專利名稱：一種來源于山菠菜的轉(zhuǎn)錄因子、編碼它的基因以及培育耐逆植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于山菠菜的轉(zhuǎn)錄因子、編碼它的基因以及利用該基因培育耐逆植物的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼轉(zhuǎn)錄因子AhDREB的基因，該基因可以具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO2中所示的基因代表了山菠菜中的一種DREB轉(zhuǎn)錄因子家族，它們都含有保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域序列。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有編碼本發(fā)明的AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體。
可使用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體。這些植物表達(dá)載體包括但不限于，雙元農(nóng)桿菌載體，例如Bin19(Bevan，M.，1984，核酸研究，128711-8721)以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體。載體還可包括3’非翻譯區(qū)域。3’非翻譯區(qū)域是指一種基因的部分，它含有一種包含聚腺苷酸信號和任何其它的可效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。聚腺苷酸信號引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。3’區(qū)域的例子包括含有農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?例如胭脂堿合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大貯存蛋白基因)的3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)。本發(fā)明的DREB轉(zhuǎn)錄因子的3’非翻譯區(qū)域可被用于在植物中表達(dá)。
本發(fā)明的載體可含有適當(dāng)?shù)膯幼?。在本發(fā)明中可使用任何一種強(qiáng)啟動子。這些啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CAMV 35S)。它可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。
本發(fā)明的表達(dá)載體在需要時(shí)也可包括增強(qiáng)子，不論是翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。這些增強(qiáng)子區(qū)域包括但不限于ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框同相，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以是多種不同的來源，可以是天然的或合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，或來自結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，包括加入植物可選擇性標(biāo)記?？墒褂玫倪x擇性標(biāo)記包括對抗生素抗性的酶，抗生素包括慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同樣，可使用產(chǎn)生通過顏色變化(例如GUS)或發(fā)光(例如熒光酶)耒識別的化合物的酶，或抗化學(xué)試劑(例如除莠劑)。
本發(fā)明的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等導(dǎo)入植物細(xì)胞。對這些技術(shù)的綜述參閱Weissbach和Weissbach，植物分子生物學(xué)方法(Method for PlantMolecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)，第二版(1988)。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育耐逆性植株的方法。該方法包括用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子AhDREB基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
可使用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物宿主包括單子葉植物和雙子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。
以擬南芥DREB cDNA為探針篩選了2.5X105未擴(kuò)增斑得到3個(gè)陽性斑，其扦入片段為1.43kb。該片段包括723bp的開放讀碼框架，編碼由240個(gè)氨基酸組成的多肽，其5’端為43bp，3’端為665bp。山菠菜AhDREB cDNA全序列及氨基酸序列見

圖1。山菠菜AhDREB活性與環(huán)境脅迫的關(guān)系以200mM NaCl溶液連續(xù)處理山菠菜4天，分別在1，2，3，4天收集葉片，提取RNA作Northern分析。結(jié)果表明DREB的轉(zhuǎn)錄在根中受鹽脅迫誘導(dǎo)(圖3)。
序列表SEQ ID NO1MSYSYPPPLPSNTLNNFLSPKPVTMKTTGGPPKPTKLYRGVRQRHWGKWVAEIRLPKNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLRGDFARLNFPNLRHEGSHIGGEFGEYKPLHSSVNAKLEAICESLAKQGNEKQGKSGKSKKKDVANNNNNTSSSSSSSCCTTATAAADAPQQQQRMPENGGDVKTESTSDSEVGSGGSSPLSDLTFGDNEEMGSENFLLESCPSHEIDWDAILSSESSEQ ID NO2CGTTGCTGTCGAATTTACTTACCCCCAAGCCCAGCCCCAACAMTGAGCTACTCATACCCACCTCCACTTCCTAGTAATACCCTTAACAACTTTCTATCTCCCAAGCCTGTGACCATGAAAACAACTGGTGGGCCGCCCAAGCCCACTAAGCTTTATCGTGGGGTTAGGCAACGTCACTGGGGTAAATGGGTTGCTGAGATCCGTTTACCCAAGAACAGGACCCGGCTTTGGTTGGGTACCTTTGATACAGCTGAGGAAGCTGCTTTGGCTTACGACAAGGCGGCTTACAAGCTGAGAGGTGACTTTGCGAGGTTGAATTTTCCTAATCTCCGCCATGAAGGGTCCCACATCGGTGGCGAATTCGGCGAATACAAACCCCTTCATTCCTCCGTAAACGCAAAACTCGAAGCCATTTGCGAGAGTCTAGCCAAACAGGGGAATGAAAAACAGGGGAAATCAGGAAAGTCCAAGAAGAAAGATGTTGCTAATAATAACAATAATACTTCATCTTCGTCATCTTCAAGCTGTTGTACAACAGCTACTGCTGCGGCCGATGCACCGCAGCAGCAGCAGCGGATGCCGGAAAACGGCGGCGATGTAAAAACCGAGAGCACCTCCGATAGTGAGGTGGGGTCCGGTGGATCGTCGCCGTTGTCGGATTTGACATTCGGAGATAATGAAGAAATGGGATCGGAGAATTTCTTGTTGGAGTCATGCCCATCTCATGAGATTGATTGGGATGCTATATTATCATCTGAATCTTAATAATTTCATTTGTGGTCTTAAGTATGGGTTAATAAGGAGTATTAATTAAATTAAATTAGGGAGTTATAAAATGTGTCATCATAATATAAGTCATGTAATGTTGTGTAAATTTTTTCTTTTTTTTTTTTTAATTTTAATTAAAATTAGTAGGTTGGTAGTGGGTAGTTTCAGGGAGGAGTGATCTCTGCAATGAAGTTTTTGGAAATTGTAGGGACTCCATATTTGGTCTTCTTTGGTGAGGCAAGTGTTTTTTTGATCTTGCCTTTGATCAATTGAAGAGTAGTTTTTTTTTCTTATTGTTTATTTTATGTTTATAGTAGAAAAAATTTTAGGATTGTAATTTGATGATCATTTTTAGTGAAGTATTATTATTAATATTTTTATTAGTATAAAAAAAAATTGGACTGTTATCAAGGTAAGTGCTTATTTTGACTTCCATATTTGTATGTTGCTCTCTTTCTTTGATTCTTTCATATTTCTAGTGAGATCTGAACTATAATTAATATGGATTAAACCTTAAATTACTAGTGGTTTGTGTAACAGGATATGCTTGATGTTCCTGTTTTATACATAATCGGAGCTTTTGTCCCTGCAACAATGATTGCAGTGCTCTATTATTTTGATCACAGTGTGGCATCTCAACTTGCTCAGCAGCGACAGCAACG
權(quán)利要求
1.一種AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其片段。
2.一種編碼權(quán)利要求1的AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3.按照權(quán)利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO2所示的序列。
4.一種含有權(quán)利要求2或3所述的基因的植物表達(dá)載體。
5.一種培育耐逆性植株的方法，包括用權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并將化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。
6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的植物為水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、或者苜宿。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種AP
文檔編號C12N15/29GK1400308SQ0112382
公開日2003年3月5日 申請日期2001年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月1日
發(fā)明者陳受宜, 劉強(qiáng), 沈義國, 張勁松, 杜保興 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所, 清華大學(xué)