專利名稱：一種抗癌基因工程藥物的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種抗癌基因工程藥物的分離純化方法，它屬于抗癌藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明是指一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人源的A型二磷酸脫氧核苷激酶(即rhNDPK-A reombinant human nuleoside diphsphate Kinase-A)的分離純化方法。Nm23-H1(no metastasis)基因是1989年分離鑒定的，其對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物便是A型二磷酸脫氧核苷激酶(NDPK-A)。雖然在該基因發(fā)現(xiàn)之前就已經(jīng)開始從生物體內(nèi)分離純化NDPK蛋白，但由于受當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制，純化工藝煩瑣且蛋白得率較低。由于生物體內(nèi)的NDPK含量低(不到1％)而工程菌中的蛋白含量高(可達(dá)30％以上)，二者差別顯著，在分離純化方法上也存在許多不同之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一種抗癌基因工程藥物指的是重組人源的A型二磷酸脫氧核苷激酶(rhNDPK-A)。發(fā)明之目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種簡單高效的分離純化重組人源的A型二磷酸脫氧核苷激酶(rhNDPK-A)的分離純化方法。
本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達(dá)到該方法包括以下步驟及工藝條件步驟一 用低滲沖擊法處理樣品將發(fā)酵后所獲菌體用15～30％蔗糖溶解、在0～6℃下放置10～60min，在低溫-10～4℃下高速離心(5000～20000rpm)10～60min，去上清，加入5～15mmol/L的磷酸緩沖液溶解，在0～6℃下放置10～60min，在低溫-10～4℃下高速離心(5000～20000rpm)10～60min獲取上清。
步驟二 硫酸銨沉淀，凝膠過濾在步驟一所獲得取上清中逐步加入硫酸銨晶體至硫酸銨濃度達(dá)10～50％，低溫離心(0～10℃、5000～20000rpm、10～60min)得蛋白沉淀，用緩沖液A(由20mmol/L Tris-HCL pH7.5、1mmol/L EDTA pH7.5、2mmol/L MgCl2pH7.5、1mmol/L DTT pH7.5組成)將蛋白質(zhì)完全溶解，將溶解后的液體用凝膠填料裝填柱過濾，柱型為3.5×90cm(直徑×高度)的柱子，上樣量為10～100ml，洗脫線速度3～30cm/h，收集各個(gè)洗脫峰液，通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳)確定目標(biāo)蛋白洗脫峰液，目標(biāo)蛋白帶的分子量為17KD左右。
步驟三 弱陰離子交換層析將步驟二收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體經(jīng)柱型5×20cm、采用DEAG(二乙基氨基乙基)弱陰離子填料裝填的離子柱層析，先用緩沖液A平衡柱子后，上樣量為30～200ml經(jīng)步驟二凝膠過濾后收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液，洗脫線速度為3～30cm/h，上樣完畢后以0.08～0.14mol/L NaCl+緩沖液A、0.17～0.22mol/L NaCl+緩沖液A、0.5～1.0mol/L NaCl+緩沖液A依次進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為4～30cm/h，收集0.17～0.22M NaCl+緩沖液A的洗脫峰液，此即為目標(biāo)蛋白洗脫峰液。
步驟四 親和層析柱型5×12cm、填料為一種藍(lán)色顏料(Cibacron Blue-3GA)，用緩液A平衡柱子后，上樣50～500ml經(jīng)步驟三收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體，用0.17～0.22mol/LNaCl+緩沖液A洗脫至基線，換用0.17～0.22mol/L NaCl+緩沖液A+0.5～3mmol/LATP的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰液，洗脫峰溶液脫鹽后經(jīng)冷凍干燥，即可得蛋白干粉，最后獲得蛋白純度達(dá)98％，酶活力為800u/mg蛋白。
本發(fā)明之方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)所獲蛋白的純度高達(dá)98％以上，得率高達(dá)47％以上。
(2)工藝操作簡單，整個(gè)流程耗時(shí)少。
(3)凝膠柱、親和柱使用壽命長。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述例1步驟一 用低滲沖擊法處理樣品將發(fā)酵后所獲菌體用20％蔗糖溶解、4℃下放置20min，低溫高速離心(4℃、10000rpm、15min)，去上清，加入8mmol/L的磷酸緩沖液溶解，在4℃下放置20min，低溫高速離心(4℃、10000rpm、20min)獲取上清。
步驟二 硫酸銨沉淀，凝膠過濾將步驟一所獲得的上清中逐步加入硫酸銨晶體至硫酸銨濃度達(dá)30％，在4℃下離心(10000rpm)15min得蛋白沉淀，用緩沖液A將蛋白質(zhì)完全溶解。將溶解后的液體用凝膠填料裝填柱過濾，柱型為3.5×90cm(直徑×高度)的柱子，上樣量為50ml重新溶解的蛋白溶液，洗脫線速度10cm/h，收集各個(gè)洗脫峰液，通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白洗脫峰液。
步驟三 弱陰離子交換層析將步驟二收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體經(jīng)柱型5×20cm(直徑×高度)、采用DEAG弱陰離子填料裝填的離子柱層析，首先用緩沖液A平衡柱子，然后上樣150ml目標(biāo)蛋白洗脫峰液，流速為8cm/h，上樣完畢后以0.12mol/L NaCl+緩沖液A、0.18mol/L NaCl+緩沖液A、0.8M NaCl+緩沖液A依次進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為11cm/h，收集0.18M NaCl+緩沖液A的洗脫峰液，此即為目標(biāo)蛋白洗脫峰液。
步驟四 親和層析柱型5×12cm、填料為一種藍(lán)色顏料，柱平衡后，上樣200ml經(jīng)步驟三收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體，用緩沖液A+0.18M NaCl洗脫至基線，換用緩沖液A+0.18M NaCl+2mM ATP的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為11cm/h，收集洗脫峰液，洗脫峰溶液脫鹽后經(jīng)冷凍干燥，即可得蛋白干粉，最后獲得蛋白純度達(dá)98.4％，酶活力為810u/mg蛋白，蛋白得率為48％。
例2步驟一 用低滲沖擊法處理樣品將發(fā)酵后所獲菌體用20％蔗糖溶解、4℃下放置20min，低溫高速離心(4℃、10000rpm、15min)，去上清，加入8mmol/L的磷酸緩沖液溶解，于4℃下放置20min，低溫高速離心(4℃、10000rpm、20min)獲取上清。
步驟二 硫酸銨沉淀，凝膠過濾將步驟一所獲得的上清中逐步加入硫酸銨晶體至硫酸銨濃度達(dá)35％，在4℃下離心(10000rpm)10min得蛋白沉淀，用緩沖液A將蛋白質(zhì)完全溶解，將溶解后的液體用凝膠填料裝填柱過濾，柱型為3.5×90cm(直徑×高度)的柱子，上樣量為60ml重新溶解的蛋白溶液，洗脫線速度10cm/h，收集各個(gè)洗脫峰液，通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白洗脫峰液。
步驟三 弱陰離子交換層析將步驟二收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體經(jīng)柱型5×20cm(直徑×高度)、采用DEAG弱陰離子填料裝填的離子柱層析，首先用緩沖液A平衡柱子，然后上樣150ml目標(biāo)蛋白洗脫峰液，流速為8cm/h，上樣完畢后以0.1mol/L NaCl+緩沖液A、0.18mol/L NaCl+緩沖液A、0.6mol/L NaCl+緩沖液A依次進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為12cm/h，收集0.18M NaCl+緩沖液A的洗脫峰液，此即為目標(biāo)蛋白洗脫峰液。
步驟四 親和層析柱型5×12cm、填料為一種藍(lán)色顏料，柱平衡后，上樣180ml經(jīng)步驟三收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體，用緩沖液A+0.18mol/L NaCl洗脫至基線，換用緩沖液A+0.18mol/L NaCl+2mmol/L ATP的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為6cm/h，收集洗脫峰液，洗脫峰溶液脫鹽后經(jīng)冷凍干燥，即可得蛋白干粉，最后獲得蛋白純度達(dá)98.8％，酶活力為830u/mg蛋白，蛋白得率為49.2％。
權(quán)利要求
1.一種抗癌基因工程藥物的分離純化方法，其特征在于該方法包括以下步驟及工藝條件步驟一 用低滲沖擊法處理樣品將發(fā)酵后所獲菌體用15～30％蔗糖溶解、0～6℃下放置10～60min，在低溫-10～4℃下高速離心5000～20000rpm10～60min，去上清，加入5～15mmol/L的磷酸緩沖液溶解，于0～6℃下放置10～60min，在低溫-10～4℃下高速離心5000～20000rpm10～60min獲取上清；步驟二 硫酸銨沉淀，凝膠過濾將步驟一所獲得的上清中逐步加入硫酸銨晶體至硫酸銨濃度達(dá)10～50％，在0～10℃下離心5000～20000rpm10～60min得蛋白沉淀，用由20mmol/LTris-HCLpH7.5、1mmol/L EDTA Ph7.5、2mmol/L MgCl2pH7.5、1mmol/L DTTpH7.5組成的緩沖液A將蛋白質(zhì)完全溶解，將溶解后的液體用凝膠填料裝填柱過濾，柱型為3.5×90cm的柱子，上樣量為10～100ml重新溶解的蛋白溶液，洗脫線速度3～30cm/h，收集各個(gè)洗脫峰液，通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白洗脫峰液，目標(biāo)蛋白帶的分子量為17KD左右；步驟三 弱陰離子交換層析將步驟二收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體經(jīng)柱型為5×20cm采用DEAG弱陰離子填料裝填的離子柱層析，先用緩沖液A平衡柱子后，上樣量為30～200ml經(jīng)步驟二凝膠過濾后收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液，洗脫線速度為3～30cm/h，上樣完畢后以0.08～0.14mol/L NaCl+緩沖液A、0.17～0.22mol/L NaCl+緩沖液A、0.5～1.0mol/L NaCl+緩沖液A依次進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為4～30cm/h，收集0.17～0.22M NaCl+緩沖液A的洗脫峰液，此即為目標(biāo)蛋白洗脫峰液；步驟四 親和層析柱型5×12cm、填料為一種藍(lán)色顏料Cibacron Blue-3GA，用緩沖液A平衡柱子后上樣50～500ml經(jīng)步驟三收集的目標(biāo)蛋白洗脫峰液體，用0.17～0.22mol/LNaCl+緩沖液A洗脫至基線，換用0.17～0.22mol/L NaCl+緩沖液A+0.5～3mmol/LATP的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰液，洗脫峰溶液脫鹽后經(jīng)冷凍干燥，即可得蛋白干粉。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗癌基因工程藥物的分離純化方法，涉及純化工藝流程，填料的選擇，以及各純化步驟的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。它包括如下步驟及工藝條件用低滲沖擊法處理樣品、硫酸銨沉淀與凝膠過濾、弱陰離子交換層析、親和層析，最后獲得目標(biāo)蛋白純品。所獲蛋白純度高達(dá)98％以上、得率高達(dá)47％以上、工藝操作簡單、整個(gè)流程耗時(shí)少，凝膠柱、親和柱使用壽命長等為本發(fā)明之優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N9/48GK1412305SQ01129779
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者王一飛, 羅勇, 錢垂文, 林鋒, 張美英, 李久香, 劉潔生 申請人:暨南大學(xué)