專利名稱：一種微生物微氧發(fā)酵生產(chǎn)1,3－丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種微生物在微氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。
眾所周知，1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，與乙二醇、1，2-丙二醇和1，4-丁二醇有著同樣的用途，但它與對(duì)苯二甲酸合成的新型聚酯材料聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PTT)具有許多優(yōu)良的特性，如尼龍樣的彈性恢復(fù)、抗紫外、臭氧及氮氧化物的著色性、低靜電、低水吸附、全色范圍內(nèi)無需添加任何特殊化學(xué)品而呈現(xiàn)出的良好的連續(xù)印染性及可生物降解性等。這些都表現(xiàn)出了1，3-丙二醇美好的應(yīng)用前景，但昂貴的價(jià)格卻阻礙了其應(yīng)用。
目前1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，如殼牌公司以乙烯為原料，在高溫(280℃)下用銀作催化劑氧化成環(huán)氧乙烷，然后加氫和一氧化碳轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛，最后氫化成產(chǎn)品1，3-丙二醇；Degussa公司則以丙烯為原料，在350℃、0.2Mpa下以鉬作催化劑氧化為丙烯醛，再水化為3-羥基丙醛，然后氫化成1，3-丙二醇(USP 5,008,473)。這兩種方法都需要在高溫和貴重催化劑作用下進(jìn)行，產(chǎn)品除1，3-丙二醇外還有1，2-丙二醇及其二聚體、三聚體等性質(zhì)相近的副產(chǎn)物，致使產(chǎn)品分離提純較困難，生產(chǎn)成本相應(yīng)較高。
微生物法轉(zhuǎn)化甘油為1，3-丙二醇的研究始于1881年，但直到20世紀(jì)80年代才逐漸引起人們的重視。與化學(xué)合成法相比，它具有條件溫和、操作簡便、副產(chǎn)物少、無環(huán)境污染等特點(diǎn)。目前1，3-丙二醇的微生物生產(chǎn)法可分為兩類一是以葡萄糖為底物用基因工程菌生產(chǎn)1，3-丙二醇(PCT/US 96/06705；USP 5,599,689；WO 96/35796；WO 9821340；WO9821339)，二是用腸道細(xì)菌將甘油歧化為1，3-丙二醇(USP 5,254,467；EP 0,373,230 A1)。前者的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物濃度均較低，而后者則相對(duì)較高。上述專利報(bào)道的方法和文獻(xiàn)中公開發(fā)表的其它微生物發(fā)酵法無一例外都是厭氧發(fā)酵，這是因?yàn)樵诟视娃D(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的過程中存在一些關(guān)鍵酶，如甘油脫氫酶、二羥丙酮激酶甘油脫水酶、1，3-丙二醇脫氫酶等，通常情況下這些酶在厭氧條件下發(fā)揮作用，而氧將導(dǎo)致個(gè)別關(guān)鍵酶失活，如甘油脫氫酶的不可逆失活，因而不能生成1，3-丙二醇。
本發(fā)明的目的是利用克雷伯氏菌、檸檬菌和梭狀芽孢桿菌等兼性菌，實(shí)現(xiàn)在微氧條件下將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的發(fā)酵工藝。本發(fā)明解決了在微氧條件下不能產(chǎn)生1，3-丙二醇的技術(shù)難題，經(jīng)長期馴化后的兼性菌不僅能在厭氧條件下將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，而且在微氧條件下也能生產(chǎn)1，3-丙二醇。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的步驟如下1)培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基中必須具備微生物生長所需的營養(yǎng)成分，如甘油或葡萄糖等碳源，酵母浸膏或酵母粉等氮源，鈉、鉀、氨、鎂、鈣等陽離子和磷酸根、硫酸根、氯離子等陰離子，以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼、和鉬等微量元素。培養(yǎng)基須在121℃下滅菌15～20分鐘方能使用。
2)種子培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速為100～300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為27～40℃，培養(yǎng)時(shí)間為9～24小時(shí)。
3)發(fā)酵培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵罐接種量為5％～20％，攪拌槳轉(zhuǎn)速為100～400轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為27～40℃，pH控制在6.0～8.0。發(fā)酵過程中可以向發(fā)酵罐中通氮?dú)饣蚩諝?，也可以不通氣，通氣量?～2vvm。發(fā)酵方式可以是間歇發(fā)酵、批式流加發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，間歇或批式流加發(fā)酵的時(shí)間為10～100小時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇的濃度可以達(dá)到5～70g/L；連續(xù)發(fā)酵時(shí)先用1％～6％甘油培養(yǎng)基進(jìn)行間歇發(fā)酵，待發(fā)酵液中菌體干重濃度達(dá)到0.2～2.0g/L時(shí)，再以0.1～0.5h-1的稀釋率流加發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行恒化培養(yǎng)。
本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所用的微生物細(xì)胞在厭氧和微氧條件下都能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，并且產(chǎn)率相當(dāng)。這種方法的益處在于簡化了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的工藝，降低了生產(chǎn)成本，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
以下詳細(xì)敘述本發(fā)明的最佳實(shí)施例本發(fā)明實(shí)施例中所用菌種為克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)，購自中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，菌種保藏號(hào)1.1736。
培養(yǎng)基分種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基兩種1)種子培養(yǎng)基(1000ml)甘油20g K2HPO4·3H2O4.56gKH2PO41.3g (NH4)2SO42.0gMgSO4·7H2O2g 酵母粉1gCaCO32g 微量元素A2ml0.5％FeSO4溶液1ml 2％CaCl2溶液1ml微量元素A組成(1000ml)
飽和鹽酸0.9mlZnCl270mgMnCl2·4H2O100mg H3BO360mgCoCl2·6H2O200mg NiCl2·6H2O25mgNaMoO4·2H2O35mg CuCl2·2H2O20mg2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成(1000ml)(NH4)SO46.61g KH2PO41.36gMgCl2·6H2O0.26檸檬酸0.42g酵母粉1g 微量元素B5ml微量元素B組成(1000ml)飽和鹽酸10ml ZnCl2·6H2O0.68gFeCl3·6H2O5.4g MnCl2·4H2O0.17gCoCl2·6H2O0.47g H3BO30.06gNaMoO4·2H2O0.005g CuCl2·2H2O0.47g種子與發(fā)酵培養(yǎng)基均要在滅菌前調(diào)節(jié)pH為7.0發(fā)酵過程分種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)兩步種子培養(yǎng)在一個(gè)500ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為200ml，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為12hr；發(fā)酵培養(yǎng)在全自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行，工作體積為5L，實(shí)際裝液量為3L，溫度和轉(zhuǎn)速恒定為37℃和300轉(zhuǎn)/min，用2mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH7.0。
具體的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下用含2％的甘油培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，厭氧條件下發(fā)酵液中1，3-丙二醇的濃度為7.8g/L，不通氣條件下為8.2g/L，通1.2L/min的空氣時(shí)為9.4g/L；甘油歧化為1，3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為47.0％，49.6％和56.9％，發(fā)酵結(jié)束時(shí)間分別為18，15和11小時(shí)。當(dāng)甘油初始濃度為4％時(shí)，厭氧、不通氣和通氣(1.2L/min的空氣)條件下間歇發(fā)酵得到的1，3-丙二醇濃度分別為15.7，16.8，15.1g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率分別為43.7％，50.8％，45.7％，發(fā)酵時(shí)間分別為32，20和17小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種微生物微氧發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，在溫度、pH和攪拌轉(zhuǎn)速恒定的條件下，進(jìn)行間歇、批式流加或連續(xù)發(fā)酵將甘油生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，所用的微生物菌種為克雷伯氏菌屬、檸檬菌和梭狀芽孢桿菌屬等兼性菌，培養(yǎng)基中除了必需的碳源、氮源和一些無機(jī)鹽外，還應(yīng)含有鋅、鐵、鎂、銅、鈷、硼、鉬等微量元素，發(fā)酵接種量為5％～20％，溫度控制在27℃～40℃，pH在6.0～8.0，間歇或批式流加發(fā)酵時(shí)間為10～100小時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇的最終濃度可達(dá)到5～70g/L。該發(fā)明方法的特征在于a)發(fā)酵過程可以在微氧條件下進(jìn)行，空氣通入量為0～2vvm；b)間歇發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基中甘油的質(zhì)量百分比濃度為2％～20％，批式流加發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加的甘油濃度為10％～100％，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度為2％～20％；c)連續(xù)發(fā)酵是以1％～6％的初始甘油濃度進(jìn)行菌體予培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到每升發(fā)酵液中含0.2～2.0g干細(xì)胞后，再以0.1～0.5h-1的稀釋率連續(xù)流加發(fā)酵培養(yǎng)基的恒化培養(yǎng)過程。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及到一種微生物微氧發(fā)酵法生產(chǎn)1,3－丙二醇的技術(shù)。本發(fā)明的特征在于所使用的微生物細(xì)胞不僅在厭氧條件下,而且在微氧條件下都能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3－丙二醇。其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵工藝簡單經(jīng)濟(jì),既簡化了操作條件,降低了生產(chǎn)成本,又縮短了發(fā)酵時(shí)間,提高了生產(chǎn)效率,而且微氧條件下發(fā)酵液中1,3－丙二醇的濃度與厭氧發(fā)酵相當(dāng)或略高一些,為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3－丙二醇的工業(yè)化提供了簡單經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵工藝。
文檔編號(hào)C12P7/02GK1348007SQ0111728
公開日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月27日
發(fā)明者修志龍, 張代佳, 王劍峰, 劉海軍 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)