專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)新疆雪蓮總黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)新疆雪蓮總黃酮的方法。具體講是以植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為手段，通過在細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)進行的新疆雪蓮大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)總黃酮的方法。本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于新疆雪蓮生長環(huán)境特異，天然生長緩慢，人工栽培困難，并且自然資源有限，難以滿足臨床上日益增長的需求，迫切需要采用新的手段來解決這一現(xiàn)實問題。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的一個重要分支，經(jīng)過越來越多的學(xué)者的努力，已經(jīng)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。進行新疆雪蓮細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，既可以解決天然資源匱乏的問題，又可以滿足人們的健康要求。目前，我國已經(jīng)有多家單位先后進行了雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)的研究，并取得了一些基礎(chǔ)性的研究成果。
但是，在目前所能夠見到的文獻中，對新疆雪蓮的研究大多數(shù)是集中在其化學(xué)成分、藥理、生理功能、分析方法等方面上，在細(xì)胞培養(yǎng)方面罕有報導(dǎo)。印度有少數(shù)的學(xué)者進行了新疆雪蓮保藏方法的研究，而中國科學(xué)院植物研究所的趙德修等人則對水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)條件進行了較為系統(tǒng)的研究，并嘗試在2升攪拌式生物反應(yīng)器中進行了水母雪蓮細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)初步研究。
Arora R.等人發(fā)現(xiàn)，將雪蓮種子放在含有0.5μmol/l NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)芽時，其發(fā)芽比例可以達到90％。將誘導(dǎo)得到的雪蓮芽在5℃的暗環(huán)境中儲存12月并且不進行繼代，其成活率為100％。如果將雪蓮芽進行低溫處理6個月或者更長的時間，然后將其放回培養(yǎng)間，會發(fā)現(xiàn)其生長速率比未經(jīng)低溫處理的芽的生長速率更快。
趙德修等人使雪蓮種子萌發(fā)出幼苗，然后使用幼苗在MS、AG-7和B53種基本培養(yǎng)基上進行了愈傷組織的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織在MS外加0.2mg6-BA/l和2mg NAA/l的培養(yǎng)基上生長良好。在誘導(dǎo)得到的愈傷組織中，抗癌有效成分jaceosidin的含量為0.04mg/g干細(xì)胞，是天然水母雪蓮原植物含量的25％。
趙德修等人在研究培養(yǎng)溫度、苯丙氨酸對固體培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮形成的影響時發(fā)現(xiàn)，25℃有利于細(xì)胞的生長，苯丙氨酸對細(xì)胞的生長未見有促進作用，但是有利于細(xì)胞中黃酮的形成。經(jīng)過高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選，可以使細(xì)胞中總黃酮的含量達到1.9％，jaceosidin的含量為0.42％，分別是原始愈傷組織的2.6倍和4.2倍。
刑建民等人在2升攪拌式生物反應(yīng)器中進行了水母雪蓮細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。與搖瓶培養(yǎng)相比，雪蓮細(xì)胞的生長速度明顯下降，并且糖的利用也不充分，經(jīng)過12天的培養(yǎng)，到結(jié)束時培養(yǎng)基中仍然在殘留24.3g/l的糖。在培養(yǎng)的過程中，DO值變化很大，從培養(yǎng)開始的85％逐漸下降到第5--8天的30％左右，然后又開始回升，到第12天上升到50％。與搖瓶培養(yǎng)相比，雪蓮細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)的生物量和黃酮含量都發(fā)生了明顯的降低，生物量從22.45g/l降到了10.35g/l，黃酮含量從占細(xì)胞干重的5.89％降到了4.14％，黃酮產(chǎn)率從1323.4mg/l降到了428.6mg/l。
分析上述已經(jīng)進行的研究可以看出，它們都是單獨從培養(yǎng)基成分或者培養(yǎng)條件著手來進行優(yōu)化，而且所研究的試材均為水母雪蓮。我們認(rèn)為雖然基因型、外植體類型、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件都有各自不可忽視的作用，但是它們都是通過對愈傷組織或者培養(yǎng)的細(xì)胞的生理狀態(tài)來起作用的，因而對培養(yǎng)的愈傷組織和細(xì)胞的生理狀態(tài)進行調(diào)控才是最根本的手段。
我們經(jīng)多年的時間，在分析、研究國內(nèi)外雪蓮研究成果的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地研究了植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到新疆雪蓮有效成分總黃酮生產(chǎn)的理論、工藝及可行性，包括從材料選擇、外植體誘導(dǎo)、高頻細(xì)胞株的保存、懸浮培養(yǎng)系的建立到分離、純化等過程，完成了實驗室和中試研究，實現(xiàn)了一個培養(yǎng)周期可收獲總黃酮4.12％(培養(yǎng)物干重)的結(jié)果，使下一步產(chǎn)業(yè)化更具有實際意義，并為此提供了可能與保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種提高新疆雪蓮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)總黃酮的方法，該方法不僅能明顯提高新疆雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)液中總黃酮的含量，而且更有利于達到產(chǎn)業(yè)化水平。
本項目經(jīng)多年研究，根據(jù)新疆雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)總黃酮的特殊機理，首創(chuàng)了采用氣升式細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，很好地控制了細(xì)胞的生長過程，縮短了緩慢生長期，延長了平穩(wěn)生長期，進而縮短了培養(yǎng)周期，降低了成本，提高總黃酮產(chǎn)量。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)路線如下將新疆雪蓮的外植體進行離體培養(yǎng)，篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，轉(zhuǎn)入細(xì)胞種子培養(yǎng)，然后進行細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過分離，純化等處理，得到總黃酮晶體。
本發(fā)明所篩選的高產(chǎn)細(xì)胞株已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，保藏號為CGMCC 0610，保藏日期是2001年8月7日。
在上述基礎(chǔ)上的新疆雪蓮愈傷組織繼代保存15天為一周期，細(xì)胞種子培養(yǎng)10天為一繼代周期，細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)10-15天為一周期。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加萘乙酸(NAA)和6-芐基嘌呤(6-BA)，添加用量為NAA 0-3.5mg/L、6-BA 0-3.0mg/L。
上述的培養(yǎng)基中需添加蔗糖1.5-2.5％，并調(diào)PH值4.5-7.5。
上述的培養(yǎng)條件為8h/d光照，2000Lx光照強度，溫度24℃±1。
培養(yǎng)結(jié)束后采用｀H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC以及CD譜對總黃酮平面和立體機構(gòu)進行測定。
本發(fā)明的最佳離體培養(yǎng)條件是MS培養(yǎng)基附加NAA3mg/l+6-BA0.3mg/l+蔗糖30％本發(fā)明提出的新疆雪蓮大規(guī)模培養(yǎng)的方法是采用2L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器(中國科學(xué)院生化中心有售)作種子罐，培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)條件為溫度22-26℃，最佳為24±1℃，光照最佳時間為8小時/天，光照強度800-2000LX，最佳為1000LX。以20L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器作為生產(chǎn)罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24±1℃，光照8h/d，光照強度1000LX，培養(yǎng)時間10-15天。
經(jīng)過上述發(fā)酵培養(yǎng)之后，進行分離純化，本發(fā)明雪蓮總黃酮的分離和純化過程如下細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，在60℃以下烘干培養(yǎng)物，通過HPLC過柱。具體方法是，將雪蓮培養(yǎng)品60℃減壓干燥至恒重，研磨成粉，取本品粉末1.0g，精密稱定(AH1.0003g)，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超聲萃取40min，濾過，回收甲醇，殘渣加適量水(3～5ml)使溶解(難溶部分超聲溶解)，放冷，通過聚酰胺層析柱(60～85目，約10g，內(nèi)徑1cm，長度15cm，濕法裝柱)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用50％乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，并定容至100ml，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液，上色譜柱，甲醇∶水∶冰醋酸(V∶V∶V＝40∶60∶1.0)為流動相；檢測波長257nm，流量1.0ml/min，靈敏度0.02AUFS，柱溫室溫，進樣量10μl，進行分離，收集獲得總黃酮晶體。結(jié)果見附圖檢測圖譜(圖1)。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇∶水∶冰醋酸(40∶60∶1.0)為流動相；檢測波長257nm。
對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，用甲醇制成每1ml含3.8。
經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)方法獲得的培養(yǎng)物與其他培養(yǎng)方法獲得培養(yǎng)物在雪蓮總黃酮含量方面存在較大差異，本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)物總黃酮含量明顯提高。通過3種培養(yǎng)方式獲得培養(yǎng)物的總黃酮產(chǎn)量差異結(jié)果見下表。
三種不同培養(yǎng)方式對細(xì)胞總黃酮產(chǎn)量的影響培養(yǎng)方式細(xì)胞成活率(％)總黃酮產(chǎn)量(mg/l)搖瓶培養(yǎng) 70.2 1295攪拌培養(yǎng)(5L) 88.3 1944氣升式培養(yǎng) 98.6 3137從表中可以看到，氣升式細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)的雪蓮細(xì)胞聚集體的比生長速率和黃酮類化合物的含量都明顯高于搖瓶培養(yǎng)和攪拌培養(yǎng)時的對應(yīng)值，表明細(xì)胞聚集體在堆積培養(yǎng)時處于較好的生長狀態(tài)。在培養(yǎng)時，0.08m3/h的通氣量能夠使細(xì)胞較好地生長并合成黃酮類化合物。由于搖瓶培養(yǎng)存在大量的細(xì)胞聚集在一起，通氣不暢造成細(xì)胞生長不利。而攪拌培養(yǎng)則存在明顯的細(xì)胞剪切力問題。因為新疆雪蓮細(xì)胞對剪切力很敏感。氣升式細(xì)胞反應(yīng)器則無上述兩種情況。


圖1是從本發(fā)明培養(yǎng)的新疆雪蓮獲得的總黃酮的色譜檢測圖譜。
實施例將保藏的新疆雪蓮細(xì)胞株在2L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器(中國科學(xué)院生化中心有售)中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)15天，培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基，附加NAA3mng/l，6-BA0.3mg/l，蔗糖30％，PH值6，溫度24±1℃，光照時間為8小時/天，光照強度1000LX。將種子培養(yǎng)15天后，按20％接種量接種至20L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器細(xì)胞罐中，在無菌條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24±1℃，光照8h/d，光照強度1000LX，培養(yǎng)時間15天。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成與上述種子液培養(yǎng)基組成相同，通氣量200ml/min。
細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，在60℃以下烘干培養(yǎng)物，將雪蓮培養(yǎng)品60℃減壓干燥至恒重，研磨成粉，取本品粉末1.0g，精密稱定(AH1.0003g)，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超聲萃取40min，濾過，回收甲醇，殘渣加適量水(3～5ml)使溶解(難溶部分超聲溶解)，放冷，通過聚酰胺層析柱(60～85目，約10g，內(nèi)徑1cm，長度15cm，濕法裝柱)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用50％乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，并定容至100ml，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液，上色譜柱，甲醇∶水∶冰醋酸(V∶V∶V＝40∶60∶1.0)為流動相；檢測波長257nm，流量1.0ml/min，靈敏度0.02AUFS，柱溫室溫，進樣量10μl，進行分離，收集獲得總黃酮晶體。
權(quán)利要求
1.一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)新疆雪蓮總黃酮的方法，其特征在于該方法包括在MS培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)和大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，干燥培養(yǎng)物，并分離和純化得到新疆雪蓮總黃酮，所說種子的保藏號是CGMCC0610。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于種子培養(yǎng)10天為一周期，發(fā)酵培養(yǎng)10-15天為一周期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于種子培養(yǎng)條件為溫度24±1℃，光照時間為8小時/天，光照強度800-2000LX。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24±1℃，光照8h/d，光照強度1000LX-2000Lx，培養(yǎng)時間10-15天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，并添加萘乙酸-3.5mg/L，6-芐基嘌呤0-3.0mg/L，蔗糖1.5-2.5％，并調(diào)PH值4.5-7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，通過HPLC過柱，分離獲得雪蓮總黃酮晶體。
7.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)液下罐后，60℃減壓干燥，研磨成粉，取本品粉末1.0g，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超聲萃取40min，濾過，回收甲醇，殘渣加水3～5ml使溶解，放冷，通過聚酰胺層析柱，以水50ml洗脫，棄去水液，再用50％乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，并定容至100ml，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液，上色譜柱，分離，收集獲得總黃酮晶體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于聚酰胺層析柱的裝柱為60～85目，約10g，內(nèi)徑1cm，長度15cm，濕法裝柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于高效液相色譜柱的條件為甲醇水∶冰醋酸V∶V∶V＝40∶60∶1.0為流動相；檢測波長257nm，流量1.0ml/min，靈敏度0.02AUFS，柱溫室溫，進樣量10μl。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所說的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)采用氣升式細(xì)胞反應(yīng)器進行深層細(xì)胞培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用氣升式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)新疆雪蓮,從培養(yǎng)液中分離提取新疆雪蓮總黃酮的方法。該方法是在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)酵的種子,再將種子轉(zhuǎn)移到20L生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng)。然后對反應(yīng)器中的培養(yǎng)液進行分離、純化獲取新疆雪蓮總黃酮7.1%,純度99%,本發(fā)明方法生產(chǎn)成本低,不污染環(huán)境,達到了產(chǎn)業(yè)化水平。
文檔編號C12N5/04GK1337467SQ01124108
公開日2002年2月27日 申請日期2001年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者賈景明, 張劍俠, 吳立軍 申請人:賈景明, 張劍俠, 吳立軍