuò)增時(shí),先使用美拉尼鼠白白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MoMuLV RT)或AMV-RT等非熱穩(wěn)定病毒逆轉(zhuǎn)錄酶等首先逆轉(zhuǎn)錄靶RNA,然后使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴(kuò)增所得的cDNA。
      一項(xiàng)重要進(jìn)展是,發(fā)現(xiàn)不在鎂(Mg2+)緩沖液而在錳(Mn2+)緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)時(shí),熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以用來有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA模板,使用DNA模板進(jìn)行引物延伸更為優(yōu)選。使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的有效錳離子激活逆轉(zhuǎn)錄公開于美國(guó)專利5,310,652;5,322,770;5,407,800;5,641,058和5,693,517,所述專利均引為參考。由于由DNA模板的cDNA合成和由DNA模板的DNA合成均可在錳離子緩沖液中進(jìn)行,使用錳離子緩沖液可以實(shí)現(xiàn)單一酶偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)(也可參見Myers and Sigua,1995,《PCR策略》,同前文,第5章)。
      發(fā)明概述本發(fā)明提供使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄RNA序列的方法。本發(fā)明還提供逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA序列的方法,優(yōu)選在一個(gè)偶聯(lián)的單管反應(yīng)中使用單一熱穩(wěn)定DNA聚合酶。相對(duì)于以前所述的高溫逆轉(zhuǎn)錄方法,本發(fā)明的方法提供了較高的逆轉(zhuǎn)錄(“RT”)效率。
      在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了在鎂離子(Mg+2)緩沖液中逆轉(zhuǎn)錄RNA的方法,以及使用單一熱穩(wěn)定DNA聚合酶在鎂離子緩沖液中逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA序列的方法,優(yōu)選是一個(gè)偶聯(lián)的單管反應(yīng)。相對(duì)于以前所述的依賴錳離子(Mn+2)激活熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法,使用鎂離子緩沖液的該方法的保真性較高。
      本發(fā)明的方法使用一種突變熱活性DNA聚合酶,優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶,其在關(guān)鍵氨基酸位置含有點(diǎn)突變,以前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)所述關(guān)鍵氨基酸位置影響DNA聚合酶對(duì)熒光素或花菁族染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)的結(jié)合能力。本發(fā)明源于以下驚人發(fā)現(xiàn),即這些突變DNA聚合酶也具有顯著提高的進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的能力,特別是在鎂離子緩沖液中的反應(yīng)。
      用于本發(fā)明方法的突變DNA聚合酶公開于歐洲專利申請(qǐng)0902,035、共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)09/146,631和PCT國(guó)際專利公開WO 98/40496,所述專利申請(qǐng)均引為參考。根據(jù)其中的記載,這些突變的DNA聚合酶具有更強(qiáng)的結(jié)合核苷酸的能力,所述核苷酸包括熒光素和花菁族染料標(biāo)記的脫氧核苷酸(dNTP)和雙脫氧核苷酸(ddNTP)等堿基類似物。為方便起見,這些突變DNA聚合酶在本文中稱為“熒光素家族染料結(jié)合”DNA聚合酶或“FDI”DNA聚合酶。FDI DNA聚合酶的主要用途是用于使用熒光素或花菁族染料標(biāo)記的染料終止物(染料標(biāo)記的ddNTP)的DNA測(cè)序反應(yīng)中。由于野生型DNA聚合酶排斥識(shí)別核苷酸類似物,甚至排斥標(biāo)記的核苷酸類似物,染料終止物測(cè)序反應(yīng)一般使用過量染料終止物。通過降低對(duì)標(biāo)記染料終止物的排斥識(shí)別,F(xiàn)DI DNA聚合酶使得用顯著較低的染料終止物濃度進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)成為可能。
      在本發(fā)明方法中使用的DNA聚合酶中發(fā)生突變的關(guān)鍵氨基酸位置,與影響DNA聚合酶對(duì)熒光素和花菁族染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸的結(jié)合能力的關(guān)鍵氨基酸相同,該位置在歐洲專利申請(qǐng)0 902 035和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)09/146,631中通過定位于天然酶中存在的一個(gè)保守基序中而得以鑒定。在多種DNA聚合酶中存在的序列基序的實(shí)例見本文表1。序列基序和關(guān)鍵氨基酸下文以基本相同的方式鑒定。
      最一般地說,使用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸單字母縮寫時(shí),該天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LXXXXXXXXXE(SEQ ID NO1)其中,2位的X是S或A,3、4、6、7、8、9和10位的X是任何氨基酸,5位的X是L或I。
      在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LSXELXIPYEE(SEQ ID NO2)其中,3位的X是Q或G,6位的X是S或A。含有該基序的DNA聚合酶的實(shí)例是棲熱菌屬DNA聚合酶。
      在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LSQELAIPYEE(SEQ ID NO3)含有該基序的DNA聚合酶的實(shí)例是棲熱菌屬水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、ZO5和T.caldophilus的DNA聚合酶。
      在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LSXELSIPYEE(SEQ ID NO4)其中,3位的X是Q或G。含有該基序的DNA聚合酶的實(shí)例是棲熱菌屬黃棲熱菌、sps17和絲狀棲熱菌的DNA聚合酶。
      在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶中的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LSVRLGXPVKE(SEQ ID NO5)其中,7位的X是V或I。含有該基序的DNA聚合酶的實(shí)例是棲熱袍菌屬海棲熱袍菌和那不勒斯棲熱袍菌的DNA聚合酶。
      在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LKSRIGLSVSE(SEQ ID NO6)含有該基序的DNA聚合酶實(shí)例是非洲棲熱腔菌的DNA聚合酶。
      在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,天然形式DNA聚合酶的關(guān)鍵基序包括以下氨基酸序列LAQNLNIXRKE(SEQ ID NO7)其中,8位的X是S或T。含有該基序的DNA聚合酶實(shí)例是芽孢桿菌屬熱堅(jiān)芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶。
      在所有上述鑒定的關(guān)鍵基序中,關(guān)鍵氨基酸是4位氨基酸。
      如實(shí)施例中證實(shí),對(duì)除E(實(shí)施例中使用的天然DNA聚合酶中存在)、A、G或P以外的任何關(guān)鍵氨基酸的突變提供了較高的RT效率。因此,本發(fā)明的方法使用熱活性突變DNA聚合酶,優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶,其特征在于天然形式DNA聚合酶包括選自SEQ ID NO1-7的序列基序,該基序中4位氨基酸突變成除E、A、G或P外的任何氨基酸。優(yōu)選,關(guān)鍵氨基酸突變成除E、A、G、P或Q外的任何氨基酸,更優(yōu)選突變成除E、A、G、P、Q或D外的任何氨基酸。
      本發(fā)明一方面涉及逆轉(zhuǎn)錄RNA的方法,該方法包括使用本文所述的突變熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選,該方法包括(a)提供含有與RNA足夠互補(bǔ)的引物和本文所述突變熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶的反應(yīng)混合物,該引物與RNA雜交并起始與靶RNA互補(bǔ)的cDNA分子的合成;和(b)在合適的條件下處理反應(yīng)混合物以提供單鏈cDNA。
      在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,反應(yīng)步驟(a)在合適的緩沖液中進(jìn)行,其中緩沖液含有Mg+2。
      本發(fā)明另一方面涉及擴(kuò)增RNA的方法,該方法包括使用本文所述的突變熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行單一酶合并逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選,該方法包括(a)提供在合適的緩沖液中含有第一和第二引物以及本文所述突變熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶的反應(yīng)混合物,其中第一引物與靶RNA足夠互補(bǔ),從而與其雜交并起始與靶RNA互補(bǔ)的cDNA分子的合成,第二引物與靶RNA足夠同源,從而與cDNA雜交并起始延伸產(chǎn)物的合成,緩沖液中含有Mg+2;(b)在合適的條件下處理反應(yīng)混合物以提供單鏈cDNA;(c)在合適的條件下處理步驟(b)的反應(yīng)混合物以擴(kuò)增步驟(b)的cDNA。
      在優(yōu)選實(shí)施方案中,逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增是使用本文所述的突變熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶在含有Mg+2的緩沖液中進(jìn)行的單一酶單管偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
      發(fā)明詳述為了方便理解本發(fā)明,以下定義一些術(shù)語(yǔ)。
      術(shù)語(yǔ)“熱活性DNA聚合酶”在本文中是指具有較高的最適反應(yīng)溫度的DNA聚合酶。在本發(fā)明中,熱活性DNA聚合酶催化最適合在60到90℃之間的溫度進(jìn)行的引物延伸。
      術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定DNA聚合酶”是指對(duì)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,即它在實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸變性所必需的時(shí)間內(nèi)處于較高溫度不會(huì)不可逆地變性(失活)。核酸變性所需的加熱條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在本文中,熱穩(wěn)定聚合酶適合在如4,965,188(本文引為參考)所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增方法的循環(huán)反應(yīng)溫度下使用。
      “高溫逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)”在本文中是指在至少40℃下進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),優(yōu)選反應(yīng)溫度為40℃到80℃,更優(yōu)選50℃到70℃。
      術(shù)語(yǔ)“基因”是指含有生成可回收的生物活性多肽或前體所必需的控制和編碼序列的DNA序列。
      術(shù)語(yǔ)“天然的”是指由天然來源分離的基因或基因產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)也指通過分子生物學(xué)技術(shù)制備的重組形式天然蛋白,其氨基酸序列與天然形式相同。
      術(shù)語(yǔ)“突變體”是指其核酸序列已經(jīng)發(fā)生改變的基因或其氨基酸序列已經(jīng)發(fā)生改變的基因產(chǎn)物,產(chǎn)生的基因產(chǎn)物具有與天然或野生型基因或基因產(chǎn)物不同的功能特性。
      在本文中,氨基酸序列中的“點(diǎn)突變”是指單個(gè)氨基酸取代或單個(gè)氨基酸缺失。點(diǎn)突變優(yōu)選通過編碼DNA中合適的密碼子改變引入氨基酸序列。
      序列中各個(gè)氨基酸在本文中表示為AN,其中A是序列中的氨基酸,N是在序列中的位置。氨基酸序列中取代型點(diǎn)突變?cè)诒疚闹斜硎緸锳1NA2,其中A1是未突變蛋白序列中的氨基酸,A2是突變蛋白序列中的氨基酸,N是氨基酸序列中的位置。使用單字母或三字母代碼代表氨基酸(參見Lehninger,BioChemistry 2nd ed.,1975,WorthPbulishers,Inc.New York,NYp73-75,本文引為參考)。例如G46D突變代表46位甘氨酸到天冬氨酸的改變。氨基酸位置根據(jù)蛋白的全長(zhǎng)序列編號(hào),含有突變的區(qū)域來自該全長(zhǎng)序列。DNA序列中核苷酸和點(diǎn)突變的表示與此類似。
      術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”是指待檢測(cè)的引物、探針和寡聚體,是聚脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)和作為嘌呤或嘧啶堿基或修飾嘌呤或嘧啶堿基的N糖苷的任何其它類型多核苷酸的總稱。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”的長(zhǎng)度沒有確定的區(qū)別,這些術(shù)語(yǔ)可以互換使用。這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此,這些術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA。
      寡核苷酸可通過任何合適的方法制備,包括例如合適序列的克隆和限制和直接化學(xué)合成,化學(xué)合成方法包括磷酸三酯法(Narang etal.,1979,Meth.Enzymol.6890-99)、磷酸二酯法(Brown et al.,1979,Meth.Enzymol.68109-151)、二乙基磷酰胺(diethylphosphoramidite)法(Beaucage et al.,1981,Tetrahedron Lett.221859-1862)和固相載體法(美國(guó)專利4,458,066),上述文獻(xiàn)均引為參考。使用氰乙基磷酰胺化學(xué)法的自動(dòng)合成是優(yōu)選的。試劑和儀器可向例如PE Biosystems(AppliedBiosystems,F(xiàn)oster City,CA)和Pharmacia(Piscataway,NJ)洽購(gòu)。
      術(shù)語(yǔ)“引物”在本文中是指天然或合成的寡核苷酸,當(dāng)置于起始引物延伸的條件下時(shí),它能作為合成的起始點(diǎn)。引物優(yōu)選是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長(zhǎng)度取決于引物的預(yù)定用途,但一般是15到35個(gè)核苷酸。短引物分子與模板形成足夠穩(wěn)定的雜合體通常需要較低的溫度。引物無(wú)需反應(yīng)模板的確切序列,但必需足夠互補(bǔ),從而與引物延伸模板雜交。
      “一對(duì)引物”在本文中是指為擴(kuò)增所需靶序列選定的在聚合酶鏈反應(yīng)等擴(kuò)增反應(yīng)中有功能的第一和第二引物。例如,為用于擴(kuò)增靶RNA的偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng),一對(duì)引物包括第一和第二引物,其中第一引物與靶RNA足夠互補(bǔ),從而與其雜交并起始與該靶RNA互補(bǔ)的cDNA分子合成,所述第二引物與所述靶RNA足夠同源,從而與cDNA雜交并起始延伸產(chǎn)物的合成。擴(kuò)增核酸序列的引物對(duì)的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域是眾所周知的。
      必要時(shí),引物可以通過摻入分光光度法、光化學(xué)法、免疫化學(xué)法或化學(xué)法可以檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。例如,有用的標(biāo)記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(ELISA試驗(yàn)中常用)、生物素或可用其獲得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白。
      在本文中,術(shù)語(yǔ)“cDNA”是指使用核糖核酸鏈(RNA)作為模板合成的DNA分子拷貝。RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA或病毒RNA等其它形式RNA。cDNA可以是單鏈、雙鏈或可以是與互補(bǔ)RNA分子氫鍵結(jié)合成RNA/cDNA雜合體。
      術(shù)語(yǔ)“逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物”是指含有用來逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的各種試劑的含水溶液。這些試劑包括酶、含水緩沖液、鹽、寡核苷酸引物、靶核酸和核苷三磷酸。在不同情況下,混合物可以是完整或不完整的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。
      術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”是指含有用來擴(kuò)增靶核酸的各種試劑的含水溶液。這些試劑包括酶、含水緩沖液、鹽、擴(kuò)增引物、靶核酸和核苷三磷酸。在不同情況下,該混合物可以是完整或不完整的反應(yīng)混合物。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中,擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),擴(kuò)增反應(yīng)混合物是PCR混合物。在本文中,擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括在偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中用于擴(kuò)增RNA的反應(yīng)混合物。
      術(shù)語(yǔ)“緩沖液”在本文中是指含有緩沖劑或緩沖劑混合物的溶液,可選地含有二價(jià)陽(yáng)離子和單價(jià)陽(yáng)離子。
      分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)均屬現(xiàn)有技術(shù),在文獻(xiàn)中有詳細(xì)的介紹。參見例如Sambrook et al.,1989《分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南》,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York;《寡核苷酸合成》(M.J.Gait,ed.,1984);《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins.Eds.,1984);《分子生物學(xué)基本方法》(Elsevier,NY);《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(John Wiley和Sons,NY)及《酶學(xué)方法》系列(Academic Press,Inc.),上引文獻(xiàn)全部引為參考。本文上文和下文提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物均引為參考。
      本發(fā)明方法中使用的突變DNA聚合酶在歐洲專利申請(qǐng)0902,035、共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631和PCT國(guó)際專利公開WO98/40496(均引為參考)鑒定的關(guān)鍵氨基酸位置含有點(diǎn)突變。歐洲專利申請(qǐng)0 902,035和共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631鑒定了天然DNA聚合酶序列中發(fā)現(xiàn)的保守關(guān)鍵序列內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸位置。PCT國(guó)際公開WO 98/40496通過與Taq DNA聚合酶的氨基酸序列同源性鑒定了Taq DNA聚合酶和其它DNA聚合酶中關(guān)鍵氨基酸的位置(E681)。兩種方法均鑒定了相同的關(guān)鍵氨基酸位置。為了敘述的準(zhǔn)確性,本文中關(guān)鍵氨基酸采用其在保守關(guān)鍵序列基序中的位置表述。
      表1基本上是按照歐洲專利申請(qǐng)0 902,035、共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631的表1復(fù)制而來,它提供了多種代表性DNA聚合酶中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基序(關(guān)鍵氨基酸以黑體表示)和全長(zhǎng)酶序列中關(guān)鍵氨基酸的位置。提供了多個(gè)位置數(shù),其中相同物種的DNA聚合酶在文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的氨基酸序列略有不同。
      表1生物體SEQ ID NO 關(guān)鍵基序 位置棲熱菌水生棲熱菌 8 LSQELAIPYEE681黃棲熱菌 9 LSGELSIPYEE679嗜熱棲熱菌10 LSQELAIPYEE683Z05 11 LSQELAIPYEE683sps17 12 LSQELSIPYEE679caldophilus 13 LSQELAIPYEE683絲狀棲熱菌14 LSQELSIPYEE679棲熱袍菌海棲熱袍菌15 LSVRLGVPVKE744那不勒斯棲熱袍菌 16 LSVRLGIPVKE744棲熱腔菌非洲棲熱腔菌 17 LSKRIGLSVSE743芽孢桿菌熱堅(jiān)芽孢桿菌 18 LAQNLNISRKE725,724嗜熱脂肪芽孢桿菌 19 LAQNLNITRKE724,727,802具有熱活性DNA聚合酶的多種物種可參見歐洲專利申請(qǐng)0902,035、共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631和PCT國(guó)際專利公開WO98/40496,該酶含有關(guān)鍵基序。用于本發(fā)明的優(yōu)選DNA聚合酶來自一種棲熱菌。
      用于本發(fā)明方法的突變DNA聚合酶是熱活性突變DNA聚合酶,優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶,其特征在于天然形式DNA聚合酶包括選自SEQID NO1-7的序列基序,該基序中4位氨基酸突變成除E、A、G或P外的任何氨基酸。優(yōu)選,關(guān)鍵氨基酸突變成除E、A、G、P或Q外的任何氨基酸,更優(yōu)選突變成除E、A、G、P、Q或D外的任何氨基酸。
      突變DNA聚合酶可以來自于任何具有熱活性DNA聚合酶的物種,該酶含有聚合酶結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵基序。關(guān)鍵基序確定該酶的聚合酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的具體功能區(qū)域,確定該基序內(nèi)對(duì)其功能至關(guān)重要的氨基酸。這些實(shí)例介紹了廣泛使用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶嗜熱棲熱菌DNA聚合酶中該位點(diǎn)的每一種可能的突變對(duì)鎂離子激活的逆轉(zhuǎn)錄效率的影響。在基本上所有具有保守的關(guān)鍵基序的DNA聚合酶中,該位點(diǎn)的氨基酸改變影響熒光素或花菁族染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)的摻入效率,預(yù)期該位點(diǎn)的氨基酸改變將會(huì)影響幾乎所有具有保守關(guān)鍵基序的DNA聚合酶的鎂離子激活的逆轉(zhuǎn)錄效率。
      DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)相關(guān)性和保守功能域的存在是眾所周知的(參見例如Ito和Braithwaite,199l,Nucl.Acids Res.19(15)4045-4047;Blanco et al.,1991,Gene 10027-38;Gutman和Minton,1993,Nucl.Acids.Res.21(18)4406-4407;和Delarue et al.,1990,Protein Engineering 3(6)461-467;均引為參考)。一般,預(yù)期保守功能域中關(guān)鍵氨基酸的突變引入其它DNA聚合酶具有類似效果(參見例如,Xu et al.,1997,J.Mol.Biol.268284-302;美國(guó)專利5,466,591;5,795,762;5,939,292和5,614,365,均引為參考)。
      其它含有關(guān)鍵基序的熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶及其中關(guān)鍵氨基酸的位置可以通過直接考察氨基酸序列方便地確定。此外,關(guān)鍵基序和氨基酸可以利用與其它已知含有關(guān)鍵基序的DNA聚合酶如表1所列的棲熱菌的DNA聚合酶的序列同源性確定。氨基酸和核酸序列比較程序可以方便地獲得。例如,包括“GAP”、“BESTFIT”和“PILEUP”的廣泛使用的序列比較程序可獲自Genetics Computer Group(Madison,Wisconsin)。一般,使用缺省參數(shù)進(jìn)行序列比較促進(jìn)與表1中所列的DNA聚合酶之一的關(guān)鍵氨基酸同源的DNA聚合酶序列中關(guān)鍵氨基酸的確定。
      獲得了新的DNA聚合酶序列后,可以發(fā)現(xiàn)含有在SEQ ID NO1中未明確描述的關(guān)鍵基序變體,但通過與已知酶的序列同源性可鑒別的序列。作為假定的例子,以下酶由于其與幾種棲熱菌酶的關(guān)鍵基序的高同源性(本例中是11個(gè)氨基酸中的10個(gè))將被認(rèn)為具有該關(guān)鍵基序,該酶在DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域具有作為SEQ ID NO3變體的基序,其區(qū)別僅在于5位氨基酸不是L或I。這種酶就本發(fā)明目的而言被視為等同物。
      關(guān)鍵氨基酸參照天然酶確定。但是,這并不意味著突變酶其它各處的氨基酸序列與天然酶相同。本發(fā)明方法中使用的突變DNA聚合酶可以含有其它突變,這些突變對(duì)于具體的應(yīng)用可能更有利。例如,消除了5’到3’外切核酸酶活性或3’到5’外切核酸酶活性的突變及其應(yīng)用是眾所周知的。在SEQ ID NO1-7中確定的關(guān)鍵基序3位上的另一個(gè)突變(例如Tth DNA聚合酶的Q682K、E683K突變)可以提供額外的好處,特別是在Mn+2激活的反應(yīng)中,如允許Mn+2濃度進(jìn)一步降低,或進(jìn)一步擴(kuò)展可以使用的鹽濃度范圍。
      本發(fā)明方法中使用的DNA聚合酶優(yōu)選以重組表達(dá)載體表達(dá),在該載體中編碼序列已經(jīng)過修飾,表達(dá)特定的目標(biāo)突變蛋白序列。在表達(dá)質(zhì)粒的編碼序列中引入點(diǎn)突變的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的,在本文引用的專利和科學(xué)文獻(xiàn)中也有介紹。詳細(xì)的方法介紹參見例如Sambrook et al.,《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》Cold Spring Harbor,1989,第二版,15.51章“寡核苷酸介導(dǎo)的誘變”和Ausebel et al.,《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(最新版),二者均引為參考。歐洲專利申請(qǐng)0902,035、共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631和PCT國(guó)際專利公開WO98/40496教導(dǎo)了合適表達(dá)載體的構(gòu)建和所得突變DNA聚合酶的表達(dá)和純化。按照引用文獻(xiàn)的指導(dǎo),使用眾所周知的技術(shù),本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠制備任何數(shù)量的表達(dá)載體,其中含有適于在多種宿主系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明方法中使用的突變DNA聚合酶的突變基因。
      用于本發(fā)明的高溫逆轉(zhuǎn)錄方法時(shí),只需要DNA聚合酶是熱活性即可。由于由RNA模板制備cDNA不涉及高溫重復(fù)變性循環(huán),該方法中使用的酶沒有必要是熱穩(wěn)定的和熱活性的。在實(shí)施例中的單一酶合并逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(RT/PCR)方法中,使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶是優(yōu)選的,因?yàn)镈NA聚合酶要經(jīng)受RT和PCR兩種條件,其中包括重復(fù)變性循環(huán)。
      根據(jù)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄時(shí),在含有RNA模板、引物和熱活性或熱穩(wěn)定突變DNA聚合酶的混合物中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)混合物通常含有所有四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)和含有二價(jià)陽(yáng)離子和一價(jià)陽(yáng)離子的緩沖液。DNA聚合酶的催化活性需要二價(jià)陽(yáng)離子。使用DNA模板進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),優(yōu)選的二價(jià)陽(yáng)離子是鎂離子,但錳離子或鈷離子等其它陽(yáng)離子也可激活DNA聚合酶。
      與使用熱活性或熱穩(wěn)定DNA聚合酶和DNA模板的延伸反應(yīng)不同,使用RNA模板的延伸反應(yīng)即逆轉(zhuǎn)錄基本上必需使用錳離子來獲得實(shí)用的效率。例如使用氯化錳或醋酸錳與Tth DNA聚合酶進(jìn)行RNA擴(kuò)增比使用氯化鎂和標(biāo)準(zhǔn)PCR條件相比,敏感性至少增加106倍。
      盡管使用Mn+2增加逆轉(zhuǎn)錄效率,但也降低保真性,產(chǎn)生較多的錯(cuò)誤合成核苷酸。使用Mn+2也降低DNA擴(kuò)增的保真性。因此,使用Mn+2的單酶單管RNA擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果是降低RNA和DNA反應(yīng)階段的保真性。因此,如需要高保真RNA擴(kuò)增,優(yōu)選分兩步進(jìn)行反應(yīng),首先使用EDTA等螯合劑從逆轉(zhuǎn)錄混合物中有效去除錳離子,然后加入合適的含鎂離子的DNA擴(kuò)增混合物完成反應(yīng),優(yōu)選的螯合劑是EGTA。
      無(wú)論使用何種二價(jià)陽(yáng)離子,在本發(fā)明方法中使用突變DNA聚合酶對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都是有利的。在錳離子反應(yīng)中,與使用天然酶相比,使用突變DNA聚合酶可以進(jìn)行高溫逆轉(zhuǎn)錄,以更高的效率擴(kuò)增RNA。此外,使用突變DNA聚合酶可以在較低的錳離子濃度下進(jìn)行反應(yīng),因此,減少了錳離子對(duì)保真性的負(fù)面影響。
      尤其出乎意料的是,突變DNA聚合酶能使用鎂離子以顯著增加的效率進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用該酶的優(yōu)選二價(jià)陽(yáng)離子鎂離子,提供了顯著較高的保真性。因此,在鎂離子反應(yīng)中,使用突變DNA聚合酶可以以實(shí)用的效率進(jìn)行高溫、高保真RNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。
      二價(jià)陽(yáng)離子以鹽形式提供,如氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氯化錳、醋酸錳或硫酸錳。通常,使用二價(jià)錳離子的反應(yīng)中,在Tris-HCl緩沖液中可以使用的陽(yáng)離子濃度是0.5到7mM MnCl2,優(yōu)選0.5到2mM,在N-二甘氨酸/醋酸鉀緩沖液或三甘氨酸(tricine)/醋酸鉀緩沖液中可以使用的陽(yáng)離子濃度是0.5到20mM醋酸錳,優(yōu)選0.5到5mM。一般,使用二價(jià)鎂離子的反應(yīng)中,在Tris-HCl緩沖液中可以使用的陽(yáng)離子濃度是0.5到10mM MgCl2,在N-二甘氨酸/醋酸鉀緩沖液或三甘氨酸(tricine)/醋酸鉀緩沖液中可以使用的陽(yáng)離子濃度是0.5到20mM醋酸錳,優(yōu)選0.5到5mM。這些濃度提供進(jìn)行常規(guī)反應(yīng)優(yōu)化的有用起始條件。在特定反應(yīng)中,最佳二價(jià)離子濃度不僅取決于所用的酶,也取決于其它反應(yīng)成分,如dNTP濃度和引物序列和濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解,對(duì)于任何特定反應(yīng),一般反應(yīng)條件,特別是二價(jià)陽(yáng)離子濃度,可以使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。
      以前,盡管混合二價(jià)陽(yáng)離子緩沖液(如二價(jià)鎂離子和二價(jià)錳離子)能夠激活RNA模板指導(dǎo)的DNA合成,但由于較低的敏感性和效率,它并不是優(yōu)選的。預(yù)期混合二價(jià)陽(yáng)離子緩沖液可以用于本發(fā)明的方法中,在某些應(yīng)用中還可能是優(yōu)選的。使用混合陽(yáng)離子可能在高效率但低保真性的Mn+2激活反應(yīng)和高保真Mg+2激活反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)平衡。
      在Mn+2緩沖液中使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的高溫逆轉(zhuǎn)錄方法和合并逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見,例如美國(guó)專利5,310,652;5,322,770;5,407,800;5,561,058;5,641,864和5,693,517,均引為參考。本發(fā)明的方法是前述方法的改進(jìn),其中改進(jìn)包括使用突變DNA聚合酶,已如上述。在優(yōu)選實(shí)施方案中,反應(yīng)在含有Mg+2作為激活DNA聚合酶的二價(jià)陽(yáng)離子的緩沖液中進(jìn)行。
      本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是使用突變DNA聚合酶似乎提供了較快的RT延伸速度,因此RT反應(yīng)所需的時(shí)間較少。優(yōu)選,為了使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中產(chǎn)生的cDNA量最大,反應(yīng)進(jìn)行約30分鐘。取決于具體應(yīng)用,特別是在錳反應(yīng)中,RT時(shí)間短至1分鐘或更短可以提供可按受的結(jié)果。
      本發(fā)明方法的其它優(yōu)點(diǎn)是使用突變DNA聚合酶可以在較低的酶濃度提供較高的RT效率,并且提供較寬的可使用鹽濃度范圍。預(yù)期,最適反應(yīng)條件取決于諸如使用的具體酶,可以以常規(guī)方式憑經(jīng)驗(yàn)確定。
      實(shí)施本發(fā)明方法所需考慮的其它方面,如靶RNA的選擇,樣品制備,引物設(shè)計(jì)和除DNA聚合酶和二價(jià)陽(yáng)離子以外用來激活DNA聚合酶的其它反應(yīng)條件,在本領(lǐng)域是眾所周知的,可參見例如上引專利。同樣,如果逆轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng),除DNA聚合酶和二價(jià)陽(yáng)離子以外用來激活DNA聚合酶的所有擴(kuò)增方面在本領(lǐng)域也是眾所周知的,可參見例如上引專利。最后,RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的應(yīng)用在本領(lǐng)域是眾所周知的,可參見例如上引專利。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明方法應(yīng)用于需要RNA逆轉(zhuǎn)錄或還需要擴(kuò)增的任何應(yīng)用中。
      提供以下實(shí)施例僅為說明,并非以任何方式限制本發(fā)明。
      實(shí)施例1突變DNA聚合酶實(shí)例由“天然”嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶構(gòu)建一系列共19個(gè)突變DNA聚合酶,代表關(guān)鍵氨基酸中的所有可能突變。如歐洲專利申請(qǐng)0 902 035和共同未決的美國(guó)申請(qǐng)09/146,631中所述,Tth DNA聚合酶氨基酸序列含有SEQ ID NO3代表的關(guān)鍵序列基序(它是SEQ IDNO2的具體實(shí)施方案,而后者是普通基序SEQ ID NO1的較窄的實(shí)施方案)。關(guān)鍵氨基酸位于683位(E683)。
      Tth DNA聚合酶序列和含有Tth DNA聚合酶基因的質(zhì)粒在本領(lǐng)域是已知的(例見美國(guó)專利5,618,711和5,789,224,均引為參考)。在本實(shí)施例中使用的具體質(zhì)粒編碼也含有G46E點(diǎn)突變的Tth DNA聚合酶,該突變消除了酶的5’到3’外切核酸酶活性,如美國(guó)專利5,466,591所述,該專利引為參考。此外,專利含有靜默核苷酸取代,引入了含有密碼子678、679和680的第一個(gè)核苷酸的ClaI識(shí)別和切割位點(diǎn),沒有改變編碼氨基酸序列。據(jù)信在5’到3’外切核酸酶結(jié)構(gòu)域存在其它突變對(duì)DNA聚合酶在Mg+2緩沖液中逆轉(zhuǎn)錄RNA的能力沒有可見的影響;具有G46E突變的DNA聚合酶在本文中被認(rèn)為是天然DNA聚合酶。
      在表達(dá)蛋白中的點(diǎn)突變通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變編碼DNA序列引入。基本上,含有密碼子683的編碼序列短片段用含有所需序列的合成片段置換。長(zhǎng)度為65個(gè)核苷酸的短片段通過限制酶CalI和HindIII消化質(zhì)粒切割。合成編碼氨基酸序列同切割片段相同但在密碼子683中含有所需突變的合成雙鏈DNA插入物。合成的片段連接至消化的質(zhì)粒中,產(chǎn)生含有編碼具有所需點(diǎn)突變的全長(zhǎng)Tth DNA聚合酶的突變密碼子的質(zhì)粒。
      實(shí)施例2逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增效率比較實(shí)施例1的20種DNA聚合酶(1種天然酶和19種突變酶)催化逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)的能力。一般,用各種DNA聚合酶進(jìn)行偶聯(lián)單酶逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)中使用相同的起始靶拷貝數(shù),在反應(yīng)中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的合成。確定每種DNA聚合酶產(chǎn)生任意但確定量的擴(kuò)增產(chǎn)物所需的循環(huán)數(shù),它反映了反應(yīng)效率。由于在逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中,起始逆轉(zhuǎn)錄步驟一般是關(guān)鍵的限速步驟,總體反應(yīng)效率的提高也表明了起始逆轉(zhuǎn)錄步驟反應(yīng)效率的提高。
      在反應(yīng)中擴(kuò)增核酸的增加使用文獻(xiàn)中所述的方法(Higuchi etal.,Bio/Technology 10413-417,1992;Higuchi et al.,1993,Bio/Technology 111026-1030;Higuchi和Watson《PCR應(yīng)用》,上文,16章;美國(guó)專利5,994,056;和歐洲專利公開487,218和512,334,均引為參考)監(jiān)測(cè)。這些方法在本文中稱為動(dòng)態(tài)PCR,它們?nèi)Q于溴化乙錠(EtBr)和其它DNA結(jié)合染料結(jié)合于雙鏈DNA時(shí)增加的熒光,以便測(cè)定反應(yīng)中雙鏈DNA的量的變化。由靶序列合成導(dǎo)致的雙鏈DNA的增加引起結(jié)合于雙鏈DNA的染料量的增加和相應(yīng)的熒光的可見增加。
      在反應(yīng)中用溴化乙錠進(jìn)行擴(kuò)增。或者,在反應(yīng)中使用SYBRGreenI(Molecular Probes,Eugene,OR)進(jìn)行擴(kuò)增。兩種染料在插入或結(jié)合于雙鏈DNA后熒光增加。反應(yīng)在合并的熱循環(huán)儀和熒光測(cè)定系統(tǒng)中進(jìn)行,熒光測(cè)定系統(tǒng)可以監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)過程中反應(yīng)混合物的熒光。很清楚,除了下文所述儀器外,還可以使用任何合適的儀器。
      RNA靶和擴(kuò)增引物靶RNA使用編碼人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的表達(dá)質(zhì)粒合成。GAPDH RNA的一個(gè)區(qū)用以下引物擴(kuò)增,引物以5’到3’方向顯示P1(SEQ ID NO20)5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAAP2(SEQ ID NO21)5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA起始靶濃度以標(biāo)準(zhǔn)方式測(cè)定。比較本文所述反應(yīng)時(shí),相對(duì)拷貝數(shù)較絕對(duì)拷貝數(shù)更重要。為了確保每一反應(yīng)中的拷貝數(shù)相同,使用同一起始RNA儲(chǔ)存液稀釋物等分試樣。
      本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到選擇靶很方便。其它RNA靶和相應(yīng)擴(kuò)增引物可以以基本相同的方法使用。反應(yīng)條件的常規(guī)優(yōu)化是可以預(yù)期的。
      擴(kuò)增每一RT-PCR擴(kuò)增在100μl的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。最終試劑濃度如下10單位DNA聚合酶
      106拷貝GAPDH RNA50mM三甘氨酸,pH8.1550mM醋酸鉀2mM醋酸鎂200μM dATP,dGTP,dCTP400μm dUTP200nm各種引物8%甘油1%DMSO1μg/ml溴化乙錠2單位UNG**由Roche Molecular Systems生產(chǎn),Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA銷售。
      或者,可以用SYBRGreen I代替溴化乙錠用來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。使用SYBRGreen I的擴(kuò)增在DMSO稀釋的0.2×SYBRGreen I(商品形式為10,000×)中進(jìn)行。
      使用溴化乙錠的反應(yīng)優(yōu)選使用ABI PRISM7700序列測(cè)定系統(tǒng)(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA)進(jìn)行,該系統(tǒng)可以選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)波長(zhǎng)。使用SYBRGreen I的反應(yīng)優(yōu)選使用GeneAmp5700序列測(cè)定系統(tǒng)(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA)在相同的熱循環(huán)條件下進(jìn)行。GeneAmp5700序列測(cè)定系統(tǒng)是為使用SYBRGreen I而設(shè)計(jì),其激發(fā)和測(cè)定波長(zhǎng)預(yù)先針對(duì)這種染料設(shè)定。
      下文所述實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)儀器進(jìn)行,該儀器基本上由GeneAmpPCR系統(tǒng)9600熱循環(huán)儀(PE Biosystem,F(xiàn)oster City,CA)組成,但增加了類似于GeneAmp5700序列測(cè)定系統(tǒng)中使用的、但設(shè)計(jì)使用溴化乙錠的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。使用該常規(guī)儀器獲得的結(jié)果預(yù)期與使用優(yōu)選的儀器之一獲得的結(jié)果相當(dāng)。
      使用如下所示的具體溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
      熱循環(huán)時(shí)間和溫度反應(yīng)前溫育 50℃ 2分鐘逆轉(zhuǎn)錄 60℃ 30分鐘95℃ 1分鐘
      55個(gè)循環(huán) 變性 95℃ 15秒退火 55℃ 30秒延伸 72℃ 15秒最后延伸和保持 72℃檢測(cè)反應(yīng)過程中每一循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物積累通過測(cè)定反應(yīng)熒光的增加確定。在每一擴(kuò)增循環(huán)中,每一反應(yīng)以接近染料最大激發(fā)極限的波長(zhǎng)的光激發(fā),染料發(fā)射在接近其最大發(fā)射極限處測(cè)定。
      熒光測(cè)定通過除以在反應(yīng)中循環(huán)間熒光測(cè)定值相對(duì)恒定的循環(huán)早期獲得的起始熒光測(cè)定值來標(biāo)準(zhǔn)化。選定進(jìn)行起始熒光測(cè)定的循環(huán)數(shù)對(duì)比較的所有反應(yīng)是相同的,所以所有測(cè)定值代表了相對(duì)相同反應(yīng)循環(huán)的增加值。
      進(jìn)行到熒光超過任意熒光水平(AFL)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)由觀察的熒光值計(jì)算。選擇接近基線熒光水平但高于測(cè)定熒光的隨機(jī)波動(dòng)范圍的AFL,以便確定在擴(kuò)增早期產(chǎn)物呈幾何級(jí)數(shù)增加時(shí)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。在擴(kuò)增的幾何增長(zhǎng)期間,達(dá)到特定閾值所需的循環(huán)數(shù)僅取決于起始拷貝數(shù)和反應(yīng)效率。如每一反應(yīng)使用相同的起始靶拷貝數(shù),達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)就是反應(yīng)效率的度量。在較后的循環(huán)中,擴(kuò)增產(chǎn)物的積累和試劑的消耗最終會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)平臺(tái)。
      所有反應(yīng)的AFL選定為1.12。由于PCR擴(kuò)增由單獨(dú)的循環(huán)組成并且每一循環(huán)進(jìn)行熒光測(cè)定,在每一循環(huán)中測(cè)定的熒光一般由低于AFL增加到高于AFL。為了提高測(cè)定的準(zhǔn)確度,達(dá)到AFL閾值的“精確”循環(huán)數(shù)(本文稱為CT值)通過循環(huán)間熒光測(cè)定值的內(nèi)插計(jì)算。
      結(jié)果使用天然Tth DNA聚合酶(E683)和每種突變DNA聚合酶(以683位的氨基酸表示)獲得的CT值示于下表。每一CT值代表兩個(gè)反應(yīng)中獲得的平均值。為了方便比較,也提供了CT值差,即(天然CT值)-(突變CT值)。使用突變DNA聚合酶增加了效率,導(dǎo)致達(dá)到預(yù)期所需的循環(huán)數(shù)較少,即CT值較低。因此,CT值的正差代表效率的增加。
      反應(yīng)效率
      結(jié)果表明683位氨基酸突變成除Ala,Gly或Pro以外的任何氨基酸導(dǎo)致DNA聚合酶的效率增加。其中,除Asp和Gln突變體外,其余突變體導(dǎo)致CT值改善至少4個(gè)循環(huán)。
      實(shí)施例3逆轉(zhuǎn)錄效率比較實(shí)施例1所述的選定DNA聚合酶催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的能力。使用Mg+2或Mn+2對(duì)每一種DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由每一反應(yīng)得到的cDNA然后使用天然酶和Mg+2在所示條件下進(jìn)行擴(kuò)增。該方法可以測(cè)定酶對(duì)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄的特異性影響。
      除了天然酶外,使用683位氨基酸為F、K、L、R和Y的突變DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)施例2中證實(shí)這些突變均顯著增加合并逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)的效率。
      逆轉(zhuǎn)錄在100μl的總反應(yīng)體積中進(jìn)行每一種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最終試劑濃度如下5單位DNA聚合酶106拷貝GAPDH RNA50mM三甘氨酸,pH8.1550mM醋酸鉀2mM醋酸鎂或醋酸錳200μM dATP,dGTP,dCTP,dUTP200nm各種引物8%甘油1%DMSO0.2×SYBRGreen I1單位UNG**由Roche Molecular Systems生產(chǎn),Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA銷售。
      使用如下所示的具體溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
      逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間和溫度反應(yīng)前溫育 50℃ 2分鐘逆轉(zhuǎn)錄 60℃ 30分鐘保持 4℃
      擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄后,向10μl反應(yīng)產(chǎn)物加10μl 2mM EGTA螯合金屬離子,從而從下列擴(kuò)增反應(yīng)中有效去除金屬離子。將混合物加入含有天然酶和Mg+2的PCR擴(kuò)增混合物。因此,殘余突變DNA聚合酶被稀釋,預(yù)期任何效應(yīng)均可忽略不計(jì)。用以下最終試劑濃度在100μl反應(yīng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增5單位天然DNA聚合酶50mM三甘氨酸,pH8.1550mM醋酸鉀2mM醋酸鎂或醋酸錳200μM dATP,dGTP,dCTP,dUTP200nm各種引物8%甘油1%DMSO0.2×SYBRGreen I使用如下所示的具體溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
      擴(kuò)增熱循環(huán)時(shí)間和溫度95℃ 1分鐘55個(gè)循環(huán) 變性95℃ 15秒退火55℃ 30秒延伸72℃ 15秒最終延伸和保持72℃結(jié)果使用天然Tth DNA聚合酶(E683)和每種突變DNA聚合酶(以683位的氨基酸表示)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和天然Tth DNA聚合酶進(jìn)行所有擴(kuò)增獲得的CT值示于下表。每一CT值代表兩個(gè)反應(yīng)中獲得的平均值。為了方便比較,也提供了CT值差,即(天然CT值)-(突變CT值)。使用突變DNA聚合酶增加了效率,導(dǎo)致達(dá)到預(yù)期所需的循環(huán)數(shù)較少,即CT值較低。因此,CT值的正差代表效率的增加。
      反應(yīng)效率Mg+2激活的RT
      反應(yīng)效率Mn+2激活的RT
      這些突變DNA聚合酶的每一種均顯著增加了逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)的效率。因?yàn)槊恳环磻?yīng)的DNA擴(kuò)增部分均使用天然酶進(jìn)行,這些結(jié)果表明這些突變DNA聚合酶的每一種增加了反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄部分的效率。使用任一種陽(yáng)離子這些突變DNA聚合酶均顯著提高了效率。
      使用Mg+2的改善特別明顯,表明使用天然DNA聚合酶使得Mg+2激活的反應(yīng)成為現(xiàn)實(shí)。與以前報(bào)導(dǎo)的一致,使用天然酶的RNA擴(kuò)增必需使用Mn+2獲得實(shí)用的反應(yīng)效率,這由使用Mg+2時(shí)CT幾乎延遲10個(gè)循環(huán)(33.8-24.6)可知。相形之下,使用E683Y突變體時(shí),Mg+2激活的反應(yīng)的效率與使用天然酶和Mn+2時(shí)相同。
      實(shí)施例4保真性選定突變DNA聚合酶和突變酶的保真性以幾種方式進(jìn)行了比較。在Mg+2中進(jìn)行的偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)的保真性與在Mn+2緩沖液中進(jìn)行的反應(yīng)的保真性進(jìn)行了比較。此外,比較了用于DNA擴(kuò)增的酶的保真性。
      DNA聚合酶的保真性可以通過測(cè)定使用酶產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度(Tm)譜來比較。DNA聚合酶的保真性反映的是鏈合成過程中發(fā)生錯(cuò)配的數(shù)量。使用低保真性酶的擴(kuò)增將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的擴(kuò)增序列群體的較大異質(zhì)性。為了測(cè)定異質(zhì)性,將擴(kuò)增產(chǎn)物變性,退火,測(cè)定所得雙鏈體的Tm。因?yàn)殡p鏈體中的鏈由異源序列群體隨機(jī)聯(lián)合形成,雙鏈體一般含有一定雙鏈的錯(cuò)配。擴(kuò)增產(chǎn)物群體的異質(zhì)性越大,雙鏈體中的平均錯(cuò)配數(shù)越大。這些錯(cuò)配使雙鏈體不穩(wěn)定,因而測(cè)定的Tm值較低。
      使用擴(kuò)增時(shí)使用的熱循環(huán)儀/熒光測(cè)定儀可以方便地獲得動(dòng)態(tài)PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線。擴(kuò)增后,熒光和穩(wěn)定之間的關(guān)系在包含產(chǎn)物退火溫度的溫度范圍內(nèi)確定。雙鏈和單鏈分子間的轉(zhuǎn)換通過染料熒光的變化反映。因此,融解溫度可以方便地確定?;蛘?,可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定,通常包括監(jiān)測(cè)隨溫度變化的光密度變化,它是反應(yīng)中雙鏈DNA量的度量。
      天然DNA聚合酶的保真性與含有E683K和E683N突變的兩種突變DNA聚合酶的保真性分別進(jìn)行比較。偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)基本上如實(shí)施例2所述在Mg+2和Mn+2緩沖液中按雙份進(jìn)行,改變?nèi)缦?。?duì)Mn+2反應(yīng),在反應(yīng)中使用2mM醋酸錳。使用25單位DNA聚合酶進(jìn)行所有反應(yīng)。
      為了測(cè)定擴(kuò)增雙鏈靶序列的雜交穩(wěn)定性譜(融解曲線),擴(kuò)增后反應(yīng)混合物的熒光在至少60到80℃的溫度范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)。不出所料,熒光測(cè)定產(chǎn)生了S形融解曲線。Tm為S形融解曲線中溫度的拐點(diǎn),這相當(dāng)于一半靶序列成為單鏈形式的溫度。
      結(jié)果Mg+2激活反應(yīng)和Mn+2激活反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值示于下表。給出的每一測(cè)定值均為兩次反應(yīng)的平均值。所有溫度為攝氏度。擴(kuò)增產(chǎn)物TM值DNA聚合酶Tm,Mg+2Tm,Mn+2天然 80 78E683K80 76E683N80 76使用Mg+2緩沖液,未觀察到天然酶和突變DNA聚合酶的保真性有差別。使用所有20種DNA聚合酶進(jìn)行的類似反應(yīng)(數(shù)據(jù)未示出)證實(shí),在Mg+2激活反應(yīng)中所有突變DNA聚合酶的保真性與天然DNA聚合酶的保真性相同。
      使用Mn+2緩沖液獲得的結(jié)果與使用Mg+2緩沖液獲得的結(jié)果相比,所有DNA聚合酶的保真性均下降,這可由所得的Tm值較低看出。有意思的是,使用Mn+2緩沖液時(shí),兩種突變DNA聚合酶甚至具有更低的保真性,至少在這些反應(yīng)條件下。
      保真性受Mn+2濃度影響。為了比較Mn+2濃度對(duì)突變和天然酶保真性的影響,使用E683K突變?cè)贛n+2濃度為0.5到5mM的范圍內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。這些結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)表明,不出所料,使用兩種酶中任一種,最低的Mn+2濃度均獲得最高的保真性。突變酶的保真性較天然酶的保真性受增加的Mn+2濃度影響更甚。但是,出乎意料的是,至少在這些試驗(yàn)中,突變酶也是在最低的Mn+2濃度下最有效。因此,使用突變酶可以在較低的Mn+2濃度下進(jìn)行反應(yīng),從而使Mn+2濃度對(duì)保真性的不利影響最小。
      此外,Mg+2激活反應(yīng)和Mn+2激活反應(yīng)均基本如上所述進(jìn)行,但使用DNA模板,這使僅在反應(yīng)的DNA部分觀察保真性的影響更為便利。在所有情況下,DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值無(wú)法區(qū)分。
      該結(jié)果和前面實(shí)施例的結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)。以前報(bào)導(dǎo)了使用Mn+2進(jìn)行高溫逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的方法,其缺點(diǎn)是保真性降低。本發(fā)明提供了幾種選擇。使用Mn+2時(shí),使用突變酶進(jìn)行RNA的高溫逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的效率較使用天然酶時(shí)要高,可以在較低的Mn+2濃度下進(jìn)行反應(yīng),從而使Mn+2濃度對(duì)保真性的不利影響最小。使用Mg+2時(shí),使用突變酶提供了具有實(shí)用效率的RNA高溫高保真逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。
      序列表&lt;110&gt;F.Hoffmann-La Roche AGGrenzacherstrasse 1244070 Basel瑞士&lt;120&gt;使用突變DNA聚合酶的高溫逆轉(zhuǎn)錄&lt;130&gt;5395&lt;150&gt;US 60/198,336&lt;151&gt;2000-04-18&lt;160&gt;21&lt;170&gt;PatentIn version 3.0&lt;210&gt;1&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(2)..(2)&lt;223&gt;X是S或A&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(3)..(3)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(4)..(4)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(5)..(5)&lt;223&gt;X是L或I&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(6)..(6)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(7)..(7)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(8)..(8)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(9)..(9)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(10)..(10)&lt;223&gt;X是任何氨基酸&lt;400&gt;1Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu1 5 10&lt;210&gt;2&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(3)..(3)&lt;223&gt;X是Q或G&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(6)..(6)&lt;223&gt;X是S或A&lt;400&gt;2Leu Ser Xaa Glu Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;3&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;400&gt; 3Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;4&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(3)..(3)&lt;223&gt;X是Q或G&lt;400&gt;4Leu Ser Xaa Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;5&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(7)..(7)&lt;223&gt;X是V或I&lt;400&gt;5Leu Ser Val Arg Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;6&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;400&gt;6Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu1 5 10&lt;210&gt;7&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;序列基序&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;(8)..(8)&lt;223&gt;X是S或T&lt;400&gt;7Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Xaa Arg Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;a&lt;211&gt;11&lt;212&gt; PRT&lt;213&gt;水生棲熱菌&lt;400&gt;8Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;9&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;黃棲熱菌&lt;400&gt;9Leu Ser Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;10&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱棲熱菌&lt;400&gt;10Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;11&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;棲熱菌.Z05&lt;400&gt;11Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu15 10&lt;210&gt;12&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;棲熱菌.sps17&lt;400&gt;12Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;13&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Thermus caldophilus&lt;400&gt;13Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;14&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;絲狀棲熱菌&lt;400&gt;14Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu1 5 10&lt;210&gt;15&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;海棲熱袍菌&lt;400&gt;15Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;16&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;那不勒斯棲熱袍菌&lt;400&gt;16Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;17&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;非洲棲熱腔菌&lt;400&gt;17Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu1 5 10&lt;210&gt;18&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;熱堅(jiān)芽孢桿菌&lt;400&gt;18Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;19&lt;211&gt;11&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱脂肪芽孢桿菌&lt;400&gt;19Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu1 5 10&lt;210&gt;20&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;20cgagatccct ccaaaatcaa 20&lt;210&gt;21&lt;211&gt;23&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工&lt;220&gt;&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;21catgagtcct tccacgatac caa 2權(quán)利要求
      1.逆轉(zhuǎn)錄RNA的方法,包括(a)提供含有所述RNA、引物、二價(jià)陽(yáng)離子和突變熱活性DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物,其中所述突變DNA聚合酶的特征在于i)該DNA聚合酶的天然形式中包含有SEQ ID NO1的氨基酸序列;ii)與天然序列相比,所述氨基酸序列中4位氨基酸突變成除E、A、G或P之外的氨基酸;和(b)在足以使所述突變DNA聚合酶起始所述引物的延伸產(chǎn)物合成的溫度下處理所述反應(yīng)混合物,以提供與所述RNA互補(bǔ)的cDNA分子。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有選自SEQ ID NO5,SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的氨基酸序列。
      3.權(quán)利要求1的方法,其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
      4.權(quán)利要求3的方法,其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
      5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法,其中所述二價(jià)陽(yáng)離子是Mg+2。
      6.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法,其中所述突變DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
      7.權(quán)利要求1、3和4任一項(xiàng)的方法,其中所述DNA聚合酶是一種棲熱菌DNA聚合酶的突變形式。
      8.權(quán)利要求7的方法,其中所述DNA聚合酶是嗜熱棲熱菌DNA聚合酶或水生棲熱菌DNA聚合酶的突變形式。
      9.權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的方法,其中步驟(b)所述反應(yīng)混合物的溫度為40℃到80℃。
      10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的方法,其中與天然序列相比,所述氨基酸序列的4位氨基酸突變成除E、A、G、P、Q或D以外的氨基酸。
      11.擴(kuò)增RNA的方法,包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1的方法逆轉(zhuǎn)錄所述RNA以提供cDNA;(b)擴(kuò)增所述cDNA。
      12.權(quán)利要求11的方法,其中DNA聚合酶的天然形式包含有選自SEQ ID NO5,SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的氨基酸序列。
      13.權(quán)利要求11的方法,其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
      14.權(quán)利要求13的方法,其中所述DNA聚合酶的天然形式包含有選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
      15.權(quán)利要求11到14任一項(xiàng)的方法,其中步驟(b)中所述擴(kuò)增是使用聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
      16.權(quán)利要求11到15任一項(xiàng)的方法,其中使用單酶逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增RNA。
      17.權(quán)利要求11到16任一項(xiàng)的方法,其中所述二價(jià)陽(yáng)離子是Mg+2。
      18.權(quán)利要求11到17任一項(xiàng)的方法,其中所述突變DNA聚合酶是熱穩(wěn)定性的。
      19.權(quán)利要求11、13和14任一項(xiàng)的方法,其中所述DNA聚合酶是一種棲熱菌DNA聚合酶的突變形式。
      20.權(quán)利要求19的方法,其中所述DNA聚合酶是嗜熱棲熱菌DNA聚合酶或水生棲熱菌DNA聚合酶的突變形式。
      21.權(quán)利要求11到20任一項(xiàng)的方法,其中步驟(b)所述反應(yīng)混合物的溫度為40℃到80℃。
      22.權(quán)利要求11到21任一項(xiàng)的方法,其中與天然序列相比,所述氨基酸序列的4位氨基酸突變成除E、A、G、P、Q或D以外的氨基酸。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄方法,特別是在鎂離子緩沖液中。這些方法在合并逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中特別有用。
      文檔編號(hào)C12N15/09GK1344802SQ0111702
      公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2001年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
      發(fā)明者E·S·史密斯, C·M·埃爾夫斯特倫, D·H·格爾范德, R·G·希古赤, T·W·麥爾斯, N·J·索恩布倫納, A·M·王 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1