專利名稱：用蠶表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子生產(chǎn)藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用蠶表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth Factor，EGF)生產(chǎn)藥物的方法。
本發(fā)明提供了用化學(xué)合成人EGF基因以及質(zhì)粒pSK-EGF的構(gòu)建。根據(jù)已知人EGF基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，VOL80，7462)，用DNA合成儀及亞磷酸三酯法合成4條編碼EGF的寡聚核苷酸鏈，用聚丙烯酰胺-7mol/L尿素變性膠電泳分離純化，寡聚核苷酸鏈的5’末端磷酸化、復(fù)性、鏈的延伸、連接、EcoRI內(nèi)切酶酶切，并克隆入pBluscript SK的EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK-EGF，經(jīng)測(cè)序證明其核苷酸序列完全正確。
本發(fā)明還提供了含人EGF基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacEGF。將含有人EGF基因片段的質(zhì)粒pSK-EGF經(jīng)BamHI和EcoRV酶切后，低熔點(diǎn)膠回收基因片段與經(jīng)BamHI和SmaI雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-8(CLONTECH公司)連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacEGF(

圖1)，經(jīng)酶切分析鑒定基因正確。
本發(fā)明還提供了含人EGF基因的重組昆蟲桿狀病毒BmBacEGF。將重組轉(zhuǎn)移載體pBacEGF DNA與已線性化的病毒BmBacPAK6(申請(qǐng)人自行構(gòu)建)DNA經(jīng)AocI酶切線性化由脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，二者在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生同源重組，待共轉(zhuǎn)染5～7天后出現(xiàn)明顯的病毒感染癥狀后，取上清進(jìn)行噬斑篩選。再通過2輪的噬斑篩選和DNA點(diǎn)雜交篩選出含hEGF基因的重組病毒BmBacEGF(圖2)，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號(hào)CGMCC NO0593。
本發(fā)明還提供了人EGF基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物。將重組桿狀病毒BmBacEGF感染家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmBacEGF注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)，分別取24、48、72、96和120小時(shí)的家蠶和蛹血淋巴，經(jīng)5000rpm 5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，取20ul進(jìn)行20％的SDS-PAGE分析，Western雜交表明能與EGF抗體結(jié)合，分子量約為6KD。ELASA檢測(cè)表明感染后第120小時(shí)每條蠶平均表達(dá)量為0.42mg，感染后第120小時(shí)每個(gè)蛹平均表達(dá)量為0.5mg(圖3)。
本發(fā)明還對(duì)人EGF基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物活性的鑒定。EGF的生物活性應(yīng)用Balb/c3T3細(xì)胞，采用MTT結(jié)合酶聯(lián)儀進(jìn)行檢測(cè)，用BmBacEGF穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時(shí)間收集蠶血和蛹體血淋巴，高速離心后測(cè)血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小時(shí)后蠶血和蛹體血淋巴中的EGF ED50(Effective dose 50使細(xì)胞生長(zhǎng)量達(dá)到最大值一半時(shí)EGF的濃度)分別為0.6ng/ml和0.88ng/ml。
本發(fā)明還對(duì)用高效表達(dá)EGF的家蠶幼蟲和蛹制成口服藥物進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將高效表達(dá)人EGF的蠶蛹進(jìn)行粗分離純化研制成口服藥物，以不同劑量喂服SD大鼠，三天后(每天一次)，用無水乙醇灌胃后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，大鼠胃粘膜受乙醇損傷的程度明顯降低，其保護(hù)胃粘膜效果在50-200ug/kg.d-1范圍內(nèi)呈量效關(guān)系(表1)，表明用表達(dá)hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護(hù)作用，成為一種新型的治療人消化性潰瘍的口服藥物。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下由于hEGF分子中二硫鍵及其他多種官能團(tuán)的存在，因而化學(xué)合成的產(chǎn)物純度及產(chǎn)率無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。目前hEGF的生產(chǎn)主要通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌酵母中獲得，但表達(dá)產(chǎn)物往往形成包涵體，分離純化時(shí)涉及到蛋白質(zhì)變性和復(fù)性問題，以及給后處理和純化工藝帶來繁衍的多步操作。為了克服上述困難，本發(fā)明以家蠶作為生物反應(yīng)器，高效表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子，表達(dá)量達(dá)到0.5mg/蛹，用表達(dá)hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，確定其對(duì)胃腸潰瘍的治療功能，為開發(fā)治療消化道潰瘍基因工程藥物開辟一條新途徑。
將重組桿狀病毒BmBacEGF注射到五齡家蠶幼蟲和蛹(Bombyx mori)(申請(qǐng)人自行飼養(yǎng))中，每頭注射2ul左右(滴度為1×107/ml)，分別取24、48、72、96和120小時(shí)表達(dá)的家蠶淋巴血，5000rpm 5min離心后取上清，用PBSpH7.4稀釋10倍后，加入等體積的2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(100Mm Tris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油)，煮沸變性取20ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳，與PVDF膜(寶靈曼公司)一起電轉(zhuǎn)過夜，通過與一抗(鼠抗人EGF，深圳晶美公司)，二抗(羊抗鼠IgG，上海生物工程公司)雜交，結(jié)果表明，Western雜交條帶分子量為6KD)左右。ELASA檢測(cè)表明感染后第120小時(shí)每條蠶平均表達(dá)量為0.42mg，感染后第120小時(shí)每個(gè)蛹平均表達(dá)量為0.5mg(圖3)。實(shí)施例5、蠶表達(dá)的人EGF的生物活性測(cè)定EGF的生物活性應(yīng)用Balb/c3T3細(xì)胞(中國生物制品檢定所)，采用MTT結(jié)合酶聯(lián)儀進(jìn)行檢測(cè)。取無菌96孔板一塊，以1號(hào)孔為空白，2好孔為對(duì)照，加入培養(yǎng)基50ul，每一樣品4個(gè)平行組，在1號(hào)孔與3號(hào)孔各加入待測(cè)樣品50ul，從3號(hào)開始向右對(duì)半稀釋；選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞一瓶，胰酶消化，細(xì)胞收集后用0.5％培養(yǎng)基洗一次，用0.5％培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)到所需濃度，每孔加入細(xì)胞懸液50ul(對(duì)照組各孔加50ul培養(yǎng)基)，37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40-50小時(shí)，然后加MTT(Sigma公司)20ul，37℃，5％ CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，加10％SDS-0.01NH4Cl 100ul，過夜，酶標(biāo)儀測(cè)OD值，λ＝490nm。結(jié)果表明，用BmBacEGF穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時(shí)間收集蠶血淋巴，高速離心后測(cè)血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小時(shí)后蠶血和蛹體血淋巴中的EGF ED50(Effective dose 50使細(xì)胞生長(zhǎng)量達(dá)到最大值一半時(shí)EGF的濃度)分別為0.6ng/ml和0.88ng/ml。實(shí)施例6、用高效表達(dá)人EGF的蠶蛹制成口服藥物進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用高效表達(dá)人EGF的五齡家蠶幼蟲、蛹體，4℃研磨經(jīng)12000rpm高速離心后，取上清，再40000rpm超速離心，取上清冷凍干燥制成口服藥物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，購自浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，共50只，每只體重220-250g，隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為hEGF I組(50ug/kg.d-1口服)，hEGFII組(100ug/kg.d-1口服)，hEGF III組(200ug/kg.d-1口服)，西咪替丁組(30mg/kg.d-1口服)，對(duì)照組(0.9％生理鹽水1ml，口服)。實(shí)驗(yàn)前3天起大鼠分別給予胃腔內(nèi)灌注或皮下注射藥物，所有藥物均用0.9％生理鹽水稀釋，分一日3次，每次等容積灌鼠。實(shí)驗(yàn)前2天起禁食，但不禁水，空腹48小時(shí)后各鼠用無水乙醇1ml/只灌胃，灌乙醇1小時(shí)后取血，處死大鼠，解剖取出胃，用1％甲醛溶液固定。沿胃大彎側(cè)剪開并展平，肉眼觀察損傷情況，測(cè)量損傷長(zhǎng)度，損傷程度以潰瘍指數(shù)表達(dá)并做病理組織切片行光鏡檢查。損傷指數(shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)線狀損傷，每mm長(zhǎng)度計(jì)1分，損傷寬度超過2mm者計(jì)分加倍，所有計(jì)分累加之和，作為每只大鼠胃粘膜損傷的潰瘍指數(shù)(表1)。結(jié)果表明用表達(dá)hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護(hù)作用，成為一種治療人消化性潰瘍的口服藥物的新方法。
表1、用蠶表達(dá)EGF口服藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注P值為各用藥組與對(duì)照組潰瘍指數(shù)比較
權(quán)利要求
1.一種用蠶表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子制備藥物的方法，其特征在于通過基因工程方法獲得重組的帶人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基因的家蠶重組桿狀病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號(hào)為0593，并用該病毒接種家蠶幼蟲和蛹進(jìn)行表達(dá)人EGF，所獲得的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥，以家蠶蛹為填充料配制成口服藥物，成為一種治療消化性潰瘍疾病的新方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacEGF的構(gòu)建是通過化學(xué)合成人EGF基因，克隆到pSK的EcoRI位點(diǎn)，將人EGF基因片段克隆進(jìn)入轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-8中，獲得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacEGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEGF的構(gòu)建是通過重組轉(zhuǎn)移載體pBacEGF與已線性化的病毒BmBacPAK6 DNA由脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，再通過2輪的噬斑和Southern雜交斑篩選獲得純化的重組病毒BmBacEGF，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號(hào)為0593。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物是通過重組桿狀病毒BmBacEGF注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的口服藥物是通過表達(dá)人EGF的家蠶五齡幼蟲和蛹經(jīng)冷凍干燥后制成的，通過動(dòng)物試驗(yàn)表明用表達(dá)hEGF的蠶幼蟲和蛹制成口服藥物有明顯的抗乙醇損傷的胃粘膜保護(hù)作用，成為一種治療人消化性潰瘍的口服藥物的新方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將人EGF基因克隆到家蠶桿狀病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中，與線性化家蠶桿狀病毒，在家蠶細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，獲得帶人表皮生長(zhǎng)因子基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEGF，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號(hào)為0593，用重組家蠶桿狀病毒針刺接種家蠶幼蟲和蛹體，使人表皮生長(zhǎng)因子在家蠶幼蟲和蛹中獲得高效表達(dá)，將高效表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的幼蟲和蠶蛹研制成口服藥物，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明對(duì)治療消化性潰瘍具有的顯著作用，成為一種治療消化性潰瘍疾病的新方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，治療效果良好。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1405310SQ0112412
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月15日
發(fā)明者張耀洲, 金勇豐, 吳祥甫 申請(qǐng)人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司