專利名稱：人工序列模板引物集及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種人工序列模板引物集，以及使用該人工序列模板引物集來檢測和/或定量核酸的方法。
背景技術(shù)：
近來，為了滿足快速準(zhǔn)確地檢測和/或定量病原體(如病毒、細(xì)菌、真菌)，以及正常和不正?；蛑械奶禺愋院怂嵝蛄校延虚_發(fā)了大量技術(shù)。這些技術(shù)在檢測和定量食品、環(huán)境樣品、種畜和其他類型物質(zhì)中微生物方面有著廣闊的用途，在這些場合下需要監(jiān)測某種推定微生物是否存在。其他應(yīng)用包括用于法醫(yī)學(xué)、分子病理學(xué)、人類學(xué)、考古學(xué)和生物學(xué)等方面。
實現(xiàn)這類任務(wù)的一種常見做法是核酸雜交。該方法基于兩條核酸鏈在合適條件下形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力，其中這兩條核酸鏈含有互補或基本互補的序列從而能夠特異性地結(jié)合。為了檢測和/或定量特定的核酸序列(稱為“靶序列”)，需制備標(biāo)記的寡核苷酸(“探針”)，該探針含有與靶序列互補的序列。為了靈敏地檢測和/或定量微量的遺傳物質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多更成熟的技術(shù)，它們通常涉及在測試樣品中擴增靶核酸(DNA或RNA)并隨后進行檢測，其中包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈取代擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(transcription mediatedamplication，TMA)和自動維持合成反應(yīng)(3SR)。
盡管所有這些技術(shù)都是檢測和鑒別樣品中微量靶核酸的有利工具，但是它們有各種不同的問題，這些問題限制了它們在臨床實驗室環(huán)境下用于常規(guī)操作時的應(yīng)用性。最困難的問題之一是，在每種測試中擴增靶核酸以便隨后進行檢測和定量分析的條件是不同的。換言之，沒有利于測試標(biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)一條件。
此外，對于目前的基于靶序列擴增的核酸檢測和/或定量方法而言，準(zhǔn)確地檢測和/或定量具有不同基因型或突變(如導(dǎo)致抗藥性的突變)的病原體一直是眾所周知的挑戰(zhàn)。
分支DNA(bDNA)法是一種新興的信號擴增技術(shù)，它可提供高重復(fù)性和準(zhǔn)確度。然而，該方法本身的靈敏度有限，且難以為常規(guī)實驗室所廣泛采用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)易用、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和/或定量樣品中病原體和基因表達的分析技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于檢測和/或定量樣品中病原體和基因表達的易用、靈敏、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。本發(fā)明的新技術(shù)可以克服現(xiàn)有技術(shù)中的許多局限。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸檢測方法，它包括步驟(1)在含有報告分子的核酸擴增反應(yīng)體系中，用人工序列模板引物集待測樣品進行核酸擴增反應(yīng)，其中所述引物集包括特異性結(jié)合于被檢測核酸序列并引發(fā)目的核酸擴增反應(yīng)的引物對，且至少一個引物是人工序列模板引物，該人工序列模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于人工序列模板引物3′端，用于與被檢測核酸序列特異性結(jié)合；(b)公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)和公用引物區(qū)，報告分子可特異性結(jié)合于該報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，且所述的報告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測的信號(i)結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，和(ii)報告分子被切斷或被取代；(2)檢測報告分子所產(chǎn)生的可檢測信號。
在一優(yōu)選例中，所述報告分子的數(shù)量大于或等于人工序列模板引物的數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，使用兩種或兩種以上不同的人工序列模板引物集，這些人工序列模板引物集分別特異性地結(jié)合于不同被檢測體的靶序列、同一被檢測體的不同靶序列、同一被檢測體的相同靶序列的不同區(qū)域、或其組合，并且這些人工序列模板引物集的報告分子結(jié)合區(qū)分別與相同或不同的報告分子發(fā)生特異性結(jié)合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種人工序列模板引物集，所述引物集包括特異性結(jié)合于被檢測序列并引發(fā)目的核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物對，其中至少一個引物是人工序列模板引物，該人工序列模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于人工序列模板引物3′端，用于與被檢測核酸序列特異性結(jié)合；(b)公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)和公用引物區(qū)，報告分子可特異性結(jié)合于該報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，且所述的報告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測的信號(i)結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，和(ii)報告分子被切斷或被取代。
在一優(yōu)選例中，人工序列模板引物還在特異結(jié)合區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，和/或在公用引物區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，所述的間隔區(qū)為1-20bp，較佳地為5-10bp。
在另一優(yōu)選例中，所述的人工序列模板引物集還包括用于增加被檢測核酸模板數(shù)量的擴增模板引物。
在另一優(yōu)選例中，所述人工序列模板引物的公用引物區(qū)的長度為0bp。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸檢測試劑盒，它含有本發(fā)明所述的人工序列模板引物集。


圖1顯示了本發(fā)明的人工序列模板引物的兩種結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2顯示了本發(fā)明人工序列模板引物集的各種組合形式。
圖3顯示了本發(fā)明人工序列模板檢測中信號產(chǎn)生幾種示意圖。
圖4是本發(fā)明一種核酸檢測方法的示意圖，其中使用的人工序列模板引物集含有一個人工序列模板引物，其報告分子結(jié)合與人工序列模板的報告分子結(jié)合區(qū)。
圖5是本發(fā)明一種核酸檢測方法的示意圖，其中使用的人工序列模板引物集含有一個人工序列模板引物、一個常規(guī)引物、一個公用引物和一個擴增模板引物，其報告分子結(jié)合與人工序列模板的報告分子結(jié)合區(qū)。
具體實施例方式
如本文所用，下列詞語/術(shù)語具有下列含義，除非另外說明。
“核酸”核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多核苷酸類似物、RNA或DNA的寡核苷酸類似物。
“模板”能夠被核酸聚合酶擴增的核酸分子的全長或部分序列。模板可以是RNA或DNA、或其類似物，并且可以是單鏈、雙鏈或部分雙鏈的。
“人工序列模板(AT)引物”人工序列模板引物是合成的寡核苷酸序列。參見圖1A，人工序列模板引物的3′端有特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)互補于靶序列并作為引物在擴增反應(yīng)中延伸。此外，人工序列模板引物還含有公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)(或其互補序列)和公用引物區(qū)。報告分子可特異性結(jié)合于該報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈。人工序列模板引物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法合成。
一種特殊形式的人工序列模板引物的公用引物區(qū)的長度為0bp，如圖1B所示。
如本文所用，“報告分子結(jié)合區(qū)”指與人工序列模板引物上報告分子發(fā)生結(jié)合的區(qū)域。當(dāng)然，報告分子可以直接結(jié)合于人工序列模板引物上的該報告分子結(jié)合區(qū)，也可結(jié)合于該結(jié)合區(qū)的互補鏈(為方便起見，人工序列模板引物上的與報告分子序列一樣的區(qū)域仍被稱為“報告分子結(jié)合區(qū)”)。
此外，一種優(yōu)選的人工序列模板引物還在特異結(jié)合區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，和/或在公用引物區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，所述的間隔區(qū)為1-20bp(較佳地為3-10bp，更佳地為5-10bp)。添加間隔區(qū)的主要目的是(1)調(diào)節(jié)人工序列模板引物的Tm，使人工序列模板引物集中各引物的Tm接近或相同；(2)防止某些二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體等)的形成；和/或(3)防止空間位阻。然而應(yīng)理解，并不是所有情況下都需要間隔區(qū)，有時并不需要間隔區(qū)。取決于待檢測的序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定人工序列模板引物是否需要間隔區(qū)，以及間隔區(qū)的長短和組成。
“報告分子”是一種用于產(chǎn)生可檢測信號的分子。所述的報告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測的信號(i)結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)或其互補序列區(qū)域，和(ii)報告分子被切斷或被取代。合適的報告分子例子是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的探針和含稀土元素的寡核苷酸鏈。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是利用不同熒光物質(zhì)激發(fā)光波長、發(fā)射光波長間的相互作用，對某些特定波長光進行檢測的一種信號檢測原理?；诖嗽懋a(chǎn)生信號的探針被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移型探針。特別合適的熒光共振能量轉(zhuǎn)移型探針包括(但并不限于)Taqman探針、分子信標(biāo)(molecular beacon)(圖3D)、FRET雙探針(圖2J)和肽核酸(peptide nucleic acid)信號探針(簡稱為PNA信號探針)。
“Taqman探針”是一種在其5′端帶有報告基團并且在3′端帶有猝滅基團的寡核苷酸，所述的猝滅基團會抑制報告基團產(chǎn)生可檢測的信號(例如熒光)。Taqman探針設(shè)計是現(xiàn)有技術(shù)，并且可以從公開途徑獲得有關(guān)信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996 Oct.；6(10)986-94)。
圖3顯示了本發(fā)明人工序列模板檢測中信號產(chǎn)生幾種示意圖。圖3A和圖3B為Taqman探針因切割而產(chǎn)生可檢測信號，圖3C為FRET雙探針因酶切或取代而產(chǎn)生可檢測信號。圖3D為分子信標(biāo)因雜交而產(chǎn)生可檢測信號。
“人工序列模板”指在本發(fā)明的PCR過程中，擴增出的摻入了人工序列模板引物的核酸序列，或其反義核酸序列。這些人工序列模板既具有對應(yīng)于靶序列的核苷酸序列，又具有對應(yīng)于人工序列模板引物公用區(qū)(包括報告分子結(jié)合區(qū)、公用引物區(qū)和間隔區(qū))的核苷酸序列。在隨后的PCR擴增循環(huán)中，這些人工序列模板作為模板起作用。
本發(fā)明所公開的方法原則上歸為信號擴增法。其關(guān)鍵是使用了合適的含人工序列的核酸序列作為信號擴增的模板(在此稱為“人工序列模板”)，因此相應(yīng)的方法被稱為“人工序列模板擴增的核酸分析”(AT分析)。AT分析可靈敏、準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化地檢測和/或定量靶核酸分子。
在本發(fā)明中，對于待測樣品沒有限制，只要其中含有遺傳物質(zhì)即可。代表性的待測樣品包括(但并不限于)DNA樣品、RNA樣品、和從RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品，以及其他形式的修飾過的多聚核苷酸。
在本發(fā)明的人工序列模板引物中，對所述的特異結(jié)合區(qū)的長度沒有特別限制，通常其長度為6-35bp，較佳地為15-25bp。對于所述公用區(qū)的也沒有特別限制，通常其長度為8-100bp，較佳地為20-60bp，更佳地約為30-50bp。
人工序列模板引物中含有的核苷酸通常選自A、T、C、G。然而，在所述的人工序列模板引物中含有其他一些核苷酸以產(chǎn)生特殊的檢測效果，如增加特異性、摻入熒光分子、或增加與模板的結(jié)合等。合適的例子但不限于選自下組的核苷酸isoG、isoC、2′-O-甲基-G、2′-O-甲基-C、及其組合。
在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，報告分子與人工序列模板引物的數(shù)量關(guān)系沒有特別限制。然而，較佳地，所述報告分子的數(shù)量應(yīng)大于或等于人工序列模板引物的數(shù)量，通常報告分子與人工序列模板引物之比大于1∶1-10∶1，更佳地為1.5∶5∶1。這樣，在反應(yīng)體系中，人工序列模板引物便基本上都處于與報告分子結(jié)合的狀態(tài)。
當(dāng)報告分子是Taqman探針時，Taqman探針與人工序列模板引物報告分子結(jié)合區(qū)的Tm，宜高于人工序列模板引物特異結(jié)合區(qū)與模板的Tm。通常，高出2-15℃，較佳地高出5-12℃。
此外，在本發(fā)明的人工序列模板引物集中還可包括一個或多個“擴增模板引物”。如本文所用，“擴增模板引物”指用于增加被檢測核酸序列(模板)數(shù)量的引物。擴增模板引物結(jié)合于待檢測序列的上游或下游，在擴增反應(yīng)中可有效地提高模板的數(shù)量，從而提供檢測的靈敏度。應(yīng)理解，“擴增模板引物”是常規(guī)引物，只是其作用是提高待檢測模板的數(shù)量而已。
在本發(fā)明中，如圖2所示，人工序列模板引物集有多種組合形式，其中包括(但并不限于)(1)下游為人工序列模板引物，上游為常規(guī)引物，報告分子與人工序列模板引物結(jié)合(圖2A)，或上下游引物位置互換(圖2B)；(2)圖2A的引物集與一條擴增模板引物形成的組合(圖2C)，圖2B的引物集與一條擴增模板引物形成的組合(圖2D)。即上下游為常規(guī)引物對，中間為一條人工序列模板引物，報告分子與人工序列模板引物結(jié)合。
(3)兩條人工序列模板引物與兩條擴增模板引物構(gòu)成的組合(圖2E)。即上下游為常規(guī)引物對，中間為一對方向相對的人工序列模板引物，報告分子與人工序列模板引物結(jié)合；(4)上下游為常規(guī)引物對，中間兩條人工序列模板引物方向相反，報告分子與人工序列模板引物結(jié)合(圖2F)；(5)下游為人工序列模板引物，上游為常規(guī)引物，報告分子與人工序列模板引物的互補序列結(jié)合(圖2G)，或上下游引物位置互換(未示出)；(6)圖2G的引物集與一條擴增模板引物形成的組合(圖2H)，即上下游為常規(guī)引物對，中間為一條人工序列模板引物，報告分子與人工序列模板引物互補序列結(jié)合，或人工序列模板引物方向變換；(7)上游為常規(guī)引物，下游為人工序列模板引物，報告分子分別標(biāo)記在人工序列模板引物及報告分子上(圖2I)，或人工序列模板引物方向變換(未示出)；或者圖2I的引物集與一條擴增模板引物形成的組合(圖2J)；(8)圖2E+圖2G的組合，即上下游為常規(guī)引物對，中間為一對反向相對的人工序列模板引物，報告分子與人工序列模板引物互補序列結(jié)合(未示出)(9)圖2F+圖2G的組合，即上下游為常規(guī)引物對，中間兩條人工序列模板引物方向相反，報告分子與人工序列模板引物互補序列結(jié)合(未示出)；
(10)圖2E+圖2I的組合，即上下游為常規(guī)引物對，中間為一對相反相對的人工序列模板引物，報告分子分別標(biāo)記在人工序列模板引物及報告分子上(未示出)；(11)圖2F+圖2I的組合，即上下游為常規(guī)引物對，中間為兩條方向相反的人工序列模板引物，報告分子分別標(biāo)記在人工序列模板引物及報告分子上(未示出)。
在本發(fā)明方法中，在同一被檢測核酸序列上可同時放置一個或多個人工序列模板引物集。這樣可以同時檢測被檢測核酸序列上的不同位置。
在本發(fā)明中，對于與人工序列模板引物結(jié)合的報告分子而言，不同的人工序列模板引物可結(jié)合相同的報告分子，也可結(jié)合不同的報告分子(例如帶有發(fā)不同熒光的報告基團和相應(yīng)猝滅基團的報告分子，序列相同或不同的報告分子)。
對于人工序列模板引物集擴增出的人工序列模板的長度沒有特別限制。按人工序列模板引物集的兩個引物的特異結(jié)合區(qū)的3′端在模板上相距的距離表示，通常為1bp-10kb，較佳地為1-2kb，更佳地為1-500b，最佳地為1-100bp。尤其是是當(dāng)間距小于100bp時，可設(shè)計針對例如病原體高保守區(qū)的引物集，從而降低假陰性率。此外，間距越短，越可發(fā)揮人工序列模板的共性。
下面結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明。
擴增模式(一)、使用含人工序列模板引物和常規(guī)引物的引物集(圖2A所示的組合)進行核酸擴增分析現(xiàn)參見圖4。在該例子中，使用一個人工序列模板引物集，該引物集包括一個人工序列模板引物1和一個常規(guī)引物2。此外，反應(yīng)體系中還包括公用引物3和報告分子4構(gòu)成。在該例子中，待檢測的樣品是RNA或DNA。
步驟1將引物集和待測樣品置于反應(yīng)體系中。
步驟2在合適的條件下，發(fā)生退火(或雜交)，即人工序列模板引物1的3′端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列。
步驟3在逆向轉(zhuǎn)錄酶(對于RNA靶序列)或DNA聚合酶(對于DNA靶序列)，人工序列模板引物的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA雙鏈。
步驟4形成的雙鏈核酸在合適的條件下變性，形成單鏈靶序列和新合成的DNA序列(即人工序列模板)?；蛘哂肦Nase水解RNA鏈，形成新合成的DNA序列(即人工序列模板)。
必要時，在合適的條件下重復(fù)上述步驟3-4。
步驟5常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的DNA序列的互補區(qū)域。
步驟6在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。當(dāng)常規(guī)引物2的3′端延伸到結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)的報告分子處時，會發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報告分子從人工序列模板上取代下來；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報告分子。
在第一和第二種情況下，報告分子仍是完整的，因此不會產(chǎn)生可檢測信號。而在第三種情況下，由于報告分子(如Taqman探針)5′端上的猝滅基團被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3′端處的報告基團就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號(如熒光信號)。
步驟7在下一循環(huán)中，在變性后的退火時，會發(fā)生三種情況7a人工序列模板引物1結(jié)合于含常規(guī)引物2序列的新合成的DNA序列。
7b公用引物3結(jié)合于含常規(guī)引物2序列的新合成的DNA序列。
7c常規(guī)引物2結(jié)合含人工序列引物1序列的人工序列模板(類似于步驟5，未示出)。
步驟8分三種情況8a人工序列模板引物1向含常規(guī)引物2序列的DNA鏈的5′端延伸，形成DNA雙鏈。在下一輪循環(huán)中，這些DNA雙鏈就是新的人工序列模板。
8b公用引物3向含常規(guī)引物2序列的DNA鏈的5′端延伸，形成DNA雙鏈。在下一輪循環(huán)中，這些DNA雙鏈就是新的人工序列模板。
8c與步驟6中相同，當(dāng)常規(guī)引物2的3′端延伸到結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)的報告分子處時，會發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報告分子從人工序列模板上取代下來；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報告分子。
在第一和第二種情況下，報告分子仍是完整的，因此不會產(chǎn)生可檢測信號。而在第三種情況下，由于報告分子(如Taqman探針)5′端上的猝滅基團被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3′端處的報告基團就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號(如熒光信號)。
步驟9重復(fù)步驟7和8。
在經(jīng)過若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因報告分子被切斷而產(chǎn)生的可檢測信號也是成指數(shù)級(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的。在可檢測信號是熒光的情況下，這些信號可用實時熒光閱讀儀，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp 5700或GeneAmp 7700等進行實時測定；也可使用靜態(tài)熒光閱讀儀，在核酸擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熒光測定。
擴增模式(二)、使用圖2C所示的人工序列模板引物集進行核酸擴增分析現(xiàn)參見圖5。在該例子中，使用一條人工序列模板引物1，常規(guī)引物2和擴增模板引物5組成一個引物集。反應(yīng)體系中還包括公用引物3及報告分子4。在該例子中，待檢測的樣品是DNA或RNA。
步驟1將引物集和待測樣品置于反應(yīng)體系中。
步驟2在合適的條件下，發(fā)生退火(或雜交)，此時發(fā)生兩種情況2a人工序列模板引物1的3′端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列。
2b擴增模板引物5與靶RNA或DNA序列結(jié)合。
步驟33a對應(yīng)于上述第一種情況，在逆向轉(zhuǎn)錄酶(對于RNA靶序列)或DNA聚合酶(對于DNA靶序列)作用下，人工序列模板引物1的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA雙鏈。
3b對應(yīng)于上述第二種情況，在逆向轉(zhuǎn)錄酶(對于RNA靶序列)或DNA聚合酶(對于DNA靶序列)作用下，擴增模板引物5的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA雙鏈。
步驟4形成的雙鏈核酸在合適的條件下變性，形成單鏈靶序列和新合成的DNA序列(即人工序列模板)。或者用RNase水解RNA鏈，形成新合成的DNA序列(在第一種情況下，形成人工序列模板；在第二種情況下，提供與常規(guī)引物2結(jié)合的靶分子核酸序列)。
必要時，在合適的條件下重復(fù)步驟2，3和4(任選的)。
步驟5在下一循環(huán)中，在變性后的退火時，會發(fā)生四種情況5a常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的含人工序列模板引物1的DNA鏈。
5b常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的含擴增模板引物5的DNA鏈。
5c人工序列模板引物1的3′端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列(同步驟2a，未示出)。
5d擴增模板引物5與靶RNA或DNA序列結(jié)合(同步驟2b，未示出)。
步驟66a對應(yīng)于5a，在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。當(dāng)人工序列模板引物2的3′端延伸到結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)的報告分子處時，會發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報告分子從人工序列模板上取代下來；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報告分子。
在第一和第二種情況下，報告分子仍是完整的，因此不會產(chǎn)生可檢測信號。而在第三種情況下，由于報告分子(如Taqman探針)5′端上的猝滅基團被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3′端處的報告基團就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號(如熒光信號)。
6b對應(yīng)于5b，在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向含擴增模板引物5序列的新生鏈5′端延伸，形成DNA雙鏈。在下一輪循環(huán)中，這些DNA雙鏈就是新的人工序列模板。
6c和6d對應(yīng)于5c和5d，分別形成新的人工序列模板(同步驟3a和3b未示出)。
步驟7在下一循環(huán)中，在變性后的退火時，會發(fā)生四種情況7a常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的含人工序列模板引物1的DNA鏈(同5a，未示出)。
7b常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的含擴增模板引物5的DNA鏈(同5b，未示出)。
7c人工序列模板引物1的3′端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列(類似于同步驟2a)。
7d擴增模板引物5與靶RNA或DNA序列結(jié)合(同步驟2b，未示出)；7e公用引物3結(jié)合于含常規(guī)引物2序列的新合成的DNA序列。
步驟8在下一次延伸過程中，可能會發(fā)生以下幾種情況8a在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。當(dāng)人工序列模板引物2的3′端延伸到結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)的報告分子處時，會發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報告分子從人工序列模板上取代下來；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報告分子。
在第一和第二種情況下，報告分子仍是完整的，因此不會產(chǎn)生可檢測信號。而在第三種情況下，由于報告分子(如Taqman探針)5′端上的猝滅基團被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3′端處的報告基團就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號(如熒光信號)。
8b同6b，在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向含擴增模板引物5序列的新生鏈5′端延伸，形成DNA雙鏈。在下一輪循環(huán)中，這些DNA雙鏈就是新的人工序列模板。
8c同6c，形成新的人工序列模板(類似于步驟3a)。
8d同6d，形成新的人工序列模板(類似于3b)。
8e公用引物3向含常規(guī)引物2序列的DNA鏈的5′端延伸，形成DNA雙鏈。在下一輪循環(huán)中，這些DNA雙鏈就是新的人工序列模板。
步驟9重復(fù)步驟7和8。
在經(jīng)過若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因報告分子被切斷而產(chǎn)生的可檢測信號也是成指數(shù)級(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的。在可檢測信號是熒光的情況下，這些信號可用實時熒光閱讀儀，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp 5700或GeneAmp 7700等進行實時測定；也可使用靜態(tài)熒光閱讀儀，在核酸擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熒光測定。
在本發(fā)明方法中，報告分子也可與人工序列模板上報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈結(jié)合(圖2G和圖2H)，或者使用兩個人工序列模板及兩個常規(guī)引物(圖2E和2F的組合)，其核酸擴增過程與擴增模式(一)和(二)基本相同，在本發(fā)明中，另一種產(chǎn)生信號的方式是使用FRET雙探針，即報告信號基團分別標(biāo)記在人工序列模板及報告分子上。參見圖3C和3C′。此時，人工序列模板引物集包括一個標(biāo)記有FRET基團如FAM熒光素的人工序列模板引物1，和一對常規(guī)引物2。在反應(yīng)體系中，還包括用另一FRET基團如標(biāo)記Dabcyl的報告分子4(寡核苷酸)。
步驟1-5，與擴增模式(一)步驟1-5類似。
在步驟6中在第一種情況下，在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。當(dāng)人工序列模板引物2的3′端延伸到結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)的報告分子處時，會發(fā)生以下3種情況
(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報告分子從人工序列模板上取代下來；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報告分子。
在第一情況下，報告分子結(jié)合在人工序列模板引物，與其上標(biāo)記的Dabcyl淬滅人工序列模板引物上的FAM分子，因此不會產(chǎn)生可檢測信號。在第二種情況下，雖然報告分子是完整的，但由于新生鏈取代了報告分子，使報告分子與人工序列模板引物間的相互淬滅被破壞，從而產(chǎn)生可檢測信號(見圖3C′)。在第三種情況下，報告分子的猝滅基團被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此人工序列模板引物上的報告分子如FAM就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號(如熒光信號)(圖3C)。
在第二種情況下， 在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3′端向含擴增模板引物5序列的新生鏈5′端延伸，形成人工序列模板。
步驟7-9與上述擴增模式(一)中步驟7-9類似。
在經(jīng)過若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因報告分子被切斷或取代而產(chǎn)生的可檢測信號也是成指數(shù)級(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的。在可檢測信號是熒光的情況下，這些信號可用實時熒光閱讀儀，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp5700或GeneAmp 7700等進行實時測定；也可使用靜態(tài)熒光閱讀儀，在核酸擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熒光測定。
本發(fā)明具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點，其主要優(yōu)點包括(1)易于復(fù)合式檢測摻入該人工序列模板區(qū)可在新合成的DNA序列中引入不屬于靶序列的一段序列。而新合成的DNA序列可作為進一步DNA擴增的模板。與不同靶序列的數(shù)目無關(guān)，新合成的DNA序列是大部分是相同的-人工序列模板區(qū)序列，這使得各不同的靶序列被轉(zhuǎn)變成具有共同特性的序列。因此，可以在相同或基本相同的條件下對該DNA序列繼續(xù)處理或操作，易于實現(xiàn)例如多管同一條件、或一管多種靶序列等復(fù)合式檢測。
(2)更高的分析靈敏度通過使用含兩個人工序列模板引物的引物集，或者對單個靶序列的不同位點設(shè)計多個人工序列模板引物集，可以產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)中單探針模式更高水平的信噪比。
此外，使用擴增模板引物還可進一步提高檢測靈敏度。
(3)高準(zhǔn)確性本發(fā)明的人工序列模板引物和人工序列模板核酸檢測方法，可減少由下列因素導(dǎo)致的假陰性概率(a)在靶序列的探針(或引物)結(jié)合位點處的二級結(jié)構(gòu)，這些二級結(jié)構(gòu)可能會有效地影響探針(或引物)的結(jié)合；(b)在靶序列的探針(或引物)結(jié)合位點處序列的改變，這些變化可以是由于不同的亞型或突變引起的。例如在HCV中，由于使用了各種藥物，會導(dǎo)致HCV發(fā)生突變或變異。如用常規(guī)核酸檢測方法，常會導(dǎo)致假陰性。而在各種生物(包括病原體)的遺傳物質(zhì)中找出高保守的短區(qū)域(如100bp或更短)是很方便的。利用本發(fā)明，可以設(shè)計針對這些短的、高保守區(qū)域(如40-50bp)的人工序列模板引物集，從而減少假陰性。根據(jù)，本發(fā)明人用多對人工序列模板引物集HCV突變株的檢測，發(fā)現(xiàn)假陰性率減少50％。
(c)在樣品加工或處理過程中長片段靶序列的斷裂，而這種斷裂發(fā)生在長片段的擴增的中間區(qū)域，會導(dǎo)致互補DNA序列復(fù)制的停止。
(4)簡化或消除多重檢測在需要檢測多種病原體時，目前常需要對某種病原體進行單獨的檢測。這是因為不同檢測反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件各不相同，因此，在同一反應(yīng)管中進行核酸擴增反應(yīng)時，各擴增反應(yīng)的效率難以接近一致，從而難以在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測多種病原體。
使用本發(fā)明的技術(shù)，因為人工序列模板的大部分是相同的，即人工序列模板區(qū)，因此便于在使檢測各病原體的PCR的反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)化，從而在一管中實現(xiàn)對多種病原體的檢測。這使得本發(fā)明技術(shù)特別適用于獻血樣品檢驗等場合。
(5)降低使用熒光標(biāo)記技術(shù)的多倍分析成本在現(xiàn)有技術(shù)中，對于多個待測的靶核酸序列，需要相同數(shù)目的熒光標(biāo)記探針。與此相反，在本發(fā)明中，對于檢測多個靶序列僅需一種公用報告探針，因此可大大降低成本。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1人工序列模板引物核酸擴增檢測HCV病毒(RNA病毒)在該實施例中，設(shè)計了包括一個人工序列模板引物和一個常規(guī)引物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程部分如圖4所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃ 5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
人工序列模板引物為5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ IDNO1)常規(guī)引物5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO2)使用的Taqman探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝滅基團是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)簦ㄩL為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
實施例2人工序列模板擴增檢測HBV病毒(DNA病毒)在該實施例中，設(shè)計了包括一個人工序列模板引物和一個常規(guī)引物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程部分如圖4所示。
在PCR方案是PCR50℃，2分鐘，94℃5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
人工序列模板引物分別為5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACCAGCGAT AGCCA GGACA-3′(SEQ IDNO4)常規(guī)引物
5′-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3′(SEQ ID NO5)使用的Taqman探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝滅基團是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
實施例3人工序列模板擴增檢測HCV病毒(RNA病毒)在該實施例中，設(shè)計了包括一個人工序列模板引物、一個常規(guī)引物和一個公用引物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程如圖4所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
人工序列模板引物為5-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAGAACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ ID NO6)常規(guī)引物5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO2)使用的公用引物序列是5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO7)使用的Taqman探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝滅基團是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
實施例4人工序列模板擴增檢測HCV病毒(RNA病毒)在該實施例中，設(shè)計了包括一個人工序列模板引物、一對常規(guī)引物和一個公用引物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程如圖5所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
人工序列模板引物為5-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAGAACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ ID NO6)常規(guī)引物15′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO2)常規(guī)引物25′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO8)使用的公用引物序列是5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO7)使用的Taqman探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝滅基團是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
實施例5人工序列模板擴增檢測HCV病毒(RNA病毒)和HBV病毒(DNA病毒)
在該實施例中，設(shè)計了包括兩個人工序列模板引物、兩對常規(guī)引物和一個公用物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程如圖5所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
HCV病毒人工序列模板引物為5-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAGAACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ ID NO6)HBV病毒人工序列模板引物為5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCATCCAGTCTATGTTTCCC TCTTGTTGCT-3′(SEQ ID NO9)HCV病毒常規(guī)引物15′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO2)HCV病毒常規(guī)引物25′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO8)HBV病毒常規(guī)引物15′-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3′(SEQ ID NO5)HBV病毒常規(guī)引物25′-AGTTTCCGTC CGAAGGTTT-3′(SEQ ID NO10)使用的公用引物序列是5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO7)使用的Taqman探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝滅基團是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，加入不同稀釋度HCV和(或)HBV陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，同時含有HBV和HCV陽性樣品不影響檢測靈敏度，其Ct值主要由高濃度病毒決定。而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
實施例6人工序列模板擴增檢測HCV病毒(RNA病毒)在該實施例中，設(shè)計了包括一個熒光素標(biāo)記的人工序列模板引物和一對常規(guī)引物的人工序列模板引物集，反應(yīng)過程部分如圖8所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃ 5分鐘；94℃20秒；和61℃40秒，共40個循環(huán)。
人工序列模板引物序列為5′-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ IDNO11)其中使用的報告基團是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)常規(guī)引物5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO2)擴增模板引物5′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO8)使用的報告探針序列是5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO3)其中使用的猝滅基團是Dabcyl(即四(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(位于3′端的)。
檢測時使用的檢測儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴增儀進行擴增。結(jié)果，如果僅使用常規(guī)引物1和人工序列模板引物進行擴增，與同時加入常規(guī)引物和擴增模板引物的人工序列模板引物集相比，其檢測靈敏度可相差10～100倍。加入不同稀釋度陽性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號，而陰性樣品及其他非特異對照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴增反應(yīng)結(jié)束時(Ct＞40)時均未出現(xiàn)熒光信號。
此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>曹，衛(wèi)<120>人工序列模板引物集及用途<130>014338<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>1aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc50<210>2<211>16<212>DNA<213>合成的引物<400>2gtgcccccgc aagact 16<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3tcgtcgccgc ctgttcctta20<210>4<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>4aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aaccagcgat agccaggaca 50<210>5<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>5cctccaatca ctcaccaacc20<210>6<211>70<212>DNA<213>合成的引物<400>6tcatccacat cccacctcat caggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc60aacgctactc 70<210>7<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>7tcatccacat cccacctcat 20<210>8<211>22<212>DNA<213>合成的引物<400>8tgagtgtcgt acagcctcca gg22<210>9<211>70<212>DNA<213>合成的引物<400>9tcatccacat cccacctcat caggaacagg cggcgacgaa tcatccagtc tatgtttccc 60tcttgttgct 70<210>10<211>19<212>DNA<213>合成的引物<400>10agtttccgtc cgaaggttt19<210>11<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>11aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc50
權(quán)利要求
1.一種人工序列模板引物集，其特征在于，所述引物集包括特異性結(jié)合于被檢測核酸序列并引發(fā)目的核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物對，其中至少一個引物是人工序列模板引物，該人工序列模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于人工序列模板引物3′端，用于與被檢測核酸序列特異性結(jié)合；(b)公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)和公用引物區(qū)，報告分子可特異性結(jié)合于該報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，且所述的報告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測的信號(i)結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，和(ii)報告分子被切斷或被取代。
2.如權(quán)利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的報告分子包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移型信號探針和含稀土元素的寡核苷酸鏈。
3.如權(quán)利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的特異結(jié)合區(qū)長度為6-35bp，所述公用區(qū)的長度為8-100bp。
4.如權(quán)利要求2中任一所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的特異結(jié)合區(qū)長度為15-25bp，所述公用區(qū)的長度為20-50bp，且所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移型信號探針選自下組Taqman探針、FRET雙探針、分子信標(biāo)和PNA信號探針，且在特異結(jié)合區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，和/或在公用引物區(qū)和報告分子結(jié)合區(qū)之間存在間隔區(qū)，所述的間隔區(qū)為1-20bp。
5.如權(quán)利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，在所述的人工序列模板引物中含有選自下組的核苷酸isoG、isoC、2′-O-甲基-G、2′-O-甲基-C、及其組合。
6.如權(quán)利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，還包括用于增加被檢測核酸模板數(shù)量的擴增模板引物。
7.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的人工序列模板引物集。
8.一種檢測核酸檢測方法，其特征在于，它包括步驟(1)在含有報告分子的核酸擴增反應(yīng)體系中，用人工序列模板引物集與待測樣品進行核酸擴增反應(yīng)，其中所述引物集包括特異性結(jié)合于被檢測核酸序列并引發(fā)目的核酸擴增反應(yīng)的引物對，且至少一個引物是人工序列模板引物，該人工序列模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于人工序列模板引物3′端，用于與被檢測核酸序列特異性結(jié)合；(b)公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)和公用引物區(qū)，報告分子可特異性結(jié)合于該報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，且所述的報告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測的信號(i)結(jié)合于報告分子結(jié)合區(qū)或該報告分子結(jié)合區(qū)的互補鏈，和(ii)報告分子被切斷或被取代；(2)檢測報告分子所產(chǎn)生的可檢測信號。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品選自下組DNA樣品、RNA樣品、和從RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，使用兩種或兩種以上不同的人工序列模板引物集，這些人工序列模板引物集分別特異性地結(jié)合于不同被檢測體的靶序列、同一被檢測體的不同靶序列、同一被檢測體的相同靶序列的不同區(qū)域、或其組合，并且這些人工序列模板引物集的報告分子結(jié)合區(qū)分別與相同或不同的報告分子發(fā)生特異性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過使用人工序列模板檢測和/或定量核酸的方法。本發(fā)明的人工序列模板引物集包括特異性結(jié)合于被檢測序列并引發(fā)目的核酸擴增反應(yīng)的寡核苷酸引物對，其中至少一個引物是人工序列模板引物，該人工序列模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)；(b)公用區(qū)，該公用區(qū)位于人工序列模板引物的5′端并且具有報告分子結(jié)合區(qū)和公用引物區(qū)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的人工序列模板核酸檢測方法。本發(fā)明可易用、靈敏、準(zhǔn)確的檢測和/或定量樣品中病原體和基因表達。
文檔編號C12Q1/68GK1405320SQ0112642
公開日2003年3月26日 申請日期2001年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月8日
發(fā)明者曹衛(wèi), 張躍建, 宋軍 申請人:曹衛(wèi)