專利名稱：一種克隆心肌細(xì)胞、心臟組織及心臟的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞、組織和器官的克隆領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及克隆心肌細(xì)胞、心臟組織及心臟的方法以及專用于該方法的轉(zhuǎn)基因載體。
背景技術(shù)：
核移植就是將供核移入受體卵母細(xì)胞質(zhì)獲得重組胚胎的過程，1997年世界上首例體細(xì)胞移植綿羊Dolly誕生，Dolly羊是以高度分化的成年母羊乳腺細(xì)胞為核供體，它采用了趨于成熟的胚胎細(xì)胞核移植程序。
美國夏威夷大學(xué)的T.wakayama等用小鼠卵丘細(xì)胞為核供體，從中克隆出小鼠而后又成功的用克隆出的小鼠卵丘細(xì)胞作核供體，從中克隆出第2代小鼠，其技術(shù)被稱為“檀香山”技術(shù)，T.wakayama，et al.，F(xiàn)ull-term development ofmice from nucleated oocyte injected with cumulus cell nuclei.Nature，(1998，394369-374)，其克隆小鼠的技術(shù)與克隆Dolly的技術(shù)有所不同1、將供體核顯微注入去核卵母細(xì)胞后使之在其中停留1-6小時(shí)，目的是給卵母細(xì)胞時(shí)間以改變供體DNA，從而使發(fā)育所必需的基因能有效表達(dá)。2、采用化學(xué)物質(zhì)激活卵母細(xì)胞，主要的化學(xué)物質(zhì)是鍶(10mMSr2+)(激活液中還包括5ug/ml的細(xì)胞松弛素B，旨在抑制極體的形成)，鍶可以刺激卵母細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)鈣的釋放，是受精后開始卵裂的信號(hào)。
隨著核移植技術(shù)發(fā)展，如何利用人體細(xì)胞的核移植技術(shù)來獲得用于治療病人所需組織或器官，科學(xué)家提出了治療性克隆概念。所謂治療性克隆，是指應(yīng)用病人的體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過一定的處理使其發(fā)育到囊胚，再利用囊胚建立ES細(xì)胞(從早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選分離出來的具有全能性和多能性的細(xì)胞)，在體外進(jìn)行誘導(dǎo)分化成特定的組織或器官(如皮膚、軟骨、乳房、腎臟、心、牙齒、心臟、肝臟、尿道、膀胱等等)，再將組織或器官移植到病人身上。利用這種方法可解決組織或器官移植過程中最重要的排斥反應(yīng)，而且解決了組織或器官的來源問題。
心臟疾病是威脅人類健康的一大重要病癥。為了治療心臟疾病，目前人工心臟是常用的治療手段。然而，人工心臟存在多種缺點(diǎn)，例如費(fèi)用昂貴，存在排異現(xiàn)象等。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)克隆心肌細(xì)胞、心臟組織和心臟的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種克隆心肌細(xì)胞、心臟組織和心臟的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供專用于所述方法的轉(zhuǎn)基因載體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種克隆心肌細(xì)胞的方法，包括步驟(a)在體外提供胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)；(b)用攜帶遺傳標(biāo)記基因載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，其中所述的載體包含心肌特異性啟動(dòng)子和抗性標(biāo)記基因，從而篩選出帶有抗性選擇基因的胚胎干細(xì)胞，獲得帶有遺傳標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞；(c)將步驟(b)中選出的胚胎干細(xì)胞經(jīng)體外定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
較佳地，所述的胚胎干細(xì)胞是通過應(yīng)用核移植技術(shù)建立體細(xì)胞克隆囊胚，然后體外培養(yǎng)所述的體細(xì)胞克隆囊胚而獲得的。其中，所述的載體含有選自下組的標(biāo)記基因新霉素抗性基因neor、潮霉素抗性基因hygro、綠色熒光蛋白基因GFP、磷酸甘油激酶基因pGK。所述的心肌特異性啟動(dòng)子包括選自下組的啟動(dòng)子心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、心室特異表達(dá)基因MLC-2C的啟動(dòng)子。
此外，在一優(yōu)選例中，所述的載體是一個(gè)有雙選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體，它是通過如下步驟構(gòu)建的(1)從人的基因組文庫中篩選心肌特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段；(2)將篩選標(biāo)記的新霉素抗性基因neor置于心肌特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制之下，同時(shí)將綠色熒光蛋白基因和hygro基因置于非組織特異性啟動(dòng)子的控制之下，從而構(gòu)成一個(gè)帶有雙選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明方法還包括步驟(d)進(jìn)一步體外誘導(dǎo)分化成心臟組織與心臟。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，它含有(1)心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第一標(biāo)記基因；以及(2)非心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述非心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第二標(biāo)記基因；
所述的第一標(biāo)記基因與第二標(biāo)記基因不相同。
較佳地，所述的心肌特異性啟動(dòng)子選自下組心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、心室特異表達(dá)基因MLC-2C的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，在所述載體中，所述的心肌特異性啟動(dòng)子包括人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子；第一標(biāo)記基因包括新霉素抗性基因；非心肌特異性啟動(dòng)子包括GK啟動(dòng)子；第二標(biāo)記基因包括磷酸甘油激酶基因pGK、綠色熒光蛋白基因、潮霉素抗性基因。


圖1是帶有多標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體的結(jié)構(gòu)示意圖。其中MHC為人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子，neo為新霉素抗性基因，pGK為磷酸甘油激酶基因，GFP為綠色熒光蛋白，Hygro為潮霉素抗性基因。
圖2是本發(fā)明一種技術(shù)方案的流程示意圖。
圖3是光學(xué)顯微鏡下顯示的ES細(xì)胞體外培養(yǎng)分化為擬胚體的照片。其中圖3A分化4天后的簡單擬胚體；圖3B分化10天后的擬胚體。
圖4顯示了在不同時(shí)間，光學(xué)顯微鏡下觀察ES細(xì)胞體外定向分化的心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性收縮的百分比。
圖5顯示了四種肌動(dòng)蛋白陽性對(duì)照RT-PCR分析結(jié)果。分別使用成對(duì)引物來擴(kuò)增從小鼠心臟、大腿骨骼肌、胃平滑肌提取的RNA。PCR結(jié)果顯示四種肌肉肌動(dòng)蛋白均能產(chǎn)生與預(yù)計(jì)片段大小一致的陽性條帶。各泳道分別是泳道1，fX174/HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2，α-心肌肌動(dòng)蛋白；泳道3，α-血管肌動(dòng)蛋白；泳道4，α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白；泳道5，γ-胃腸肌動(dòng)蛋白。
圖6顯示了四種肌動(dòng)蛋白在不同時(shí)相擬胚體中表達(dá)情況的RT-PCR分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，采用已獲得的克隆人體細(xì)胞囊胚在體外進(jìn)行培養(yǎng)，獲得ES細(xì)胞，并用帶篩選基因的基因載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得能表達(dá)心肌肌動(dòng)蛋白的ES細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞、心肌組織與心臟，從而為臨床治療提供了一條新途徑。
使用本發(fā)明方法，不僅可以為人體器官直接移植除解決供體來源問題，還可排除器官移植過程產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
如本文所用，術(shù)語“心肌特異性啟動(dòng)子”指在心肌細(xì)胞、心臟組織或心臟中發(fā)揮啟動(dòng)作用，但在其他組織(如骨骼肌、肝臟等)中并不發(fā)揮啟動(dòng)作用的啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的心肌特異性啟動(dòng)子包括各種已發(fā)現(xiàn)或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的心肌特異性啟動(dòng)子。代表性的例子包括(但并不限于)心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、心室特異表達(dá)基因MLC-2C的啟動(dòng)子等。
用于在本發(fā)明的心肌特異性啟動(dòng)子，還可含有天然與其相連的且處于其控制之下的外顯子序列。例如，當(dāng)心肌特異性啟動(dòng)子是人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子α-MHC，它可包括4.5kb的5’端側(cè)翼序列(啟動(dòng)子區(qū))和1kb含外顯子1-3的序列。當(dāng)心肌特異性啟動(dòng)子含有天然與其相連的且處于其控制之下的外顯子序列時(shí)，在轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞定向分化后，還可利用表達(dá)的所述外顯子篩選心肌細(xì)胞。
在本發(fā)明方法中，首先是在體外提供胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)。這些ES細(xì)胞可用各種常規(guī)方法獲得。一種優(yōu)選的方法是先獲得克隆體細(xì)胞囊胚，然后將囊胚體外培養(yǎng)成ES細(xì)胞。
克隆體細(xì)胞囊胚的獲得一種克隆體細(xì)胞囊胚的獲得方法詳見中國專利申請(qǐng)No.99119951.0，(1999年11月2日提交)。簡而言之，以人為例，就是通過將人體細(xì)胞直接注射到去核的人或山羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，再利用電刺激或化學(xué)激活的方法使直接注射的胚胎激活；或?qū)⑷梭w細(xì)胞直接注射到去核的山羊卵母細(xì)胞透明帶下，通過電刺激使之融合，再利用電刺激或化學(xué)激活的方法使融合卵激活。將激活的重構(gòu)胚移植到羊輸卵管內(nèi)作短暫的培養(yǎng)，回收并觀察胚胎的發(fā)育情況，獲得發(fā)育至桑椹或囊胚期胚胎。
一種代表性的方法包括以下步驟提供去核的非人哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞和用于供核的人體細(xì)胞；用顯微注射法，將用于供核的人體細(xì)胞直接注射入所述的去核供質(zhì)卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵；或者將用于供核的人體細(xì)胞直接注射入非人哺乳動(dòng)物的卵周隙中，再用電刺激法使人體細(xì)胞融合進(jìn)卵母細(xì)胞內(nèi)，形成重構(gòu)卵；
對(duì)所述的重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理，形成激活的重構(gòu)卵；將所述的激活的重構(gòu)卵移植到非人寄母動(dòng)物的輸卵管中，作短暫培養(yǎng)，再回收發(fā)育的早期胚胎。
其中，通過激活處理，形成被激活的重構(gòu)卵。本領(lǐng)域中的常規(guī)的激活處理方法都可用于本發(fā)明。通常，對(duì)重構(gòu)卵的激活處理可用電刺激和/或化學(xué)刺激法進(jìn)行。較佳地，在本發(fā)明中對(duì)重構(gòu)卵的激活處理選自下組(i)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-100μs；(ii)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-100μs(更佳地25-80μs)，然后再如下進(jìn)行化學(xué)法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM 6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小時(shí)。
囊胚體外培養(yǎng)成ES細(xì)胞1.小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的原代培養(yǎng)一種方法包括步驟解剖孕12.5-13.5天的neor小鼠，取其胚胎于PBS中洗去血塊；去除頭、四肢及內(nèi)臟團(tuán)，PBS洗滌3次；將胚胎剪成泥狀；用胰酶處理；終止消化，并離心；棄去上清，加入新的培養(yǎng)液，打勻細(xì)胞后，接種至培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)。
如果倘若消化效果不好，可嘗試以下方法在50ml血清瓶中加10ml胰酶，37℃磁力攪拌消化10分鐘，吸出5ml消化液于1號(hào)離心管中同時(shí)加5ml培養(yǎng)液。再加5ml胰酶于血清瓶中，繼續(xù)消化10分鐘，同樣吸出5ml消化液于2號(hào)離心管，重復(fù)上述步驟5次，隨后離心繼續(xù)下步操作。
2.MEF(小鼠成纖維細(xì)胞)的再培養(yǎng)待細(xì)胞80％匯合生長后，留1-2瓶傳代，其余細(xì)胞凍存。
3.飼養(yǎng)層(feeder)的制備飼養(yǎng)層制備時(shí)，接種的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶預(yù)先用0.1％的明膠處理2小時(shí)；4孔板每孔接種15萬個(gè)細(xì)胞，10cm的平皿接種500萬個(gè)細(xì)胞，也可按7.5×104-10×104/cm2MEF計(jì)算；飼養(yǎng)細(xì)胞一般使用5天，在接種前制備。
4.ES細(xì)胞的原代培養(yǎng)將囊胚置于含有小鼠成纖維細(xì)胞的多孔板中培養(yǎng)，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。同時(shí)，可設(shè)置對(duì)照，例如通過熱休克處理將囊胚置于高于正常溫度下處理一定時(shí)間，如41℃ 60分鐘。
待內(nèi)細(xì)胞團(tuán)長大后，用末端封閉的巴斯德吸管使其脫離孔底，再用毛細(xì)吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞至PBS中洗滌；胰酶消化；加入培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞打散后，再轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板培養(yǎng)。
5.ES細(xì)胞的再培養(yǎng)與細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)相同，要注意每天更換培養(yǎng)液，及時(shí)傳代(2-3天傳一次)，傳代時(shí)將細(xì)胞打散成單個(gè)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建在本發(fā)明另一方面，提供了一種用于篩選心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體，它包括心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第一標(biāo)記基因；以及(2)非心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述非心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第二標(biāo)記基因；所述的第一標(biāo)記基因與第二標(biāo)記基因不相同。
本發(fā)明轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建可用常規(guī)方法進(jìn)行。例如，從人的基因組文庫中篩選心肌特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段。然后，將篩選標(biāo)記的新霉素抗性基因(neor)置于心特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制之下，同時(shí)將綠色熒光蛋白基因和潮霉素抗性基因hygro置于非組織特異性啟動(dòng)子(GK啟動(dòng)子)的控制之下，從而構(gòu)成一個(gè)帶有雙選擇標(biāo)記基團(tuán)的轉(zhuǎn)基因載體。
在獲得了轉(zhuǎn)基因載體后，可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法來轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，并根據(jù)具體的標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。一種優(yōu)選的方法是抗生素抗性基因進(jìn)行篩選。另一種優(yōu)選方法是用利用熒光基因(如GFP基因)進(jìn)行篩選。
ES細(xì)胞分化及其衍生的心肌細(xì)胞的篩選
從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育而來的胚胎干細(xì)胞，在特定培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞在體外可分化為血液始祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，這些細(xì)胞在體外分化過程可在很大程度上模仿它們?cè)谡Ｅ咛ブ械陌l(fā)育過程。將胚胎干細(xì)胞先進(jìn)行8天的心肌細(xì)胞生成誘導(dǎo)，然后在含G418篩選培養(yǎng)液和普通培養(yǎng)液中分別再培養(yǎng)8天，對(duì)體外誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定和超微結(jié)構(gòu)分析，確定用心肌特異啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因篩選心肌細(xì)胞的有效性。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于闡述目的而不用于限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1克隆鼠體細(xì)胞囊胚的獲得將人體細(xì)胞直接注射到去核的小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，再利用電刺激或化學(xué)激活的方法使直接注射的胚胎激活；或?qū)⑿∈篌w細(xì)胞直接注射到去核的山羊卵母細(xì)胞透明帶下，通過電刺激使之融合，再利用電刺激或化學(xué)激活的方法使融合卵激活。將激活的重構(gòu)胚移植到小鼠輸卵管內(nèi)作短暫的培養(yǎng)，回收并觀察胚胎的發(fā)育情況，獲得發(fā)育至桑椹或囊胚期胚胎(圖2)。
實(shí)施例2囊胚體外培養(yǎng)成ES細(xì)胞1.小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的原代培養(yǎng)i)解剖孕12.5-13.5天的neor小鼠(由上海市轉(zhuǎn)基因研究中心胚胎工程部提供)，取其胚胎于PBS中洗去血塊；ii)去除頭，四肢，及內(nèi)臟團(tuán)，PBS洗滌3次；iii)轉(zhuǎn)移胚胎至一小的培養(yǎng)皿中，用剪刀將胚胎剪成泥狀；iv)用吸管轉(zhuǎn)移胚胎至50ml血清瓶中，加入5-10ml胰酶，37℃，磁力攪拌消化20分鐘；v)加入25ml培養(yǎng)液終止消化，500g離心15分鐘；
VI)棄去上清，加入新的培養(yǎng)液，打勻細(xì)胞后，接種至培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)。
2.EF的再培養(yǎng)待細(xì)胞80％匯合生長后，留1-2瓶傳代，其余細(xì)胞凍存。
傳代1)棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次；2)加胰酶消化1分鐘，而后加入培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5分鐘；3)棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，打勻細(xì)胞后，將其傳至培養(yǎng)瓶。
凍存1)按常規(guī)培養(yǎng)將細(xì)胞制成懸液，計(jì)數(shù)，令細(xì)胞密度達(dá)到5×106/ml左右；2)用培養(yǎng)液+DMSO配成10％的DMSO培養(yǎng)液，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打細(xì)胞；3)分裝凍存管，置于泡沫盒中，放在-80℃，幾天后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
復(fù)蘇1)從液氮中取出凍存管，不時(shí)搖動(dòng)，使其急速融化，一般在30秒至1分鐘內(nèi)完成；2)吸取凍存液至離心管中，1000rpm離心5分鐘；3)棄去上清，加入新的培養(yǎng)液，混勻后接種至培養(yǎng)瓶；4)次日更換培養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。
3.飼養(yǎng)層的制備1)棄去舊的培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)液，37℃溫育3-5小時(shí)；2)PBS洗滌4遍以徹底清除殘留的絲裂霉素C；3)胰酶消化1分鐘，而后加入培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5分鐘；4)棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，打勻細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；5)按所需細(xì)胞數(shù)將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。
4.ES細(xì)胞的原代培養(yǎng)1)將囊胚置于含有MEF的4孔板中培養(yǎng)，加1ml培養(yǎng)液，對(duì)照熱休克處理將囊胚置于高于正常溫度下處理一定時(shí)間，如41℃60分鐘；
2)待內(nèi)細(xì)胞團(tuán)長大后，用末端封閉的巴斯德吸管使其脫離孔底，再用毛細(xì)吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞至PBS中洗滌1-2次；3)用毛細(xì)吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞至胰酶中消化3-4分鐘(37℃)；4)加入培養(yǎng)液終止消化，用口徑很小的吸管將細(xì)胞打散成3-4個(gè)細(xì)胞小團(tuán)塊，再轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板培養(yǎng)。
5.ES細(xì)胞的再培養(yǎng)與細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)相同，要注意每天更換培養(yǎng)液，及時(shí)傳代(2-3天傳一次)，傳代時(shí)將細(xì)胞打散成單個(gè)細(xì)胞。
6.細(xì)胞系的鑒定采用以下方法進(jìn)行細(xì)胞系鑒定(1)AKP染色鈣-鈷法顯示堿性磷酸酶固定福爾馬林-鈣，4℃制片冰凍切片，恒冷切片A.作用液3％β-甘油磷酸鈉 2.5ml2％巴比妥鈉2.5ml2％氯化鈣 5.0ml5％氯化鎂 0.25ml雙蒸水 0.25ml調(diào)節(jié)PH至 9.0-9.4B.2％硝酸鈷C.1％硫化銨D.2％甲基綠操作程序1)切片入蒸餾水，入作用液，37℃，25分鐘至6小時(shí)(時(shí)間視固定，制片方法及組織內(nèi)酶活性強(qiáng)弱而定，恒冷切片需時(shí)較短)；2)蒸餾水洗2次；3)硝酸鈷3分鐘；4)蒸餾水充分漂洗；
5)硫化銨2分鐘；6)蒸餾水充分漂洗；7)甲基綠對(duì)比染色1-2分鐘；(此步可省)8)自來水洗，甘油明膠封蓋。
結(jié)果堿性磷酸酶-棕黑色，細(xì)胞核-綠色。
對(duì)照1)底物對(duì)照作用液中以蒸餾水代替β-甘油磷酸鈉；2)制酶活性對(duì)照作用液前先將切片以L-四咪唑(tetramisol)10-4mol/L處理。
(2)體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)1)取1-2板長滿ES細(xì)胞的3.5cm培養(yǎng)皿，用常規(guī)傳代的方法將其制成單細(xì)胞懸液；2)取少許細(xì)胞懸液，適度稀釋后計(jì)數(shù)；3)離心(1000rpm，10min)，棄上清；4)加少量培養(yǎng)基(約0.5×107-1×107/0.1ml)；5)取同性別小鼠，在其腹股溝處注射ES細(xì)胞懸液，每只小鼠1×107細(xì)胞；6)兩周后觀察，4-5周后，處死小鼠，取出腫塊；7)固定，切片，染色觀察。
(3)形態(tài)學(xué)觀察及生長曲線的測定基本上按照《動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用》(陳瑞銘主編)的方法進(jìn)行。
生長曲線的測定1.按常規(guī)制備細(xì)胞懸液，再用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至104個(gè)/ml，105個(gè)/ml兩個(gè)濃度；2.從4個(gè)培養(yǎng)體系個(gè)各取1ml細(xì)胞懸液，接種至24孔板，每種細(xì)胞濃度做3個(gè)平行，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時(shí)后，將培養(yǎng)液吸出，加入胰酶消化，隨后從孔中取出細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，其余放回CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；3.定時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)/ml作為縱坐標(biāo)，與之相對(duì)應(yīng)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，作曲線。細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間為倍增時(shí)間。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
1.從人的基因組文庫中篩選心肌特異的人肌球蛋白重鏈(MHC)啟動(dòng)子取1ul人基因組文庫為模板，用MHC啟動(dòng)子特異的引物15-’TCATTGCTGAAACCGAGAA-3’(SEQ ID NO1)；引物25’-TTGCCTGCACAGTGACTAG-3’(SEQ ID NO2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得688bp的目的片段，回收。采用Promega公司pGEM-T載體，用Nco I和Spe I酶切后將目的片段用T4連接酶連接到T載體上(3674bp)。制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，挑單菌落測序。測序正確后大提質(zhì)粒DNA，用Nco I和Spe I酶切鑒定后，用[α-32P]dCTP標(biāo)記探針，與人的基因組文庫雜交，依據(jù)《分子克隆》操作。挑取陽性菌落，提取DNA，獲得的α-MHC啟動(dòng)子含有4.5kb的5’端側(cè)翼序列及1kb的包含外顯子1-3的基因，但不包括起始密碼子。
2.從pMC1-neo polyA(購自Stratagene公司)載體中用SalI和XhoI酶切獲得1146bp的新霉素基因neor cDNA片段。
3.用T4連接酶連接MHC-neor cDNA片段，12-16℃過夜。
4.克隆磷酸甘油酸激酶(pGK)-潮霉素(hygro)cDNA片段取1ul人基因組文庫為模板，用pGK啟動(dòng)子特異的引物15’-TGGGTCTCGCACATTCTTCA-3’(SEQ ID NO3)，引物2 GGTCTTTCGTGGGCTTCAGT(SEQID NO4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得692bp的目的片段，回收、測序。測序結(jié)果與GenBank中人pGK基因序列(L00159)進(jìn)行比較，結(jié)果正確。然后將pGK片段與購自Stratagene公司的Hygromycin B基因片段用T4連接酶進(jìn)行連接，形成pGK-hygro片段。
5.克隆pGK-GFP cDNA片段同步驟4，將獲得的pGK片段與購自Invitrogen公司的GFP連接，形成pGK-GFP。
6.取MHC-neo cDNA片段，pGK-hygro cDNA片段，PBM20載體(BoehringerMannheim公司)(帶有HindIII和XhoI酶切位點(diǎn))，pGK-GFP cDNA片段，T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。
7.制備感受態(tài)細(xì)菌。
8.取連接產(chǎn)物于JM109感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
9.挑取轉(zhuǎn)化皿上的單菌落，接種于LB培養(yǎng)基中(含100ug/ml Amp)。
10.提取質(zhì)粒。
11.酶切鑒定(XhoI和HindIII)，獲得帶有多標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體。
在構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體中，有關(guān)元件的結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中MHC為人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子，neo為新霉素抗性基因，pGK為磷酸甘油激酶基因，GFP為綠色熒光蛋白，Hygro為潮霉素抗性基因。
實(shí)施例4ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選用實(shí)施例3制備的轉(zhuǎn)基因載體(打靶載體)通過以下方法轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞1、復(fù)蘇的ES細(xì)胞傳代后的第2天(36hr)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
2、轉(zhuǎn)染2hr前，換新鮮的培養(yǎng)基。
3、吸棄培養(yǎng)基，用PBS漂洗培養(yǎng)皿2次4、每100mm培養(yǎng)皿加1.5ml 0.25％胰酶，37℃，5min。
5、加3.5ml ES細(xì)胞培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)抽吸，20次。用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞總數(shù)，通常每個(gè)打靶載體每次轉(zhuǎn)染約需2×107個(gè)細(xì)胞。
6、1000rpm，2min離心ES細(xì)胞懸液。吸棄上清，將細(xì)胞重懸于10ml PBS中。
7、重新離心，1000rpm，2min。將細(xì)胞重懸于PBS中，使細(xì)胞密度達(dá)到2×107/ml。
8、將30～50μg線性化的打靶載體DNA與1ml細(xì)胞混勻裝入電穿孔槽中，室溫放置5min。
9、在基因脈沖儀中電擊(600V，25μF)，室溫放置1min。
10、將電穿孔槽中的細(xì)胞與7ml新鮮的ES細(xì)胞培養(yǎng)基混勻，分入4個(gè)已長滿滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中(100mm)。
11、將40μl未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于一個(gè)100mm培養(yǎng)皿中作為對(duì)照。
12、24小時(shí)后，換成潮霉素(200μg/ml)ES細(xì)胞篩選培養(yǎng)基，此后每天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。
13、通常轉(zhuǎn)染7天后可以開始挑取克隆進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例5篩選后ES細(xì)胞定向分化成心肌細(xì)胞將實(shí)施例4中挑取的單個(gè)未分化的ES克隆在熒光顯微鏡下篩選，含有綠色熒光蛋白的克隆進(jìn)行擴(kuò)增。用PCR鑒定含有MHC-neor和-hygro片段的胚胎干細(xì)胞。將這些胚胎干細(xì)胞先進(jìn)行8天的心肌細(xì)胞生成誘導(dǎo)，然后在含G418篩選培養(yǎng)液和普通培養(yǎng)液中分別再培養(yǎng)8天，對(duì)體外誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定和超微結(jié)構(gòu)分析，確定用心肌特異啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因篩選心肌細(xì)胞的有效性。
1.分化ES細(xì)胞的懸滴培養(yǎng)未分化的ES細(xì)胞經(jīng)0.05％Trypsin+0.53mM EDTA消化為分散的ES細(xì)胞，離心去除上清(以便去除LIF)。加入10ml ES細(xì)胞分化培養(yǎng)基(不含LIF，15％FBS增加為20％FBS)。反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，用多孔移液管在100mm組織培養(yǎng)皿蓋下面滴加5排30μl/滴(104cells/ml)的細(xì)胞液，小心翻轉(zhuǎn)蓋子，并置于含10mlPBS培養(yǎng)皿上。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天。
2.分化ES細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)ES細(xì)胞經(jīng)兩天懸滴培養(yǎng)后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子并收集，置于含10ml分化培養(yǎng)基的陪氏培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)五天，隔天換液。
結(jié)果形成了擬胚體。ES細(xì)胞經(jīng)過2天懸滴培養(yǎng)、2天懸浮培養(yǎng)后，便形成簡單擬胚體(simple embryoid body，SEB)(圖3A)。細(xì)胞外周可見內(nèi)胚層細(xì)胞，內(nèi)胚層細(xì)胞的形成被認(rèn)為是下一步分化起始所需的先決條件。SEB再經(jīng)過進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)便可見囊性擬胚體(cystic embryoid body，CEB)(圖3B)，體積變大，包括柱狀外胚層樣細(xì)胞的內(nèi)層和此結(jié)構(gòu)內(nèi)部累積的液體。
3.ES細(xì)胞定向分化培養(yǎng)為心肌細(xì)胞將經(jīng)兩天懸滴培養(yǎng)、五天懸浮培養(yǎng)的擬胚體轉(zhuǎn)移到含2ml分化培養(yǎng)基、經(jīng)0.1％明膠處理的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種一個(gè)擬胚體，令ES細(xì)胞貼壁成長為心肌細(xì)胞。
結(jié)果懸浮培養(yǎng)5天后的ES細(xì)胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)后，在接種的第2天，光學(xué)顯微鏡下即可見自發(fā)節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。隨著細(xì)胞的進(jìn)一步培養(yǎng)，出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞數(shù)目百分比逐漸增大，有的擬胚體在鏡下可見多個(gè)有著獨(dú)立收縮頻率的收縮區(qū)域，可以分為心肌細(xì)胞收縮區(qū)，平滑肌收縮區(qū)，肌小管收縮區(qū)，收縮頻率為10-220次/分。本實(shí)驗(yàn)采用懸滴-懸浮兩步培養(yǎng)法，較懸浮一步培養(yǎng)法有明顯的優(yōu)越性，擬胚體的形態(tài)更飽滿，懸浮培養(yǎng)時(shí)貼壁細(xì)胞數(shù)目少，貼壁培養(yǎng)后出現(xiàn)自發(fā)性收縮細(xì)胞的百分比較一步法高。在培養(yǎng)后期，自發(fā)性收縮心肌細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，心跳頻率逐漸降低，有的細(xì)胞出現(xiàn)間歇性停跳，直至最后完全停跳，整個(gè)培養(yǎng)過程為40天(圖4)。
實(shí)施例6ES細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的 RT-PCR的鑒定對(duì)心肌、骨骼肌、腸道平滑肌、血管平滑肌肌動(dòng)蛋白特異的上下游引物的合成。這些探針的3’-未翻譯區(qū)為心肌肌動(dòng)蛋白5’-GGCTAAGAGAGACATCTC-3’(SEQ ID NO5)，骨骼肌肌動(dòng)蛋白5’-CGAGTCAATCTATGTACACG-3’(SEQ ID NO6)，腸道平滑肌肌動(dòng)蛋白5’-AAGGCTTGAAGGTTTTAATGATCTGTGGCTGGTGACCAAGTCTTGTGGGGATCCCAGAGAAGG-3’(SEQ ID NO7)，血管平滑肌肌動(dòng)蛋白5’-CACAGTTGTGTGCTAGAGGCAG-3’(SEQ ID NO8)。
心肌肌動(dòng)蛋白，骨骼肌肌動(dòng)蛋白，腸道平滑肌肌動(dòng)蛋白的5’端引物均為5’-GCTCCCAGCACCATGAAGA TCAAG-3’(SEQ ID NO9)；血管平滑肌肌動(dòng)蛋白的5’引物為5’-GCACCCAGCACCATGAAGATCAAG-3’(SEQ IDNO10)。
對(duì)擬胚體各時(shí)相的總體RNA的提取采用Trizol試劑，依據(jù)操作說明進(jìn)行。以3’端未翻譯區(qū)作為上游引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA單鏈作為模板，5’-肌動(dòng)蛋白作為下引物，PCR循環(huán)參數(shù)為94℃變性3分鐘，接著32個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
提取小鼠心臟、腿部骨骼肌、胃、股動(dòng)脈RNA做陽性對(duì)照。用上述引物對(duì)來擴(kuò)增從小鼠心臟、大腿骨骼肌、胃平滑肌提取的RNA。PCR結(jié)果顯示四種肌肉肌動(dòng)蛋白均能產(chǎn)生與預(yù)計(jì)片段大小一致的陽性條帶。
提取擬胚體在7天、7+3天、7+5天、7+8天、7+15天、7+19天的總體RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，除胃腸道肌動(dòng)蛋白在第7天外，均能擴(kuò)增出與陽性對(duì)照一致的擴(kuò)增帶(圖6)。這表明分化的擬胚體提供了一個(gè)體外研究紋狀肌(心肌和骨骼肌)和平滑肌(血管和胃腸道平滑肌)細(xì)胞基因表達(dá)的系統(tǒng)。
序列表<110>上海中路生物工程有限公司中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所北京市心肺血管疾病研究所<120>一種克隆心肌細(xì)胞、心臟組織及心臟的方法<130>011723<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>19<212>DNA<213>合成的引物<400>1tcattgctga aaccgagaa 19<210>2<211>19<212>DNA<213>合成的引物<400>2ttgcctgcac agtgactag 19<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3tgggtctcgc acattcttca20<210>4<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>4ggtctttcgt gggcttcagt20<210>5<211>18<212>DNA<213>合成的引物<400>5ggctaagaga gacatctc 18<210>6<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>6cgagtcaatc tatgtacacg20<210>7<211>63<212>DNA<213>合成的引物<400>7aaggcttgaa ggttttaatg atctgtggct ggtgaccaag tcttgtgggg atcccagaga60agg 63<210>8<211>22<212>DNA<213>合成的引物<400>8cacagttgtg tgctagaggc ag 22<210>9<211>24<212>DNA<213>合成的引物<400>9gctcccagca ccatgaagat caag24<210>10<211>24<212>DNA<213>合成的引物<400>10gcacccagca ccatgaagat caag2權(quán)利要求
1.一種克隆心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟(a)在體外提供胚胎干細(xì)胞；(b)用攜帶遺傳標(biāo)記基因載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，其中所述的載體包含心肌特異性啟動(dòng)子和抗性標(biāo)記基因，從而篩選出帶有抗性選擇基因的胚胎干細(xì)胞，獲得帶有遺傳標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞；(c)將步驟(b)中選出的胚胎干細(xì)胞經(jīng)體外定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細(xì)胞是通過應(yīng)用核移植技術(shù)建立體細(xì)胞克隆囊胚，然后體外培養(yǎng)所述的體細(xì)胞克隆囊胚而獲得的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體含有選自下組的標(biāo)記基因新霉素抗性基因neor、潮霉素抗性基因hygro、綠色熒光蛋白基因GFP、磷酸甘油激酶基因pGK。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的心肌特異性啟動(dòng)子包括選自下組的啟動(dòng)子心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、心室特異表達(dá)基因MLC-2C的啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體是一個(gè)有雙選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體，它是通過如下步驟構(gòu)建的(1)從人的基因組文庫中篩選心肌特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段；(2)將篩選標(biāo)記的新霉素抗性基因neor置于心肌特異的人α心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制之下，同時(shí)將綠色熒光蛋白基因和hygro基因置于非組織特異性啟動(dòng)子的控制之下，從而構(gòu)成一個(gè)帶有雙選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因載體。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括步驟(d)進(jìn)一步體外誘導(dǎo)分化成心臟組織與心臟。
7.一種載體，其特征在于，它含有(1)心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第一標(biāo)記基因；以及(2)非心肌特異性啟動(dòng)子元件以及位于所述非心肌特異性啟動(dòng)子控制之下的第二標(biāo)記基因；所述的第一標(biāo)記基因與第二標(biāo)記基因不相同。
8.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述的心肌特異性啟動(dòng)子選自下組心肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、心室特異表達(dá)基因MLC-2C的啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述的心肌特異性啟動(dòng)子包括人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子；第一標(biāo)記基因包括新霉素抗性基因；非心肌特異性啟動(dòng)子包括GK啟動(dòng)子；第二標(biāo)記基因包括磷酸甘油激酶基因pGK、綠色熒光蛋白基因、潮霉素抗性基因。
10.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述的心肌特異性啟動(dòng)子是人肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子α-MHC，且包括4.5kb的5’端側(cè)翼序列和1kb含外顯子1-3的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種克隆心肌細(xì)胞的方法，包括步驟(a)在體外提供胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)；(b)用攜帶遺傳標(biāo)記基因載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，其中所述的載體包含心肌特異性啟動(dòng)子和抗性標(biāo)記基因，從而篩選出帶有抗性選擇基因的ES細(xì)胞，獲得帶有遺傳標(biāo)記的ES細(xì)胞；(c)將步驟(b)中選出的ES細(xì)胞經(jīng)體外定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。本發(fā)明還提供了有關(guān)的轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明方法可高效專一地獲得定向分化的心肌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1397646SQ0112612
公開日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2001年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者成國祥, 楊曉, 黃益民, 陳建泉, 孫彥洵 申請(qǐng)人:上海杰隆生物工程股份有限公司, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 北京市心肺血管疾病研究所