專利名稱：一種用于同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)、尤其是致病菌的核酸檢測技術(shù)范疇。本發(fā)明涉及一套能夠同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針、它的序列、它的使用方法和它的用途。
由致病菌引起的疾病每年導(dǎo)致成千上萬人的死亡和無法估量的經(jīng)濟(jì)損失，因此，致病菌的快速、準(zhǔn)確檢測與鑒定是控制細(xì)菌性疾病發(fā)生及疾病診斷與治療的重要手段。現(xiàn)有的細(xì)菌檢測方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法及生化鑒定、免疫學(xué)方法，這些方法存在操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力、檢測效率低等缺點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)是近幾年來迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，利用它進(jìn)行細(xì)菌檢測具有快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)越性，也是將來檢測技術(shù)發(fā)展的方向?；蛐酒夹g(shù)檢測的基礎(chǔ)是設(shè)計一系列高靈敏度、高特異度、相互匹配的探針，固定在玻璃片等固相載體上，利用探針與樣品的雜交反應(yīng)，一次實(shí)驗(yàn)就可以確定樣品中細(xì)菌的種類，大大提高檢測效能，同時節(jié)省了人、財、物力(Anthony RM，Brown TJ and French GL.Rapid diagnosis ofbacteria by universal amplification of 23 S Ribosomal DNA followed byhybridization to an oligonucleotide array.J Clin Microbiol，2000，38781-788.)。
本發(fā)明涉及的寡核苷酸探針全部為自行設(shè)計，探針設(shè)計在細(xì)菌16srRNA基因的可變區(qū)，目前尚未見國內(nèi)外報道相同的序列及檢測細(xì)菌的范圍。
本發(fā)明的目的是提供一套用于同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針序列以及這套探針的使用方法和用途。這套探針特別適用于基于基因芯片原理(核酸雜交)的檢測技術(shù)，將全套探針或其中的一部分固定在玻璃片等固相載體上，即可成為用于不同檢測目的的基因芯片，能夠快速、準(zhǔn)確、高效地檢測出樣品中的細(xì)菌包括埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、弧菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬的細(xì)菌以及軍團(tuán)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌等。如果制備成相應(yīng)的試劑盒，可以廣泛應(yīng)用于臨床細(xì)菌性疾病的診斷、抗生素篩選、環(huán)境監(jiān)測與評價、食品衛(wèi)生監(jiān)督與檢疫、食物中毒快速檢測，以及細(xì)菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查研究等方面。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的這一套寡核苷酸探針設(shè)計在細(xì)菌16s rRNA基因的可變區(qū)，長度為20-28個堿基不等。每條探針的堿基序列可以與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致，也可以與16s rRNA基因上這一特定區(qū)域DNA負(fù)鏈的堿基序列一致。同一次雜交反應(yīng)中使用的所有探針上述一致性相同。
每條探針的堿基序列與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA負(fù)鏈的堿基序列一致為準(zhǔn)，本發(fā)明的整套探針的序列及其可以達(dá)到的檢測功能是1 gtacaaggcccgggaacgtattcacc 與所有真細(xì)菌雜交，用于檢測所有真細(xì)菌2 gacataaggggcatgatgatttgacgt 與革蘭氏染色陽性細(xì)菌雜交，用于檢測革蘭氏陽性細(xì)菌3 gtcgtaagggccatgatgacttgacgt 與革蘭氏染色陰性細(xì)菌雜交，用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌4 gtcatgaatcacaaagtggtaagcgc 與腸道細(xì)菌雜交，用于檢測腸道細(xì)菌5 acgacgcactttatgaggtccgcttg 與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌雜交，用于檢測這三屬細(xì)菌6 gctcctaaaaggttactccaccggct 用于檢測金黃色葡萄球菌的探針7 cgacggctagctccaaatggttactg 血漿凝固酶陰性葡萄球菌檢測探針8 cggctagctccaaaaggttactctag 血漿凝固酶陰性葡萄球菌檢測探針9 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于檢測肉毒梭狀芽孢桿菌的探針10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于檢測艱難梭菌的探針11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于檢測破傷風(fēng)梭菌的探針13 ccgaagttaagctacctacttcttttac用于檢測福氏志賀氏菌的探針14 gaaggttaagctacctacttcttttagc用于檢測宋內(nèi)志賀氏菌的探針
15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于檢測空腸彎曲菌的探針16 aggtcgccccttcgccgccctctgtatc用于檢測嗜肺軍團(tuán)桿菌的探針17 cgatccgaactgagaccggcttttaagg用于檢測結(jié)核分枝桿菌的探針18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于檢測普通變形桿菌的探針19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于檢測銅綠假單胞菌的探針20 actgagaatagttttatgggattagg 用于檢測單核增生李斯特氏菌的探針21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于檢測霍亂弧菌的探針22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于檢測河弧菌的探針23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于檢測副溶血性弧菌的探針24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌探針25 agattggctttaagagattagcttgccg用于檢測乙型溶血性鏈球菌的探針26 atccccaccttcctccagtt作為實(shí)驗(yàn)陽性對照的探針利用上述的整套探針或其一部分，可以通過雜交反應(yīng)對樣品中的相應(yīng)細(xì)菌進(jìn)行檢測。具有較高的靈敏度和特異性，尤其適用于基于基因芯片原理的檢測。在進(jìn)行基于基因芯片原理的檢測時，需要把探針全部或其中一部分用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ㄔ诠滔噍d體上(如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)，成為n×n排布的探針陣列，即為基因芯片。然后利用一對或多于一對的PCR引物擴(kuò)增待檢樣品中的細(xì)菌，選擇引物的要求是能夠擴(kuò)增出所有細(xì)菌的包含探針?biāo)趨^(qū)域的片段。在擴(kuò)增的同時引入熒光標(biāo)記或其它適宜的標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針檢測的靶，在一定條件下與基因芯片共保溫20分鐘至數(shù)小時，利用熒光掃描儀或相應(yīng)的其它檢測設(shè)備即可檢測到雜交信號。根據(jù)信號出現(xiàn)的位置可以判斷出細(xì)菌的種類。
除了基于基因芯片原理的檢測外，這套探針也可以用于基于反向斑點(diǎn)雜交檢測首先將探針固定在合適的載體上，再提取待檢細(xì)菌核酸，并對細(xì)菌的核酸進(jìn)行標(biāo)記，然后，將標(biāo)記好的核酸與載體上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，最后，通過合適的反應(yīng)進(jìn)行檢測。
實(shí)施例為了進(jìn)一步說明一套用于同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針的實(shí)現(xiàn)方法和用途，參照以下實(shí)施例進(jìn)行說明，實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
首先以采用玻璃片作為固相載體制備基因芯片為例，普通玻璃片使用前需要進(jìn)行醛基化處理以引入醛基基團(tuán)，市售的醛基化的玻璃片可以直接使用。每條寡核苷酸探針的3’端或者5’端需要進(jìn)行氨基化修飾，3’端的氨基化修飾可以在寡核苷酸合成開始時引入，5’端氨基化修飾可以合成后進(jìn)行。通過機(jī)械手打印、噴印或者手工點(diǎn)樣將探針點(diǎn)涂在玻璃片上，可以將26條探針點(diǎn)在一個3.5×3.0mm的區(qū)域內(nèi)，形成6×5陣列，點(diǎn)之間的距離為0.5mm。探針末端的氨基與玻璃片上的醛基結(jié)合使得探針固定在玻璃片上。點(diǎn)好的玻片置于低溫干燥處，放置過夜。然后，為了封閉玻璃片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基，按照以下程序?qū)ΣＦM(jìn)行處理0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗2次，每次5min；純水(25℃)洗2次，每次5min；純水(95℃)洗1次，洗2min，涼至室溫；迅速將玻片放入封閉液洗(1.3g硼氫化鈉溶在375ml磷酸緩沖液中，再向溶液加入125ml無水乙醇)10min；0.2％SDS(25℃)洗3次，每次1min；純水(25℃)洗2次，每次1min；玻片自然干燥，立即投入使用。
第二步是通過PCR制備基因芯片檢測的靶序列。引物選擇在細(xì)菌的16s rRNA基因的保守區(qū)，其擴(kuò)增的區(qū)域包含探針?biāo)诘膮^(qū)域。利用經(jīng)過熒光標(biāo)記的上游引物5′AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3′和非標(biāo)記的下游引物5′AGG AGG TGA TCC AAC CGC A 3′擴(kuò)增待檢樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為370bp，不需要進(jìn)行產(chǎn)物的純化，取1μl與4μl雜交液(6×SSC，0.2％SDS，5×Denhardt’s，10μg/ml鮭魚精DNA)混合，加熱到98℃變性5min，然后迅速置于冰上，5min后取出混合液2μl，點(diǎn)在探針陣列區(qū)域，小心地蓋上蓋玻片，注意蓋玻片與載玻片之間不可留有氣泡。放入雜交盒，向盒內(nèi)加入10μl 3×SSC以保持濕度。擰緊雜交盒的螺絲，放入55℃水浴鍋內(nèi)雜交1h。取出雜交盒，拿出玻片，立即投入1×SSC(0.2％SDS)洗30s，再投入雜交液0.1×SSC(0.2％SDS))洗30s，最后在0.1×SSC中洗10s，并在空氣中干燥。
第三步是芯片檢測與結(jié)果分析，采用ScanArray 3000芯片檢測儀，選擇需要的區(qū)域進(jìn)行掃描，一般掃描1-2次。最后利用Imagene4.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析、處理。根據(jù)信號出現(xiàn)的位置可以判斷出細(xì)菌的種類，達(dá)到檢測的目的。
權(quán)利要求
1.一套用于同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針，在一定的使用條件下，能夠檢測出實(shí)驗(yàn)樣品中的細(xì)菌及其種類，其特征在于探針的序列、探針的使用方法及用途三個方面。
2.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，探針設(shè)計在細(xì)菌16s rRNA基因的可變區(qū)，長度為20-28個堿基不等。每條探針的堿基序列可以與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致，也可以與16s rRNA基因上這一特定區(qū)域DNA負(fù)鏈的堿基序列一致。同一次雜交反應(yīng)中使用的所有探針上述一致性相同。
3.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，以每條探針的堿基序列與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA負(fù)鏈的堿基序列一致為準(zhǔn)，本發(fā)明的整套探針的序列及其可以達(dá)到的檢測功能是1 gtacaaggcccgggaacgtattcacc 與所有真細(xì)菌雜交，用于檢測所有真細(xì)菌2 gacataaggggcatgatgatttgacgt 與革蘭氏染色陽性細(xì)菌雜交，用于檢測革蘭氏陽性細(xì)菌3 gtcgtaagggccatgatgacttgacgt 與革蘭氏染色陰性細(xì)菌雜交，用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌4 gtcatgaatcacaaagtggtaagcgc 與腸道細(xì)菌雜交，用于檢測腸道細(xì)菌5 acgacgcactttatgaggtccgcttg 與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌雜交，用于檢測這三屬細(xì)菌6 gctcctaaaaggttactccaccggct 用于檢測金黃色葡萄球菌的探針7 cgacggctagctccaaatggttactg 血漿凝固酶陰性葡萄球菌檢測探針8 cggctagctccaaaaggttactctag 血漿凝固酶陰性葡萄球菌檢測探針9 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于檢測肉毒梭狀芽孢桿菌的探針10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于檢測艱難梭菌的探針11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于檢測破傷風(fēng)梭菌的探針13 ccgaagttaagctacctacttcttttac用于檢測福氏志賀氏菌的探針14 gaaggttaagctacctacttcttttagc用于檢測宋內(nèi)志賀氏菌的探針15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于檢測空腸彎曲菌的探針16 aggtcgccccttcgccgccctctgtatc用于檢測嗜肺軍團(tuán)桿菌的探針17 cgatccgaactgagaccggcttttaagg用于檢測結(jié)核分枝桿菌的探針18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于檢測普通變形桿菌的探針19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于檢測銅綠假單胞菌的探針20 actgagaatagttttatgggattagg 用于檢測單核增生李斯特氏菌的探針21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于檢測霍亂弧菌的探針22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于檢測河弧菌的探針23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于檢測副溶血性弧菌的探針24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的探針25 agattggctttaagagattagcttgccg用于檢測乙型溶血性鏈球菌的探針26 atccccaccttcctccagtt作為實(shí)驗(yàn)陽性對照的探針
4.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致的探針與上述的26條探針檢測功能一致，堿基序列分別反向互補(bǔ)。
5.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，利用上述的整套探針或其一部分，可以通過雜交反應(yīng)對樣品中的相應(yīng)細(xì)菌進(jìn)行檢測。具有較高的靈敏度和特異度，尤其適用于基于基因芯片原理的檢測。
6.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，利用上述的整套探針，可以同時檢測區(qū)分的細(xì)菌有埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、弧菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬的細(xì)菌以及軍團(tuán)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌等。
7.根據(jù)專利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于，這一套寡核苷酸探可以用于臨床疾病診斷、抗菌素篩選、環(huán)境檢測與評價、食品衛(wèi)生監(jiān)督與檢疫、食物中毒快速檢測、細(xì)菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查。
全文摘要
一套用于同時檢測多種細(xì)菌的寡核苷酸探針，屬于微生物檢測領(lǐng)域。探針設(shè)計在16s rRNA基因的可變區(qū)，具有較高的靈敏度和特異性，尤其適用于基于基因芯片原理的檢測。在一定的使用條件下可以同時檢測埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、弧菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、軍團(tuán)桿菌、銅綠假單胞菌等14個種屬的細(xì)菌?？捎糜诩膊≡\斷、抗菌素篩選、環(huán)境檢測、食物中毒檢測、細(xì)菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號C12Q1/68GK1396269SQ01120290
公開日2003年2月12日 申請日期2001年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月16日
發(fā)明者李君文, 靳連群, 晁福寰, 鄭金來, 王升啟, 王新為 申請人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所