專利名稱：一種t載體的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種T載體的制備方法，特別是用內(nèi)切酶消化前T載體得到T載體的方法。
背景技術(shù)：
“T/A”克隆法(Clark 1988；Holtonh and Graham 1991；Marchuk et al.1991；Mead et al.1991；Hu 1993；Zhou et al.1995)是伴隨著PCR技術(shù)發(fā)展起來的一種克隆方法。由于Taq酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性可以在幾乎任何雙鏈DNA分子的3’端加上一個突出的“A”(Clark 1988；Zhou et al.1995)，因此人們開發(fā)出一種3’端帶一突出“T”的特殊載體——T載體，以用于克隆Taq酶擴增的PCR產(chǎn)物或其它以Taq酶做A-tailing操作的線性DNA片段。目前用到的T載體一般是商品化的載體，其構(gòu)建策略不同廠商各有不同(Holton and Graham 1991；Marchuk et al 1991)，主要分為兩類1.在高濃度的dTTP的存在下，被產(chǎn)平末端的內(nèi)切酶消化后的載體與Taq酶溫育，由于Taq酶在不存在dATP的情況下有相對良好的3’末端加“T”能力，因此可以在線性化載體的平滑末端的3’端添加一個“T”，制成T載體。
2.在ddTTP的存在下，具平滑末端的的載體與末端轉(zhuǎn)移酶溫育，由于ddTTP不含3’-OH，因此末端轉(zhuǎn)移酶只能在載體的3’端加上一個“T”，構(gòu)成T載體。
以上方法制得的T載體由于有生產(chǎn)廠商的嚴格質(zhì)量控制，其效率可達70％或更高(PromegaCatalog & Technical Reference 2000-01)，可以滿足常規(guī)的克隆操作。但由于其操作步驟較多，質(zhì)量不易控制，因此只應用于幾種常見載體如pUC18，pGEM等，而且須由專業(yè)的公司來生產(chǎn)。
一類產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的限制性內(nèi)切酶的識別序列為T載體的簡易制作提供了素材(Mead et al.1991)。將這種識別序列反向重復的插入載體，并且將切割位點5’上游的第一個堿基設為T(即序列切開后的3’末端突出堿基為T)，便得到一前T載體，相應的酶切處理可使前T載體轉(zhuǎn)變成含3’末端突出一個T的成熟T載體。已嘗試過用這一方法得到T載體的相應限制性內(nèi)切酶有XcmI、HphI、Eam1105I或其同裂酶AspEI等(Mead et al.1991；Ichihara and Kurosawa1993；Testori et al.1994；Cha et al.1993；Ido and Hayami 1997；Arashi-Heese et al.1999；Schutteet al.1997；de Vries 1998；Borovkov and Rivkin 1997；Testori and Sollitti 1997)。但值得指出的是，目前用這一方法制作的T載體其克隆效率介于14-50％之間，質(zhì)量不穩(wěn)定。其中一個重要的原因是市售內(nèi)切酶所含殘余外切酶活性對目的T載體的影響。由于顯而易見的原因，含單核苷酸突出末端的T載體比含多核苷酸粘性末端的載體對外切酶活性的影響更為敏感。而在這類T載體的制作中，為降低背景，提高克隆效率，過消化(overdigestion)是通常采用的一種策略，這使得殘余外切酶活性對目的T載體的影響變得更為顯著，從而明顯降低所得T載體的質(zhì)量，并使其變得不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的構(gòu)建T載體的方法，該方法可最大限度抑制殘余外切酶活性對所得T載體的影響，從而解決上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題。
本發(fā)明提供的制備T載體的方法，是將兩個產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的內(nèi)切酶識別序列以反向重復方式插入自身不含相應內(nèi)切酶識別序列的載體，而且切割位點5’上游的第1個堿基設為T(即序列切開后的3’末端突出堿基為T)，得到前T載體，用內(nèi)切酶過消化(overdigestion)該前T載體，得到成熟T載體；其特征是用內(nèi)切酶過消化前T載體時，在酶切反應體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競爭性底物(Exonuclease Competitive Substrate，簡稱ECS)。添加外切酶競爭性底物可以抑制市售內(nèi)切酶所含殘余外切酶活性對所得T載體的影響。
所說的外切酶競爭性底物為線性單鏈或雙鏈寡DNA；最好為較短(約5-50個堿基或堿基對)的線性單鏈或雙鏈寡DNA，以使得在不過度增加過消化體系中總DNA濃度的條件下，提供足夠的DNA末端以抑制殘余外切酶活性對所得T載體的影響。
DNA外切酶的底物是非特異性的線形DNA的末端。因此在制作T載體的過消化體系中添加一些小分子寡DNA做為外切酶的競爭性底物，可以起到與目的T載體競爭殘余外切酶活性部位的作用，從而可抑制外切酶活性對目的T載體的影響?？紤]到一般現(xiàn)有載體都長達幾個Kb，是ECS的上百倍，因此本發(fā)明一般在過消化體系中添加與前T載體質(zhì)量相當?shù)腅CS，在不過度增加總DNA濃度的情況下，使ECS的末端濃度達到目的T載體的十至上百倍，從而最大程度的抑制了殘余外切酶活性對目的T載體的影響，保證了所得T載體的質(zhì)量。實驗證明按本發(fā)明方法可生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定，克隆效率極高的優(yōu)質(zhì)T載體；而且該方法操作簡單，易控制，具有普遍的應用意義。


圖1是HphI-XcmI接頭序列(Sequence of the HphI-XcmI linker)結(jié)構(gòu)示意圖。該接頭含兩個以反向重復排列的HphI、XcmI識別序列串聯(lián)體GGTGACCANNNNTNNNNTGG(N示A、T、C、G四種堿基中的任意堿基)；接頭兩末端分別是EcoRI和SalI所對應的粘性末端，為克隆入相應載體提供方便；接頭中間還有一EcoRV識別位點，為以后的重組克隆篩選提供方便。
圖2是重組質(zhì)粒pUC-HX(前T載體)的EcoRV酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。M示分子量Marker；泳道1為未消化的質(zhì)粒pUC-HX；泳道2為EcoRV消化后的pUC-HX；泳道3為EcoRV消化后的質(zhì)粒pUC18。
具體實施例方式
以下通過具體實施對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1。質(zhì)粒pUC-HX(前T載體)的構(gòu)建按圖1所示的序列用常規(guī)方法合成HphI-XcmI接頭序列。接頭的兩條鏈分別合成，再分別溶于雙蒸水后，等摩爾混合，37℃退火15分鐘，即可得到全長為60bp的雙鏈HphI-XcmI接頭(如圖1所示)。該接頭含兩個以反向重復方式排列的HphI、XcmI識別序列串聯(lián)體GGTGACCA(NNNNT/NNNN)TGG(序列中內(nèi)切酶XcmI的切割位點5’上游第一個堿基被設為T)，內(nèi)切酶XcmI消化含該接頭的載體可得到成熟T載體。
將上述合成的DNA接頭HphI-XcmI插入到質(zhì)粒pUC18的EcoRI+SalI窗口，連接、轉(zhuǎn)化后便得到重組質(zhì)粒pUC-HX，其酶切分析(如圖2所示)和測序結(jié)果均表明插入正確。
實施例2.ECS的合成按常規(guī)方法合成兩條外切酶競爭性底物ECS1和ECS2，其具體序列分別為5’p-CCAGCGCTGGT和5’-CAAGAATTCATGGAATTTGGCAACCTA。ECS1是一含5’磷酸基團的11個核苷酸的具回文結(jié)構(gòu)的寡DNA分子，在37℃的過消化體系中可彼此配對形成含與T載體相似的DNA末端的雙鏈結(jié)構(gòu)。ECS2是一27個核苷酸的普通PCR引物(不含5’磷酸基團)，在37℃的過消化體系中可保持單鏈結(jié)構(gòu)。
實施例3。載體pUC-HX-T(T載體)的獲得在分別添加ECS1和ECS2以及不添加外切酶競爭性底物的三種情況下，分別用限制性內(nèi)切酶XcmI消化載體pUC-HX得到成熟T載體pUC-HX-T。
酶切反應體系如下pUC-HX 2μg外切酶競爭性底物(ECS1/ECS2) 2μg/NULLXcmI 15UBuffer 2(NEB)10μlddH20 至終體積100μl37℃反應2個小時，酚抽使酶失活。酶切產(chǎn)物跑1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大小約為2.7kb的DNA片段(參照QIAGEN膠回收試劑盒說明書)，即為載體pUC-HX-T。
實施例4.載體pUC-HX-T的克隆效率測試1.連接反應以Taq酶擴增得到的PCR產(chǎn)物為外源片段，載體pUC-HX-T和外源片段按摩爾比1∶5的量加入連接反應體系，以TaKaRa公司提供的連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2作連接，16℃反應過夜。
2.克隆效率測定參照《分子克隆》第二版。以E.coli Top10為受體菌用氯化鈣法制備感受態(tài)細胞；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，復蘇后涂布與LB(Amp+)瓊脂板，37℃培養(yǎng)過夜；從平板上隨機挑選一定數(shù)量克隆做擴大培養(yǎng)，提取其中質(zhì)粒做酶切分析，鑒定是否含目的插入片段。
分別以長為1.3kb和0.5kb的Taq酶擴增的PCR產(chǎn)物為外源片段對實施例3三種體系中(不加ECS和分別加ECS1，ECS2)制得的載體pUC-HX-T分別做克隆效率測試，并以商品化的T載體pMD18-T(購自TaKaRa公司)為對照。具體結(jié)果如表1和表2所示。
從表1和表2可看出過消化體系中ECS的添加對所得T載體的質(zhì)量有明顯影響，可顯著提高所得T載體的克隆效率，并使其效率保持較為穩(wěn)定；分別添加ECS1和ECS2的體系中生產(chǎn)出的T載體其克隆效率無明顯差別，說明殘余外切酶活性作用的非特異性，單鏈寡DNA(ECS2)或雙鏈寡DNA(ECS1)對所得T載體有幾乎同樣的保護效果；添加了ECS的過消化體系中生產(chǎn)出的T載體具有略高于商品化的T載體pMD18-T的克隆效率。因此，應用本發(fā)明生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、優(yōu)良的T載體切實可行。
表1.三種體系中制得的載體pUC-HX-T和pMD18-T對長為1.3kb的A-tailed PCR產(chǎn)物的克隆效率比較

表2.三種體系中制得的載體pUC-HX-T和pMD18-T對長為0.5kb的A-tailed PCR產(chǎn)物的克隆效率比較

權(quán)利要求
1.一種T載體的制備方法，將兩個產(chǎn)3’末端單核苷酸突出的內(nèi)切酶識別序列以反向重復方式插入自身不含相應酶切位點的載體，而且將識別序列中切割位點5’上游的第1個堿基設為T，得到前T載體，用內(nèi)切酶過消化該前T載體，得到成熟T載體；其特征是用內(nèi)切酶過消化前T載體時，在酶切反應體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競爭性底物。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的外切酶競爭性底物為線性單鏈或雙鏈寡DNA。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法。其特征是所說的外切酶的競爭性底物為5～50個堿基的線性單鏈寡DNA或5～50個堿基對的線性雙鏈寡DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用內(nèi)切酶消化前T載體得到T載體的方法。本發(fā)明應用單鏈或雙鏈寡DNA作為外切酶的競爭性底物,在不過度增加總DNA濃度的情況下,向生產(chǎn)T載體的過消化體系中添加至少10倍于前T載體摩爾濃度的外切酶競爭性底物以抑制外切酶活性對所得T載體的影響,從而得到質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)良T載體。
文檔編號C12N15/09GK1346890SQ0112985
公開日2002年5月1日 申請日期2001年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者王珣章, 賀雄雷, 付捷, 龍綮新 申請人:中山大學