專利名稱：丙烯甲烷共氧化制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用甲烷氧化細(xì)菌催化丙烯甲烷共氧化反應(yīng)制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法。
環(huán)氧化物是有機(jī)合成中的重要原料，作為許多化合物的前體大規(guī)模地應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)，運(yùn)用生物技術(shù)合成環(huán)氧化物尤其是光學(xué)活性環(huán)氧化物是有機(jī)合成中一個(gè)極富挑戰(zhàn)性的課題(D.J.Leak，P.J.Aikens，M.Seyed-Mahmoudian.Themicrobial production of epoxides Trends Biotechnology，1992，10(7)256-261)。目前，環(huán)氧化物主要采用氯醇法和過氧化物法合成。這些方法均為多步反應(yīng)過程，存在副產(chǎn)物多，廢水處理昂貴等缺點(diǎn)。生物酶是一種獨(dú)特的有機(jī)合成催化劑。生物催化具有反應(yīng)條件溫和，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。廣泛存在于自然界中的甲烷氧化細(xì)菌(Methanotrophic bacteria)是一類以甲烷為唯一碳源和能源生長的細(xì)菌，能利用依賴輔酶NADH的甲烷單加氧酶(Methane Monoxygenase，MMO)活化分子氧，催化烷烴羥基化和烯烴環(huán)氧化反應(yīng)。
作為環(huán)氧化物合成的一條嶄新途徑，該催化過程可以利用空氣中的分子氧實(shí)現(xiàn)烯烴的直接環(huán)氧化；但由于在丙烯環(huán)氧化制備環(huán)氧丙烷的生物催化反應(yīng)過程中，隨著產(chǎn)物環(huán)氧丙烷的積累和輔酶NADH的消耗，細(xì)胞會(huì)很快失去活性，這成為進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)所要解決的首要問題。通過將環(huán)氧化產(chǎn)物不斷抽提出來，可以解決環(huán)氧化產(chǎn)物對細(xì)胞的毒副作用。對僅由能量短缺導(dǎo)致失活的細(xì)胞，外源性電子給體的加入可使細(xì)胞獲得再生；高燦柱(高燦柱，李樹本，寧治中等，分子催化，1990，4，291；高燦柱，李樹本，寧治中等，分子催化，1991，5，227)曾報(bào)道甲烷是Methylomonas sp.GYJ3細(xì)胞最好的再生劑。但高燦柱進(jìn)行的是將細(xì)胞環(huán)氧化與甲烷再生反應(yīng)交替進(jìn)行的間歇式反應(yīng)，環(huán)氧化連續(xù)反應(yīng)仍無法進(jìn)行。曾報(bào)道與丙烯等體積存在的甲烷可明顯抑制甲烷氧化細(xì)菌的環(huán)氧化活性(Ching T.hou，Ramesh Patel，Allen I.Laskin Microbial Oxidation ofGaseous hydrocarbonsEpoxidation of C2 to C4 n-Alkenes by MethylotrophicBacteria Applied and Environmental Microbiology，July 1976，127-134)。
本發(fā)明的目的在于解決上述問題而提出一種以甲烷利用菌為催化劑，催化丙烯甲烷共氧化反應(yīng)連續(xù)制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法。
本發(fā)明的目的可由如下措施實(shí)現(xiàn)首先對甲基單胞菌Methylomonas sp.GYJ3進(jìn)行培養(yǎng)，然后將收獲的細(xì)胞用含有磷酸鹽的緩沖溶液懸浮，充入含有丙烯、甲烷和空氣的混合氣體啟動(dòng)反應(yīng)，32-40攝氏度、150-200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)一定時(shí)間后得到含有產(chǎn)物環(huán)氧丙烷的水溶液。
下式是由甲烷氧化細(xì)菌中甲烷單加氧酶催化完成的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)。隨反應(yīng)的進(jìn)行， 由于還原型輔酶NADH的不斷消耗和體系中的毒性產(chǎn)物環(huán)氧丙烷的積累導(dǎo)致細(xì)胞很快失活。甲烷作為甲烷氧化細(xì)菌的天然底物，可以通過以下途徑再生出還原型輔酶NADH，為反應(yīng)體系提供還原能量。 (注NADH2，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；PQQ，氧化型吡咯并喹啉醌；PQQH2，還原型吡咯并喹啉醌；)本發(fā)明將甲烷與丙烯按一定比例混合，實(shí)現(xiàn)了在環(huán)氧化反應(yīng)的同時(shí)輔酶NADH的原位再生，解決了甲烷氧化細(xì)菌催化丙烯環(huán)氧化制備環(huán)氧丙烷的關(guān)鍵性問題。
丙烯甲烷共氧化制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法，其特征在于采用甲烷作為輔助底物，與一定比例的丙烯混合，在甲烷氧化細(xì)菌細(xì)胞存在下，32-40攝氏度、150-220轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷。
本發(fā)明采用的甲烷氧化細(xì)菌Methylomonas sp.GYJ3的濃度為2-30毫克/毫升。
本發(fā)明采用的丙烯和甲烷的體積比為1∶0.5-1∶1.5。
本發(fā)明采用的反應(yīng)介質(zhì)為含有50-100毫摩爾/升的磷酸氫二鈉，50-100毫摩爾/升的磷酸二氫鈉，5毫摩爾/升的氯化鎂的磷酸鹽緩沖溶液，ph＝6.5-6.9。
本發(fā)明采用的反應(yīng)溫度為32-40攝氏度，轉(zhuǎn)數(shù)為150-220轉(zhuǎn)/分鐘。
本發(fā)明有如下特點(diǎn)a 采用生物催化的方法在溫和的條件下以丙烯、甲烷為底物反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷；b 采用一定比例的丙烯甲烷混合氣體同時(shí)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了輔酶NADH的原位再生，使反應(yīng)得以連續(xù)進(jìn)行，解決了甲烷間歇式再生導(dǎo)致反應(yīng)無法連續(xù)進(jìn)行的問題。
c 采用甲烷作為外源性電子給體，與甲酸鈉等相比，反應(yīng)成本更低廉，而且不用間斷反應(yīng)，更符合將來工業(yè)化的要求。
現(xiàn)進(jìn)一步通過最佳實(shí)施例來闡述發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式。
實(shí)施例1培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌Methylomonas sp.GYJ3，收獲后離心，將其添加到20毫升含有下列成分的反應(yīng)液的100毫升錐形瓶中，甲烷氧化細(xì)菌Methylomonassp.GYJ3的細(xì)胞在該反應(yīng)液中的濃度為2-30毫克/毫升濃度為50-100毫摩爾/升的磷酸氫二鈉，濃度為50-100毫摩爾/升的磷酸二氫鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂，ph＝6.5-6.9。其中一個(gè)瓶子密封后抽出60毫升空氣，加入20毫升丙烯和20毫升氧氣，用氮?dú)馄胶馐Ｓ嗟臍庀?，作為對照；另一個(gè)瓶子密封后抽出空氣60毫升，加入20毫升丙烯、20毫升氧氣和10毫升甲烷，用氮?dú)馄胶馐Ｓ嗟臍庀啵?2攝氏度，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床反應(yīng)；環(huán)氧化物的檢測和定量分析在氣相色譜儀上進(jìn)行。每隔1小時(shí)用注射器抽取0.5毫升反應(yīng)液，8000轉(zhuǎn)/分鐘，4分鐘，取上清。色譜條件為SE-54彈性石英毛細(xì)管柱(25m×0.25mm i.d.)，載氣N2，檢測器氫火焰，分流進(jìn)樣。進(jìn)樣器、檢測器溫度分別控制在180攝氏度、200攝氏度，柱溫60攝氏度，進(jìn)樣體積1微升，外標(biāo)法定量。結(jié)果如表1所示
比較發(fā)現(xiàn)，丙烯∶甲烷＝1∶0.5(V/V)混合充入反應(yīng)體系時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌的環(huán)氧化活性被輕微激活。
實(shí)施例2其它同實(shí)施例1，僅將丙烯甲烷比例改為1∶1；32攝氏度，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床反應(yīng)，每次批式反應(yīng)5-7小時(shí)，反應(yīng)完畢后，離心分離產(chǎn)物，回收細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行下一批反應(yīng)。每隔1小時(shí)從密封的反應(yīng)瓶中取0.5毫升細(xì)胞液，離心后得上清液，用氣相色譜檢測產(chǎn)物環(huán)氧丙烷，然后比較其產(chǎn)量變化趨勢。結(jié)果見表2
比較發(fā)現(xiàn)，丙烯∶甲烷＝1∶1(V/V)混合充入反應(yīng)體系時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌的環(huán)氧化活性被較大程度激活。
實(shí)施例3其它同實(shí)施例1，僅將丙烯甲烷比例改為1∶1.5，32攝氏度，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床反應(yīng)，每次批式反應(yīng)5-7小時(shí)，反應(yīng)完畢后，離心分離產(chǎn)物，回收細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行下一批反應(yīng)。每隔1小時(shí)從密封的反應(yīng)瓶中取0.5毫升細(xì)胞液，離心后得上清液，用氣相色譜檢測產(chǎn)物環(huán)氧丙烷，然后比較其產(chǎn)量變化趨勢。結(jié)果見表3
比較發(fā)現(xiàn)，丙烯∶甲烷＝1∶1.5(V/V)混合充入反應(yīng)體系時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌的環(huán)氧化活性被最大程度激活。
實(shí)施例4其它同實(shí)施例1，僅將丙烯甲烷比例改為1∶2，32攝氏度，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床反應(yīng)，每隔1小時(shí)從密封的反應(yīng)瓶中取0.5毫升細(xì)胞液，離心后得上清液，用氣相色譜檢測產(chǎn)物環(huán)氧丙烷，然后比較其產(chǎn)量變化趨勢。結(jié)果見表4
比較發(fā)現(xiàn)，丙烯∶甲烷＝1∶2(V/V)混合充入反應(yīng)體系時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌的環(huán)氧化活性被較大程度抑制。
權(quán)利要求
1.一種丙烯甲烷共氧化制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法，其特征在于以甲烷利用菌Methylomonas sp.GYJ3作為催化劑，以丙烯甲烷混合氣體作為反應(yīng)底物，在反應(yīng)介質(zhì)存在下，32-40攝氏度、150-220轉(zhuǎn)/分鐘條件下反應(yīng)得到環(huán)氧丙烷，同時(shí)實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的原位再生。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該反應(yīng)中丙烯和甲烷的體積比為1∶0.5-1∶1.5。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于反應(yīng)介質(zhì)為含有濃度為50-100毫摩爾/升的磷酸二氫鈉，濃度為50-100毫摩爾/升的磷酸氫二鈉，濃度為5毫摩爾/升的氯化鎂組成的磷酸鹽緩沖溶液，ph＝6.5-6.9。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于Methylomonas sp.GYJ3的濃度為2-30毫克/毫升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用一定比例的丙烯甲烷共氧化制備環(huán)氧丙烷的生物催化方法。采用甲烷利用菌Methylomonas sp.GYJ3作為催化劑,在同一催化體系中同時(shí)充入一定比例的丙烯和甲烷作為反應(yīng)底物,解決了由于體系中輔酶NADH的消耗而導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低,間歇式再生或添加其它外源電子給體所造成反應(yīng)無法連續(xù)進(jìn)行的問題,實(shí)現(xiàn)了輔酶NADH在反應(yīng)體系中的原位再生。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1328161SQ0112138
公開日2001年12月26日 申請日期2001年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月11日
發(fā)明者崔俊儒, 辛嘉英, 陳建波, 夏春谷, 李樹本 申請人:中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所