專利名稱：3－脫氧－3－羰基－紅霉內(nèi)酯b,它的工程菌株及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，生產(chǎn)化合物的工程菌株及該化合物的應用。
背景技術：
紅霉素及其衍生物是臨床上廣泛應用的一類抗生素。第一代紅霉素易為酸降解及產(chǎn)生耐藥性，已很少使用。通過化學修飾改造的第二代紅霉素，如羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地紅霉素等可以克服第一代紅霉素易被酸降解的不足，在臨床上正被廣泛應用，但卻仍無法克服耐藥性這一缺點。現(xiàn)在正在推向市場的第三代紅霉素telithromycin是酮內(nèi)酯類抗生素的典型代表，也是使用化學修飾對紅霉素結構進行改造的。酮內(nèi)酯類抗生素結構上的最大特點是在紅霉素大環(huán)內(nèi)酯的C-3位用羰基取代糖基。研究表明，酮內(nèi)酯類抗生素不僅結構穩(wěn)定，而且對許多耐藥菌具有活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以作為酮內(nèi)酯類抗生素——第三代紅霉素前體物質(zhì)的化合物3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B，它是結構式(I)的化合物。 該化合物可以由生物合成，也可以用化學方法合成。
本發(fā)明的第二個目的是提供—種能夠產(chǎn)生上述結構式(I)化合物的糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M1 CGMCC N0604。該菌株已于2001年8月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC № 0604。
化合物3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B經(jīng)過生物及化學修飾后，即可成為酮內(nèi)酯類抗生素，也就是第三代紅霉素，因此該化合物在制備酮內(nèi)酯類抗生素中將起到重要作用。
紅霉素的生物合成途徑已較清晰(張部昌，趙志虎，馬清鈞.紅霉素生物合成的分子生物學.生物技術通訊，2001，12(2)151-160)，根據(jù)紅霉素生物合成途徑可以推斷出，本發(fā)明的3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B生物合成途徑如下 此前已有報道(Xue Q，Ashley G，Hutchinson CR，et al.A multiplasmidapproach to preparing large libraries of polyketides.Proc Natl Acad Sci US A.1999，96(21)11740-5；McDaniel R，Thamchaipenet A，Gustafsson C，et al.Multiple genetic modifications of the erythromycin polyketide synthase toproduce a library of novel“unnatural”natural products.Proc Natl Acad SciUSA.1999，961846-51)利用基因工程方法合成3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B，但均是利用鏈霉菌異源表達系統(tǒng)，宿主菌沒有對內(nèi)酯環(huán)進行進一步的修飾。本發(fā)明在紅霉素生產(chǎn)菌中對紅霉素基因進行改造，不僅合成了3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B，而且菌體內(nèi)的羥化酶對其C-6位進一步氧化修飾，合成了自然界中從未發(fā)現(xiàn)的新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B。
在用質(zhì)譜檢測糖多孢紅霉菌M1發(fā)酵液時沒有檢測到3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B，而是3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B，說明糖多孢紅霉菌中C-6位羥化酶對底物要求并不嚴格，可將3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B幾乎全部氧化成3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B。
下面結合附圖對本發(fā)明的實施例作進一步說明。


圖1為整合體的PCR鑒定。
圖2為糖多孢紅霉菌Z1發(fā)酵液對枯草桿菌的抑制試驗。
圖3為重組體的PCR鑒定。
圖4為S erythraea M1提取液質(zhì)譜圖具體實施方式
本發(fā)明實施例中所用的培養(yǎng)基、緩沖液和試劑如下LB培養(yǎng)基按Sambrook方法(Sambrook J，F(xiàn)risch EF and Maniatis T.分子克隆實驗指南(第二版) (金冬雁，黎孟楓等譯).北京科學出版社，1992)，TSB培養(yǎng)基按Hopwood方法(Hopwood DA，Bibb MJ，Chater KF et al.Genetic manipulation ofstretomycesa laboratory manual.The John Innes Foundation，England，1985)，SGGP培養(yǎng)基、PEG3350-T緩沖液和改進P緩沖液按Yamamoto方法(Yamamoto H，MaurerKH and Hutchinson CR.Transformation of streptomyces erythraeus.J Antibiotics，1986，39(9)，1304-13)，R3M培養(yǎng)基按Summers方法(Summers RG，Donadio S，Staver MJ，et al.Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic geneclusterof Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamineproduction.Microbiology，1997，143(10)3251-62)。
糖多孢紅霉菌A226(Serythraea A226)菌株由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所菌種室提供，硫鏈絲菌肽(thiostrepton，Tsr)、PEG3350為Sigma公司產(chǎn)品，溶菌酶為Fluka公司產(chǎn)品，蛋白酶K為AMRESCO公司產(chǎn)品，PEG1000為MERCK-Schuchardt公司產(chǎn)品，TSB為DIFCO公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶為Biolab公司產(chǎn)品，pfu DNA聚合酶為上海生工公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶為MBI公司產(chǎn)品，長片段DNA聚合酶(Expand Long Template PCR System)為Roche公司產(chǎn)品，DNA MarkerDL2,000為大連寶生物公司產(chǎn)品，質(zhì)粒純化試劑盒和PCR純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。
本發(fā)明實施例中所用的實驗方法為大腸桿菌的培養(yǎng)、質(zhì)粒酶切、連接、轉(zhuǎn)化等按Sambrook方法(Sambrook J，F(xiàn)rischEF and Maniatis T.分子克隆實驗指南(第二版)(金冬雁，黎孟楓等譯).北京科學出版社，1992)，質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物純化按Promega產(chǎn)品說明書進行。
糖多孢紅霉菌A226的培養(yǎng)和總DNA的提取按Hopwood方法(Hopwood DA，BibbMJ，Chater KFet al.Genetic manipulation of stretomycesalaboratory manual.The JohnInnes Foundation，England，1985)進行。
糖多孢紅霉菌A226原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化按Yamamoto方法(Yamamoto H，MaurerKH and Hutchinson CR.Transformation of streptomyces erythraeus.J Antibiotics，1986，39(9)，1304-13)和Summers方法(Summers RG，Donadio S，Staver MJ，et al.Sequencingand mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.Microbiology，1997，143(10)3251-62)進行。
發(fā)酵液的生物活性測定過夜培養(yǎng)的枯草桿菌(B subtilis)PUB110涂布LB平皿，放上滅菌濾紙片，在濾紙上加10μl培養(yǎng)72 hrs的發(fā)酵液，放37℃恒溫箱培養(yǎng)7hrs以上。
發(fā)酵液中紅霉素及其衍生物的提取50mlTSB發(fā)酵液的離心上清液用氨水調(diào)pH至9.0-9.5，乙酸乙酯萃取，水浴濃縮。
發(fā)酵液中3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯的質(zhì)譜鑒定按上述方法提取的糖多孢紅霉菌M1發(fā)酵液用ZabsPec質(zhì)譜儀檢測。實施例1、pWHM2201質(zhì)粒的構建1、PCR引物的設計為敲除紅霉素合成基因中KR6酶域，根據(jù)文獻CortesJ，Haydock SF，Roberts GA，et al.An unusually large multifunctional polypeptide in theerythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.Nature，1990，348(6297)176-8序列，在其兩側各擴增一個片段，片段間有20bp重疊。其引物為片段1正向5’-TACGAATTCAGATCTCATGCGGCTCCTGGAGTCCGCAGTGGACG；反向5’-CTCGAGGTCGCCGGTGGCCGGGCCCGCCGGCTCCCAGCTCGACTCG；片段2正向5’-CGAGTCGAGCTGGGAGCCGGCGGGCCCGGCCACCGGCGACCTCGAG；反向5’-TTCAAGCTTCTGCAGTCATGAGTTCCCTCCGCCCAGCCAG。
再以片段1和片段2為模板，片段1正向引物和片段2反向引物為引物，合成無KR6的基因片段，整個DNA片段長約3.2kb。
2、PCR擴增條件1)片段1和片段2的擴增A加樣總DNA模板5μl，DMSO 5μl，4×2.5mMdNTP 5μl，10×pfu DNA聚合酶緩沖液5μl，水10μl，2.5μM引物2×10μl，pfu DNA聚合酶1μl；B擴增條件95℃ 5min，(94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 2min)×30，72℃ 7min；2)重迭PCR擴增A加樣片段1和2模板各2.5μl，4×2.5mM dNTP 5μl，長片段DNA合成酶緩沖液5μl，水10μl，2.5μM引物(片段1正向和片段2反向)2×10μl，長片段DNA合成酶0.75μl；B擴增條件95℃ 5min，(94℃ 1min，65℃ 1min，68℃5min)×30，68℃ 7min；3、pUC2201克隆重疊PCR擴增出所需DNA片段后，按博大公司產(chǎn)品說明書與pUC-T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在重迭PCR產(chǎn)物克隆到pUC-T載體后，對pUC2201外源基因的序列進行了部分序列分析鑒定，結果表明一個測序反應完成的500多個堿基與報道序列完全一致，表明以該序列構建的pWHM2201質(zhì)粒可用作同源重組載體。
4、pWHM2201的構建將pUC2201中外源DNA片段用EcoRI和HindIII酶切后連于pWHM3 EcoRI和HindIII酶切位點，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將從大腸桿菌DH5α抽提出來的pWHM2201質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567菌株，以制備無甲基化修飾質(zhì)粒，用于糖多孢紅霉菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
實施例2、染色體整合和染色體二次重組的PCR鑒定1)根據(jù)tsr基因序列(Hopwood DA，Bibb MJ，Chater KF et al.Genetic manipulationofstretomycesalaboratory manual.The John Innes Foundation，England，1985)設計鑒定引物為正向5’-CCTGAATTCATGACTGAGTTGGACACCATCGCA反向5-TCTAAGCTTGGAAACGTTGAGAACTCGGTCTG。擴增出來的DNA片段長度774bp.
2)根據(jù)紅霉素合成基因序列，在KR6酶域兩側選擇PCR引物為正向5‘-AACGTCTTCCCGGCGGCACC；反向5‘-GTCGAGGTAGGACCGGACCC。
KR6未去除的擴增片段長度為1，770bp，KR6去除的DNA擴增片段長度為1,239bp。
3)pWHM2201質(zhì)粒和染色體同源重組將糖多孢紅霉菌A226制成原生質(zhì)體后，用pWHM2201質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，含30μg/ml Tsr的R3M培養(yǎng)基進行篩選。從轉(zhuǎn)化子中挑130個菌落涂含Tsr的R3M斜面，有18個菌落可在Tsr斜面上正常生長。接種其中4個斜面進行液體培養(yǎng)提取總DNA，以Tsr引物進行PCR擴增，結果如圖1所示，凝膠電泳均有明顯的條帶，表明pWHM2201質(zhì)粒已整合到染色體上。
為了證明PCR產(chǎn)物的模板為基因組總DNA，而不是菌體中的游離質(zhì)粒，提取質(zhì)粒，凝膠電泳時未見質(zhì)粒條帶，以提取液為模板進行PCR擴增，也未見PCR條帶。說明質(zhì)粒已整合到染色體上，而不是在菌體中游離存在。
為了進一步確認pWHM2201質(zhì)粒已整合到染色體上的紅霉素合成基因位點，選取在含Tsr的R3M斜面上生長正常的一株菌株(Serythraea Z1)，接種含30μg/ml Tsr的5ml TSB搖管，同時接種糖多孢紅霉菌A226于無Tsr的TSB搖管，30℃培養(yǎng)72hrs。在涂有枯草桿菌PUB110的LB平皿上加10μl發(fā)酵液。若pWHM2201質(zhì)粒整合到了染色體上將破壞紅霉素合成基因，使其不能夠合成紅霉素。如圖2所示，對枯草桿菌PUB110抑制試驗結果為Z1轉(zhuǎn)化體已不再抑制枯草桿菌的生長，說明pWHM2201質(zhì)粒確已整合到紅霉素生物合成基因位點。
實施例3、糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M的篩選將整合體糖多孢紅霉菌Z1在無抗性R3M斜面上連續(xù)傳兩代后，制原生質(zhì)體涂無抗性R3M平皿，從中挑取40個菌落各連續(xù)涂含Tsr的R3M斜面和無Tsr的R3M斜面。有8個菌落(S erythraea M1-M8)僅在無抗性的R3M斜面上生長。接種4個菌落(M1-M4)進行液體培養(yǎng)提取總DNA，以去除KR6鑒定引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物約1.2kb(如圖3所示)，表明染色體上KR6酶域已被敲除。得到糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M1 CGMCC №0604。
實施例4、糖多孢紅霉菌M發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定將糖多孢紅霉菌M1的50ml發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，水浴濃縮后用ZabsPec質(zhì)譜儀檢測。如圖4所示，3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B(3-deoxy-3-oxo-erythronolide B，DOEB)的各質(zhì)子峰清晰可見383.0m/z為[DOEB-H2O]H+，401.0m/z為[DOEB]H+，423.0m/z為[DOEB]Na+，439.0m/z為[DOEB]K+。因此斷定，糖多孢紅霉菌M1的發(fā)酵產(chǎn)物含3-去氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B。
權利要求
1.結構式(I)化合物
2.糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M1 CGMCC №0604。
3.結構式(I)化合物在制備酮內(nèi)酯類抗生素中的應用。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為3－脫氧－3－羰基－紅霉內(nèi)酯B,它的工程菌株及應用,涉及一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物,生產(chǎn)化合物的工程菌株及該化合物的應用。本發(fā)明的化合物是通式(I)化合物;本發(fā)明的工程菌為糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaerythraea)M1CGMCC № 0604;本發(fā)明在制備酮內(nèi)酯類抗生素中會得到廣泛應用。
文檔編號C12N1/21GK1336370SQ01123629
公開日2002年2月20日 申請日期2001年8月16日 優(yōu)先權日2001年8月16日
發(fā)明者張部昌, 馬清鈞, 趙志虎 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所