專利名稱：一株釀酒酵母工程菌及其生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母菌及其應(yīng)用，特別是涉及一株釀酒酵母工程菌及利用該菌生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法。
酒精(又稱乙醇)在人們的日常生活及生產(chǎn)中具有重要作用。由于它燃燒時(shí)釋放到環(huán)境中的污染物較汽油要少得多，用乙醇來補(bǔ)充或替代汽油可減輕國(guó)家對(duì)石油的依賴。它可直接用作燃料，也可以不同濃度與汽油混合使用。美國(guó)環(huán)保局的資料表明，汽油里摻入10％的乙醇可減少25％-30％一氧化碳排放量。若按此比例配制復(fù)合性燃料酒精，我國(guó)每年約需酒精500萬噸，市場(chǎng)是巨大的。燃料酒精開發(fā)研究作為國(guó)家“十.五”重大攻關(guān)項(xiàng)目已經(jīng)全面啟動(dòng)，降低酒精的發(fā)酵生產(chǎn)成本是問題的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)酒精主要存在以下幾個(gè)問題1、產(chǎn)品單一，其主產(chǎn)品只有酒精，發(fā)酵后的酵母菌細(xì)胞通常作飼料蛋白用，致使酒精生產(chǎn)成本偏高，綜合開發(fā)利用率較低，既增加了成本，又污染環(huán)境。2、發(fā)酵成熟醪的酒精濃度較低(一般在9-12％左右)，嚴(yán)重限制了酒精單產(chǎn)的增加，同時(shí)耗費(fèi)大量的酒精蒸餾提取等能源和費(fèi)用。3、發(fā)酵強(qiáng)度不高，發(fā)酵周期長(zhǎng)，一般需要60-90小時(shí)。4、使用的酒精酵母正常發(fā)酵溫度范圍窄，一般在28-33℃，使得酒精生產(chǎn)受季節(jié)溫度影響較大，發(fā)酵溫度控制費(fèi)用較大。
本發(fā)明的目的是提供一株能夠同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的釀酒酵母工程菌。
本發(fā)明的釀酒酵母工程菌ZHJM-1 CGMCC № 0578已于2001年05月16日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(其簡(jiǎn)稱為CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC № 0578。
釀酒酵母工程菌ZHJM-1的構(gòu)建過程是依據(jù)不同酵母菌種的生理生化特性，分別篩選生產(chǎn)酒精的酒精酵母菌種2.558(Saccharomyces cerevisiae 2.558，可以在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心買到)和細(xì)胞麥角固醇含量高的面包酵母菌種2.403(Saccharomyces cerevisiae 2.403，可以在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心買到)，對(duì)上述菌種進(jìn)行生孢培養(yǎng)、單倍體分離，經(jīng)紫外線和亞硝基胍誘變篩選具有不同交配型及不同遺傳標(biāo)記的單倍體突變菌株(2.558-12 a his和2.403-8αtrp)；
將分離到的高產(chǎn)酒精的酵母菌單倍體突變菌株與細(xì)胞麥角固醇含量高的酵母菌單倍體突變菌株進(jìn)行雜交；在YNB基本培養(yǎng)基上篩選得到高產(chǎn)酒精和麥角固醇的酵母工程菌ZHJM-1。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述釀酒酵母工程菌ZHJM-1同時(shí)高產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法。為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，包括以下步驟1)將上述釀酒酵母工程菌ZHJM-1接種于總還原糖濃度為30％-60％，含0.1-0.5％硫酸銨，0.1％磷酸，pH為4.5-7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28-40℃條件下培養(yǎng)35-60小時(shí)；2)將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣；3)自上清液中蒸餾獲得酒精，自濾渣中提取麥角固醇。
在上述過程中，所述菌種的接種量為10％-40％，其中優(yōu)選的是20％-30％，最優(yōu)選的是25％。
所述培養(yǎng)基的還原糖為玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液或糖蜜。
所述在28-40℃條件下培養(yǎng)35-60小時(shí)，是指首先攪拌培養(yǎng)15-30小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)20-30小時(shí)。
為了使發(fā)酵的效果更好，所述接種的釀酒酵母工程菌ZHJM-1在接種之前，應(yīng)將斜面培養(yǎng)的菌種活化，培養(yǎng)為液體菌種，液體菌種經(jīng)過至少三級(jí)液體種子培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述的斜面菌種是將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于總糖含量為2-35％的麥芽汁固體斜面或YEPD固體斜面上，在28-40℃條件下培養(yǎng)20-72小時(shí)后，放入4℃冰箱保存。所述液體菌種是將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升總糖含量為8-35％的麥芽汁或YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28-40℃攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為液體菌種。所述至少三級(jí)液體種子培養(yǎng)是指一級(jí)液體種子培養(yǎng)，是將液體菌種按5-30％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量8-35％的糖化液的三角瓶中，于28-40℃攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；所述二級(jí)液體種子培養(yǎng)，是將一級(jí)種子培養(yǎng)液按5-30％的接種量接入裝有300升，總糖含量為10-35％的糖化液的種子培養(yǎng)罐，在28-40℃條件下攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；所述三級(jí)液體種子培養(yǎng)是將二級(jí)種子培養(yǎng)液按10-30％的接種量接入裝有3000升，總糖含量為10-35％的糖化液的種子培養(yǎng)罐，在28-40℃條件下攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
本發(fā)明的釀酒酵母工程菌ZHJM-1，具有耐高溫、耐高滲透壓、耐高濃度酒精、酵母細(xì)胞的麥角固醇含量高等特性。發(fā)酵成熟醪的酒精濃度達(dá)13％(v/v)以上，酵母細(xì)胞的麥角固醇含量達(dá)細(xì)胞干重的2％以上。這樣，通過一次發(fā)酵即可生產(chǎn)酒精和麥角固醇兩個(gè)產(chǎn)品。
本發(fā)明使用的發(fā)酵底物是普通的麥芽汁、淀粉糖化液或糖蜜等，只需調(diào)節(jié)其還原糖總含量，適當(dāng)添加硫酸銨和磷酸，即可進(jìn)行正常生產(chǎn)，方法簡(jiǎn)單，成本低廉。
本發(fā)明發(fā)酵周期短，正常發(fā)酵的溫度范圍較寬，該方法對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒精發(fā)酵廠的設(shè)備和條件均可生產(chǎn)，生產(chǎn)投資較少。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的酒精和麥角固醇與單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)的這兩種產(chǎn)品在質(zhì)量上無任何差異。本發(fā)明的方法實(shí)用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，易于推廣。由于一次發(fā)酵同時(shí)獲得兩個(gè)產(chǎn)品，所以投資少、見效快、效益高，具有很強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1、利用釀酒酵母工程菌ZHJM-1發(fā)酵生產(chǎn)酒精和麥角固醇，步驟如下1、斜面菌種將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于含有總糖含量為3％的麥芽汁固體斜面上，在30℃條件下培養(yǎng)70小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、液體菌種將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升，總糖含量為10％的麥芽汁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃攪拌條件下培養(yǎng)20小時(shí)，即為液體菌種；3、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按8％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量10％的玉米淀粉糖化液三角瓶中，于30℃攪拌條件下培養(yǎng)19小時(shí)，得到一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；4、二級(jí)液體種子培養(yǎng)將一級(jí)種子培養(yǎng)液按8％的接種量接入裝有300升總糖含量為15％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在30℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；5、三級(jí)液體種子培養(yǎng)將二級(jí)種子培養(yǎng)液按15％的接種量接入裝有3000升總糖含量為15％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在30℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
6、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是總還原糖濃度為35％的玉米淀粉糖化液，添加0.15％硫酸銨，0.1％磷酸，培養(yǎng)基的pH為5；7、發(fā)酵罐發(fā)酵將三級(jí)種子培養(yǎng)液按15％的接種量接入裝有2000升上一步配制的總糖含量為35％的玉米淀粉糖化液培養(yǎng)基中，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)28小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)28小時(shí)；8、按常規(guī)方法將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣(濾渣中80％以上為酵母細(xì)胞)；9、按工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)方法自上清液中蒸餾獲得酒精，自酵母菌細(xì)胞中提取麥角固醇。
實(shí)施例2本實(shí)施例的步驟與實(shí)施例1相同，只是對(duì)培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件做了適當(dāng)調(diào)整，其步驟如下1、斜面菌種將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于含有總糖含量為10％的YEPD固體斜面上，在35℃條件下培養(yǎng)50小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、液體菌種將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升，總糖含量為20％的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于35℃攪拌條件下培養(yǎng)18小時(shí)，即為液體菌種；3、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按18％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量18％的大米淀粉糖化液三角瓶中，于35℃攪拌條件下培養(yǎng)18小時(shí)，得到一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；4、二級(jí)液體種子培養(yǎng)將一級(jí)種子培養(yǎng)液按8％的接種量接入裝有300升總糖含量為20％的大米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)18小時(shí)，得到二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；
5、三級(jí)液體種子培養(yǎng)將二級(jí)種子培養(yǎng)液按15％的接種量接入裝有3000升總糖含量為20％的大米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)18小時(shí)，得到三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
6、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基是總還原糖濃度為45％的大米淀粉糖化液，添加0.25％硫酸銨，0.1％磷酸，培養(yǎng)基的pH為6；7、發(fā)酵罐發(fā)酵將三級(jí)種子培養(yǎng)液按20％的接種量接入裝有2000升上一步配制的總糖含量為45％的玉米淀粉糖化液培養(yǎng)基中，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)22小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)25小時(shí)；8、按常規(guī)方法將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣(濾渣中80％；以上為酵母細(xì)胞)；9、按工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)方法自上清液中蒸餾獲得酒精，自酵母菌細(xì)胞中提取麥角固醇。
實(shí)施例3利用釀酒酵母ZHJM-1發(fā)酵生產(chǎn)酒精和麥角固醇，步驟如下1、斜面菌種將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于含有總糖含量為20％的YEPD固體斜面上，在40℃條件下培養(yǎng)22小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、液體菌種將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升，總糖含量為33％的YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃攪拌條件下培養(yǎng)14小時(shí)，即為液體菌種；3、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按28％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量32％的大米淀粉糖化液三角瓶中，于38℃攪拌條件下培養(yǎng)14小時(shí)，得到一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；4、二級(jí)液體種子培養(yǎng)將一級(jí)種子培養(yǎng)液按8％的接種量接入裝有300升總糖含量為20％的大米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在38℃攪拌條件下，培養(yǎng)14小時(shí)，得到二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；5、三級(jí)液體種子培養(yǎng)將二級(jí)種子培養(yǎng)液按15％的接種量接入裝有3000升總糖含量為20％的大米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在38℃攪拌條件下，培養(yǎng)14小時(shí)，得到三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
6、四級(jí)液體種子培養(yǎng)將三級(jí)種子培養(yǎng)液按15％的接種量接入裝有30000升總糖含量為20％的大米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在38℃攪拌條件下，培養(yǎng)14小時(shí)，得到四級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
7、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基是總還原糖濃度為52％的甘薯淀粉糖化液，添加0.35％硫酸銨，0.1％磷酸，培養(yǎng)基的pH為4.5；8、發(fā)酵罐發(fā)酵將四級(jí)種子培養(yǎng)液按25％的接種量接入裝有2000升上一步配制的總糖含量為52％的甘薯淀粉糖化液培養(yǎng)基中，在35℃條件下攪拌培養(yǎng)15小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)20小時(shí)；9、按常規(guī)方法將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣(濾渣中80％以上為酵母細(xì)胞)；10、按工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)方法自上清液中蒸餾獲得酒精，自酵母菌細(xì)胞中提取麥角固醇。
實(shí)施例4利用釀酒酵母工程菌ZHJM-1發(fā)酵生產(chǎn)酒精和麥角固醇，步驟如下1、斜面菌種將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于含有總糖含量為35％的麥芽汁固體斜面上，在32℃條件下培養(yǎng)30小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、液體菌種將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升，總糖含量為35％的麥芽汁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于35℃攪拌條件下培養(yǎng)20小時(shí)，即為液體菌種；3、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按20％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量20％的玉米淀粉糖化液三角瓶中，于35℃攪拌條件下培養(yǎng)19小時(shí)，得到一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；4、二級(jí)液體種子培養(yǎng)將一級(jí)種子培養(yǎng)液按20％的接種量接入裝有300升總糖含量為20％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；5、三級(jí)液體種子培養(yǎng)將二級(jí)種子培養(yǎng)液按20％的接種量接入裝有3000升總糖含量為20％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
6、四級(jí)液體種子培養(yǎng)將三級(jí)種子培養(yǎng)液按20％的接種量接入裝有30000升總糖含量為20％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到四級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
7、五級(jí)液體種子培養(yǎng)將四級(jí)種子培養(yǎng)液按20％的接種量接入裝有300000升總糖含量為20％的玉米淀粉糖化液種子培養(yǎng)罐，在35℃攪拌條件下，培養(yǎng)19小時(shí)，得到五級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
8、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是總還原糖濃度為56％的甜菜糖蜜，1.0％的玉米水解液，添加0.1％硫酸銨，0.1％磷酸，培養(yǎng)基的pH為6；9、發(fā)酵罐發(fā)酵將五級(jí)種子培養(yǎng)液按26％的接種量接入裝有2000升上一步配制的培養(yǎng)基中，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)22小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)25小時(shí)；10、按常規(guī)方法將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣(濾渣中80％以上為酵母細(xì)胞)；11按工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)方法自上清液中蒸餾獲得酒精，自酵母菌細(xì)胞中提取麥角固醇。
權(quán)利要求
1.釀酒酵母工程菌ZHJM-1 CGMCC №0578。
2.一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，包括以下步驟1)將權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌ZHJM-1接種于總還原糖濃度為30％-60％，含0.1-0.5％硫酸銨，0.1％磷酸，pH為4.5-7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28-40℃條件下培養(yǎng)35-60小時(shí)；2)將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，分別收集上清液及濾渣；3)自上清液中蒸餾獲得酒精，自濾渣中提取麥角固醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述菌種的接種量為10％-40％，其中優(yōu)選的是20％-30％，最優(yōu)選的是25％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的還原糖為玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液或糖蜜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述在28-40℃條件下培養(yǎng)35-60小時(shí)，是指首先攪拌培養(yǎng)15-30小時(shí)，然后靜止培養(yǎng)20-30小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于在接種所述的釀酒酵母工程菌ZHJM-1之前，將斜面培養(yǎng)的菌種活化，培養(yǎng)為液體菌種，液體菌種經(jīng)過至少三級(jí)液體種子培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述的斜面菌種是將釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種接種于總糖含量為2-35％的麥芽汁固體斜面或YEPD固體斜面上，在28-40℃條件下培養(yǎng)20-72小時(shí)后，放入4℃冰箱保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述液體菌種是將保存的釀酒酵母工程菌ZHJM-1菌種活化后，接一環(huán)細(xì)胞于裝有150毫升總糖含量為8-35％的麥芽汁或YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28-40℃攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為液體菌種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種同時(shí)生產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法，其特征在于所述至少三級(jí)液體種子培養(yǎng)是指一級(jí)液體種子培養(yǎng)，是將液體菌種按5-30％的接種量接入裝有250毫升，總糖含量8-35％的糖化液的三角瓶中，于28-40℃攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為一級(jí)液體種子培養(yǎng)物；所述二級(jí)液體種子培養(yǎng)，是將一級(jí)種子培養(yǎng)液按5-30％的接種量接入裝有300升，總糖含量為10-35％的糖化液的種子培養(yǎng)罐，在28-40℃條件下攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；所述三級(jí)液體種子培養(yǎng)是將二級(jí)種子培養(yǎng)液按10-30％的接種量接入裝有3000升，總糖含量為10-35％的糖化液的種子培養(yǎng)罐，在28-40℃條件下攪拌培養(yǎng)14-20小時(shí)，即為三級(jí)液體種子培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種釀酒酵母工程菌ZHJM－1CGMCC № 0578以及一種用該釀酒酵母工程菌同時(shí)高產(chǎn)酒精和麥角固醇的方法,包括以下步驟:1．將釀酒酵母工程菌ZHJM－1接種于總還原糖濃度為30%－60%,含0.1－0.5%硫酸銨,0.1%磷酸,pH為4.5－7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28－40℃條件下培養(yǎng)35－60小時(shí);2．將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過濾,分別收集上清液及濾渣(其中80%以上為酵母細(xì)胞);3．自上清液中蒸餾獲得酒精,自酵母細(xì)胞中提取麥角固醇。
文檔編號(hào)C12N1/16GK1388243SQ0111852
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者張博潤(rùn), 何秀萍, 郭文潔, 董志揚(yáng), 楊克遷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所