專(zhuān)利名稱(chēng)：高活性纖維素酶組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種酶，尤其是利用遺傳工程技術(shù)得到的纖維素酶組合物。
背景技術(shù)：
纖維素酶已大量用于紡織、釀酒、飼料、中藥提取和果汁生產(chǎn)等行業(yè)。Wood等在《酶學(xué)方法》(Methodsin Enzymology)，160,25,234頁(yè)(1986)中公開(kāi)了完整的真菌纖維素酶系統(tǒng)包括幾個(gè)不同的酶種類(lèi)，包括那些被鑒定為外切纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)，內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(“EG”)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)(“BG”)的酶。CBH、EG和BG真菌纖維素酶分類(lèi)可進(jìn)一步擴(kuò)展到包括每種類(lèi)型之中的多重成份，已從多種真菌資源中分離到CBH和EG。現(xiàn)有的生產(chǎn)纖維素酶的菌種多為綠色木霉菌，這些菌種通過(guò)化學(xué)與物理誘變?nèi)缓蠛Y選而得到，綠色木霉菌雖然能在大罐生產(chǎn)時(shí)分泌10-20克/升蛋白質(zhì)，而且大部分為纖維素酶，但由于綠色木霉本身產(chǎn)的酶特異活性較低，一般在200,000國(guó)際單位/升(余曉斌，2000，ChinaEnzyme)。厭氧真菌是近二十年來(lái)從草食動(dòng)物胃腸道分離出來(lái)的新型微生物菌種，大部分具有分泌植物細(xì)胞壁降解的酶活性，而且這些酶的特異活性特別高(Wood et al.1986)。單位重量的酶對(duì)纖維素降解的能力比綠色木霉產(chǎn)的酶高出許多倍(Gilbert et al.1992)，但厭氧真菌生長(zhǎng)速度慢，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。一種有效的方法為將厭氧真菌編碼纖維素酶的基因轉(zhuǎn)入綠色木霉，這樣既能分泌大量酶，而且這些酶的活性高，例如厭氧真菌Orpinomyces的Cellulase B(CelB)(Lietal，1997)的特異酶活性為220,000國(guó)際單位/克，比綠色木霉的酶的特異活性高出十倍以上。如何將高特異活性的厭氧真菌的CelB基因轉(zhuǎn)入綠色木霉生產(chǎn)菌中，從而提高纖維酶素的產(chǎn)量，達(dá)到400,000-1200,000國(guó)際單位/升，而β-葡聚糖酶活性可達(dá)到1000,000-3000,000國(guó)際單位，是本領(lǐng)域需解決的技術(shù)難題。酶制劑的生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)為大罐發(fā)酵液每升的活性單位，單位體積生產(chǎn)的活性水平直接制約生產(chǎn)成本，能耗及能否用于工農(nóng)業(yè)的各種領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提高纖維素酶的活性產(chǎn)量，生產(chǎn)出一種活性高、能廣泛應(yīng)用于上述行業(yè)的產(chǎn)品。其原理是將編碼高特異活性的纖維素酶Cellulase B基因用轉(zhuǎn)基因方法植入現(xiàn)有生產(chǎn)菌珠HypocreaiecorinaMGG80，同時(shí)通過(guò)重組DNA技術(shù)，將生產(chǎn)菌珠在生產(chǎn)條件下受到誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Promoter)加入該基因位點(diǎn)，從而指導(dǎo)植入基因的高效表達(dá)，獲得一種新的纖維素酶組合物。
本發(fā)明采用基因重組技術(shù)制造出一種高活性纖維素酶組合物，其特征在于它是由下述重量百分比的纖維素酶構(gòu)成由木霉菌株產(chǎn)生的纖維素酶CBH I 30～40％、CBH II 10～25％、EG I 10～15％、EG II 6～10％、EG III 1～4％、EG IV 0.5～2％、EG V 0.5～1.0％，和厭氧真菌產(chǎn)生的纖維素酶CelB10～30％，其中，CelB基因?yàn)镃BH I基因的啟動(dòng)子和終止信號(hào)(Terminater)，分泌信號(hào)(Secretion Signal)是CBHI編碼的前28個(gè)氨基酸編碼。
所述CBHI編碼的前28個(gè)氨基酸詳細(xì)編碼為MYRKLAVISAFLATARAQSACTLQSETH。
高活性纖維素酶組合物的制備方法，是采用DNA重組技術(shù)，包括質(zhì)粒的構(gòu)建、里氏木霉菌的轉(zhuǎn)化、高產(chǎn)菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達(dá)，其特征在于(1)質(zhì)粒的構(gòu)建里氏木霉的DNA用Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性?xún)?nèi)切酶作為部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質(zhì)粒中，用T4連接酶(T4 ligase)連接里氏木霉(T·reesei)和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E·coli)，轉(zhuǎn)化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落篩選；通過(guò)篩選，十二個(gè)含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質(zhì)粒DNA被分離出來(lái)，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定；CBH I基因5′端1500個(gè)堿基對(duì)，和3′的1000個(gè)堿基對(duì)用聚合酶鏈反應(yīng)〔Polymerase Chain Reactions(PCR)]進(jìn)行放大，重新裝入PUC18質(zhì)粒中，5′端片斷除含啟動(dòng)子部分外，還含有編碼CBHI的前28個(gè)氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，厭氧真菌的CelB基因也是通過(guò)PCR進(jìn)行放大，只包括編碼對(duì)羥甲基纖維素CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時(shí)加入了限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處；(2)里氏木霉的轉(zhuǎn)化里氏木霉的轉(zhuǎn)化采用Penttila的方法，在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再?gòu)拿總€(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化菌落中任意分離兩個(gè)單個(gè)菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長(zhǎng)速度；(3)高產(chǎn)菌株的篩選在上述菌株中挑選生長(zhǎng)速度快、形態(tài)與轉(zhuǎn)化前接近的菌珠，在無(wú)菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉，得上清液，取上清液測(cè)酶活性，對(duì)上清液活性比同樣條件下未轉(zhuǎn)化菌株高出1.5倍的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達(dá)通過(guò)上述基因工程所獲得高產(chǎn)菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導(dǎo)底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級(jí)發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產(chǎn)量可達(dá)到300,000-500,000國(guó)際單位/升。
獲得的高活性纖維素酶發(fā)酵液，經(jīng)板框過(guò)濾，得澄明濾液，經(jīng)0.4um微膜過(guò)濾后再經(jīng)孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例，檢測(cè)合格后按規(guī)格分裝即可。
在同等條件下發(fā)酵，本發(fā)明的纖維素酶活性提高1-5倍，達(dá)到400,000-1200,000國(guó)際單位/升，產(chǎn)品價(jià)格較國(guó)外進(jìn)口同類(lèi)品種下降33％以上，且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，使用效果良好，通過(guò)此種方法獲得的產(chǎn)品因其質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，可廣泛應(yīng)用于紡織、釀酒、食品、飲料、醫(yī)藥、石油開(kāi)采和飼料行業(yè)，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，提升這些行業(yè)的產(chǎn)業(yè)水平。


圖1是本發(fā)明的重組基因設(shè)計(jì)示意圖。
1—CBHI的啟動(dòng)子(CBHI Promoter)2—厭氧真菌的CelB基因(0rpinomyces CelB Gene)3—CBHI的終止信號(hào)(CBHI Terminater)4—質(zhì)粒序列(Plasmid Sequence)5—CBHI的分泌信號(hào)(CBHI Secretion Signal)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1如圖1所示，含有圖1的質(zhì)粒通過(guò)對(duì)里氏木霉的轉(zhuǎn)化(Transformation)和篩選，獲得帶有圖1所示遺傳信息的菌株，然后用于生產(chǎn)所得產(chǎn)品中保留原生產(chǎn)菌株所產(chǎn)的和加入新來(lái)源基因所產(chǎn)的幾種纖維素酶，重新組合的產(chǎn)品為復(fù)合酶，具體組份為H.iecorina產(chǎn)生的CBHI36％、CBHII20％、EGI12％、EGII8％、EGIII2％、EGIV1％、EGV1％和厭氧真菌產(chǎn)生的CelB20％，各組分之間有協(xié)同促進(jìn)作用，新加入的CelB基因中為CBHI基因的啟動(dòng)子和終止信號(hào)，分泌信號(hào)是CBHI編碼的前28個(gè)氨基酸編碼。
其制備方法，是采用DNA重組技術(shù)，包括質(zhì)粒的構(gòu)建、里氏木霉菌的轉(zhuǎn)化、高產(chǎn)菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達(dá)和產(chǎn)品提取等步驟。具體分別為(1)質(zhì)粒的構(gòu)建里氏木霉QM9414的DNA用美國(guó)Invitrogen公司的Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性?xún)?nèi)切酶作為部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質(zhì)粒中，用T4Ligase連接T·reesei和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E·coli)，轉(zhuǎn)化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落篩選；用于篩選的探針為T(mén).reesei的DNA片斷(Shoemaker et al.1983)。通過(guò)篩選，十二個(gè)含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質(zhì)粒DNA被分離出來(lái)，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，總共測(cè)定了大約600個(gè)堿基對(duì)，而且正反鏈的序列都進(jìn)行了測(cè)定；CBH I基因5′端1500個(gè)堿基對(duì)，和3′的1000個(gè)堿基對(duì)用Polymerase ChainReactions(PCR)進(jìn)行放大，重新裝入PUC18質(zhì)粒中，5′端片斷除含啟動(dòng)子部分外，還含有編碼CBHI的前28個(gè)氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。兩種片斷裝入PUC18后，進(jìn)行DNA測(cè)序，以排除在PCR放大時(shí)引入突變的可能。厭氧真菌的CelB基因也是通過(guò)PCR進(jìn)行放大，只包括編碼對(duì)CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時(shí)加入了限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處。嵌入CelB基因后的質(zhì)粒也進(jìn)行了測(cè)序。
(2)里氏木霉的轉(zhuǎn)化里氏木霉的轉(zhuǎn)化采用Penttila等(1987)的方法。為了便于選擇嵌合了PUC18片斷的菌落，含有Aspergillusnidulans的乙酰胺酶(acetamidase)基因的PUC18作為一種co-transfomation的質(zhì)粒(Penttila等，1987)。轉(zhuǎn)化的方法請(qǐng)參照Penttila等(1987)。在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再?gòu)拿總€(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化菌落中任意分離兩個(gè)單個(gè)菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長(zhǎng)速度；(3)高產(chǎn)菌株的篩選在上述菌株中挑選生長(zhǎng)速度快、形態(tài)與轉(zhuǎn)化前接近的菌珠，在無(wú)菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶為250毫升三角瓶，用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉(5000rpm，15min)，取上清液測(cè)酶活性(1％CMC，50℃，PH4.8)，對(duì)上清液活性比同樣條件下未轉(zhuǎn)化菌株高出1.5倍的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達(dá)通過(guò)上述基因工程所獲得高產(chǎn)菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導(dǎo)底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級(jí)發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產(chǎn)量可達(dá)到300,000-500,000國(guó)際單位/升。
(5)產(chǎn)品提取取上述發(fā)酵液，經(jīng)板框過(guò)濾，得澄明濾液，經(jīng)0.4um微膜過(guò)濾后再經(jīng)孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例，檢測(cè)合格后按規(guī)格分裝即可。
權(quán)利要求
1.一種高活性纖維素酶組合物，其特征在于它是由下述重量百分比的纖維素酶構(gòu)成由木霉菌株產(chǎn)生的纖維素酶CBH I 30～40％、CBH II 10～25％、EG I 10～15％、EG II 6～10％、EG III 1～4％、EGIV0.5～2％、EGV0.5～1.0％，和厭氧真菌產(chǎn)生的纖維素酶CelB10～30％，其中，CelB基因?yàn)镃BH I基因的啟動(dòng)子和終止信號(hào)(Terminater)，分泌信號(hào)(Secretion Signal)是CBHI編碼的前28個(gè)氨基酸編碼。
2.權(quán)利要求1的纖維素酶組合物的制備方法，是采用DNA重組技術(shù)，包括質(zhì)粒的構(gòu)建、里氏木霉菌的轉(zhuǎn)化、高產(chǎn)菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達(dá)，其特征在于(1)質(zhì)粒的構(gòu)建里氏木霉的DNA用Easy-DNA試劑提取，用HindIII限制性?xún)?nèi)切酶作部分水解，然后裝入用同樣酶水解后的PUC18質(zhì)粒中，用T4Ligase連接T·reesei和PUC18的DNA片斷，連接后的樣品用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E·coli)，轉(zhuǎn)化后的樣品均勻地接種在含50微克/克的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落篩選；通過(guò)篩選，十二個(gè)含CBHI基因的菌落被選出，它們所含的質(zhì)粒DNA被分離出來(lái)，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定；CBH I基因5′端1500個(gè)堿基對(duì)，和3′的1000個(gè)堿基對(duì)用聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chain Reactions(PCR)進(jìn)行放大，重新裝入PUC18質(zhì)粒中，5′端片斷除含啟動(dòng)子部分外，還含有編碼CBHI的前28個(gè)氨基酸的序列，而且5′端和3′接合處加入幾種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，厭氧真菌的CelB基因也是通過(guò)PCR進(jìn)行放大，只包括編碼對(duì)CMC有活性的中間部分氨基酸的區(qū)間，同時(shí)加入了限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，以便順利嵌入CBH I基因5′和3′端的接合處；(2)里氏木霉的轉(zhuǎn)化里氏木霉的轉(zhuǎn)化采用Penttila的方法，在雙層瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得大約120個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行了選擇和非選擇培養(yǎng)交替培養(yǎng)三次，再?gòu)拿總€(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化菌落中任意分離兩個(gè)單個(gè)菌落，接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5天，記錄每株菌種生長(zhǎng)速度；(3)高產(chǎn)菌株的篩選在上述菌株中挑選生長(zhǎng)速度快、形態(tài)與轉(zhuǎn)化前接近的菌珠，在無(wú)菌條件下取出大約一平方厘米的菌絲體，用于接種50毫升的纖維素酶誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶用棉塞封口，接種后于28℃的搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌絲體和殘留纖維素用離心去掉，取上清液測(cè)酶活性，對(duì)上清液活性比同樣條件下未轉(zhuǎn)化菌株高出1.5倍的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分離培養(yǎng)；(4)菌種發(fā)酵表達(dá)通過(guò)上述基因工程所獲得高產(chǎn)菌種，以微晶纖維素作為主要碳源和誘導(dǎo)底物，于28℃、PH4.6-4.8、溶氧20％以上條件三級(jí)發(fā)酵，即可得到高活性纖維素酶組合物的發(fā)酵液，其產(chǎn)量可達(dá)到300,000-500,000國(guó)際單位/升。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖維素酶組合物的制備方法，其特征在于取發(fā)酵液，經(jīng)板框過(guò)濾，得澄明濾液，經(jīng)0.4um微膜過(guò)濾后再經(jīng)孔徑為10000道爾頓超濾膜超濾濃縮3-8倍，得不同活性單位濃縮液后，按蔗糖20％、苯甲酸鈉0.2％、山梨酸鉀0.2％的比例先后加入蔗糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀，檢測(cè)合格后按規(guī)格分裝即可。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高活性纖維素酶組合物及其制備方法,它是由下述重量百分比的纖維素酶構(gòu)成:CBHI 30～40%、CBHII 10～25%、EGI 10～15%、EGII 6～10%、EGIII 1～4%、EGIV 0.5～2%、EGV 0.5～1.0%,Ce1B 10～30%,其中,Ce1B基因?yàn)镃BHI基因的啟動(dòng)子和終止信號(hào),分泌信號(hào)是CBHI編碼的前28個(gè)氨基酸編碼。其制備方法是采用DNA重組技術(shù),包括質(zhì)粒的構(gòu)建、里氏木霉菌的轉(zhuǎn)化、高產(chǎn)菌株的篩選、菌種發(fā)酵表達(dá)等。本發(fā)明在同等條件下發(fā)酵,纖維素酶活性提高1—5倍達(dá)到400,000—1200,000國(guó)際單位/升,產(chǎn)品價(jià)格較國(guó)外進(jìn)口同類(lèi)品種下降33%以上,且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,使用效果良好,可廣泛應(yīng)用于紡織、釀酒、食品、飲料、醫(yī)藥、石油開(kāi)采和飼料行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1335395SQ01128578
公開(kāi)日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2001年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者李新良, 羅永清, 沈建新 申請(qǐng)人:湖南尤特爾生化有限公司