專利名稱：木薯的直接糖化和使用糖類溶液的氨基酸發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)木薯直接糖化的方法，由此可以制備出高濃度的糖類溶液，這種方法不需要對(duì)木薯淀粉進(jìn)行分離和提純，本發(fā)明還涉及一種氨基酸發(fā)酵方法，其中由此制備的糖類溶液被用作發(fā)酵的原料。
木薯淀粉是從木薯中制備的一種淀粉，且可以通過用淀粉酶處理將其轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖用作各種發(fā)酵產(chǎn)物例如，氨基酸等的主要原料。
迄今為止，制備是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過將木薯磨碎，通過用水提取、篩網(wǎng)篩分或采用離心分離將蘊(yùn)藏其間的細(xì)淀粉微粒與包括纖維物質(zhì)的剩余物質(zhì)分離，最后將分離的淀粉干燥。一般，木薯(生木薯)含約50％的水，而木薯淀粉基于與其產(chǎn)出同樣量的剩余物質(zhì)被排除的生木薯獲得20-25％的產(chǎn)率。
而生木薯的分析結(jié)果顯示出其含有40-45％的淀粉。且因此相當(dāng)量的淀粉還遺留在被排除的包括纖維物質(zhì)的剩余物質(zhì)中，而沒有被提取。
通常用研磨機(jī)，例如銼刀等對(duì)木薯進(jìn)行研磨。但由于多少有些低的研磨效率和淀粉微粒不充分的分離，淀粉的產(chǎn)率還沒有明顯地提高。與馬鈴薯淀粉相比其細(xì)胞膜較厚，且其淀粉粒徑小于馬鈴薯淀粉。事實(shí)上，在掃描電子顯微鏡(SEM)下，對(duì)剩余物質(zhì)觀察，顯示出緊密地分布其中的，幾乎均勻的和球形的淀粉顆粒，且大量的淀粉顆粒被膜狀物質(zhì)覆蓋。
為了再現(xiàn)用銼刀研磨木薯的實(shí)驗(yàn)室類似條件，根據(jù)如

圖1所示的流程圖進(jìn)行淀粉生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)。其中用銼刀磨碎木薯，且最終獲得的淀粉和剩余物質(zhì)分別稱量，以確定淀粉的產(chǎn)率。在同樣的條件下，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)三次(進(jìn)行第1-3次)，且結(jié)果示于表1。表1(基于圖1所示的流程圖的淀粉生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果)
如表1所示，在每一次實(shí)驗(yàn)中獲得的淀粉重量與剩余物質(zhì)的重量幾乎相同，因此這些結(jié)果很好地證明了實(shí)際的狀況，這個(gè)狀況就是與產(chǎn)生的最終產(chǎn)物木薯淀粉幾乎同樣量的剩余物質(zhì)在木薯淀粉磨中被排除掉。
因此，考慮到大量的淀粉微粒均勻遺留在剩余物質(zhì)中，且被膜狀物質(zhì)覆蓋，由于淀粉的產(chǎn)出有很大的限制，因此難以通過用于分離淀粉的常規(guī)的研磨處理將存在于木薯中的淀粉充分地提取。這表明存在于木薯中的淀粉源還沒有有效地利用，而且大量淀粉還被包含在從淀粉磨中排除的剩余物質(zhì)中，這造成了環(huán)境污染的問題。
如果通過對(duì)木薯直接糖化，而且不需要對(duì)木薯淀粉的提取步驟，可以制備出可以用作發(fā)酵原料的高濃度的糖類水溶液是值得考慮的，則在淀粉生產(chǎn)期間作為副產(chǎn)品的剩余物質(zhì)的量明顯降低，且有關(guān)的環(huán)境污染問題也將被解決。本發(fā)明的實(shí)施就是基于這樣的觀念。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)木薯的直接糖化方法，該方法不需要對(duì)木薯淀粉的分離和提純，從而可以制備出高濃度的糖類水溶液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種氨基酸發(fā)酵方法，其中由此制備的糖類溶液用作氨基酸發(fā)酵的原料。
作為為實(shí)現(xiàn)上述目的的熱心研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)生木薯被去皮，且干燥至水分含量是16wt.％或更低時(shí)，得到的干燥物質(zhì)易于磨碎，使覆蓋淀粉微粒的膜破裂，從而使存在其間的淀粉用淀粉液化酶和糖化酶糖化。更具體地說，當(dāng)生木薯被干燥至水分含量是16wt.％或更低時(shí)，且接著被粉碎至粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，所得到的細(xì)粉末具有良好的水中可懸浮性，產(chǎn)生出35％高濃度的均勻懸浮液，且保持流暢的可流動(dòng)性易于操作。且隨后的酶液化和糖化可以順利地進(jìn)行，從而80％或更多的包含在粉末中的淀粉可以被糖化，以產(chǎn)生出40％或更高濃度的糖類溶液，它可以用作發(fā)酵的進(jìn)料溶液。另外，在粉狀的木薯懸浮于水中用于酶液化和糖化的情況下，在酶液化之前，用纖維素酶處理，從而使粉狀的木薯可以高濃度(45-55g/dl)在水中懸浮。而且，在粉狀的木薯被懸浮在水中用以酶液化和糖化的情況下，預(yù)先用淀粉液化酶處理，從而可以高濃度(45g/dl)在水中懸浮，且隨后的酶液化和糖化可以順利地進(jìn)行。
在任一情況下，獲得的糖類溶液適合于作為氨基酸發(fā)酵的碳源。通過發(fā)酵方式可以獲得高產(chǎn)率的氨基酸和相應(yīng)地極大地有效利用存在于木薯中的淀粉，且進(jìn)一步明顯降低源自木薯的包括纖維物質(zhì)的剩余物質(zhì)的量。本發(fā)明就是基于這些新發(fā)現(xiàn)。
也就是說，本發(fā)明在權(quán)利要求1中涉及一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供平均粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，向細(xì)粉末中添加水，加水量應(yīng)能保證形成粗淀粉漿，而且淀粉含量是35.wt％或更多，之后用淀粉液化酶和糖化酶對(duì)所述的漿液進(jìn)行酶液化和糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液，本發(fā)明在權(quán)利要求2中涉及一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，在含纖維素酶的水溶液中使所述細(xì)粉末懸浮，以制備出粗淀粉漿，其中淀粉含量是35.wt％或更多，與此同時(shí)所述的漿液經(jīng)受纖維素酶處理，之后用淀粉液化酶和糖化酶對(duì)經(jīng)過纖維素酶處理的漿液進(jìn)行酶液化和糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液，本發(fā)明在權(quán)利要求3中涉及一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，在含淀粉液化酶的水溶液中使所述細(xì)粉末懸浮，以制備出粗淀粉漿，其中淀粉含量是35.wt％或更多，與此同時(shí)所述的漿液經(jīng)受酶液化，之后將得到的液化溶液用糖淀粉酶進(jìn)行酶糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液，本發(fā)明在權(quán)利要求4中涉及如權(quán)利要求1至3的任一權(quán)利要求所述的方法，其中在所述干燥的木薯中的水含量是5-10.wt％，而本發(fā)明在權(quán)利要求5中涉及一種氨基酸發(fā)酵方法，其特征在于使用通過權(quán)利要求1至4任一權(quán)利要求所述的木薯直接糖化方法制備的高濃度糖類水溶液作為氨基酸發(fā)酵的原料。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的舉例說明。
可以用作本發(fā)明原料的生木薯在收獲之后易于腐敗。針對(duì)其固有的屬性，為了長(zhǎng)期保藏，收獲之后應(yīng)立即去皮和干燥。另外，去皮的和干燥的木薯可以用研磨機(jī)細(xì)粉碎，如同木薯淀粉。在干粉中的淀粉含量是約90％，因此，干粉是主要含淀粉的粗淀粉粉末。
被干燥至水含量是16.wt％或更低的木薯，可以首先被粉碎成直徑范圍是1mm至10mm的顆粒，且接著根據(jù)常規(guī)方法用研磨機(jī)粉碎成粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末。
作為用于工業(yè)規(guī)模上的大量處理的機(jī)械研磨設(shè)備的例子，均質(zhì)機(jī)和球磨機(jī)等可以被使用。
粉末中水分含量越小，就會(huì)有越多的顆粒，使得對(duì)于粉末的總重量粒徑是150μm或更低，且更有利于酶液化和糖化的進(jìn)行。由于這些原因，干粉含16.wt％或更低的水分，優(yōu)選采用5-10wt.％的水分。
粉末粒徑是150μm或更低時(shí)，其具有好的水中懸浮性，這樣使得即使45％的漿液仍能保持良好的可流動(dòng)性。且獲得的糖類溶液具有的粘度低于500cp，使其易于處理。采用細(xì)粉碎粉末帶來的好處是可以縮短酶液化時(shí)間和使得到的液體易于處理。
粉狀的木薯可以用淀粉液化酶和淀粉酶直接酶液化和糖化，如同木薯淀粉一樣。當(dāng)干木薯被酶液化和糖化時(shí)，淀粉轉(zhuǎn)化成水可溶葡萄糖，同時(shí)除淀粉之外的其它成分例如纖維物質(zhì)保持為固體物質(zhì)，因此酶糖化結(jié)束之后，它們可以通過例如離心分離和過濾之類的常規(guī)固液分離工藝被輕易地去除。
在干木薯粉懸浮于水中的情況下，值得推薦的是在酶液化之前，干木薯用纖維素酶處理。通過纖維素酶處理，粉末可以以高濃度輕易地在水中懸浮，隨后酶液化和糖化促進(jìn)糖化度的提高和相應(yīng)地降低了剩余的固體物質(zhì)的量，這就防止了當(dāng)遺留有固體物質(zhì)的糖類溶液用作發(fā)酵的碳源時(shí)，會(huì)遭遇這樣的負(fù)面影響。
在這種情況下，值得推薦的是將所有量的要被液化的干木薯粉漸漸加入到含纖維素酶的水溶液中，而不是一下加入，從而可以以45-55g/dl的高濃度在水中懸浮，并相應(yīng)地制備出40-45％高濃度的糖類溶液。
通過纖維素酶對(duì)木薯粉作用是值得考慮的，覆蓋淀粉微粒的膜被酶分解，因此酶液化和淀粉糖化可以有效地進(jìn)行。纖維素酶是市售得到的，例如可以使用“纖維素酶YC”(商品名，Kikkoman有限公司的產(chǎn)品)。優(yōu)選使用通過屬于木霉屬的真菌生產(chǎn)的纖維素酶。當(dāng)以濾紙分解活性(FPA)表述時(shí)，纖維素酶的使用量可以是約10單位或更多(參見酶使用手冊(cè)，Chijin Shokan有限公司出版的297和298頁(yè)內(nèi)容)?？梢允?00單位或更多每克粉，優(yōu)選300-1500單位每克粉。酶反應(yīng)可以在40-50℃的溫度范圍進(jìn)行，且pH是5-7。反應(yīng)時(shí)間通?？梢允羌s2-4小時(shí)。
如果已經(jīng)進(jìn)行了纖維素酶反應(yīng)，接著淀粉液化酶，例如“T-5”(商品名，Daiwa化學(xué)工業(yè)有限公司的產(chǎn)品)以每克粉20單位量被加入進(jìn)懸浮液中，且該混合物在85-95℃攪拌加熱1小時(shí)。得到的液化液體被靜置冷卻至60℃，且pH用稀硫酸調(diào)節(jié)至4.2。接著糖化酶例如“NC-4.2”(商品名，Amano制藥有限公司的產(chǎn)品)以原始采用的每克粉2-5單位的量被加入，且該混合物被加熱至55-65℃，攪拌下，加熱在該溫度下持續(xù)40-48小時(shí)，以完成酶反應(yīng)。
另外，在干木薯粉懸浮于水中的情況下，值得推薦的是預(yù)先以20單位每克粉的量向粉中添加淀粉液化酶，從而使酶液化進(jìn)行得順利。在這種情況下，在40-60℃的溫度下，粉末可以緩慢地添加進(jìn)含液化酶的水溶液中，而不需要將溫度加熱至使液化酶活性高的90℃，從而使高濃度(45-55g/dl)的漿液可以被糖化，以制備以葡萄糖濃度計(jì)40-45g/dl濃度的糖化溶液，這是由于提高了液化和糖化效率。
接下來，去皮的和干燥的木薯粉粒徑和糖化度之間的關(guān)系，和糖化度和剩余率[剩余物質(zhì)(包括遺留在糖化溶液中未糖化的固體物質(zhì))與使用的粉末的總量之間的比率]之間的關(guān)系通過實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1說明。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1在收獲之后，馬上將生木薯去皮，且在目光下曬干，直至重量降低至原來的2/3，且在減壓條件下，進(jìn)一步在40℃持續(xù)約40小時(shí)，直至識(shí)別不出存在重量上的變化。由此約10-20cm長(zhǎng)度的干木薯被切成1cm2的大小，且接著用混合器“Osterrizer16-速”(SUN BEAM OSTER公司的產(chǎn)品)細(xì)粉碎。粉末的水分含量是約5％。另外，用酸將粉末分解(通過在加入6N鹽酸的沸水中加熱2小時(shí))，作為根據(jù)HPLC方法分析的結(jié)果，以葡萄糖計(jì)的淀粉含量測(cè)定為89.4％。
通過9、16、40和100目篩，粉碎的木薯粉分成4種樣品。5g的各樣品在攪拌下，以5部分被添加進(jìn)含液化酶“T-5”(Daiwa化學(xué)工業(yè)有限公司的產(chǎn)品)(20單位每克粉末)的水溶液中。在添加結(jié)束之后，在沸水中進(jìn)行液化反應(yīng)1小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行震動(dòng)操作。該反應(yīng)混合物被冷卻至室溫靜置，并用稀硫酸調(diào)節(jié)至pH值為4.5。糖化酶“NC-4”以每克粉3單位的量添加其中，且該混合物被加熱至60℃。在振動(dòng)下，在該溫度下該糖化反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)。在糖化反應(yīng)完成之后，該反應(yīng)混合物經(jīng)過離心分離，并分析糖化溶液以估計(jì)糖化度和剩余率。
有關(guān)粒徑、糖化度和剩余率之間關(guān)系的估計(jì)結(jié)果示于表2中。從表2所示的結(jié)果可以看出，越細(xì)的粒徑就會(huì)使糖化進(jìn)行得越順利。通過將粉末研磨至粒徑是150μm或更低，基于使用的粉末可以獲得約82％的葡萄糖，且粉末中所含的94％的淀粉被糖化。表2
去皮的和干燥的木薯中的水分含量與通過100目(=150μm)的粉末與用研磨機(jī)研磨的干木薯獲得的粉末重量比率之間的關(guān)系通過實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2說明，其中所述的干木薯在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)具有各種水分含量。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2約3-5cm長(zhǎng)的去皮的木薯置于恒濕器中，以便于將水分含量調(diào)節(jié)至8-22％，且45g的具有給定水分含量的各木薯用“Osterrzer16-速”混合器研磨4分鐘。
各研磨的樣品在105℃被干燥4小時(shí)，之后用100目篩篩分。計(jì)算已經(jīng)通過100目篩的粉末的重量比。去皮的和干燥的木薯中水分含量(％)和通過100目篩粉末的重量比之間的關(guān)系示于圖2中。從圖2中可以看出，當(dāng)樣品木薯中的水分含量超過16％時(shí)，粉末粉碎至150μm或更低的目標(biāo)粒徑的比率極大的降低。當(dāng)其超過17％時(shí)，沒有達(dá)到目標(biāo)粒徑的的粉末比率提高10％或更多。因此，在調(diào)節(jié)水分含量至16％或更低之后，進(jìn)行研磨工藝，從而使研磨至150μm或更低目標(biāo)粒徑的粉末比率可以達(dá)到78％(約35g每批)，因此研磨效率得到提高，具有高濃度的漿液可以被送入酶反應(yīng)。
當(dāng)干木薯粉懸浮于水中，在酶液化之前對(duì)其使用纖維素酶處理，在這種情況下的酶處理效果用實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3說明。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3用于實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的通過100目篩的5g的木薯粉(水分含量約5％)漸漸地加入7.2ml水中含有0.3g“纖維素酶YC”的纖維素酶的溶液中，并同時(shí)進(jìn)行攪拌操作。在添加所有量的粉末之后，在振動(dòng)下，反應(yīng)在50℃下進(jìn)行2小時(shí)。在添加7ml水之后、將0.02ml的液化酶“T-5”以每克粉末20單位的量添加其中，在振動(dòng)下，該混合物在95℃下，加熱1小時(shí)。該反應(yīng)混合物被冷卻至室溫靜置，且pH值用稀硫酸被調(diào)節(jié)至4.2。將0.0004ml的糖化酶“NC-4.2”以每克原始使用的粉末3單位的量添加其中，且該混合物被加熱至60℃，且在該溫度下攪拌48小時(shí)。在糖化反應(yīng)結(jié)束之后，獲得的糖化溶液經(jīng)過離心分離。對(duì)糖化溶液進(jìn)行分析，以估計(jì)糖化度和剩余率。結(jié)果示于表3中。為了比較，除了沒有使用纖維素酶以外，進(jìn)行上述同樣的工藝。結(jié)果也示于表3中。表3
從表3所示的結(jié)果可以看出，在酶液化之前的纖維素酶處理，與沒有采用纖維素酶處理的對(duì)照樣品相比，導(dǎo)致較高的糖化度和很少的剩余率。因此，用纖維素酶對(duì)粉狀的木薯處理可以說明顯地改善了糖化效率和隨后糖化中糖化溶液的品質(zhì)。
另外，即使在纖維素酶濃度低至約10單位/ml的情況下，以FPA計(jì)，干木薯粉漸漸地加入，從而可以保持可流動(dòng)性，直至得到的漿液濃度高達(dá)50g/dl。這樣保持可流動(dòng)性的漿液的液化和糖化進(jìn)行頂利，用以提供高濃度的糖化溶液。
干木薯粉懸浮在水中，預(yù)先用液化酶處理情況下的液化酶效果通過實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4說明。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4通過向4ml水中添加預(yù)定量的液化酶“Y-5”制得的水溶液被保持在40℃，接著將6g通過100目篩的干木薯粉(水含量約5％)緩慢地添加其中，制得10ml總體積的漿液。得到的漿液在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1類似的條件下，進(jìn)行酶液化和糖化。添加的液化酶的量調(diào)整到每克粉100單位(這對(duì)于淀粉的量是標(biāo)準(zhǔn)的量)，其兩倍的量和0(沒有添加)，且將在液化處理之前，在所有的情況下，進(jìn)一步添加液化酶以便于成為每克粉200單位。
雖然，在將粉末懸浮于水溶液期間，它們之間在可懸浮性方面沒有明顯的區(qū)別，在預(yù)先添加酶和未添加酶的情況下，當(dāng)用以影響液化的溫度上升時(shí)，它們之間看出有明顯的區(qū)別。在這兩種情況中，預(yù)先添加酶的，液化反應(yīng)進(jìn)行得迅速，使得漿液在30分鐘的過程內(nèi)就成為流暢的液體，所述的30分鐘是常規(guī)液化反應(yīng)時(shí)間的一半。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，預(yù)先沒有添加酶的對(duì)照樣品沒有完全液化。
剩余率、糖化度和添加的液化酶的量之間的關(guān)系示于表4中。表4
從表4中所示的結(jié)果可以看出，預(yù)先添加液化酶的樣品與預(yù)先沒有添加液化酶的對(duì)照樣品相比較，在剩余率和糖化度方面明顯不同，由此表明通過預(yù)先用酶處理木薯粉可以使酶液化和糖化有效地進(jìn)行。
另外，在上述方法中55g的干木薯粉被緩慢地添加進(jìn)含液化酶的水溶液中，用以制備100ml的總體積的漿液，在將粉末懸浮于水溶液期間，液化之前溫度調(diào)整到40℃，即將在膠凝作用之前，將溫度調(diào)整至60℃，在液化酶高活性時(shí)溫度調(diào)整至80℃。在如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1類似的條件下進(jìn)行酶液化和糖化。結(jié)果示于表5中。表5
在糖化溶液的濃度方面，看不出它們之間有很大的區(qū)別。在將粉末懸浮于含液化酶的水溶液期間比較所設(shè)定的溫度，在60℃，在糖化度方面提供最好的結(jié)果，但40℃提供最出色的可懸浮性。在80℃的情況下，可以感覺到糖化溶液的粘度提高，大量溶液附著于反應(yīng)容器的內(nèi)壁。
本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)在于由干木薯獲得的糖化溶液，用作氨基酸發(fā)酵的原料。
氨基酸發(fā)酵的種類沒有特別的限制。氨基酸發(fā)酵的例子包括產(chǎn)生氨基酸例如，谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、鳥氨酸、谷氨酸鹽、天冬酰胺等的發(fā)酵。
用于這些發(fā)酵的微生物，可以使用各種氨基酸發(fā)酵中所公知的微生物。下面是舉例說明-L-谷氨酸發(fā)酵乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869-L-賴氨酸發(fā)酵乳發(fā)酵短桿菌ATCC21800-L-色氨酸發(fā)酵大腸埃希氏桿菌AGX17(PGX44)(NRRLB-12263)-L-苯丙氨酸發(fā)酵乳發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160)，參見法國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2686898。
-L-酪氨酸發(fā)酵乳發(fā)酵短桿菌AJ12081(FERM P-7249)，參見日本專利特許公開No.70093/1985。
-L-蘇氨酸發(fā)酵嗜乙酰乙酸棒狀桿菌AJ12318(FERMBP-1172)，參見美國(guó)專利US5188945-L-異亮氨酸發(fā)酵黃色短桿菌AJ12149(FERMBP-759)，參見美國(guó)專利US4656135除了本發(fā)明獲得的糖化溶液用作碳源以外，用于發(fā)酵的培養(yǎng)基可以是公知的培養(yǎng)基。上述糖化溶液可以被作為全部或部分的碳源。在用作部分碳源的情況下，其余的碳源可以是迄今為止使用過的碳源。發(fā)酵方法也可以是常規(guī)的方法。當(dāng)使用本發(fā)明的糖化溶液時(shí)，微生物的增殖率變得很大，使得發(fā)酵時(shí)間與使用葡萄糖作為發(fā)酵碳源的公知方法相比，可以被縮短約1-5小時(shí)。
基于通過發(fā)酵獲得的各種氨基酸的糖類的濃度和產(chǎn)率接近等于公知方法獲得的。
源自木薯的細(xì)固體物質(zhì)混合進(jìn)發(fā)酵液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基使用了通過木薯直接糖化制備的糖化溶液。然而，它們對(duì)源自發(fā)酵液體培養(yǎng)基的所需氨基酸的分離和提純幾乎沒有負(fù)面影響。當(dāng)微生物用膜過濾時(shí)，根據(jù)發(fā)酵微生物的種類和采用的木薯研磨程度，在一些情況下，過濾速度降低。在這種情況下，例如離心分離的方式可以用來去除微生物。
氨基酸，例如賴氨酸的主要用途是直接用于飼料領(lǐng)域。因此，在賴氨酸打算用于飼料的情況下，發(fā)酵液體培養(yǎng)基可以直接濃縮和干燥，例如通過流化床干燥，從而可以獲得顆粒飼料添加劑。
下列實(shí)施例更詳細(xì)地說明了本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。糖化溶液-制備實(shí)施例1通過100目篩的450g木薯粉(水份含量約5％)被懸浮于水中，經(jīng)調(diào)節(jié)使總量變?yōu)?L。得到的漿液在攪拌下被加熱至85℃，且向其中添加1.5ml的液化酶“T-5”。液化反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)，且之后反應(yīng)混合物被冷卻至60℃靜置。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，并添加0.5ml的糖化酶“NC-4.2”。在振動(dòng)下，糖化反應(yīng)在60℃進(jìn)行48小時(shí)。
在糖類溶液中的葡萄糖濃度是37.5g/dl(糖化度90％)。糖化溶液-制備對(duì)比實(shí)施例除了使用的干木薯粉含20％的水(粉末通過100目篩的比率52％)以外，重復(fù)如糖化溶液-制備實(shí)施例1的類似的工藝，進(jìn)行酶液化和糖化。結(jié)果，糖類溶液中的葡萄糖濃度是34.6g/dl(糖化度83％)。糖化溶液-制備實(shí)施例2通過將40g的纖維素酶“CELLULASEYC”在攪拌下，溶于10L水中所制備的水溶液被加熱至40℃。在攪拌下，通過100目篩的10kg木薯粉(淀粉含量89％)在1小時(shí)的時(shí)間漸漸被加入其中。在添加所有的木薯粉之后，在攪拌下，50℃下，進(jìn)行2小時(shí)酶反應(yīng)。
將3.3ml的液化酶“T-5”添加其中。在攪拌下，在90℃進(jìn)行液化反應(yīng)1小時(shí)，之后反應(yīng)混合物被冷卻至60℃靜置。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，并添加11.3ml的糖化酶“NC-4.2”。得到的混合物被加熱至60℃，并在此溫度下攪拌48小時(shí)。反應(yīng)溶液被冷卻至室溫以獲得18.5L的糖類溶液。
在糖類溶液中的葡萄糖濃度是44g/dl(糖化度87％)。糖化溶液-制備實(shí)施例3將133ml的液化酶“T-5”，在攪拌下，溶于20L的水中而制備的水溶液被加熱至40℃。在攪拌下，通過100目篩的17kg木薯粉(淀粉含量74％)在1小時(shí)的時(shí)間漸漸被加入其中。攪拌操作在90℃進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)混合物被冷卻至60℃靜置。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，并添加20ml的糖化酶“NC-4.2”。得到的混合物被加熱至60℃，并在此溫度下攪拌48小時(shí)。反應(yīng)溶液被冷卻至室溫以獲得37.5L的糖類溶液。
在糖類溶液中的葡萄糖濃度是35g/dl(糖化度97％)。發(fā)酵實(shí)施例1作為培養(yǎng)基，270ml的含60g/L市售葡萄糖、1g/L的MgSO4、lg/L的KH2PO4、15ml/L的大豆酸水解產(chǎn)物和300μg/L的生物素的底物溶液在120℃下加熱15分鐘滅菌，并置于S型罐中。
30ml的產(chǎn)生L-谷氨酸的微生物乳發(fā)酵短桿菌(ATCC13869)預(yù)培養(yǎng)的接種培養(yǎng)基被置于其中，使其具有300ml的總量，并開始發(fā)酵。在攪拌旋轉(zhuǎn)速度為1-1.2krpm和通風(fēng)率為1/lvvm的條件下進(jìn)行發(fā)酵。在整個(gè)發(fā)酵期間，用氨水溶液使pH值保持在7.5。發(fā)酵溫度保持在30℃。在開始發(fā)酵5小時(shí)之后，聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯以培養(yǎng)基中其濃度是2000mg/L的濃度被添加。
制備兩種糖化(糖類)溶液。向糖化溶液-制備實(shí)施例1(下文稱作“木薯糖化溶液1”)中獲得的糖類溶液中添加少量的市售葡萄糖以制備具有葡萄糖濃度為40g/dl的糖類溶液。另一種葡萄糖濃度是40g/dl的糖類溶液(下文稱作“葡萄糖溶液”)，其制備只使用市售葡萄糖。各糖類溶液在120℃下加熱15分鐘進(jìn)行滅菌，以供使用。
作為糖化溶液，使用木薯糖化溶液1、葡萄糖溶液和木薯糖化溶液1和葡萄糖溶液以1∶1混合的溶液。向這三種糖化溶液中添加聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯，以在糖化溶液中的濃度是2000mg/L的濃度被添加，由此制備的各底物溶液連續(xù)送入S-型罐中，以便于使發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度保持在1-2g/dl。
各發(fā)酵結(jié)果顯示當(dāng)葡萄糖底物溶液被連續(xù)送入時(shí)，獲得產(chǎn)率為56％的L-谷氨酸，而50％和100％木薯底物溶液的情況下，獲得的L-谷氨酸分別是56％和57％的產(chǎn)率。當(dāng)50％和100％木薯底物溶液被連續(xù)送入，培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)于葡萄糖底物溶液的情況下，分別被縮短3.7小時(shí)和4.2小時(shí)。
上述獲得的各發(fā)酵液體培養(yǎng)基用市售中空紗束型膜組件進(jìn)行膜分離處理。結(jié)果在膜傳遞系數(shù)方面，它們之間看不出有明顯的區(qū)別。另外，通過該膜的溶液通過添加鹽酸將pH調(diào)節(jié)為3.2，因此L-谷氨酸結(jié)晶出來，并毫不困難地通過過濾分離出來。發(fā)酵實(shí)施例2使用糖化溶液-制備實(shí)施例2中獲得的糖化溶液，在50L罐中進(jìn)行L-谷氨酸發(fā)酵。除了接種培養(yǎng)基的液體量是2.8L、發(fā)酵開始時(shí)的液體量是20L、攪拌旋轉(zhuǎn)速度是250rpm，目糖化的葡萄糖濃度是44d/dl以外，發(fā)酵是在如發(fā)酵實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行的。
作為各發(fā)酵的結(jié)果，當(dāng)木薯底物溶液送入培養(yǎng)基時(shí)，獲得的L-谷氨酸的產(chǎn)率同葡萄糖底物溶液情況下獲得的產(chǎn)率一樣是50％。與送入葡萄糖底物溶液相比，送入木薯底物溶液提供的發(fā)酵溶液被縮短約1小時(shí)。發(fā)酵實(shí)施例320ml的含30g/L市售葡萄糖、10g/L的氯化銨、3g/L的尿素、1g/L的KH2PO4、100mg/L的MgSO4·7H2O、10mg/L的FeSO4·7H2O、8mg/L的MnSO4·4H2O、1g/L的大豆酸水解產(chǎn)物(作為氮源)、0.1mg/L的鹽酸硫胺和0.3mg/L的生物素，且具有7.0pH值的培養(yǎng)基分別注入三個(gè)500ml的振蕩瓶。在115℃加熱10分鐘滅菌之后，用一鉑環(huán)的在液體培養(yǎng)基斜面上生長(zhǎng)48小時(shí)的乳發(fā)酵短桿菌(ATCC21800)接種培養(yǎng)基，在31.5℃下振搖24小時(shí)進(jìn)行接種培養(yǎng)。
300ml的含80g/L的廢糖蜜、50g/L的硫酸銨、1g/L的KH2PO4、1g/L的MgSO4·7H2O、100mg/L的大豆酸水解產(chǎn)物(作為氮源)、0.1mg/L的鹽酸硫胺和0.3mg/L的生物素，且具有7.0pH值的培養(yǎng)基分別注入三個(gè)1L的小尺寸玻璃發(fā)酵容器中，且在120℃加熱15分鐘滅菌。在冷卻至31.5℃之后，在上述瓶中培養(yǎng)的15ml培養(yǎng)基分別添加到三個(gè)發(fā)酵容器中，并在31.5℃，以攪拌旋轉(zhuǎn)速度為700rpm和通風(fēng)率為1/2vvm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)在培養(yǎng)基中糖類的濃度變得小于5g/L，表明原料培養(yǎng)基開始供應(yīng)。
制備有2種補(bǔ)料培養(yǎng)基，含有下述成分由市售的葡萄糖制備的40g/dl葡萄糖濃度的溶液作為糖化溶液，或?qū)⑸倭康氖惺燮咸烟翘砑舆M(jìn)由糖化溶液-制備實(shí)施例3獲得的糖化溶液中使其以葡萄糖濃度計(jì)為40g/dl的濃度，由此制備的溶液作為糖化溶液、大豆酸水解產(chǎn)物(如氮100mg/L)、0.1mg/L的鹽酸硫胺和0.3mg/L的生物素。調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，使得培養(yǎng)基中的糖類濃度小于5g/L。
在分別供應(yīng)了100ml補(bǔ)料培養(yǎng)基之后，連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)直至培養(yǎng)基中的糖類被消耗盡。測(cè)量培養(yǎng)基中L-賴氨酸積聚的濃度。
在兩種容器中發(fā)酵的結(jié)果，在補(bǔ)加葡萄糖的情況下，L-賴氨酸的產(chǎn)率是35％，而在補(bǔ)加木薯的情況下，L-賴氨酸的產(chǎn)率是38％。發(fā)酵實(shí)施例4
使用在糖化溶液-制備實(shí)施例3中獲得的糖化溶液在50L罐中進(jìn)行L-賴氨酸發(fā)酵。除了接種培養(yǎng)基的液體量是2.75L、發(fā)酵開始時(shí)的液體量是18L、攪拌旋轉(zhuǎn)速度是250rpm和通風(fēng)率為1/2vvm以外，如發(fā)酵實(shí)施例3同樣的條件進(jìn)行發(fā)酵。
結(jié)果，在補(bǔ)加葡萄糖的情況下，L-賴氨酸的產(chǎn)率是34％，而在補(bǔ)加木薯的情況下，L-賴氨酸的產(chǎn)率是37％。
如上所述，本發(fā)明提供一種木薯的直接糖化方法，這種方法不需要對(duì)由此得到的淀粉進(jìn)行分離步驟，其中去皮和干燥的木薯被粉碎，且接著進(jìn)行酶化和糖化，從而使含在粉狀木薯中的80％或更多的淀粉被糖化，以制備出具有40％或更高濃度的糖類溶液，該溶液可以用作氨基酸發(fā)酵的原料液體。而當(dāng)所述的糖類溶液用作氨基酸發(fā)酵的碳源時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)以高產(chǎn)率獲得氨基酸。另外，通過本發(fā)明，木薯中幾乎所有的淀粉可以被糖化，且進(jìn)一步用作氨基酸發(fā)酵的碳源，并降低了源自木薯的不受歡迎的剩余物質(zhì)的量。
圖1顯示的是源自木薯的淀粉和剩余物質(zhì)的制備實(shí)施例的流程圖。
圖2顯示的是去皮的和干燥的木薯中水分含量(％)和粒徑為150μm或更小的粉末重量比(％)之間的關(guān)系圖。
權(quán)利要求
1．一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供平均粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，向細(xì)粉末中添加水，加水量應(yīng)能保證形成粗淀粉漿，而且淀粉含量是35.wt％或更多，之后用淀粉液化酶和糖化酶對(duì)所述的漿液進(jìn)行酶液化和糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液。
2．一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，在含纖維素酶的水溶液中使所述細(xì)粉末懸浮，以制備出粗淀粉漿，其中淀粉含量是35.wt％或更多，與此同時(shí)所述的漿液經(jīng)受纖維素酶處理，之后用淀粉液化酶和糖化酶對(duì)經(jīng)過纖維素酶處理的漿液進(jìn)行酶液化和糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液。
3．一種木薯的直接糖化方法，其中包括將去皮的生木薯干燥至水分含量至16.wt％或更低，將得到的干燥的木薯粉碎，以提供粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末，在含淀粉液化酶的水溶液中使所述細(xì)粉末懸浮，以制備出粗淀粉漿，其中淀粉含量是35.wt％或更多，與此同時(shí)所述的漿液經(jīng)受酶液化，之后將得到的液化溶液用糖化酶進(jìn)行酶糖化，從而制得高濃度的糖類水溶液。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一權(quán)利要求所述的方法，其中在所述干燥的木薯中的水含量是5-10.wt％。
5．一種氨基酸發(fā)酵方法，其特征在于使用通過權(quán)利要求1至4任一權(quán)利要求所述的方法制備的高濃度糖類水溶液作為氨基酸發(fā)酵的原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木薯的直接糖化方法,由此可以制備出具有高濃度的糖類溶液,這種糖化不需要對(duì)木薯淀粉進(jìn)行分離和提純,本發(fā)明還公開了一種氨基酸發(fā)酵方法,其中由此制備的糖類溶液作為氨基酸發(fā)酵的原料。本發(fā)明涉及一種木薯的直接糖化方法,其中包括對(duì)去皮的生木薯進(jìn)行干燥,直至水分含量是16.wt%或更低,將得到的干木薯磨成粉以提供粒徑為150μm或更低的細(xì)粉末,向細(xì)粉末中添加水,加水量應(yīng)能保證形成粗淀粉漿,而且淀粉含量是35.wt%或更多,之后用淀粉液化酶和糖化酶對(duì)所述的漿液進(jìn)行酶液化和糖化,從而制得高濃度的糖類溶液,本發(fā)明還涉及一種氨基酸發(fā)酵方法,其中由此制備的糖類溶液作為氨基酸發(fā)酵的碳源。
文檔編號(hào)C12P19/02GK1321772SQ0111738
公開日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2001年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者櫻井紀(jì)子, 三輪治文 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社