專(zhuān)利名稱(chēng)：脂肪酸去飽和酶基因,含該基因的載體,用該基因轉(zhuǎn)化的植物,以及產(chǎn)生該植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼對(duì)在Δ9位置上與脂相連的脂肪酸具有去飽和活性(以后稱(chēng)為“Δ9去飽和”)的蛋白質(zhì)的基因，含有該基因的載體，用該基因轉(zhuǎn)化的植物及產(chǎn)生該植物的方法。
背景技術(shù)：
構(gòu)成有機(jī)體生物膜的膜脂的狀態(tài)隨著外界溫度下降而由液晶態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)。這個(gè)改變稱(chēng)為“相分離”。相分離涉及生物膜特性的變化。據(jù)信膜脂在固態(tài)時(shí)喪失物質(zhì)透性選擇力，這樣使生物膜不能發(fā)揮其基本功能，從而使細(xì)胞受到損傷(低溫?fù)p傷)。
膜脂相轉(zhuǎn)變的溫度——在該溫度下膜脂由液晶態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，主要取決于與脂相連的脂肪酸?；牟伙柡统绦?碳鏈中雙鍵的數(shù)目)。與之相連的二個(gè)脂肪酸酰基團(tuán)都是飽和脂肪酸殘基的脂類(lèi)分子其相轉(zhuǎn)換溫度高于室溫，而與之相連的脂肪酸?；鶊F(tuán)至少帶有一個(gè)雙鍵的脂類(lèi)分子的相轉(zhuǎn)換溫度則低于0℃(Santaren，J.F.等，Biochim.Biophys.Acta，687231，1982)。
通常一個(gè)脂肪酸中的雙鍵位置從羧基末端碳原子數(shù)至出現(xiàn)該雙鍵處碳原子并以數(shù)標(biāo)示在符號(hào)Δ之后。總的雙鍵數(shù)目置于總碳原子數(shù)之后并用冒號(hào)分開(kāi)。例如亞麻酸記為182Δ9，12，可用相列結(jié)構(gòu)式代表CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH在某些情況下，雙鍵位置從脂肪酸甲基端碳原子數(shù)至有雙鍵碳原子處并以數(shù)標(biāo)示在符號(hào)ω之后。
在高等植物的膜脂中只有磷脂酰甘油(PG)含有相對(duì)大量的飽和分子，這就強(qiáng)烈暗示PG的相轉(zhuǎn)換導(dǎo)致植物低溫?fù)p傷(Murata，N.等，PlantCell Physiol.231071，1982；Roughan P.G.，PlantPhysiol.，77740，1985)，而PG的分子組成則取決于存在于葉綠體中的甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(以下稱(chēng)為ATase)的特異性底物。(Frentzen，M.等，Eur.J.Biochem.，129629，1983；Murata，N.，Plant Cell Physiol.，2481，1983；Frentzen，M.等，Plant Cell Physial.，281195，1988)。
Nishizawa等實(shí)驗(yàn)顯示，把從一種抗凍植物擬南芥菜(Arabidopsisthaliana)中獲得的ATase基因引入煙草并表達(dá)，PG中飽和類(lèi)分子含量下降，因而賦予植株較其野生型具有更高的抗寒凍性(PCT/JP92/00024，1992)。然而植物本身也有ATase，即使在外源ATase大量表達(dá)時(shí)仍不可避免地與內(nèi)源ATase產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，從而使得這些外源ATase的效應(yīng)被減弱。例如，煙草轉(zhuǎn)化體表達(dá)擬南芥菜ATase最多的一個(gè)克隆的葉中PG的飽和分子含量為28％，這比煙草野生型低8％，但卻比擬南芥菜野生型高8％(PCT/JP92/00024，1992)。
在質(zhì)體中產(chǎn)生的多數(shù)酰基-ACP通常包括16∶0-ACP及18∶1-ACP，據(jù)信它們的比例相等。在某些組織中，16∶0-ACP及18∶0-ACP的比例高于18∶1-ACP的比例(Toriyama，S.等，Plant CellPhysial.，29615，1988)。在這些組織中，很難通過(guò)運(yùn)用外源ATase酶使飽和類(lèi)分子品種含量下降至滿(mǎn)意的水平。
光合蘭細(xì)菌(藍(lán)綠藻)的膜脂組成與構(gòu)成高等植物葉綠體膜系統(tǒng)的脂類(lèi)相似(Murata，N.等，in the“The Biochemistry ofPlants”，Academic Press，1987)。在藍(lán)綠藻中，與膜脂相連的脂肪酸的不飽和程度是由具有使這些脂相連脂肪酸去飽和能力的酶類(lèi)所控制。目前已知僅能向脂相連的脂肪酸中引入一個(gè)雙鍵的構(gòu)巢組囊藻(Anacystis nidulans)(聚球藻(Synechococcus)PCC 7942)對(duì)寒凍敏感(Ono，T.等，Plant Physiol.，67179，1981)，而至少能引入兩個(gè)雙鍵的集胞藻(Synechocystis)PCC 6803則對(duì)寒凍有抗性(Wada，H.等，Plant Cell Physiol.，30971，1898)。
藍(lán)綠藻中所有脂肪酸的去飽和酶均以脂類(lèi)為其底物通過(guò)與底物反應(yīng)將雙鍵引入到脂相連的脂肪酸中。因此，由16∶0/16∶0-及18∶0/16∶0等飽和分子品種組成的藍(lán)綠藻膜脂中的PG、SQDG、MGDG、DGDG之類(lèi)脂肪酸分子中可以被引入順式雙鍵(Murata，N.等，在“TheBiochemistry of Plants”，Academic Press，1987)。在這方面，高等植物與藍(lán)綠藻有著很大的差別，它們所具有的脂肪酸去飽和酶能在硬脂酰-ACP(18∶0-ACP)的Δ9位置引入雙鍵卻不能在合成的由16∶0/16∶0(及少量的18∶0/16∶0-)等飽和分子品種組成的PG或SQDG中引入雙鍵。
目前已知在構(gòu)巢組囊藻(Anacystis nidulans)中引入并表達(dá)集胞藻屬(Synechocystis)PCC 6803的Δ12去飽和酶基因能產(chǎn)生非構(gòu)巢組囊藻內(nèi)源存在的16∶2Δ9，12，從而賦予對(duì)寒凍敏感的構(gòu)巢組囊藻(Anacystis nidulans)以對(duì)寒凍的抗性(Wada，H.等，Nature，347200，1990)。
迄今由藍(lán)綠藻中所獲得的去飽和酶基因有Δ6去飽和酶(Reddy，A.S.等，Plant Mol.Biol.，27293，1993)及Δ12去飽和酶(Wada，H.等，Mature，347200，1990)基因。然而，Δ6和Δ12去飽和酶不能分別地在脂肪酸Δ6和Δ12位置上去飽和，除非在其Δ9位置上引入一個(gè)雙鍵。而且，只有Δ9及Δ12位置上脂肪酸去飽和之后，Δ15去飽和酶才能使該脂肪酸在Δ15位上發(fā)生去飽和。因此，一旦將能在Δ9位置使脂肪酸去飽和的酶類(lèi)基因引入到高等植物并使之表達(dá)，它們應(yīng)該能夠降低高等植物中飽和分子品種的含量從而授予高等植物抗寒凍性。然而能在Δ9位使飽和脂肪酸去飽和的酶類(lèi)基因至今還沒(méi)有得到。
所以，本發(fā)明的目的之一是提供在Δ9位置具有飽和脂肪酸去飽和化能力的酶類(lèi)基因及含有上述基因部分的多核苷酸。
另一目的即是提供含有在飽和脂肪酸Δ9位置上具有去飽和能力的酶類(lèi)基因的載體或含有該基因部分的多核苷酸的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供由Δ9位去飽和酶基因或含有該基因部分的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞及植株。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明者們由于通過(guò)不同的研究實(shí)現(xiàn)了上述目標(biāo)，他們成功地從組囊藻(Anacystis)屬的藍(lán)綠藻基因組DNA中克隆了編碼Δ9去飽和酶基因，獲得了整合該基因的載體DNA，并以這種載體DNA轉(zhuǎn)化了植物細(xì)胞，而且還使細(xì)胞分化以再生植株，這樣賦予植物以抗寒凍性。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明主要內(nèi)容如下(1)基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有在Δ9位置使脂相連脂肪酸去飽和化的活性。(2)在(1)中所述基因或含有部分該基因的多核苷酸，其中蛋白質(zhì)具有在Δ9位置使脂相連的脂肪酸去飽和活性，含有基本上如SEQ ID No.4中所示的氨基酸序列。(3)在(1)所述基因或含有部分該基因的多核苷酸，其中編碼具有能在Δ9位置使脂相連的脂肪酸去飽和化的蛋白質(zhì)的基因是含有SEQ IDNo.3所示堿基序列的DNA鏈。(4)含有按照(1)-(3)項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的基因或包括部分該基因的多核苷酸的載體。(5)用(1)-(3)中任何一項(xiàng)所述的基因或包括部分該基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。(6)一種通過(guò)(5)中所述植物細(xì)胞分化而再生植株的創(chuàng)制方法。(7)用(1)-(3)中任何一項(xiàng)所說(shuō)的基因或包括其部分基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示des 9 var片段編碼氨基酸序列與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶(NSCD2)的氨基酸序列的比較。在圖1中，表明兩個(gè)序列中有相同的氨基酸；說(shuō)明兩個(gè)序列中有著性質(zhì)相似的氨基酸；X則表示有高度同源性。
圖2是一個(gè)以des 9 var片段作探針的構(gòu)巢組囊藻基因組DNA在Southern分析中的放射自顯影的電泳圖。
圖3表示插入的DNA片段λ5，λ15及p15X之間的關(guān)系。粗箭頭表示蛋白質(zhì)的編碼位置及方向。細(xì)箭頭表示測(cè)序位置及方向。
圖4顯示des 9 nid片段編碼氨基酸序列與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶(MSCD2)氨基酸序列的比較。比較方式與圖1相同。
圖5中兩幅照片顯示了在轉(zhuǎn)化煙草植株低溫處理后對(duì)其生物學(xué)形態(tài)的影響。左圖表示為用去飽和酶基因轉(zhuǎn)化煙草低溫處理后結(jié)果，右圖表示的是用pBI 121轉(zhuǎn)化煙草低溫處理后結(jié)果。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在背景說(shuō)明中已提及本發(fā)明的Δ9去飽和酶是在藍(lán)綠藻中內(nèi)源存在的一種酶。Δ9去飽和酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)與小鼠(Kaestner，K.H.等，J.Biol.Chem.，26414755，1989)、大鼠(Mihora，K.，J.Biochem.，1081022，1990)及酵母(Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.，26520144，1990)等的硬脂酰-輔酶A去飽和酶有局部相似之處，但作整體看則差別很大。而且它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知的能在Δ6、Δ12對(duì)脂相連脂肪酸有去飽和能力的藍(lán)綠藻酶類(lèi)及有同樣功能的在ω3位去飽和的高等植物酶類(lèi)(Yadav，N.S.等，Plant physiol.，103467，1993)相比則全然不同。在這里本發(fā)明的基因是從天然原料中得到，而藍(lán)綠藻可作為原材料。所用藍(lán)綠藻包括組囊藻屬，集胞藻屬及魚(yú)腥藻(Anabaena)屬等但并不僅限于這幾屬。為使高等植物中飽和分子去飽和化，基于以下原因傾向使用組囊藻型Δ9去飽和酶(Murata，N.等，Plant Cell Physiol.，33933，1992，屬于組囊藻屬的I型藍(lán)綠藻，而不使用魚(yú)腥藻及集胞藻型去飽和酶。
集胞藻PCC 6803及多變魚(yú)腥藻(Anabaena variabilis)中幾乎所有的膜脂上sn-1及sn-2位置均分別地被18碳原子(C18)及16碳原子(C16)的脂肪酸所占有(Sato，N.等，Biochim.Biophys.Acto，710279，1982；Wada，H.等，Plant Cell Physiol.，30971，1989)。另一方面，構(gòu)巢組囊藻中幾乎所有膜脂的sn-1及sn-2位置都由C16所占有(Bishop，D.G.等，Plant Cell Physiol.，271593，1986)。因此，可以相信魚(yú)腥藻及集胞藻中Δ9去飽和酶具有以18∶0/16∶0分子品種為底物使sn-1位置上18∶0。去飽和成為18∶1Δ9的反應(yīng)活性，而組囊藻中Δ9去飽和酶則具有以16∶0/16∶0分子品種為底物使sn-1位置上16∶0去飽和成為16∶1Δ9的反應(yīng)活性?？紤]到高等植物含有大量的16∶0/16∶0類(lèi)飽和分子品種，那么以去飽和高等植物中飽和分子品種為目的則選取組囊藻(Anacystis)型Δ9去飽和酶比選取魚(yú)腥藻及集胞藻型Δ9去飽和酶更為合適。
以下實(shí)例將顯示本發(fā)明的基因包括編碼含有基本上如SEQ ID No4中所示的氨基酸序列的Δ9去飽和酶基因以及除簡(jiǎn)并密碼子以外的能編碼同一多肽片段的簡(jiǎn)并異構(gòu)體。本發(fā)明中基因主要是用DNA鏈形式?；旧显赟EQ ID No4展示的氨基酸序列不僅包括在SEQ ID No4中所展示的氨基酸序列，而且也包括上述序列經(jīng)過(guò)部分刪除、替換及增補(bǔ)等修飾之后所產(chǎn)生的而仍保留有Δ9去飽和酶活性的序列。
本發(fā)明的基因可從前述的藍(lán)綠藻細(xì)胞用已知任何常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。
制備本發(fā)明基因的過(guò)程簡(jiǎn)述如下培養(yǎng)藍(lán)綠藻細(xì)胞，收集細(xì)胞，用常規(guī)的已知技術(shù)如乙醇沉淀或其他方法制備基因組DNA，以基因組DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建基因文庫(kù)，從文庫(kù)中選擇目的基因的克隆并使之?dāng)U增。
用于構(gòu)建基因文庫(kù)的載體包括任何常規(guī)載體特例的包括噬菌體例如λDASH II(Stratagene)，噬菌體柯斯質(zhì)粒如PWE 15，(Stratagene)，噬菌體質(zhì)粒如pBluesoipt II(Stratagene)等。本發(fā)明的基因可用針對(duì)某一載體特定類(lèi)別的常規(guī)方法引入到這些載體中。
本發(fā)明所引入的基因的克隆即從如此制備的基因文庫(kù)中篩選獲得。
篩選克隆的方法包括任何已知的常規(guī)方法，如噬斑雜交和菌落雜交，運(yùn)用抗體的免疫學(xué)篩選法以及運(yùn)用核苷酸探針的噬菌斑雜交法及菌落雜交法。核苷酸探針選擇法的優(yōu)化準(zhǔn)則是所選用探針的部分堿基序列經(jīng)估測(cè)應(yīng)與本發(fā)明基因序列相似(例如，圖1中所示編碼MSCD2中260-295處氨基酸序列的堿基序列)。
本發(fā)明在選得的克隆中基因的堿基序列可用常規(guī)的Maxam-Gilbert方法(Maxam-Gilbert，Methods Enzymol.，65499，1980)及應(yīng)用M13噬菌體的雙脫氧鏈終止法(Massing，J.等，Gene，19269，1982)進(jìn)行確定和證實(shí)。
Δ9去飽和酶的實(shí)際表達(dá)可以用例如Wada等(J.Bacteriol.，1756056，1993)法加以證實(shí)。
本發(fā)明基因一旦測(cè)序，就可以用商業(yè)上能得到的DNA合成儀采用任何一種已知的常規(guī)方法例如亞磷酸酯方法進(jìn)行合成。
具有Δ9去飽和酶活性的本發(fā)明基因或含有基因部分片段的多核苷酸可從篩選所得的克隆中分離，整合進(jìn)到欲引入宿主植物的載體，把該載體引入植物細(xì)胞并在植株中表達(dá)Δ9去飽和酶，從而賦予植株抗寒凍性。
引入基因的植物種類(lèi)無(wú)特別限制。
為引入基因所構(gòu)建的載體應(yīng)適合于Δ9去飽和酶基因在植物中穩(wěn)定地表達(dá)。更準(zhǔn)確地說(shuō)，啟動(dòng)子、編碼翻譯調(diào)控區(qū)的DNA序列、編碼轉(zhuǎn)移至葉綠體處肽的DNA序列、具備Δ9去飽和酶活性的本發(fā)明基因或含有基因部分的多核苷酸、編碼終止密碼子及一個(gè)終止子的DNA序列，它們均需整合至適當(dāng)?shù)奈恢?。在?gòu)建導(dǎo)入除本發(fā)明的基因以外的基因各種元件時(shí)可應(yīng)用任何常規(guī)的已知元件。編碼轉(zhuǎn)移至葉綠體處肽的DNA序列的優(yōu)選實(shí)例是豌豆核-1，5-二磷酸羧基酶小亞基的基因。啟動(dòng)子實(shí)例是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。終止子實(shí)例是胭脂堿合成酶終止子。
基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法包括各種已知的常規(guī)方法，這些方法的描述見(jiàn)“植物基因轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)；實(shí)驗(yàn)指南”，Draper，J.等，BlackwellScientific Publications，1988。典型的方法包括應(yīng)用病毒及桿菌的生物學(xué)方法，如電穿孔的物理化學(xué)方法，聚乙二醇法及顯微注射方法等等。在這些方法中應(yīng)用農(nóng)桿菌對(duì)諸如煙草類(lèi)的雙子葉植物是最好的，因?yàn)槭褂盟鼙ＷC穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。應(yīng)用農(nóng)桿菌的方法包括應(yīng)用一種野生型腫瘤質(zhì)粒作為中間過(guò)渡載體的方法(Nature，287(1980)p.654；Coll，32(1983)p.1033；EMBO J.，3(1984)p.1525)，使用T-DNA上腫瘤形成基因區(qū)缺陷的載體作為中介載體的方法(EMBO J.，2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)，p.629)以及雙元載體等(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983)p.179；Nucl.Acids Res.，12(1984)p.8711)。以上任一方法均可使用。以農(nóng)桿菌感染植物方法的范例包括直接接種至培養(yǎng)細(xì)胞，與原生質(zhì)體共培養(yǎng)以及葉-圓盤(pán)等方法。其中葉-圓盤(pán)方法依據(jù)其直接、簡(jiǎn)便并產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化植株的能力、是優(yōu)選的方法。
為獲得再生植株，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以在已知培養(yǎng)基如Muroshige-Skoog培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基補(bǔ)充以有選擇性的抗生素、植物生物激素及其它試劑。長(zhǎng)出根的幼菌要移植至土壤中使其長(zhǎng)成完整植株。
生長(zhǎng)成熟的轉(zhuǎn)化植株可通過(guò)如下步驟檢測(cè)其抗寒凍性被測(cè)植株在不會(huì)受到寒凍損傷的溫度下培養(yǎng)生長(zhǎng)(如25℃)，然后轉(zhuǎn)移至低溫處(例如4℃)短暫生長(zhǎng)(如一周)。植物所受損傷，可以檢測(cè)如萎黃及繁育力下降。或者比較它與對(duì)照植株的生長(zhǎng)情況。
本發(fā)明現(xiàn)在將用如下的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些實(shí)施例決不意味要限制本發(fā)明應(yīng)用范圍。
〔實(shí)施例1〕多變魚(yú)腥藻Δ12去飽和酶基因(des A)上游開(kāi)放閱讀框架側(cè)翼DNA片段的克隆多變魚(yú)腥藻IAM M-3由東京大學(xué)分子及細(xì)胞生物科學(xué)研究所提供。在約100ml的BG-11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(“Plant MolecularBiology”，Shaw，C.H.ed.，p.279 IRL PRESS，1988)。該培養(yǎng)物在25℃、1000lux熒光燈照射下以120rpm速率振蕩使細(xì)菌充分生長(zhǎng)。培養(yǎng)液在室溫下用5000g離心10分鐘收集沉淀的細(xì)胞。
為制備基因組DNA，細(xì)胞在50ml溶液A(500mM Tris-HCl 1mMEDTA，pH8.0)中懸浮，清洗后再離心收集沉淀的細(xì)胞。隨后細(xì)胞在15ml溶液B(50mM Tris-HCl，20mM EDTA，50mM NaCl，0.25M蔗糖，pH8.0)中懸浮。然后加入40mg溶菌酶(Sigma)至溶液B使之溶解，把混合液置于37℃振蕩1小時(shí)。再向該振蕩培養(yǎng)物中加入蛋白酶K(15mg)及SDS(終濃度為1％)并使混合液在37℃振蕩過(guò)夜。繼續(xù)向振蕩培養(yǎng)物中加入NaClO4至終濃度為1M，再加20ml氯仿/異丙醇(24∶1)。所得混合物振蕩10分鐘后離心收集水相。用氯仿/異戊醇重復(fù)抽提之后，向所得水相中加入50ml乙醇，基因組DNA制備物可用玻璃棒纏繞之后收集獲得。DNA制備物以20ml溶液A溶解并加入NaCl至終濃度為0.1M。加入RNA酶至終濃度為50mg/ml，所得混合物在37℃溫育1小時(shí)。隨后以等體積的由溶液A飽和的苯酚抽提兩次，并加乙醇至水相收集沉淀的基因組DNA。以70％乙醇清洗后使之溶解于1ml的溶液A中以獲得多變魚(yú)腥藻的基因組DNA溶液。
Sakamoto等報(bào)道在Δ12去飽和酶基因上游存在有開(kāi)放閱讀框架(ORF)側(cè)翼序列，他們?cè)陉P(guān)于從多變魚(yú)腥藻中一個(gè)膜脂相連飽和脂肪酸Δ12去飽和酶基因的克隆的報(bào)告里推測(cè)上述序列與去飽和酶有某種關(guān)系(日本植物生理學(xué)家年會(huì)報(bào)告摘要3aF04，1993)。但ORF的功能未被鑒定。發(fā)明者對(duì)ORF及其功能有興趣。他們注意到ORF處DNA鏈的三個(gè)堿基序列并合成了四個(gè)引物(SEQ ID Nos5-8)，以此引物用多變魚(yú)腥藻基因組DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
這四個(gè)引物中，有SEQ ID Nos5-6的堿基序列的引物編碼正義鏈而SEQ ID Nos7-8的堿基序列的引物則編碼反義鏈。SEQ IDNos6-7的堿基序列是來(lái)源于同一氨基酸序列。由上述正義鏈及反義鏈各選一種構(gòu)成一對(duì)引物并用這總共有四種引物組合完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。向反應(yīng)液(100μl)中加入引物(每種20μM)及多變魚(yú)腥藻基因組DNA(1μg)，反應(yīng)用Gene Amp PCR試劑盒進(jìn)行(TAKARA SHUZOCO.，LTD.)。完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括95℃(1分鐘)，45℃(1分鐘)及72℃(2分鐘)。在第一個(gè)循環(huán)中，95℃保持3分鐘。反應(yīng)結(jié)束之后，把反應(yīng)液(10μl)放在2％瓊脂糖凝膠上電泳以分析合成的DNA。分析結(jié)果表明在以SEQ ID Nos6和8作為引物組合所合成DNA中作為被檢測(cè)的主帶具有預(yù)期長(zhǎng)度(約190bp)的DNA片段。該DNA片段(以下稱(chēng)為des 9 var)以Klenow片段處理形成平頭末端，然后克隆進(jìn)入質(zhì)粒pTZ18R(Pharmacia)的SmalI位點(diǎn)，隨后以熒光DNA測(cè)序儀測(cè)定堿基序列(Applied Biosystems)。測(cè)得的堿基順序表示在SEQ ID No1中。由此堿基序列所推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID No2)與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶有相當(dāng)高的同源性(見(jiàn)圖1示des 9 var片段編碼的氨基酸序列與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶(MSCO2)相應(yīng)序列的比較)。
隨后以des 9 var片段為探針對(duì)構(gòu)巢組囊藻基因組DNA作Southern雜交分析。分別用三種限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、PstI及BamHI切割構(gòu)巢組囊藻基因組DNA(約0.1μg)。所產(chǎn)生DNA片段用在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行分離，然后印跡至尼龍膜上(Hybond-N+；Amersham)。DNA探針用Multiprime DNA標(biāo)記試劑盒(Amersham)以〔α-32P〕dCTP標(biāo)記。DNA探針在反應(yīng)液中與尼龍膜于55℃共同溫育反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)液中包括6×SSPE(1×SSPE為10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，1mMEDTA及0.15M NaCl混合液)、0.2％SDS、100μg/ml鯡魚(yú)精DNA。處理后所得尼龍膜以2×SSC(1×SSE由0.15M NaCl、15mM檸檬酸鈉組成)在室溫下振蕩15分鐘進(jìn)行清洗共清洗二次，再以0.1×SSC于40℃振蕩15分鐘共清洗二次，然后進(jìn)行放射自顯影進(jìn)行分析。結(jié)果表明以任何限制性?xún)?nèi)切酶切割基因組DNA都只能檢測(cè)出一個(gè)DNA片段(見(jiàn)圖2)，在圖2中“Non”表示基因組DNA用任何限制性?xún)?nèi)切酶酶切)。
〔實(shí)施例2〕構(gòu)巢組囊藻基因組DNA中與des 9 var片段有高度同源的DNA鏈的克隆構(gòu)巢組囊藻R2-SPc培養(yǎng)物由東京大學(xué)分子及細(xì)胞生物科學(xué)研究所提供，其基因組DNA制備方法與前述多變魚(yú)腥藻中所用方法相同。把基因組DNA(約100μg)以Sau 3AI部分酶解，并按照“MolecularCloning，2rd edition，pp.2.85-2.87(Sambrook，J.等，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，1987)所述進(jìn)行蔗糖密度梯度離心收集長(zhǎng)度約為9-23kbp的DNA片段。把所得DNA片段克隆到用BamHI及HingIII切割后的Lambda噬菌體載體λDASH II(Stratagene)然后包裝成為噬菌體顆粒以產(chǎn)生構(gòu)巢組囊藻基因組文庫(kù)。取大腸桿菌p2392用噬菌體(文庫(kù))感染后在直徑約為15cm含有NZYM-瓊脂的平板上培養(yǎng)。共形成100,000個(gè)噬菌斑，然后將它們印跡至尼龍膜上(Hybond-N+；Amersham)。同上面Southern分析方法一樣，des 9 var片段仍用〔α-32P〕dCTP標(biāo)記并與所得尼龍膜反應(yīng)，用放射自顯影檢測(cè)陽(yáng)性噬菌斑，最終篩選出30個(gè)有不同信號(hào)強(qiáng)度的噬菌體克隆，從中選出12個(gè)克隆。用常規(guī)方法從每個(gè)克隆中提取噬菌體DNA。所得DNA用幾種限制性?xún)?nèi)切酶切割后在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，隨后印跡至尼龍膜上。該尼龍膜用上述篩選過(guò)程中的Southern印跡技術(shù)在相同的條件下進(jìn)行分析，并比較與探針雜交的DNA片段的長(zhǎng)度與信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果是λ5及λ15這兩個(gè)克隆顯示最強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)檫@兩個(gè)克隆已被插入DNA片段長(zhǎng)度為11和15kbp，據(jù)估算可認(rèn)為它們的長(zhǎng)度足能包含預(yù)期OPF的整個(gè)片段。插入這兩個(gè)克隆的每個(gè)DNA用幾種限制性?xún)?nèi)切酶切割后作Southern印跡分析。結(jié)果顯示以XhoI切割的兩個(gè)克隆的DNA所產(chǎn)生的片段中均有約5kbp片段雜交帶。把這個(gè)片段的DNA亞克隆進(jìn)入pBluescript SK-(Stratagene)XhoI位點(diǎn)，產(chǎn)生含有源于λ5及λ15DNA片段的質(zhì)粒p5X及p15X。制作了p5X及p15X的詳細(xì)酶切圖譜并加以比較。該圖表明p5X及p15X含有同樣的基因組DNA片段(見(jiàn)圖3顯示的λ5及λ15中插入DNA的相關(guān)性，矩形陰影部分表示在篩選中與des 9 var探針雜交的DNA片段。粗箭頭表示des 9 nid(下面將要提到)區(qū)域及正義鏈的方向。細(xì)箭頭表示帶有des 9 nid區(qū)域的測(cè)序方向。5kbp、1.25kbp及0.5kbp的線(xiàn)條是左邊圖的尺寸標(biāo)記。限制性?xún)?nèi)切酶的縮寫(xiě)意義如下B，BamHI；H，HindIII；N，NotI；Hp，HpaI；RI，EcoRI；RV，EcoRV；S，SalI；P，PstI；X，XhoI)。
用限制性?xún)?nèi)切酶或ExoIII從p15X制備缺失質(zhì)粒，約有2kbp的DNA片段的堿基順序含有與能與des 9 var雜交區(qū)域，它的順序由熒光DNA測(cè)序儀測(cè)定(見(jiàn)圖3)。從結(jié)果估計(jì)這個(gè)片段包含834bp(des 9 nid)的ORF，它編碼278個(gè)氨基酸(SEQ ID No4)。這個(gè)氨基酸序列與前面從多變魚(yú)腥藻克隆的des 9 var片段編碼的相應(yīng)氨基酸序列(SEQID No2)有80％同源性。運(yùn)用核酸及氨基酸序列分析軟件GENETYX(Software Development)及EMBL和DDBJ的核酸及氨基酸序列資料庫(kù)檢索高度同源氨基酸序列。插索結(jié)果顯示des 9 nid與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶有30％的一般同源性，但其部分區(qū)域則與小鼠去飽和酶有極高的同源性(見(jiàn)圖4顯示的des 9 nid與小鼠硬脂酰-輔酶A去飽和酶氨基酸序列比較結(jié)果)，這暗示所得的des 9 nid應(yīng)能編碼一個(gè)使飽和脂肪酸去飽和的酶。
〔實(shí)施例3〕測(cè)定des 9 nid基因在大腸桿菌中表達(dá)的活性構(gòu)巢組囊藻去飽和酶只具有Δ9去飽和酶活性或者說(shuō)它具有在Δ9位使脂相連的飽和脂肪酸去飽和的能力(Bishop，D.G.等，PlantCell Physiol.，271593，1986)。因此，嘗試在大腸桿菌中表達(dá)des 9 nid編碼的多肽并測(cè)量它的活性。
因?yàn)橛蓀15X直接表達(dá)較困難，故構(gòu)建了在大腸桿菌中表達(dá)的載體。具體地說(shuō)，選擇pET3a(Novagen)作為載體并將des 9 nid克隆進(jìn)入它的NdeI及BamHI位點(diǎn)之間，這樣通過(guò)如下的步驟處理就不用在des 9 nid編碼的氨基末端加上額外的氨基酸為了剛好在des 9 nid編碼蛋白質(zhì)的C末端下游加上一個(gè)BamHI位點(diǎn)，以包括碳末端在它們之間的兩個(gè)堿基序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。具體地說(shuō)以p15X作為模板，用下面的兩個(gè)引物完成PCR，得到約140bp的產(chǎn)物。正義引物5’-ACGTCATGGCCTGCAGT(下劃線(xiàn)處為PstI位點(diǎn))(SEQ IDNo9)反義引物5’-CGCGGATCCTTAGTTGTTTGGAGACG(下劃單線(xiàn)為BamHI位點(diǎn)，下劃雙線(xiàn)為終止密碼子)(SEQ ID No10)把產(chǎn)物亞克隆到pUCl9的SmaI位點(diǎn)并驗(yàn)證堿基序列的正確性。這樣在所得質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)下游又產(chǎn)生一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。隨后該質(zhì)粒用EcoRI及PstI切割。同時(shí)p15X也用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶從而在終止密碼子下游引入一個(gè)BamHI位點(diǎn)。質(zhì)粒再以SalI切割，然后在四種脫氧核苷酸存在情況下用DNA聚合酶Klenow片段進(jìn)行填充反應(yīng)(fill-inreaction)，隨后用HindIII切割。把由下面兩個(gè)人工合成的DNA片段組成的接頭插入到所得的質(zhì)粒上，從而在氨基末端引入一個(gè)NdeI位點(diǎn)。接頭是下列兩種DNA等摩爾量的混合物。5’-CATATGACCCTTGCTATCCGACCCA(下面劃線(xiàn)處為NdeI位點(diǎn))(SEQ IDNo11)和5’-AGCTTGGGTCGGATAGCAAGGGTCATATG(下劃單線(xiàn)為NdeI位點(diǎn)，下劃雙線(xiàn)為HindIII位點(diǎn)部分)(SEQ ID No12)。
把所得質(zhì)粒(p Des 9 Nde)導(dǎo)入到感受態(tài)的大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen)細(xì)胞中，這些感受態(tài)細(xì)胞可通過(guò)常規(guī)方法制備(Molecular Cloning，pp.250-251，1982)。轉(zhuǎn)化的BLDESI菌株可通過(guò)選擇氨芐青霉素抗性獲得。
把BLDSI菌株及含有pET3a的BL21菌株(BLI)接種到100ml M9培養(yǎng)基(M9含有200μg/ml氨芐青霉素，4mg/ml葡萄糖10μM Fecl3，0.5μg/ml維生素B1，1mg/ml酪蛋白水解產(chǎn)物)中在37℃培養(yǎng)。該繼續(xù)培養(yǎng)直至培養(yǎng)液混濁度在波長(zhǎng)600mM達(dá)到0.5 O.D.為止，在培養(yǎng)液中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM。把細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)以誘導(dǎo)Δ9去飽和酶的表達(dá)。收集大腸桿菌沉淀并用1.2％NaCl清洗，隨后提取脂類(lèi)。采用Blight和Dyed Can J.Biochem.Physiol.，37911，1959)的方法提取脂類(lèi)，將脂類(lèi)置完全密閉的容器中在85℃與5％鹽酸甲醇溶液(2.5ml)反應(yīng)2.5小時(shí)以產(chǎn)生甲基化的脂肪酸。產(chǎn)物脂肪酸甲基酯用己烷(2.5ml)抽提4次后用氮?dú)獬ト軇┦怪疂饪s。用氣相色譜分析脂肪酸甲基酯。與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲基酯的保留時(shí)間的比較鑒別相應(yīng)的脂肪酸。采用Chromatopack C-RTA Plus(ShimadzuCorp.)進(jìn)行定量分析。結(jié)果如下面表1。表1.大腸桿菌中脂肪酸組成菌株 16∶016∶118∶1Δ11 其它BL1(0小時(shí))47 20 29 4BL1(1小時(shí))50 17 29 4BLDES1(0小時(shí)) 44 22 30 4BLDES1(1小時(shí)) 40 28 28 4表中小時(shí)表示用IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的時(shí)間結(jié)果顯示BLDES1菌株中16∶1含量上升，表明本發(fā)明的基因有去飽和16∶0的活性。
上述兩種菌株在補(bǔ)充有0.1M硬脂酸的M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并按上述相同方式進(jìn)行比較。與BL菌株不同，BLDES1不僅產(chǎn)生16∶1，也能產(chǎn)生18∶1Δ9。這表明由des 9 nid基因編碼多肽既能以16∶0也能以18∶0為底物產(chǎn)生不飽和脂肪酸。
〔實(shí)施例4〕des 9 nid基因?qū)霟煵葜仓陙?lái)自構(gòu)巢組囊藻的des 9nid基因按如下方法整合進(jìn)入煙草植株(1)植物中表達(dá)的載體質(zhì)粒的構(gòu)建把質(zhì)粒pDes9Nde用SacI及SalI切割以產(chǎn)生一個(gè)保存在兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間的des 9 nid基因片段。用HindIII及SphI從帶有豌豆RubisCo基因(Schreicher等，EMBO J.4，25(1985))的pSNIP 9克隆中切下葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列，并把其克隆進(jìn)入用相同限制性?xún)?nèi)切酶切割的pUC118質(zhì)粒中，從而生成在轉(zhuǎn)運(yùn)序列下游含有多克隆位點(diǎn)的pTRA3質(zhì)粒。這個(gè)質(zhì)粒的HingIII位點(diǎn)用Klenow酶切開(kāi)和填平，接著插入一個(gè)XbaI連接物(linker)(pTRA3X)。質(zhì)粒pTRA3X用SalI及SacI雙酶切并插入經(jīng)同樣雙酶切得到的des 9 nid基因片段(pTRA3Xdes9)。在pTRA3Xdes9質(zhì)粒中，des 9 nid基因隨著RubisCo的轉(zhuǎn)運(yùn)序列將會(huì)在同一閱讀框架里被翻譯。該質(zhì)粒用SacI及XbaI雙酶切后插入到下列的植物載體中。植物表達(dá)型雙元載體pBI 121(Clonetech)用SacI及XbaI雙酶裂解以產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)基因的質(zhì)粒pBI(-GUS)。把上面制備的轉(zhuǎn)移基因插入質(zhì)粒pBI(-GUS)中花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子及胭脂堿合成酶(NOS)終止子之間以構(gòu)成導(dǎo)入植株的載體(pBI 121(-GUS)Rbsc-des9)。(2)將pBI 121(-GUS)Rbsc-des導(dǎo)入農(nóng)桿菌把根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Clonetech)接種于50ml YEB培養(yǎng)基(每升中含5g牛肉浸膏，1g酵母提取物，1g蛋白胨和5g蔗糖，2mM MgSO4(pH7.4))中置28℃培養(yǎng)24小時(shí)。把經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的溶液在4℃，3000rpm離心20分鐘以收集細(xì)胞。細(xì)胞用10ml/mM Hepes-KOH(pH 7.4)清洗3次再以3ml 10％甘油清洗。然后把這些細(xì)胞用3ml 10％甘油懸浮而制成為導(dǎo)入DNA的農(nóng)桿菌細(xì)胞。
由此制備的細(xì)胞溶液(50μl)及質(zhì)粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9(1μg)放置在小池中并用電穿孔儀器基因脈沖發(fā)生儀(Gene Pulser)(BioRad)，在25μf，2500V，200Ω條件下進(jìn)行電脈沖處理從而將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。把細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至Eppendonf離心管中并加入800μ的SOC培養(yǎng)基(每升含20g胰蛋白胨，5g酵母提取物和0.5g NaCl，補(bǔ)充2.5mM KCl，10mM MgSO4，10mM MgCl2和20mM葡萄糖(pH7.0)。細(xì)胞在28℃靜置培養(yǎng)1.5小時(shí)。培養(yǎng)液(50μl)接種至補(bǔ)充有100ppm卡那霉素的YEB瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂濃度1.2％)中在28℃培養(yǎng)2天。
從所產(chǎn)生的菌落中挑選分隔良好的菌落并從挑選得的菌落通過(guò)堿法制備質(zhì)粒DNA。此質(zhì)粒DNA以適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶解。所產(chǎn)生的DNA片段用在1％瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行分離并以32P-標(biāo)記的des 9nid基因片段作探針作Southern印跡分析；從而證明農(nóng)桿菌細(xì)胞中含有質(zhì)粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9。此根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞縮寫(xiě)為“ALBBSDES”。(3)煙草的轉(zhuǎn)化把ALBBSDES細(xì)胞株在加有50ppm卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中置28℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。取培養(yǎng)液(1.5ml)在10,000rpm離心3分鐘收集細(xì)胞。然后用1ml LB培養(yǎng)液清洗細(xì)胞以去除卡那霉素。另外也可把細(xì)胞液在10,000rpm離心3分鐘收集細(xì)胞。然后用1.5ml LB培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞以制備成感染用細(xì)胞液。
為感染煙草，取其幼葉在0.5％次氯酸鈉水溶液中浸10分鐘。隨后以滅菌水清洗葉片3次再以滅菌濾紙擦拭以準(zhǔn)備待感染的葉片標(biāo)本。葉片用無(wú)菌手術(shù)以刀切成每個(gè)為1cm2的小片。把這些小片置于農(nóng)桿菌的溶液中并使其背面朝上，溫和振蕩2分鐘。然后把小葉片放置于滅菌過(guò)的濾紙上以除去過(guò)剩的農(nóng)桿菌。將Whatman No.1濾紙(φ7.0cm)置MS-B5培養(yǎng)基(含有1.0ppm芐基腺嘌呤0.1ppm及0.8％瓊脂)平板上(Murashige，T.and Skoog，F(xiàn).Plant Physiol.，15473(1962))，并將葉子標(biāo)本的每一小片背面朝上放在濾紙上。該平板用封口膜密封后，葉片在25℃下以16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗的周期培養(yǎng)2天。隨后，把葉片轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有250ppm calforan及100ppm卡那霉素的MS-B5培養(yǎng)基上并在相同的條件下培養(yǎng)以去除農(nóng)桿菌。另外，可把葉片放置在平板底部補(bǔ)充有250ppm Calforan和100ppm卡那霉素的MS-B5培養(yǎng)基中并在相同條件下培養(yǎng)7天。同時(shí)，葉片周邊形成愈傷組織并且小芽生長(zhǎng)開(kāi)始。再培養(yǎng)另外的10天后，把伸展的芽放置在補(bǔ)充有250 calforan及100rpm卡那霉素的MS-HF培養(yǎng)基(無(wú)芐基腺嘌呤和萘乙酸的MS-B5培養(yǎng)基)。培養(yǎng)10天后，選擇生根的芽枝作為卡那霉素耐受的轉(zhuǎn)化體并移栽至盛有并補(bǔ)充250ppm calforan的MS-HF培養(yǎng)基的植物盆中。
〔實(shí)施例5〕轉(zhuǎn)化的煙草基因組的Southern及Northern分析由卡那霉素耐受的煙草中提取DNA并通過(guò)Southern及Northern印跡技術(shù)驗(yàn)證預(yù)期基因的導(dǎo)入及表達(dá)。基因組DNA的提取方法依照手冊(cè)(Rogers，S.O.&Bendich，A.J.Plant Molecular BiologyManual A6；1(1988))中的CTAB方法進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下，取煙草葉(2g)在液氮中研磨，并以CTAB提取緩沖液提取基因組DNA。把DNA(10μg)用EcoRI及XbaI酶解后在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳，用0.4N NaOH使分離的DNA片段印跡至尼龍膜上(Hybond N+；Amersham)來(lái)源自質(zhì)粒pTRA3Xdes9的含有去飽和酶基因的轉(zhuǎn)運(yùn)序列為探針與該該膜在65℃雜交16小時(shí)，以此證明預(yù)期基因?qū)霟煵莼蚪M中。
由煙草葉(約2g)中提取RNA并分析確證轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。這些步驟包括用硫氰酸胍提取poly(A)＋RNA(Nagy，F(xiàn).等，Plant MolecularBiology Manual B4；1(1988))并在含甲醛瓊脂糖凝膠中電泳。把RNA印跡至尼龍膜(Hybond N+；Amersham)并與上述Southern印跡方法的同樣條件下進(jìn)行雜交分析。在RNA量表達(dá)不同的轉(zhuǎn)化體中選RNA表達(dá)含量最高的進(jìn)行分析脂肪酸。
〔實(shí)施例6〕轉(zhuǎn)化的煙草植株中脂類(lèi)的脂肪酸分析在實(shí)例5中經(jīng)驗(yàn)證有高RNA表達(dá)的煙草轉(zhuǎn)化植株以及pBI 121轉(zhuǎn)化的對(duì)照煙草植株，按如下的方法提取它們?nèi)~中的磷脂酰甘油PG及硫代異鼠李糖基二?；视?SQDG)等脂類(lèi)。分析它們的脂肪酸組成。至于部分轉(zhuǎn)化體及非轉(zhuǎn)化體的根內(nèi)脂類(lèi)也加以分析。(1)總脂類(lèi)的提取脂類(lèi)的提取采用Bligh-Dyer方法(Can.J.Biochem.Physiol.，37911，1959)。取2g濕重葉(或當(dāng)根部分作樣品時(shí)取1g)以刀切碎并加20ml氯仿/甲醇(1∶2，體積比)。用勻漿器打碎葉片并靜置15分鐘。把氯仿(12ml)及蒸餾水(12ml)加至打碎的葉片中并劇烈振蕩。該混合物在4℃，3,000rpm下離心30分鐘以分離水層及有機(jī)層。收集有機(jī)層(下層)后加入適量的乙醇。溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中30℃減壓蒸發(fā)。殘留物用2ml氯仿/甲醇(1∶4，體積比)溶解以制備總脂類(lèi)提取物。部分該總脂提取物以5％鹽酸甲醇溶液按下面方法處理以生成甲基化脂肪酸。(2)脂類(lèi)的分級(jí)分離取2.5ml DEAE-Toyopearl 650C(TOSOH)懸浮液與25ml 1M醋酸鈉水溶液(pH7.0)混合以制備其醋酸型。所得懸浮液依次用蒸餾水、甲醇清洗并在甲醇中懸浮。把該懸浮液裝柱(內(nèi)徑1.5cm)中使其高度達(dá)1.5cm并以50ml氯仿/甲醇(1∶4，體積比)清洗。
隨后，將脂類(lèi)總提取物上柱。用50ml氯仿/甲醇(1∶4，體積比)洗脫甘油(MGDG)、雙半乳糖雙酰甘油(DGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE)及磷脂酰膽堿(PC)以制備中性脂(MGDG，DGDG，PE，PC)部分。然后用5ml乙酸洗脫出磷脂酰絲氨酸(PS)，并再用20ml氯仿/甲醇(1∶4，體積比)洗去醋酸。而含有PG，SPDG及磷脂酰肌醇(PI)的部分則可由50ml氯仿、甲醇、10M乙酸銨(20∶80∶0.2，體積比)溶液抽提獲得。該分級(jí)部分抽提液中加入乙醇(15ml)后溶劑經(jīng)在減壓下蒸發(fā)盡。把殘留物在0.2ml氯仿/甲醇(2∶1，體積比)中溶液以制備酸性脂類(lèi)部分(PG、SQDG及PI)。
MGDG、DGDG、PE及PC通過(guò)硅酸柱層析(Iatrobeads，IatoronLaboratories Inc.)作進(jìn)一步分級(jí)分離。更準(zhǔn)確地說(shuō)，把樣品溶于氯仿(1ml)并上樣至用氯仿平衡的柱，依次用氯仿/丙酮(4∶1)、丙酮及甲醇洗脫，憑此，用丙酮把糖脂(MGDG、DGDG)洗脫而用甲醇把磷脂(PC及PE)洗脫下來(lái)。(3)用薄層層析(TLC)分離純化PG及脂肪酸分析由步驟(2)所得各分部液在硅膠-TLC板#5721(Merck)上分離。分離酸性脂類(lèi)以氯仿/丙酮/甲醇/醋酸/水(50∶20∶10∶15∶5，體積比)作為展層液，而分離中性脂類(lèi)則以氯仿/甲醇/水(70∶21∶3，體積比)作為展層液。通過(guò)TLC分離后，噴上櫻草靈(primulin)(溶于丙酮的80％溶液)使在紫外光下產(chǎn)生熒光。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)脂類(lèi)比較遷移率來(lái)判斷脂類(lèi)分部液中的各類(lèi)脂分。產(chǎn)生熒光的脂類(lèi)與硅膠共同刮下后置有螺旋帽的試管中。當(dāng)判斷脂類(lèi)的脂肪酸組成時(shí)，脂中加入3ml 5％鹽酸甲醇溶液然后使該混合物在完全密閉狀態(tài)下于85℃反應(yīng)2小時(shí)以產(chǎn)生甲基化脂肪酸。同時(shí)為了檢測(cè)sn-1及sn-2位置的脂肪酸組成，從刮下硅膠加入5ml氯仿/甲醇(2∶1)混合溶液中收集脂類(lèi)并使之干燥。在脂中加入1ml 50mM TrisCl(pH7.2)及0.05％Triton X-100，混合物劇烈振蕩以分散脂類(lèi)。在該分散液中加入來(lái)自特勒麥根霉(Rhizopus delemar)的脂酶(2500U；Boehringer)，并把混合物在37℃保持30分鐘使在sn-1位置上選擇性釋放脂肪酸。在反應(yīng)產(chǎn)物濃縮后，未反應(yīng)脂類(lèi)、溶解脂類(lèi)及自由脂肪酸通過(guò)薄層層析，以氯仿/丙酮/甲醇/醋酸/水(10∶4∶2∶3∶1)作展層劑使之分離開(kāi)。這些物質(zhì)從硅膠中回收并如前述方法一樣與鹽酸甲醇溶液反應(yīng)以產(chǎn)生甲基化脂肪酸。所得脂肪酸甲基酯用3ml己烷抽提3次后再在減壓下蒸發(fā)盡溶劑使之濃縮。通過(guò)氣相色譜分析脂肪酸甲基酯。用與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲基酯保留時(shí)間相比較鑒定這些脂肪酸。定量分析則通過(guò)(Chromatopnck)C-R7A plus(Shimadzu Corp.)進(jìn)行。關(guān)于總脂類(lèi)、PG及其它代表性脂類(lèi)的結(jié)果分別地展示在表2、表3及表4中。這些表中表示的平均分析數(shù)值對(duì)照是2個(gè)，平均的轉(zhuǎn)化體是2個(gè)或3個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體平均的。表2.葉中總脂類(lèi)的脂肪酸分析結(jié)果植株 16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0＋18∶0對(duì)照植株 173 1 4 3 1 9 63 20轉(zhuǎn)化植株 10121 5 1 2 1456 11表3.PG中脂肪酸分析結(jié)果植株 16∶0 16∶1t 16∶1c 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0＋18∶0＋16∶1tPG對(duì)照植株 32 37 0 1 5 10 14 70轉(zhuǎn)化植株18 37 8 0 10 12 15 55表4.其它脂類(lèi)中脂肪酸分析結(jié)果植株 16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0+18∶0SQDG對(duì)照植物51 1 0 0 3 2 7 3654轉(zhuǎn)化植株36 22 0 0 0 4 9 2836MGDG對(duì)照植株7 0 1 9 1 2 4 768轉(zhuǎn)化植株3 9 1 10 0 1 5 693DGDG對(duì)照植物19 0 0 0 3 1 4 7322轉(zhuǎn)化植株9 13 0 1 0 1 5 709PC對(duì)照植物 28 0 0 0 5 1 214433轉(zhuǎn)化植株19 12 0 0 3 4 402322PE轉(zhuǎn)化植株 20 0 0 0 3 1 6 7023對(duì)照植物18 10 0 0 2 2 313820PI轉(zhuǎn)化植株 48 1 0 0 2 1 113750對(duì)照植物44 7 0 0 1 2 182845PG所聯(lián)接脂肪酸分析結(jié)果揭示在表達(dá)來(lái)自構(gòu)巢組囊藻脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)化過(guò)的煙草植株中，16∶0(棕櫚酸)含量大量下降而順式16∶1含量則增加，同時(shí)18∶0幾乎減少為零(在對(duì)照中有少量的18∶0)而18∶1則上升。因此，對(duì)照煙草植株中飽和脂肪酸含量(16∶0＋16∶1反式＋18∶0(硬脂酸))為70％而由未飽和酶基因轉(zhuǎn)化的煙草植株中則顯著地下降到55％。對(duì)PG中sn-1、sn-2位置的相應(yīng)分析結(jié)果表明多于98％的sn-2位置被飽和脂肪酸(16∶0或16∶1順式)所占有，由導(dǎo)入基因新產(chǎn)生的16∶1則全部出現(xiàn)在sn-1位置。所以，很明顯由去飽和酶基因轉(zhuǎn)化的煙草中PG的sn-1位置上飽和脂肪酸含量變得極小。總而言之，在sn-1、sn-2位置上由飽和脂肪酸構(gòu)成的飽和分子類(lèi)數(shù)量大大減少，從而根據(jù)脂類(lèi)的分子種類(lèi)組成可判斷該煙草植株變成具有明顯抗寒凍性表型的植株。
至于其它脂類(lèi)，如MGDG、DGDG、SQDG、PC、PE和PC等，很明顯可見(jiàn)16∶0下降而16∶1則相應(yīng)上升約10％，18∶0的去飽和程度也有增加。在MGDG和DGDG中，16∶1主要在sn-1位置產(chǎn)生，但在sn-2位置也能檢測(cè)出少量16∶1。主要在葉綠體上出現(xiàn)MGDG、DGDG、SQDG及PG等脂類(lèi)的去飽和程度，發(fā)現(xiàn)在高等植物葉綠體中表達(dá)藍(lán)綠藻構(gòu)巢組囊藻的去飽和酶也獲得極大的提高。這四類(lèi)存在于構(gòu)巢組囊藻質(zhì)膜上的脂類(lèi)能作為去飽和酶的底物是有很大的可能性。令人奇怪的是PC、PE及PI中棕櫚酸及硬脂酸也能發(fā)生去飽和，而構(gòu)巢組囊藻質(zhì)膜卻缺乏這些脂類(lèi)，但它們?cè)诟叩戎参飬s主要存在葉綠體外。
在本例中，轉(zhuǎn)化煙草植株的脂類(lèi)分析證明源自構(gòu)巢組囊藻的脂肪酸去飽和酶可在諸如轉(zhuǎn)化煙草類(lèi)高等植物中以極高的效率使幾乎所有脂類(lèi)中16∶0和18∶0發(fā)生去飽和。
根內(nèi)總脂類(lèi)的脂肪酸分析結(jié)果見(jiàn)表5。表5.根內(nèi)總脂類(lèi)的脂肪酸分析結(jié)果植株16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 ∑16∶0＋18∶0非轉(zhuǎn)化植株260 0 0 52 4721 31轉(zhuǎn)化植株 17130 0 24 586 19結(jié)果顯示源自構(gòu)巢組囊藻的脂肪酸去飽和酶不僅是能催化葉中16∶0和18∶0的去飽和作用，而且也能對(duì)根中的16∶0和18∶0發(fā)揮同樣作用，這暗示本發(fā)明中脂肪酸去飽和酶基因不僅能改善植物抗寒凍性，而且也可能增加不飽和脂肪酸的含量，使得它能在以植物為原材料生產(chǎn)油料產(chǎn)品的工業(yè)中得到應(yīng)用。
〔實(shí)施例7〕檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株抗寒凍性通過(guò)RNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)及脂類(lèi)分析實(shí)驗(yàn)判定為有希望的轉(zhuǎn)化體自花傳粉后收集其下一代的種子。部分種子栽培于添有800ppm卡那霉素MS-HF培養(yǎng)基中，以16＋時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光照周期在25℃培養(yǎng)2周。選擇卡那霉素耐受的幼苗。把這些幼苗移植于植物盒中并再培養(yǎng)4周。以pBI 121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植株也按上述步驟重復(fù)(對(duì)照)。
這些植株在連續(xù)光照條件下用4℃低溫處理11天，然后置25℃培養(yǎng)2天。結(jié)果，在對(duì)照植株(以pBI 121轉(zhuǎn)化的植株)可見(jiàn)明顯的葉子呈波狀及萎黃，而轉(zhuǎn)化植株則無(wú)任何損傷。據(jù)此可以認(rèn)為抗寒凍性能夠通過(guò)引入去飽和酶基因得到改善。工業(yè)應(yīng)用性導(dǎo)入本發(fā)明的編碼Δ9去飽和酶基因能夠賦予植物抗寒凍性，且植株內(nèi)不飽和脂肪酸含量也能被增加。
序列表SEQ ID NO1的信息長(zhǎng)度196堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型基因組DNA最初來(lái)源生物多變魚(yú)腥藻藻株IAM M-3序列描述SEQ ID NO1GCT CTG GGG TTG TTG CTG TTA TAT CTA GGC GGG TGG TCT TTT GTG GTC TGGGGA GTT TTC TTT CGC ATC GTT TGG GTT TAC CAC TGT ACT TGG TTG GTA AACAGC GCT ACC CAT AAG TTT GGC TAC CGC ACC TAT GAT GCT GGT GAC AGA TCCACT AAC TGT TGG TGG GTA GCT GTC CTA GTG TTT GGT GAA GGT TSEQ ID NO2的信息長(zhǎng)度65氨基酸類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型肽最初來(lái)源生物多變魚(yú)腥藻藻株IAM M-3序列描述SEQ ID NO2Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Gly Gly Trp Ser Phe Val Val TrpGly Val Phe Phe Arg Ile Val Trp Val Tyr His Cys Thr Trp Leu Val Asn SerAla Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Thr Tyr Asp Ala Gly Asp Arg Ser Thr AsnCys Trp Trp Val Ala Val Leu Val Phe Gly Glu GlySEQ ID NO3的信息長(zhǎng)度837堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型基因組DNA最初來(lái)源生物構(gòu)巢組囊藻藻株R2-SPc序列描述SEQ ID NO3ATG ACC CTT GCT ATC CGA CCC AAG CTT GCC TTC AAC TGG CCG ACC GCC CTGTTC ATG GTC GCC ATT CAC ATT GGA GCA CTG TTA GCG TTC CTG CCG GCC AACTTT AAC TGG CCC GCT GTG GGC GTG ATG GTT GCG CTG TAT TAC ATT ACC GGTTGT TTT GGC ATC ACC CTA GGC TGG CAC CGG CTA ATT TCG CAC CGT AGC TTTGAA GTT CCC AAA TGG CTG GAA TAC GTG CTG GTG TTC TGT GGC ACC TTG GCCATG CAG CAC GGC CCG ATC GAA TGG ATC GGT CTG CAC CGC CAC CAT CAC CTCCAC TCT GAC CAA GAT GTC GAT CAC CAC GAC TCC AAC AAG GGT TTC CTC TGGAGT CAC TTC CTG TGG ATG ATC TAC GAA ATT CCG GCC CGT ACG GAA GTA GACAAG TTC ACG CGC GAT ATC GCT GGC GAC CCT GTC TAT CGC TTC TTT AAC AAATAT TTC TTC GGT GTC CAA GTC CTA CTG GGG GTA CTT TTG TAC GCC TGG GGCGAG GCT TGG GTT GGC AAT GGC TGG TCT TTC GTC GTT TGG GGG ATC TTC GCCCGC TTG GTG GTG GTC TAC CAC GTC ACT TGG CTG GTG AAC AGT GCT ACC CACAAG TTT GGC TAC CGC TCC CAT GAG TCT GGC GAC CAG TCC ACC AAC TGC TGGTGG GTT GCC CTT CTG GCC TTT GGT GAA GGC TGG CAC AAC AAC CAC CAC GCCTAC CAG TAC TCG GCA CGT CAT GGC CTG CAG TGG TGG GAA TTT GAC TTG ACTTGG TTG ATC ATC TGC GGC CTG AAG AAG GTG GGT CTG GCT CGC AAG ATC AAAGTG GCG TCT CCA AAC AAC TAASEQ ID NO4的信息長(zhǎng)度278氨基酸類(lèi)型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型肽最初來(lái)源生物構(gòu)巢組囊藻藻株R2-SPc序列描述SEQ ID NO4Met Thr Leu Ala Ile Arg Pro Lys Leu Ala Phe Asn Trp Pro Thr Ala Leu PheMet Val Ala Ile His Ile Gly Ala Leu Leu Ala Phe Leu Pro Ala Asn Phe AsnTrp Pro Ala Val Gly Val Met Val Ala Leu Tyr Tyr Ile Thr Gly Cys Phe GlyIle Thr Leu Gly Trp His Arg Leu Ile Ser His Arg Ser Phe Glu Val Pro LysTrp Leu Glu Tyr Val Leu Val Phe Cys Gly Thr Leu Ala Met Gln His Gly ProIle Glu Trp Ile Gly Leu His Arg His His His Leu His Ser Asp Gln Asp ValAsp His His Asp Ser Asn Lys Gly Phe Leu Trp Ser His Phe Leu Trp Met IleTyr Glu Ile Pro Ala Arg Thr Glu Val Asp Lys Phe Thr Arg Asp Ile Ala GlyAsp Pro Val Tyr Arg Phe Phe Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Val Gln Val Leu LeuGly Val Leu Leu Tyr Ala Trp Gly Glu Ala Trp Val Gly Asn Gly Trp Ser PheVal Val Trp Gly Ile Phe Ala Arg Leu Val Val Val Tyr His Val Thr Trp LeuVal Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Ser His Glu Ser Gly Asp GlnSer Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala Leu Leu Ala Phe Gly Glu Gly Trp His AsnAsn His His Ala Tyr Gln Tyr Ser Ala Arg His Gly Leu Gln Trp Trp Glu PheAsp Leu Thr Trp Leu Ile Ile Cys Gly Leu Lys Lys Val Gly Leu Ala Arg LysIle Lys Val Ala Ser Pro Asn AsnSEQ ID NO5的信息長(zhǎng)度18堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO5ATGACAATTG CTACTTCASEQ ID NO6的信息長(zhǎng)度15堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO6GCTCTGGGGT TGTTGSEQ ID NO7的信息長(zhǎng)度15堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO7CAACAACCCC AGAGCSEQ ID NO8的信息長(zhǎng)度18堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO8RTGRTGRTTR TTRTGCCASEQ ID NO9的信息長(zhǎng)度17堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO9ACGTCATGGC CTGCAGTSEQ ID NO10的信息長(zhǎng)度26堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO10CGCGGATCCT TAGTTGTTTG GAGACGSEQ ID NO11的信息長(zhǎng)度25堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO11CATATGACCC TTGCTATCCG ACCCASEQ ID NO12的信息長(zhǎng)度29堿基對(duì)類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸、合成DNA序列描述SEQ ID NO12AGCTTGGGTC GGATAGCAAG GGTCATATG
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)植物細(xì)胞再生創(chuàng)制植物的方法，其中的植物細(xì)胞是用一種多核苷酸轉(zhuǎn)化的，該多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有在Δ9位點(diǎn)使與脂類(lèi)相連接的脂肪酸去飽和活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有在Δ9位點(diǎn)使與脂類(lèi)相連接的脂肪酸去飽和的活性，并且該蛋白質(zhì)是來(lái)源于組囊藻屬的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白質(zhì)含有基本上如SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的多核苷酸含有基本上如SEQID NO3所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述的植物具有抗寒冷的特性。
全文摘要
編碼的蛋白質(zhì)具有Δ9位置使脂相連的脂肪酸去飽和的活性的基因;含有該基因或包括其基因部分的多核苷酸的載體,由該基因或含有其基因部分的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞;通過(guò)植物細(xì)胞再生而長(zhǎng)成成熟植株的產(chǎn)生植株的方法;以及由該基因或含有其基因部分的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植株。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1334340SQ0112309
公開(kāi)日2002年2月6日 申請(qǐng)日期2001年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月28日
發(fā)明者西澤治, 盧栗敏博 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社